《菊苣转基因植株的扩繁方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《菊苣转基因植株的扩繁方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN102771396A43申请公布日20121114CN102771396ACN102771396A21申请号201210288751922申请日20120814A01H4/00200601C12Q1/6820060171申请人四川省草原科学研究院地址611743四川省成都市郫县红光镇国宁西路368号72发明人张玉白史且李达旭邓永昌方鹏飞74专利代理机构北京众合诚成知识产权代理有限公司11246代理人龚燮英54发明名称菊苣转基因植株的扩繁方法57摘要本发明公开了一种菊苣转基因植株的扩繁方法，包括以下步骤A1、农杆菌介导的转ZEOLIN基因的菊苣植株的检测；A2、转基因植株叶片灭。
2、菌；A3、转基因菊苣芽的诱导与增殖；A4、转基因菊苣芽生根；A5、转基因菊苣再生植株的PCR检测；A6、转基因菊苣扩繁植株的炼苗和移栽。本发明以转基因菊苣叶片为外植体进行扩繁，分化率达90以上，每个幼叶外植体平均可分化出1869个不定芽，不定芽易于生根，生根率到90以上，在芽分化、芽繁殖和生根阶段，都通过不同浓度的潮霉素筛选，PCR检测再生植株阳性率高达8554，是常规遗传转化率的78倍，炼苗移栽后平均成活率达97以上。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页1/1页21一种菊苣转基因植株的扩繁方法，其特征在。
3、于，包括以下步骤A1、农杆菌介导的转ZEOLIN基因的菊苣植株的检测采用CTAB法提取转基因菊苣基因组DNA，以含有外源目的基因ZEOLIN的质粒DNA做阳性对照，未转化菊苣植株DNA及DDH2O做阴性对照，利用设计的引物进行PCR扩增和SOUTHERN杂交检测，选取阳性的菊苣转基因植株，再用改良SDS法提取RNA，进行RTPCR检测，选取都为阳性的转基因菊苣作为后续材料；A2、转基因植株叶片灭菌选取步骤A1检测为阳性的转基因菊苣叶片，先采用自来水冲洗，在超净工作台上用01HGCL2浸泡叶片810MIN，期间不停摇动，无菌水反复冲洗45遍，无菌滤纸吸干多余水分；A3、转基因菊苣芽的诱导与增殖用。
4、无菌刀片将灭菌后的菊苣叶片切成0505CM，叶片近轴面向下，接种在含25MG/L潮霉素、20MG/L6BA、02MG/LIBA、001MG/LTDZ的芽诱导培养基上诱导分化出不定芽绿点，将小芽点接种到含有15MG/L潮霉素、20MG/L6BA、02MG/LIBA的芽增殖培养基上形成大量丛生芽；所述芽诱导培养基MS基本培养基25MG/LHYG20MG/L6BA02MG/LIBA001MG/LTDZ30G/L蔗糖8G/L琼脂，PH5860；芽增殖培养基MS基本培养基15MG/LHYG20MG/L6BA02MG/LIBA30G/L蔗糖8G/L琼脂，PH5860；A4、转基因菊苣芽生根待丛生芽长到23。
5、CM时，小心将芽剥离叶片基部，接种到含有10MG/LHYG和01MG/LNAA的生根培养基上进行生根培养；所述生根培养基1/2MS培养基10MG/LHYG01MG/LNAA15G/L蔗糖8G/L琼脂，PH值5860；A5、转基因菊苣再生植株的PCR检测在无菌操作台上，从玻璃瓶中取出生根20天左右的转基因扩繁菊苣，剪取叶片12片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，进行PCR检测，将阳性的再生植株重新转入新的1/2MS培养基中继续培养至炼苗；A6、转基因菊苣扩繁植株的炼苗和移栽对步骤A5检测为阳性的再生植株进行炼苗和移栽，具体炼苗方法为首先在培养室中将封口膜或瓶盖打开，适应12天，在培养容器。
6、内注入清水，温室中炼苗23D，然后取出小植株，小心洗净根部的培养基，移栽到装有灭菌基质的花盆中，于温室炼苗5D后移到室外常规培养，每2天喷施1/2MS盐溶液；植株炼苗后移栽到田间，成活的植株即为扩繁的带有外源目的基因的转基因植株。权利要求书CN102771396A1/3页3菊苣转基因植株的扩繁方法技术领域0001本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种菊苣转基因植株的扩繁方法。背景技术0002菊苣CICHORIUMINTYBUS为菊科菊苣属多年生草本植物。菊苣不仅是高产优质的饲用作物，又具药用、食用和蜜源用等多方面的开发潜力。菊苣根系含有丰富倍半萜内酯、糖苷、香豆素、黄酮类、花青甙、细胞激肽类。
