CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体.pdf

CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体包括两株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体CHO(中国倉鼠卵巢细胞)生产细胞系极其生产的预防和治疗用人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体制剂。其产品特征为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源IgGFc基因重组后在中国倉鼠卵巢(CHO)细胞稳定表达细胞的全人源抗体IgG1λ和IgG1κ，分别命名ChHAIgG16和ChHAIgG78。分子量为150kd左右。由ChHAIgG16和ChHAIgG78以3∶1混合的鸡尾酒式抗体制剂，命名HAMaxTMM。利用其高度中和甲肝病毒感染的功能特性和与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征，可望在临床上替代血制品丙种球蛋白而用于预防和治疗由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎。

1.  人源抗甲肝病毒基因工程抗体，其特征在于：
1)为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源IgGFc基因重组后在CHO稳定表达细胞的全人源IgG1λ全抗体，它由两条重链和两条λ-κ嵌合轻链组成，分子量为150kD左右，命名ChHAIgG16；
2)为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源IgGFc基因重组后在CHO稳定表达细胞的全人源IgG1κ全抗体，它由两条重链和两条κ轻链组成，分子量为150kD左右，命名ChHAIgG78；
3)人源抗甲肝病毒基因工程抗体ChHAIgG16或ChHAIgG78，其可变区基因组成特征为特异性的轻链和重链基因，来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列，其中ChHAIgG16轻链和重链可变区基因序列已在专利公开号为CN1316437A专利申请中陈述；ChHAIgG78轻链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“RASQSVSSSYLA”，“GASSRAT”和“QQYGSSPLT”；HAV78IgG重链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“SHEMN”，“YIGSRGSDTSYADSVKGR”和“ERYRYFEDYYHGLDV”；其基因特征决定了其对甲肝病毒的亲和力和中和保护功能；
4)人源抗甲肝病毒基因工程抗体ChUAIgG16或ChHAIgG78，其轻重链先导序列和恒定区基因来源于哺乳类细胞人源抗体高效表达载体VH-dhfr1和VK-dhfr1，该载体已在专利公开号为CN1363682专利申请中陈述；
5)是通过哺乳类细胞表达载体系统，在CHO工程细胞系中生产的特异性结合和识别甲肝病毒外壳蛋白的高亲和力中和性人源完全抗体，具有与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征；其结合甲肝病毒外壳蛋白和中和病毒感染的功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。

2.  根据权利要求1，用于生产人源抗甲肝病毒基因工程抗体的CHO工程细胞系的特征在于：
1)为稳定高效表达人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体ChHAIgG16的CHO工程细胞系；
2)为稳定高效表达人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体ChHAIgG78的CHO工程细胞系；
3)可被放大规模生产，其生产的抗体为分泌型抗体，可从培养上清中获得；
4)经无血清细胞培养后，可通过亲和层析过程从其培养上清中经纯化而获得抗体蛋白。

3.  人源抗甲肝病毒基因工程抗体制剂HAMax^TMM，其特征在于：为包含ChHAIgG16和ChHAIgG78两种抗体中的一种抗体单一的或两种混合的静脉注射用、肌肉注射用、口服或外用的抗体制剂；其对甲肝病毒抗原具有很高的亲和力，并具有在体外完全中和甲肝病毒和体内完全保护猴子抵御甲肝病毒攻击。

