发明领域
本发明涉及液化含淀粉物质的改良方法，该方法适于作为生产糖浆和发 酵产品方法中的一个步骤。本发明还涉及生产乙醇的方法，包括根据本发 明液化含淀粉原料。
发明背景
液化是本领域公知的方法，通过其将淀粉转化成较短的链和粘性较低的 糊精。该方法通常涉及加入α-淀粉酶的同时或之后的淀粉糊化。液化用于 生产糖浆和发酵产品如乙醇的方法中。存在改进液化步骤的需要，用于将 淀粉转化成糖浆和发酵产品，尤其是如乙醇。
发明概述
本发明的目的是提供液化含淀粉物质的改良方法，尤其是例如通过干磨 (dry milling)减小了大小的含淀粉物质。
本发明者已经发现通过用至少一种α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶 (maltogenic amylase)或者用至少一种淀粉酶和至少一种酯酶处理可以提高 干磨含淀粉物质的液化。认为酯酶作用于含淀粉物质中存在的脂质来产生 较小的分子，该较小的分子较少产生称为凝沉淀粉(retrograded starch)的 淀粉-脂质复合物。本发明方法的一个优势是通过降低糊化的热或温热浆液 的粘度来提高液化并防止或至少减少蒸汽蒸煮(jet cooking)过程中凝沉淀 粉的形成。此外，根据本发明，从含淀粉的原材料释放出更多的碳水化合 物。
因此，本发明的第一个方面提供了液化含淀粉物质的方法，包括用至少 一种α-淀粉酶和麦芽糖(maltogenic)淀粉酶处理所述含淀粉物质的步骤。
本发明的第二个方面提供了液化含淀粉物质的方法，包括用至少一种淀 粉酶和至少一种酯酶处理所述含淀粉物质的步骤。
液化方法的一个实施方案中，包括步骤：
i)用至少一种酯酶预处理含淀粉物质的浆液，
ii)用α-淀粉酶液化预处理的浆液
优选的实施方案中，减小含淀粉物质的大小，优选通过干磨。可以以多 阶段(stage)热浆处理(hot slurry process)来进行液化步骤ii)，如三阶段 处理，在不同的温度和保持时间(holding times)下进行。
发酵产品如乙醇和其它基于淀粉的产品如糖浆的生产中，含淀粉的原 料，如全谷物或整谷粒(whole grains)，优选玉米，大小可以被减小，优 选通过干磨，以便打开结构并使得可以进一步加工。减小含淀粉物质大小 的技术，包括干磨，是本领域公知的。
另一方面中，本发明提供了生产发酵产品如乙醇的方法，包括：
(a)减小含淀粉物质的大小
(b)用至少一种α-淀粉酶和至少一种麦芽糖淀粉酶液化步骤(a)的产 物；
(c)用碳水化合物源产生酶(carbohydrate source generating enzyme)来 糖化步骤(b)中所获得的液化物质；和
(d)使用发酵微生物来发酵糖化的物质。
优选实施方案中，减小含淀粉物质的大小，优选通过干磨。根据本发明 的液化方法进行步骤(b)。分开或同时进行步骤(c)和(d)(SSF方法)。
另一方面中，本发明涉及生产发酵产品如乙醇的方法，包括：
(a)减小含淀粉物质的大小
(b)用至少一种淀粉酶和至少一种酯酶液化步骤(a)的产物；
(c)用碳水化合物产生酶糖化步骤(b)中所获得的液化物质；和
(d)使用发酵微生物来发酵糖化的物质。
优选实施方案中，减小含淀粉物质的大小，优选通过干磨。根据本发明 进行步骤(b)。分开或同时进行步骤(c)和(d)(SSF方法)。
本发明还提供了生产发酵产品如乙醇的方法，包括
(a)减小含淀粉物质的大小
(b)i)用至少一种酯酶预处理所述含淀粉物质的浆液，和
ii)用α-淀粉酶液化预处理的浆液
(c)用碳水化合物产生酶来糖化步骤(b)中所获得的液化物质；和
(d)使用发酵微生物来发酵糖化的物质。
可以根据本发明的液化方法进行步骤(b)和(c)。分开或同时进行步 骤(c)和(d)(SSF方法)。
发明描述
本发明提供了改良的液化方法，该方法适于用作生产如糖浆或发酵产品 方法中的一个步骤。作为本发明方法的结果，防止或至少降低了凝沉淀粉 的形成，并因此从含淀粉原材料中释放出更多的碳水化合物。
原料
减小含淀粉原料的大小，优选通过干磨。干磨方法是本领域公知的，通 常包括在干或基本上干的状态下研磨/磨碎含淀粉物质如全谷物或整谷粒的 步骤。然而，其他能够减小含淀粉物质大小的技术也被考虑到并落入本发 明范围之内。
乙醇生产中，干磨通常包括研磨(grinding)/磨碎(milling)全谷物或 整谷粒来产生粗粉，使粗粉接受液化，糖化，发酵和任选地例如通过蒸馏 收集的步骤。