7、和有机酸等物质，具有清肝利胆，防病抗癌的功效。根中提取的苦味物质可作为咖啡的代用品，肉质根上长出的嫩芽可作为蔬菜食用，其肉质根加工而成的保健食品出口韩国、日本等地很受欢迎，蓝色的花冠具有一定的观赏价值，是一种大力推广的新兴多用途经济植物，倍受国内外学者的重视。发明内容0003本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种菊苣转基因植株的扩繁方法。0004本发明的技术方案如下0005一种菊苣转基因植株的扩繁方法，包括以下步骤A1、农杆菌介导的转ZEOLIN基因的菊苣植株的检测采用CTAB法提取转基因菊苣基因组DNA，以含有外源目的基因ZEOLIN的质粒DNA做阳性对照，未转化菊苣植株DNA。
8、及DDH2O做阴性对照，利用设计的引物进行PCR扩增和SOUTHERN杂交检测，选取阳性的菊苣转基因植株，再用改良SDS法提取RNA，进行RTPCR检测，选取都为阳性的转基因菊苣作为后续材料；0006A2、转基因植株叶片灭菌选取步骤A1检测为阳性的转基因菊苣叶片，先采用自来水冲洗，在超净工作台上用01HGCL2浸泡叶片810MIN，期间不停摇动，无菌水反复冲洗45遍，无菌滤纸吸干多余水分；0007A3、转基因菊苣芽的诱导与增殖用无菌刀片将灭菌后的菊苣叶片切成0505CM，叶片近轴面向下，接种在含25MG/L潮霉素、20MG/L6BA、02MG/LIBA、001MG/LTDZ的芽诱导培养基上诱导。
9、分化出不定芽绿点，将小芽点接种到含有15MG/L潮霉素、20MG/L6BA、02MG/LIBA的芽增殖培养基上形成大量丛生芽；0008所述芽诱导培养基MS基本培养基25MG/LHYG20MG/L6BA02MG/LIBA001MG/LTDZ30G/L蔗糖8G/L琼脂，PH5860；0009芽增殖培养基MS基本培养基15MG/LHYG20MG/L6BA02MG/LIBA30G/L蔗糖8G/L琼脂，PH5860；0010A4、转基因菊苣芽生根待丛生芽长到23CM时，小心将芽剥离叶片基部，接种到含有10MG/LHYG和01MG/LNAA的生根培养基上进行生根培养；0011所述生根培养基1/2MS培养基。
10、10MG/LHYG01MG/LNAA15G/L蔗糖8G/L琼脂，PH值5860；0012A5、转基因菊苣再生植株的PCR检测在无菌操作台上，从玻璃瓶中取出生根20说明书CN102771396A2/3页4天左右的转基因扩繁菊苣，剪取叶片12片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，进行PCR检测，将阳性的再生植株重新转入新的1/2MS培养基中继续培养至炼苗；0013A6、转基因菊苣扩繁植株的炼苗和移栽对步骤A5检测为阳性的再生植株进行炼苗和移栽，具体炼苗方法为首先在培养室中将封口膜或瓶盖打开，适应12天，在培养容器内注入清水，温室中炼苗23D，然后取出小植株，小心洗净根部的培养基，移栽到装有灭。
11、菌基质的花盆中，于温室炼苗5D后移到室外常规培养，每2天喷施1/2MS盐溶液；植株炼苗后移栽到田间，成活的植株即为扩繁的带有外源目的基因的转基因植株。0014菊苣常规农杆菌遗传转化效率较低，最高的达到百分之十几，最低的只有百分之几，通过常规遗传转化得到转基因菊苣植株的量很少，且假阳性率高，转化的工作量很大，利用转基因菊苣叶片作为外植体进行扩殖，省去了遗传转化的繁琐步骤，可以在短时间内得到大量含有目的外源基因的阳性转基因菊苣植株。0015本发明以转基因菊苣叶片为外植体进行扩繁，分化率达90以上，每个幼叶外植体平均可分化出1869个不定芽，不定芽易于生根，生根率到90以上，在芽分化、芽繁殖和生根阶。
12、段，都通过不同浓度的潮霉素筛选，PCR检测再生植株阳性率高达8554，是常规遗传转化率的78倍，炼苗移栽后平均成活率达97以上。通过该技术，一株转基因菊苣，经离体扩繁2个月可产生上千株转基因阳性组培苗。与常规遗传转化获得转基因植株相比，该技术培养周期短，程序简单，扩繁系数高，成本低，对菊苣重要农艺性状影响小，产生的后代目的基因遗传稳定，可实现转基因菊苣的快速和大规模培育，也为菊苣基因工程和菊苣遗传改良奠定了基础。附图说明0016图1为转基因菊苣在筛选培养基上分化形成的芽点；0017图2为转基因菊苣扩繁中芽的增殖；0018图3为转基因菊苣扩繁植株生根培养；0019图4为转基因菊苣扩繁生根后的试管。