4.  CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体极其抗体制剂HAMax^TMM的用途，其特征在于：
1)可用于预防或治疗由甲肝病毒引起的甲型肝炎药物的制备；
2)可用于诊断甲肝病毒感染的试剂的制备；
3)可用于预防和治疗由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎的静脉注射用、肌肉注射用、口服或外用的生物制剂的制备。

CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体
一、技术领域
本发明属于生物工程和生物制药技术领域。
二、背景技术
本发明包括两株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体。分别由中国鼠卵巢细胞(CHO)生产细胞系生产。其抗体及其制剂可用于制备诊断、预防和治疗由甲型肝炎病毒感染引起的甲型肝炎的药物或试剂。
传染病所致死亡病例数在全世界死亡人口中仍占首位，而病毒性肝炎是严重危害我国人民健康的传染病。在法定报告的传染病中，各种肝炎病毒引起的急、慢性肝炎在我国所有传染病中发病率和死亡率均占首位。甲型肝炎(甲肝)是由甲肝病毒引起的急性传染病，感染对象以青少年及儿童为主，成年人发病率也呈上升趋势，它是各种病毒性肝炎中发病率最高的一种，每年发生的急性病毒性肝炎中，约有50％为甲型肝炎。我国是甲肝流行最严重的国家之一，虽然甲肝疫苗的使用已经降低了甲肝的发病率，但每年在我国局部地区仍有一定规模的爆发流行，而一旦发生传染病爆发流行，特异性抗体制剂的防御和治疗将比疫苗更迅速有效。
至今为止，大多数病毒性疾病无特异性治疗药物，用于临床治疗和预防某些病毒性疾病的生物制品仍然以血制品为主，如多年来临床上使用的血源性丙种球蛋白，用于甲肝或乙肝病毒引起的病毒性肝炎以及麻疹等预防，这些血制品中不仅非特异性杂蛋白多，特异性抗体含量很低，而且最大的问题是血源制品潜在的未能检出的病源污染问题，从长远利益考虑应当摒弃。作为一类新兴起的生物工程药，人源抗病毒基因工程抗体以其对人体无免疫原性，无污染源，特异性抗病毒疗效及连续规模生产可行性等优势逐渐成为预防和治疗病毒性疾病的一类有实际运用前景的新产品。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前已批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中的抗体有35种。其中已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源化基因工程抗体中，其中有一种即为抗病毒基因工程抗体，其商品名为“Synagis^TM″，为人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)基因工程抗体。
因此以人源基因工程产品替代血制品已成为国内外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。用纯鼠源单克隆抗体预防和治疗病毒性疾病在国际上尚无任何批准的先例，鼠源抗体人用最大的不利之处为异源蛋白，在人体内易引起遗传免疫排斥而使抗体失效并引起免疫性疾病。因此，特异性抗病毒人源中和性抗体是病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一。抗甲肝抗体制剂研制成功，将为国内外首创，有可能获一类新药证书。
三、发明内容
本发明的目的是将已获得的中和性抗甲肝病毒Fab抗体基因(详见专利公开号为CN1316437A的专利申请)与人源IgG恒定区基因重组，通过哺乳类细胞表达系统，在哺乳类细胞CHO细胞中生产针对甲肝病毒的具有明显中和功能的分泌型完全人源IgG抗体，为将来取代目前市场上的血源性丙种球蛋白，研究开发新的临床抗病毒预防和治疗用特异性抗体药物提供可行性研究。
本发明包括以CHO生产细胞系生产的两株人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体及其抗体制剂，陈述如下：
1.人源抗甲肝病毒基因工程抗体，其特征在于：
1)为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源IgGFc基因重组后在CHO稳定表达细胞的全人源IgG1λ全抗体，它由两条重链和两条λ-κ嵌合轻链组成，分子量为150kD左右，命名ChHAIgG16；
2)为来源于噬菌体人源抗体库筛选的与人源IgGFc基因重组后在CHO稳定表达细胞的全人源IgG1κ全抗体，它由两条重链和两条κ轻链组成，分子量为150kD左右，命名ChHAIgG78；