通常基于所需的发酵产品和所使用的方法来选择原料。适用于本发明方 法中的原料实例包括：含淀粉原料，如块茎，根，全谷物或整谷粒，谷类 玉米，玉米穗轴(cob)，小麦，大麦，黑麦，高粱或谷类，含糖原料，如 糖蜜，水果物质，糖，甘蔗或甜菜，马铃薯，和含纤维素物质，如木质或 植物残余物。含淀粉的整谷粒(corn grain)是本发明的生产液化和发酵产 品如的方法的优选原料。
发酵产品
根据本发明，可能的发酵产品包括醇类(例如，乙醇，甲醇，丁醇，1，3- 丙二醇)；有机酸(例如柠檬酸，醋酸，衣康酸，乳酸，葡糖酸，葡糖酸 盐或酯(gluconate)，乳酸，琥珀酸，2，5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如丙 酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)和更复杂的化合物， 包括例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12， β-胡萝卜素)；和激素。
液化
本发明者已经发现通过用至少一种α-淀粉酶和至少一种麦芽糖淀粉酶 或者用至少一种淀粉酶和至少一种酯酶处理所述的含淀粉物质可以提高含 淀粉物质的液化。
因此本发明的第一个方面中提供了液化含淀粉物质的方法，包括用至少 一种α-淀粉酶和至少一种麦芽糖淀粉酶处理所述含淀粉物质的步骤。 根据本发明的第二个方面，提供了液化含淀粉物质的方法，包括用至少 一种淀粉酶和至少一种酯酶处理含淀粉物质的步骤。
不受限于任何理论，认为用淀粉酶和酯酶的组合物处理减少了凝沉淀粉 的形成。认为酯酶攻击例如干磨的含淀粉物质如玉米中存在的脂质来产生 较小的分子，该较小的分子较少产生蒸汽蒸煮过程中形成的称为凝沉淀粉 的淀粉-脂质复合物。此外酯酶催化树枝体(dendrimer)和可溶性淀粉链之 间在油界面发生的反应来形成新的结构以防止蒸汽蒸煮和液化过程中形成 的脂质-淀粉复合物。还可以减少进行液化所需的淀粉酶量。
根据本发明，“液化”是其中含淀粉物质，优选(整)谷物颗粒(grain) 原料分裂(水解)成麦芽糖糊精(糊精)的过程。根据本发明，通过将 20-40wt％，优选25-35wt％含淀粉物质的浆液和水加热至20-105℃，优选 60-95℃并加入酶来启动液化(稀化(thinning))来进行液化。然后将浆液在 95-140℃，优选105-125℃的温度下进行蒸汽蒸煮来完成浆液的糊化。然后 将浆液冷却至60-95℃，并加入更多的酶来完成水解(第二次液化)。
本发明的一个实施方案中，以多阶段过程如三阶段过程来进行液化，其 中第一阶段在80至105℃的范围进行，第二阶段在65至95℃的温度范围， 和第三阶段在40-75℃的温度。
优选实施方案中，在以下的温度阶段进行三个阶段：第一阶段：80-95℃， 第二阶段：75-85℃，和第三阶段：60至70℃。根据本发明，第一阶段的保 温时间为10至90分钟，第二阶段为30-120分钟，第三阶段为30-120分钟。
本发明的液化方法通常在pH4.5-6.5，尤其是5至6的pH进行。
淀粉酶可以是任何淀粉酶，优选以下“淀粉酶”部分中提及的淀粉酶。 优选实施方案中，淀粉酶是α-淀粉酶和/或麦芽糖淀粉酶。酯酶可以是任何 酯酶，优选“酯酶”部分中提及的酯酶。优选的酯酶是脂酶，磷脂酶和角 质酶，或其混合物。可以在脂肪酸氧化酶(fatty acid oxidizing enzymes)， 优选脂肪氧合酶(lipoxygenase)的存在下，进行本发明的液化方法或本发 明的预处理步骤，如以下的“脂肪酸氧化酶”部分中进一步限定的。
一个实施方案中，液化过程包括步骤：
I)用至少一种酯酶预处理含淀粉物质的浆液和
ii)用α-淀粉酶液化预处理的浆液。
优选减小预处理物质的大小，优选通过干磨。如上所述，可以以三阶段 热浆液过程来进行液化。本发明的一实施方案中，在预处理过程中将酯酶 和麦芽糖淀粉酶一起使用。另一个实施方案中，在预处理过程中存在酯酶， 麦芽糖淀粉酶和α-淀粉酶。进一步的实施方案中，在预处理过程中存在酯 酶，麦芽糖淀粉酶和碳水化合物源产生酶，如葡糖淀粉酶和可选的真菌酸 性α-淀粉酶。
本发明方法的另一个实施方案中，用酯酶，麦芽糖淀粉酶和/或α-淀粉 酶处理来液化例如通过干磨减小大小的含淀粉物质，经过或不经过预处理。
优选的实施方案中，通过使优选的例如通过干磨减小大小的含淀粉物质 的含水浆液经受：酯酶，优选脂酶；麦芽糖淀粉酶；和α-淀粉酶，优选酸 性淀粉酶，如真菌酸性α-淀粉酶来进行预处理，接着用α-淀粉酶液化。
优选在20-105℃，优选60-95℃温度范围的含水热浆液中进行处理。
发酵产品方法