13、苗；0020图5为转ZEOLIN基因菊苣再生扩繁后的PCR电泳检测；注MDL2000DNAMARKERPPCBZEOLIN（阳性对照的质粒）；CK阴性对照非转基因菊苣16转基因菊苣；0021图6为转基因菊苣扩繁植株炼苗后成活的植株；0022图7为转基因菊苣扩繁植株田间表现。具体实施方式0023以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。0024转ZEOLIN基因菊苣植株获得的方法为常规方法，简述如下采用菊苣叶片为外植体，外植体预培养2D，用OD60004ABS的农杆菌菌液侵染10MIN,，过23D的共培养和12D的恢复培养后将转化后的外植体接种在含适量抑菌剂头孢和筛选剂潮霉素的培养基上进行筛选、。
14、抗性芽的再生和增殖，再进行生根培养、炼苗、移栽和检测，最后得到转ZEOLIN基因的菊苣植株。0025菊苣转基因植株的扩繁方法说明书CN102771396A3/3页50026（1）农杆菌介导的转ZEOLIN基因的菊苣植株的检测。采用CTAB法提取转基因菊苣基因组DNA，以含有外源目的基因ZEOLIN的质粒DNA做阳性对照，未转化菊苣植株DNA及DDH2O做阴性对照，利用设计的引物进行PCR扩增和SOUTHERN杂交检测，选取阳性的菊苣转基因植株，再用改良SDS法提取RNA，进行RTPCR检测，选取都为阳性的转基因菊苣作为后续材料。00272转基因植株叶片灭菌。选取第一步检测为阳性的转基因菊苣叶片。
15、，先采用自来水冲洗，在超净工作台上用01HGCL2浸泡叶片810MIN，期间不停摇动，无菌水反复冲洗45遍，无菌滤纸吸干多余水分。0028（3）转基因菊苣芽的诱导与增殖。用无菌刀片将灭菌后的菊苣叶片切成0505CM，叶片近轴面向下，接种在含25MG/L潮霉素、20MG/L6BA、02MG/LIBA、001MG/LTDZ的芽诱导培养基上诱导分化出不定芽绿点，如图1所示，由图1可以看出，转基因菊苣的一个外植体能分化形成许多不定芽的绿点，统计分析其分化率达到90以上。将小芽点接种到含有15MG/L潮霉素、20MG/L6BA、02MG/LIBA的芽增殖培养基上形成大量丛生芽，如图2所示，由图2看出一个。
16、外植体可以形成大量丛生芽，统计得出每个外植体平均可以形成1869个不定芽，最多的可以形成41个丛生芽。0029所述芽诱导培养基MS基本培养基25MG/LHYG20MG/L6BA02MG/LIBA001MG/LTDZ30G/L蔗糖8G/L琼脂，PH5860。0030芽增殖培养基MS基本培养基15MG/LHYG20MG/L6BA02MG/LIBA30G/L蔗糖8G/L琼脂，PH5860。0031（4）转基因菊苣芽生根。待丛生芽长到23CM时，小心将芽剥离叶片基部，接种到含有10MG/LHYG和01MG/LNAA的生根培养基上进行生根培养，2周后产生大量根，如图3所示，从图3可以看出不定芽易于生根，。
17、长势良好，统计分析生根率到90以上。0032所述生根培养基1/2MS培养基10MG/LHYG01MG/LNAA15G/L蔗糖8G/L琼脂，PH值5860。00335转基因菊苣再生植株的PCR检测。在无菌操作台上，从玻璃瓶中取出生根20天左右的转基因扩繁菊苣（图4所示），剪取叶片12片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，进行PCR检测，如图5所示，图5可以看出，PCR检测的大部分扩繁植株都为阳性，统计分析PCR检测再生植株阳性率高达8554，是常规遗传转化率的78倍。将阳性的再生植株重新转入新的1/2MS培养基中继续培养至炼苗。0034（6）转基因菊苣扩繁植株的炼苗和移栽。对第5步检测为阳。
18、性的再生植株进行炼苗和移栽，具体炼苗方法为首先在培养室中将封口膜或瓶盖打开，适应12天，在培养容器内注入清水，温室中炼苗23D，然后取出小植株，小心洗净根部的培养基，移栽到装有灭菌基质（沙、土壤和蛭石）的花盆中，于温室炼苗5D后移到室外常规培养，每2天喷施1/2MS盐溶液，如图6所示，图6可以看出，植株炼苗后成活率高，长势良好。植株炼苗后移栽到田间，成活的植株即为扩繁的带有外源目的基因的转基因植株，如图7所示，图7看出，扩繁的植株在田间移栽成活后长势良好，植株平均成活率达到97以上。0035应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。说明书CN102771396A1/3页6图1图2图3说明书附图CN102771396A2/3页7图4图5图6说明书附图CN102771396A3/3页8图7说明书附图CN102771396A。