3)人源抗甲肝病毒基因工程抗体ChHAIgG16或ChHAIgG78，其可变区基因组成特征为特异性的轻链和重链基因，来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列，其中ChHAIgG16轻链和重链可变区基因序列已在专利公开号为CN1316437A专利申请中陈述；ChHAIgG78轻链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“RASQSVSSSYLA”，“GASSRAT”和“QQYGSSPLT”；HAV78IgG重链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“SHEMN”，“YIGSRGSDTSYADSVKGR”和“ERYRYFEDYYHGLDV”，其基因特征决定了其对甲肝病毒的亲和力和中和保护功能；
4)人源抗甲肝病毒基因工程抗体ChHAIgG16或ChHAIgG78，其轻重链先导序列和恒定区基因来源于哺乳类细胞人源抗体高效表达载体VH-dhfr1和VK-dhfr1，该载体已在专利公开号为CN1363682专利申请中陈述；
5)是通过哺乳类细胞表达载体系统，在CHO工程细胞系中生产的特异性结合和识别甲肝病毒外壳蛋白的高亲和力中和性人源完全抗体，具有与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征；其结合甲肝病毒外壳蛋白和中和病毒感染的功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。
2.用于生产人源抗甲肝病毒基因工程抗体的CHO工程细胞系的特征在于：
1)为稳定高效表达人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体ChHAIgG16的CHO工程细胞系；
2)为稳定高效表达人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体ChHAIgG78的CHO工程细胞系；
3)可被放大规模生产，其生产的抗体为分泌型抗体，可从培养上清中获得；
4)经无血清细胞培养后，可通过亲和层析过程从其培养上清中经纯化而获得抗体蛋白。
3.人源抗甲肝病毒基因工程抗体制剂HAMax^TM，其特征在于：为包含ChHAIgG16和ChHAIgG78两种抗体中的一种抗体单一的或两种混合的静脉注射用、肌肉注射用、口服或外用的抗体制剂；其对甲肝病毒抗原具有很高的亲和力，并具有在体外完全中和甲肝病毒和体内完全保护猴子抵御甲肝病毒攻击。
4.CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体极其抗体制剂HAMax^TM的用途，其特征在于：
1)可用于预防或治疗由甲肝病毒引起的甲型肝炎药物的制备；
2)可用于诊断甲肝病毒感染的试剂的制备；
3)可用于预防和治疗由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎的静脉注射用、肌肉注射用、口服或外用的生物制剂地制备。
总而言之，本发明陈述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程全抗体，是在获得抗体基因的基础上获得全抗体基因产物的表达，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，并已被重组到CHO细胞DNA中，形成稳定表达细胞系。利用此稳定表达细胞系，可在CHO细胞中连续规模生产抗甲肝病毒全抗体，所述抗体具有识别甲肝病毒核壳蛋白上中和抗原，从而阻断甲肝病毒感染的功能，利用其高度中和甲肝病毒感染的功能特性和与天然抗体分子类似的全抗体分子结构特征，制备抗体制剂，可望在临床上替代目前市场上的血制品丙种球蛋白而用于预防和治疗由甲肝病毒感染引起的甲型肝炎。
四、附图说明
1.图1为ChHAIgG78轻重链可变区由核甘酸序列推导的氨基酸序列，包括抗体可变区的框架区(FR)和高变区(CDR)。
2.图2为用FITC标记的抗人IgGK链(2A)和抗人IgGFc(2B)荧光抗体染色的第30代ChHAIgG16CHO细胞表达人源IgG抗体的荧光。
3.图3为ELISA检测稳定传代中HAIgG16和HAIgG78两株CHO工程细胞系表达上清中分泌的IgG抗体含量。
4.图4为SDS-PAGE电泳分析CHO细胞中表达的亲和层析纯化的人源抗甲肝病毒IgG抗体。
5.图5为测定人源抗甲肝病毒基因工程抗体的亲和力和国际单位比较的ELISA分析结果。
6.图6为人源抗甲肝病毒基因工程抗体的体外中和效力检测。
7.图7为ChHAIgG16和ChHAIgG78与HRP标记鼠抗甲肝病毒中和抗体的竞争ELISA分析。
8.图8为免疫组和对照组恒河猴HAV抗体及ALT的动态变化。