本发明的发酵产品如乙醇的生产方法通常包括减小含淀粉物质原料的 大小，例如通过干磨，液化，糖化，发酵和任意地例如通过蒸馏收集的步 骤。生产发酵产品如乙醇的生产方法中，减小含淀粉的原料如全谷物或整 谷粒优选玉米的大小，例如通过干磨，以便打开结构并允许进一步的处理。 一方面中，本发明提供了生产发酵产品如乙醇的方法，包括
(a)减小含淀粉物质的大小
(b)用至少一种α-淀粉酶和至少一种麦芽糖淀粉酶来液化步骤(a)的 产物；
(c)用碳水化合物源产生酶来糖化步骤(b)中获得的液化物质；和
(d)使用发酵微生物来发酵糖化的物质。
可以根据本发明的液化方法来进行步骤(b)。
另一方面中，本发明提供了生产发酵产品如乙醇的方法，包括
(a)减小含淀粉物质的大小；
(b)用至少一种淀粉酶和至少一种酯酶液化步骤(a)的产物；
(c)用碳水化合物源产生酶来糖化步骤(b)中所获得的液化物质；和
(d)使用发酵微生物来发酵糖化的物质。
可以根据本发明的液化方法来进行步骤(b)。
再一方面中，本发明提供了生产发酵产品如乙醇的方法，包括
(a)减小含淀粉物质的大小
(b)i)用至少一种酯酶预处理所述含淀粉物质的浆液
ii)用α-淀粉酶液化预处理的浆液。
(c)用碳水化合物产生酶来糖化步骤(b)中所获得的液化物质；和
(d)使用发酵微生物来发酵糖化的物质。
根据本发明的液化方法来进行步骤(b)。顺序或同时进行步骤(c)和 (d)(SSF方法)。
发酵步骤后可以是任选的收集，如发酵产品的蒸馏。
糖化
“糖化”是其中麦芽糖糊精(如来自液化过程的产物)转化成可以通过 发酵微生物如酵母代谢的低分子糖DP1-3(即碳水化合物源)的步骤。可以 使用本领域共知的糖化步骤来进行本发明发酵产品生产过程中的糖化步 骤。通常使用至少一种或多种碳水化合物源产生酶如葡糖淀粉酶来酶促进 行糖化。本发明生产乙醇方法中的糖化步骤可以是本领域中公知的糖化步 骤。一个实施方案中，将葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶用于 处理液化的含淀粉物质。完全糖化步骤可持续达约24至约72小时或更长 时间，且通常在约30至65℃的温度和4至5的pH下进行，通常约pH4.5。 然而，更优选的是进行预糖化步骤，在30-65℃的温度，通常约60℃持续约 40至90分钟，接着完成同时糖化和发酵方法(SSF方法)的发酵过程中的 糖化。乙醇生产中，通常以同时糖化和发酵(SSF)方法来进行糖化，其中 不存在糖化的保温阶段，意味着一起加入发酵微生物如酵母和酶。SSF方法 中，通常就在发酵之前，引入例如高于50℃温度的预糖化步骤。
发酵
乙醇生产中，发酵微生物优选是酵母，将其施加到糖化的醪液。“发酵 微生物”指的是适用于所需发酵过程中的任何微生物。根据本发明的合适 发酵微生物能够将糖如葡萄糖或麦芽糖直接或间接发酵即转化成所需的发 酵产品。发酵微生物的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵 母属(Saccharomyces)的一些种，尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。可购得的酵母包括，例如，RED STAR/Lesaffre ETHANOL RED (从Red Star/Lesaffre，USA获得)，FALI(从Fleischmann’s Yeast，Burns Philp Food Inc的分部，USA获得)，SUPERSTART(从Altech获得)， GERT STRAND(从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOL(从DSM Specialties获得)。优选实施方案中，将酵母施加至醪液，且将发酵进行24-96 小时，如通常35-60小时。优选实施方案中，温度通常为26-34℃，尤其是 约32℃，且pH通常为3-6，优选约pH4-5。酵母细胞的优选应用量为每mL 发酵液105至1012个活酵母数，优选107至1010，尤其是5×107。在乙醇产 生阶段的过程中，酵母细胞数优选为107至1010，尤其是约2×108。关于酵 母用于发酵的更多指导可以在例如“The alcohol Textbook”(编辑 K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall，Nottingham University Press，United Kingdom 1999)中找到，在此将其引入作为参考。
收集
发酵后，通过例如蒸馏来收集醪液来提取发酵产品，如醇类产品(尤其 是乙醇)。在其中终产品是乙醇的情况中，可以将其用作例如燃料乙醇； 饮用乙醇，即，适于饮用的酒精(potable neutral spirits)；或工业乙醇。
淀粉转化
用于生产糖浆如葡萄糖，麦芽糖，寡聚麦芽糖(malto-oligosaccharides) 和寡聚异麦芽糖(isomalto-oligosaccharides)的传统淀粉转化过程中也可以 包括本发明的液化方法。
淀粉酶
合适的淀粉酶包括α-淀粉酶，β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶，或其混合物。
α-淀粉酶
根据本发明，优选的α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。
一个实施方案中，α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶，如，来源自地衣芽孢 杆菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂 肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株。其他α-淀粉酶包括来源自芽孢 杆菌NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM 9375菌株的α-淀粉酶， 所有这些都被详细描述于WO95/26397中，和Tsukamoto等，Biochemical and Biophysical Research Communications，151(1988)，pp.25-31中所述的α- 淀粉酶。
α-淀粉酶还可以是变体和/或杂交体，尤其是WO96/23873，WO96/23874， WO97/41213，WO99/19467，WO00/60059和WO02/10355任一中所述的一 种(所有文献在此引入作为参考)。特别考虑的α-淀粉酶变体描述于美国 专利No.6,093,562，6,297,038或美国专利No.6,187,576中(在此引入作为参 考)并包括在位置R179至G182缺失一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆 菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选公开于WO1996/023873中的双缺 失-参见例如第20页第1-10行(在此引入作为参考)，与WO99/19467所 公开的SEQ ID NO：3中所示的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比较优 选对应于Δ(181-182)，或缺失氨基酸R179和G180，使用WO99/19467 中SEQ ID NO：3的编号(在此引入作为参考)。更优选的是芽孢杆菌α- 淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与WO99/19467所公开的SEQ ID NO：3中所示的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比较，其具有对应于Δ (181-182)的双缺失且进一步包括N193F取代(也称为 1181*+G182*+N193F)。
特别考虑的α-杂交淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(显示于 WO99/19467的SEQ ID NO：4中)的445个C-端氨基酸残基，和来源自解 淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(显示于WO99/19467的SEQ ID NO：5中)的 37个N-端氨基酸残基，并具有以下取代： G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用 WO99/19467的SEQ ID NO：4的编号)。尤其优选的是具有下列突变H154Y， A181T，N190F，A209V和Q264S的一个或多个的变体和/或在位置176和 179之间缺失两个残基的变体，优选缺失E178和G179(使用WO99/19467 的SEQ ID NO：5的编号)。
其他考虑的细菌α-淀粉酶是EP1022334中公开的KSM-K36α-淀粉酶并 作为FREM BP6945保藏，和EP1022334中公开的KSM-K38α-淀粉酶并作 为FERM BP-6946保藏。因此还考虑变体，尤其是WO02/31124中公开的变 体(来自Novozymes A/S)。