五、具体实施方式
以下的优先实施例对本发明作详细说明，但不意味着限制本发明的内容。在这些实施例中，为说明本发明，采用的抗体Fab基因和哺乳类细胞人源抗体高效表达载体均来自本实验室发明。所用主要菌株为商品化产品XLI-Blu(美国Strategene公司)。CHO细胞购自美国ATCC。甲肝病毒为本研究所肝炎室从我国病人分离的龙甲株，现由肝炎室保存，可向相关技术领域的研究机构或单位公开提供(参见专利公开号为CN1316437A的专利申请)。
实施例1为CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体基因的序列特征；实施例2-4为CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体的克隆制备方法；实施例5为CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体的蛋白特征；实例6-9为CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体功能特征。
实例1，CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体基因的序列特征：其可变区基因组成特征为特异性的轻链和重链基因，来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列，其中ChHAIgG16轻链和重链可变区基因序列已在专利公开号为CN1316437A专利申请中陈述。ChHAIgG78轻链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“RASQSVSSSYLA”，“GASSRAT”和“QQYGSSPLT”。其完整核甘酸序列如下：
GAGCTCACGCAGTCTCCA GGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGG GAAAGAGCC
ACC CTC TCC TGC AGG GCCAGTCAGAGTGT AGCAGCAGCTACTTA GCC
TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATC
CAGCAGGGCCACTGGC ATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA
GACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTA
CTGTCAGCAGTATGGT AGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGA GGGACCAAG GT
GGAGATCAAACGA ACTGTG
ChHAIgG78重链可变区CDR1，CDR2和CDR3序列为分别“SHEMN”，“YIGSRGSDTSYADSVK”其完整核甘酸序列如下：
CTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGATACAGCCCGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTG
TGTAGCCTCTGGATTC AGGTTCAGTAGTCATGAAATGAACTGGGTC CGCCAG
GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATCGGTAGTCGTGGTAGTGA
CACATCCTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACC GTC TCCAGA GAC AAC
GCC CGG AAC ACA CTG TAT CTG CAA ATG AACAACCTGA GAGCCGAGGA
CACGGCTGTTTATTACT GTGCGCGAGAGAGG TAT CGA TACTTTGAA GACTA
CTATCACGGTTT GACGTCTGGGGCCAAGGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA
图1为ChHAIgG78轻重链可变区由核甘酸序列推导的氨基酸序列，包括抗体可变区的框架区(FR)和高变区(CDR)。