其他α-淀粉酶包括来源自曲霉属(Aspergillus)菌株如米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)的α-淀粉酶。优选实施方案中，α-淀 粉酶是酸性α-淀粉酶。更优选的实施方案中，酸性α-淀粉酶是酸性真菌α- 淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。更优选，酸性α-淀粉酶是来源自曲霉属的酸 性真菌α-淀粉酶。可购得的酸性真菌淀粉酶是SP288(从Novozymes A/S， Denmark获得)。
一个实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意 思是这样的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在3.0至7.0，优选3.5至6.0，或 更优选4.0-5.0范围的pH下以有效量加入时具有活性。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是芬加密尔(Fungamyl)样α-淀粉酶。本发明 的公开内容中，术语“芬加密尔样α-淀粉酶”表示与WO96/23874中SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列呈现高度同一性，即高于50％，55％，60％， 65％，70％，75％，80％，85％，90％，95或甚至99％相同的α-淀粉酶。当 用作麦芽糖产生酶时，真菌α-淀粉酶的加入量可以为0.001-1.0AFAU/g DS， 优选0.002-0.5AFAU/g DS，优选0.02-0.1AFAU/g DS。
优选的α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，优选来自曲霉属，优选是黑曲霉种。 优选实施方案中，酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的一种，在 Swiss-prot/TeEMBL数据库公开为“AMYA_ASPNG”，主要登录号为 no.P56271。还考虑一系列具有与此至少70％同一性的酸性真菌淀粉酶变体， 如至少80％或甚至至少90％同一性。
其他涉及的α-淀粉酶包括WO2005/003311(在此引入作为参考)中所 公开的杂交α-淀粉酶。
优选的包括α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM的MYCOLASETM； BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETMX和SANTMSUPER，来自Novozymes A/S Denmark的SANTM EXTRA L，和CLARASETML-40,000，DEX-LOTM，SPEYME FRED，SPEZYMETM AA和SPEZYMETMDELTA AA(Genencor Int，USA)，和以商品名称SP288销售的的酸性α- 淀粉酶(从Novozymes A/S，Denmark可获得)。
α-淀粉酶的加入量是本领域公知的。以AUU单位测量时，酸性α-淀粉 酶活性优选存在量为5-50,0000AAU/kgDS，以500-50,000AAU/kg DS的量， 或更优选100-10,000AAU/kg DS的量，如500-1,000AAU/kg DS。真菌酸性 α-淀粉酶的优选加入量为10-10,000AFAU/kg DS，500-2,500AFAU/kg DS 的量，更优选100-1,000AFAU/kg DS的量，如约500AFAU/kg DS。
麦芽糖淀粉酶
淀粉酶还可以是麦芽糖α-淀粉酶。“麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α- 麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构象的 麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的麦芽糖α-淀粉酶以商品 名MALTOGENASETM可从Novozymes A/S购得。麦芽糖α-淀粉酶描述于美 国专利No.4,598,048，4,604,355和6,162,628中，在此将其引入作为参考。
酯酶
如在此所用的，“酯酶”也称为羧酸酯水解酶，指的是作用于酯键的酶， 并包括根据酶命名法(分别可从http：//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme 或来自Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego，California，增 补1(1993)，增补2(1994)，增补3(1995)，增补4(1997)和增补5， Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J. Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250；1-6和Eur.J.Biochem. 1999，264，610-650获得)归类于E.C.3.1.1羧酸酯水解酶的酶。酯酶的非限 制性实例包括芳基酯酶，三酰基甘油脂酶，乙酰酯酶，乙酰胆碱酯酶，胆 碱酯酶，托品酯酶，果胶酯酶，固醇酯酶，叶绿素酶，L-阿拉伯内酯酶，葡 糖酸内酯酶，糖醛酸内酯酶(uronolactonase)，鞣酸酶，视黄基-棕榈酰酯 酶，羟丁酯-二聚物水解酶，酰基甘油脂酶，3-氧己二酸烯醇内酯酶，1，4- 内酯酶，半乳糖脂酶，4-吡哆醇内酯酶，酰基肉毒碱水解酶，氨酰-tRNA水 解酶，D-阿拉伯内酯酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，磷脂酶A1，6-乙酰葡糖脱 乙酰酶，脂蛋白脂酶，二氢香豆素脂酶，柠檬苦素-D-环-内酯酶，类固醇内 酯酶，三乙酸-内酯酶(triacetate-lactonase)，放线菌素内酯酶，苔色素酸- 缩酚酸(orsellinate-depside)水解酶，头孢菌素C脱乙酰酶，绿原酸酯水解 酶，α-氨基酸酯酶，4-草酰乙酸甲酯酶，羧甲烯丁烯羟酸内酯酶 (Carboxymethylenebutenolidase)、，deoxylimonate-A-环-内酯酶，2-乙酰-1- 烷基甘油磷酸胆碱酯酶，镰刀霉氨酸-C鸟氨酸酯酶，芥子酸胆碱酯酶，蜡 酯水解酶，佛波醇-二酯水解酶，磷脂酰肌醇脱乙酰酶，唾液酸O-乙酰酯酶， 乙酰氧丁炔基并噻吩脱乙酰酶(acetoxybutynylbithiophene deacetylase)，乙 酰水杨酸脱乙酰酶，甲基伞形基乙酸脱乙酰酶(methylumbelliferyl-acetate deacetylase)，2-吡喃酮-4，6-二羧酸内酯酶，N-乙酰半乳糖胺聚糖脱乙酰酶， 保幼激素酯酶，双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯酶，蛋白质-谷氨酸甲基酯 酶，11-顺-视黄基-棕榈酸水解酶，全-反-视黄基棕榈酸水解酶，L-鼠李糖酸 -1，4-内酯酶，5-(3，4-二乙酰氧基丁-1-炔基)-2，2’-并噻吩脱乙酰酶，脂肪酰基 乙酯合成酶，木糖酸-1，4-内酯酶，N-乙酰葡糖胺磷脂酰肌醇脱乙酰酶，西 曲酸苯甲酯酶(cetraxate benzylesterase)，乙酰烷基甘油乙酰水解酶和乙酰 木聚糖酯酶。
本发明中所用的优选酯酶是脂肪分解酶，如脂酶(归类于E.C.3.1.1.3， EC3.1.1.23和/或EC3.1.1.26)和磷脂酶(归类于EC3.1.1.4和/或EC3.1.1.32， 包括归类于EC3.1.1.5的溶血磷脂酶)。其它优选的酯酶是角质酶(归类于 EC3.1.1.74)。
酯酶有效量的实例是0.01至400LU/g DS(干固体)。优选，酯酶的使 用量为0.1至100LU/g DS，更优选为0.5至50LU/g DS，更优选为1至20 LU/g DS。此后可以使用本领域已知的标准技术来获得酯酶含量的进一步优 化。
优选实施方案中，酯酶是脂肪分解酶，更优选是脂酶。如在此所用的， “脂肪分解酶”指的是脂酶和磷脂酶(包括溶血-磷脂酶)。脂肪分酶优选 是微生物来源的，尤其是细菌、真菌或酵母来源的。