实例2，CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体基因的克隆重组：将通过噬菌体表面呈现系统获得的抗甲肝病毒中和抗体Fab基因克隆入本实验室发明的人源抗体高效表达表达载体中。其中，ChHAIgG16和ChHAIgG78轻链可变区基因以EcoRV和XhoI内切酶位点分别克隆入载体VK-dhfrl中(该载体已在专利公开号为CN1363682专利申请中陈述)，置于EF-1α启动子控制之下，获得表达载体16VL-dhfr和78VK-dhfr。ChHAIgG16和ChHAIgG78重链可变区基因以BssHII和BstE II分别克隆入载体VH-dhfr1中(该载体已在专利公开号为CN1363682专利申请中陈述)，获得表达载体16VH-dhfr和78VH-dhfr。载体质粒DNA经柱层析纯化(QiagenMidi Kit，Qiagen公司，美国)后用于转染CHO细胞。
实例3，高效稳定表达人源IgG抗体的CHO细胞系的建立极其表达：用LipofectinAINE 2000转染试剂盒(GIBCO BRL公司，美国)将纯化的表达载体质粒DNA和LipofectAMINE Plus共转染24孔板中长成单层CHO-dhfr-细胞(美国ATCC商品号：CRL-9096)，24小时后撤除IMDM培养基(GIBCO BRL公司，美国)中用于维持CHO-dhfr细胞生长的次品黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，并按1∶20-30稀传入T25方瓶。24小时后加入筛选药物氨甲喋呤(MTX，Sigma公司，美国)，起始浓度为10^-7M，逐渐加大至10^-6M，在压药过程中挑选双重表达IgG重链和轻链基因的阳性克隆获得重组完全人源IgG抗体的表达。
实例4，人源抗甲肝病毒全抗体基因在CHO细胞中的稳定传代表达：根据实例2方法，首先建成人源抗甲肝病毒全抗体ChHAIgG16和ChHAIgG78 CHO细胞工程细胞系，将高效表达人源抗甲肝病毒全抗体基因的目的细胞系以耐受MTX10^-8M或2×10^-6M的代次为第一代，在含10％新生牛血清的IMDM培养条件下1∶4传代，每代细胞约生长3-4天，收集每代细胞的表达上清以备检测。用免疫荧光方法检测不同代次序CHO细胞内IgG1抗体的表达。如图2所示，是用FITC标记的抗人IgGK链(2A)和抗人IgGFc(2B)荧光抗体染色的第30代ChHAIgG16CHO细胞表达人源IgG抗体的荧光。其细胞表达阳性率在稳定传代第30代次时仍然稳定在此基础上95％以上。在用ELISA夹心法检测感传代细胞表达上清中分泌的IgG抗体，用抗人IgGFab抗体(Sigma公司，美国)包被ELISA板，加待检测的不同稀释度的CHO细胞表达上清后，加HRP标记的抗人IgGFc抗体，显色后检测O.D值，并与用已知浓度的人源IgG标准品(SIgG)和已知浓度的纯化ChHAIgG16(RIgG)ELISA检测标准曲线进行比较，计算出表达上清中的IgG含量。如图3所示，是ELISA检测稳定传代中HAIgG16和HAIgG78两株CHO工程细胞系表达上清中分泌的IgG抗体含量，其中ChHAIgG16工程细胞系表达水平稳定在50-60mg/L，而HAIgG78工程细胞系表达水平稳定在40-50mg/L。
实例5，CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体的亲和层析纯化：收集CHO细胞无血清培养上清，2000G离心，用低蛋白吸附滤膜过滤上清，将滤过后上清过ProteinG亲合层析柱，洗脱中和，经脱盐柱脱盐。图4是SDS-PAGE电泳分析CHO细胞中表达的亲和层析纯化的人源抗甲肝病毒IgG抗体。其中图4A为还原条件下的纯化抗甲肝病毒IgG抗体重链(50KD)和轻链(25KD)电泳带，从左至右分别为蛋白分子标准品，ChHAIgG16纯化抗体0.5ug，1ug和2ug，人源IgG标准品0.5ug，1ug和2ug。图4B为非还原条件下的纯化抗甲肝病毒IgG抗体H2L2四聚体电泳带。从左至右分别为蛋白分子标准品，ChHAIgG16纯化抗体0.5ug，1ug和2ug，人源IgG标准品0.5u，HAIgG78纯化抗体0.5ug，1ug和2ug。
实例6，CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体的亲和力测定极其国际标准单位比较：用纯化的甲肝病毒包被ELISA板，将实例4中纯化的HAIgG16抗体和HAIgG78抗体浓度调整到1mg/ml，以1∶400起始(每孔0.25ug)，1∶2倍比稀释，将不同稀释度的样品加入孔中，37C反应后，加HRP标记的抗人IgGFc抗体，显色后检测O.D值。同时与来自生物制品检定所78国际单位/ml标准丙种球蛋白相比较测定其标准国际单位。图5是测定人源抗甲肝病毒基因工程抗体的亲和力和国际单位比较的ELISA分析结果。图中16IgG，78IgG，3∶1Mix，SigG和EHF-IgG分别代表ChHAIgG16，ChHAIgG78抗体，ChHAIgG16和ChHAIgG78以3∶1重量混合抗体，标准丙种球蛋白和无关的抗汉坦病毒人源抗体。与标准丙种球蛋白相比，特异性抗甲肝病毒抗体高于丙种球蛋白近4倍，其亲和常数可达1.6×10^-11M。1mg重组人源抗甲肝病毒基因工程抗体相当于320国际单位。而ChHAIgG16和ChHAIgG78混合抗体并未达到提高抗体亲和力的效果。
实例7，CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体中和功能测定极其国际标准单位比较：将实例4中纯化的ChHAIgG16和ChHAIgG78抗体浓度调整到1mg/ml，以1∶25起始(每孔4ug)，1∶2倍比稀释，将不同稀释度的样品与100TCID的甲肝病毒37C孵育2小时，然后感染甲肝病毒敏感细胞T4细胞。21天后ELISA检测各样品管中甲肝病毒含量。检测的样本为甲肝病毒感染21天后的细胞裂解上清。图6是人源抗甲肝病毒基因工程抗体的体外中和效力检测。中和试验结果表明，这株抗体不仅有很高的亲和力，而且同样据有较强的中和能力。当体外中和100TCID50甲肝病毒感染达80％以上时仅需1ug左右，而50％中和时，仅需0.05ug抗体。而ChHAIgG16和ChHAIgG78混合抗体在中和试验中具有协同增强作用。同样条件纯化的抗汉坦病毒基因工程抗体则不能中和甲肝病毒感染。
实例8.CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体竞争抑制实验：用纯化的甲肝病毒包被ELISA板。将实例4中纯化的ChHAIgG16和ChHAIgG78抗体浓度调整到1mg/ml，以每孔ug起始，1∶2倍比稀释，将不同稀释度的样品加入孔中，37℃反应后，加1∶1000稀释的HRP标记鼠抗甲肝病毒中和抗体，显色后检测O.D值。图7为ChHAIgG16和ChHAIgG78与HRP标记鼠抗甲肝病毒中和抗体的竞争ELISA分析。其中，ChHAIgG16抗体在0.1ug情况下可完全与HRP标记鼠抗甲肝病毒中和抗体竞争，而ChHAIgG78抗体则不能很好地HRP标记鼠抗甲肝病毒中和抗体竞争，表明ChHAIgG16抗体和HAIgG78抗体针对不同的甲肝病毒抗原决定族。
实例9.CHO细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体在恒河猴体内的保护性实验：实验用恒河猴4只，由广西壮族自治区卫生防疫站提供，3雌1雄，重为1.95-4Kg，实验随机分为2组，每组2只，每只猴子实验前采血，检测抗HAV总抗体，为阴性，ALT正常，并排除被其它肝炎病毒感染的可能。一组猴子(猴204，猴205)在用甲肝病毒野毒株攻击前，先静脉接种人源抗甲肝病毒基因工程抗体ChHAIgG16和ChHAIgG78 3∶1混合抗体制剂，2mg/只；一组猴子(猴206，猴207)不接种抗体，只注射生理盐水。30小时后，用甲肝病毒野毒株攻击这两组猴子，10％的粪便悬液(其中含有抗菌素)3ml/只猴子，ELISA检测甲肝抗原P/N值在3左右，静脉注射。每周采血检测ALT(血清丙氨酸转氨酶)，采取常规方法检测每天收集的大便。血清中抗HAV总抗体采用竞争法ELISA检测，按甲肝抗体检测试剂盒说明书进行(万泰生物技术公司，中国)。粪便中甲肝病毒RNA检测采用抗体捕获PCR方法进行，方法如下：所用负链引物为结合于VP1的核苷酸2389-2414，5’-GGAAATGTCTCAGGTACTTTCTTTG-3’，正链引物为结合于VP3的羧基端核苷酸2167-2193，5’-GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG-3’。抗体捕捉病毒在0.5ml离心管中进行。循环参数为：94℃变性30秒，55℃退火复性30秒，72℃延伸30秒，35个循环，最后一个周期结束时引物延伸时间增加5分钟。结果如图8所示，是免疫组和对照组恒河猴HAV抗体及ALT的动态变化。实验组(图8A为猴204数据，图8B为猴205数据)与对照组(图8C为猴206数据，图8D为猴207数据)在重组抗体免疫及甲肝病毒野毒株攻击前后ALT及抗HAV总抗体的动态变化：在甲肝病毒野毒株攻击后观察了三个月，对照组在野毒株攻击后约5-6周，ALT明显升高，持续约2个星期，而对照组ALT无明显变化，均保持正常水平。对照组抗HAV总抗体在5-6周前后开始明显呈现阳性，并一直持续到观察结束，说明HAV野毒株在对照组恒河猴体内进行了复制并引起感染和发病。而实验组恒河猴在接受人源重组抗HAV抗体后，其外源抗HAV抗体一直持续阳性达6周左右，其中一只在8周时仍能检出阳性，但在9周后抗体变为阴性，另一只在7周后变为阴性。但直到观察结束(14周)，实验组猴子ALT仍为正常。说明外源重组抗体在恒河猴体内可有效地保护恒河猴不受甲肝病毒感染，更不发病。