所用的脂肪分解酶可 以来源自任何来源，包括，例如，犁头霉属(Absidia)的菌株，尤其是Absidia blakesleena和伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)；无色杆菌属 (Achromobacter)的菌株，尤其是解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)； 气单胞菌属(Aeromonas)的菌株；链格孢属(Alternaria)的菌株，尤其是 甘蓝链格孢(Alternaria brassiciola)；曲霉属的菌株，尤其是黑曲霉和黄曲 霉(Aspergillus flavus)；无色杆菌属的菌株，尤其是解毒无色杆菌；短梗 霉属(Aureobasidium)的菌株，尤其是出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)； 芽孢杆菌属的菌株，尤其是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，嗜热脂肪芽 孢杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；白僵菌属(Beauveria)的菌株； 索丝菌属(Brochothrix)的菌株，尤其是热杀索丝菌(Brochothrix thermosohata)；假丝酵母属(Candida)的菌株，尤其是柱状假丝酵母(Candida cylindracea(Candida rugosa))，Candida paralipolytica，和南极假丝酵母 (Candida antarctica)；色杆菌属(Chromobacter)的菌株，尤其是粘稠色 杆菌(Chromobacter viscosum)；鬼伞属(Coprinus)的菌株，尤其是Coprinus cinerius；镰孢菌属(Fusarium)的菌株，尤其是尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)，腐皮镰孢菌(Fusarium solani)，豌豆腐皮镰孢菌(Fusarium solani pisi)和大刀玫瑰色镰孢菌(Fusarium roseum culmorum)；地霉属 (Geotricum)的菌株，尤其是潘氏地霉(Geotricum penicillatum)；汉逊氏 酵母属(Hansenula)的菌株，尤其是异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)； 腐殖霉属(Humicola)的菌株，尤其是Humicola brevispora，Humicola brevis var.thermoidea，和Humicola insolens；Hyphozyma的菌株；乳杆菌属 (Lactobacillus)的菌株，尤其是弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)；绿 僵菌属(Metarhizium)的菌株；毛霉属(Mucor)的菌株；拟青霉属 (Paecilomyces)的菌株；青霉属(Penicillium)的菌株，尤其是圆弧青霉 (Penicillium cyclopium)，皮落青霉(Penicillium crustosum)和扩展青霉 (Penicillium expansum)；假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株，尤其是铜 绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(同，洋葱伯克霍尔 德氏菌(Burkholderia cepacia))，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)， 莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)，嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)，门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)，脂解臭味假单 胞菌(Pseudomonas mephitica lipolytica)，产碱假单胞菌，植物假单胞菌 (Pseudomonas plantari)，类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri)和Pseudomonas wisconsinensis；丝核菌属 (Rhizoctonia)的菌株，尤其是腐皮丝核菌(Rhizoctonia solani)；根毛霉 属(Rhizomucor)的菌株，尤其是米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)；根霉 菌属(Rhizopus)的菌株，尤其是日本根霉(Rhizopus japonicus)，小孢根 霉(Rhizopus microsporus)和结节根霉(Rhizopus nodosus)；红冬孢酵母 属(Rhodosporidium)的菌株，尤其是念珠红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；红酵母属(Rhodotorula)的菌株，尤其是粘红酵母(Rhodotorula glutinis)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)的菌株，尤其是Sporobolomyces shibatanus；高温霉属(Thermomyces)的菌株，尤其是绵状高温霉 (Thermomyces lanuginosus)(之前为Humicola langinosa)；Thiarosporella 的菌株，尤其是Thiarosporella phaseolina；木霉属(Trichoderma)的菌株， 尤其是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和里氏木霉(Trichoderma reesei)； 和/或轮枝孢菌属(Verticillium)的菌株。
优选实施方案中，脂肪分解酶来源自曲霉属的菌株，无色杆菌属的菌株， 芽孢杆菌属的菌株，假丝酵母属的菌株，色杆菌属的菌株，镰孢菌属的菌 株，腐殖霉属的菌株，Hyphozyma的菌株，假单胞菌属的菌株，根毛霉属 的菌株，根霉属的菌株或高温霉属的菌株。
更优选的实施方案中，脂肪分解酶是脂酶。在此可利用脂酶改变例如来 自玉米基质的发酵培养基(包括发酵酵母)中的甘油三酯油脂(triglyceride oils and fats)的结构和组成的能力。脂酶催化不同类型的甘油三酯转化，如 水解，酯化和酯交换。合适的脂酶包括酸性，中性和碱性脂酶，如本领域 公知的，尽管与中性或碱性脂酶相比较，酸性脂酶(如例如脂酶GAMANO 50，从Amano可获得)似乎在较低的脂酶浓度更有效。用于本发明中的优 选脂酶包括南极假丝酵母脂酶和柱状假丝酵母脂酶。更优选的脂酶是纯化 的脂酶，如南极假丝酵母脂酶(脂酶A)，南极假丝酵母脂酶(脂酶B)， 柱状假丝酵母脂酶，和卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂酶。
所述脂酶可以是EP258,068-A中公开的一种脂酶，或可以是脂酶变体， 如WO00/60063或WO00/32578(在此将其引入作为参考)中所公开的变体。 优选的商业脂酶包括LECITASETM，LIPOLASETM，LIPEXTM和NOVOZYM 735(从Novozymes A/S，Denmark可获得)和G AMANOTM50(从Amano 可获得)。
脂酶优选的加入量为约1至400LU/g DS，优选1至10LU/g DS，更优 选1至5LU/g DS。
本发明的另一优选实施方案中，所述至少一种酯酶是角质酶。角质酶是 能够降解角质的酶。角质酶可以来源自任何来源。优选的实施方案中，角 质酶来源自曲霉属的菌株，尤其是米曲霉；链格孢属的菌株，尤其是甘蓝 链格孢菌；镰孢菌属的菌株，尤其是腐皮镰孢菌，豌豆腐皮镰孢菌，大刀 玫瑰色镰孢菌或接骨木玫瑰色镰孢菌(Fusarium roseum sambucium)；长蠕 孢属(Helminthosporum)的菌株，尤其是蒜头长蠕孢(Helminthosporum sativum)；腐殖霉属的菌株，尤其是Humicola insolens，假单胞菌属的菌株， 尤其是门多萨假单胞菌或恶臭假单胞菌，丝核菌属的菌株，尤其是腐皮丝 核菌；链霉菌属(Streptomyces)的菌株，尤其是疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)；或单格孢霉(Ulocladium)，尤其是Ulocladium consortiale。最 优选的实施方案中，角质酶来源自Humicola insolens，尤其是Humicola insolens DSM 1800菌株。Humicola insolens角质酶描述于WO96/13580中， 在此将其引入作为参考。角质酶可以是变体，如WO00/34450和WO01/92502 (在此将其引入作为参考)中公开的变体的一种，。优选的角质酶变体包 括WO01/92502的实施例2中所列的变体，在此特意将其引入作为参考。角 质酶的有效量为0.01至400LU/g DS，优选约0.1至100LU/g DS，更优选1 至50LU/g DS。此后可以使用本领域已知的标准方法来获得角质酶含量的 进一步优化。
另一优选实施方案中，所述至少一种酯酶是磷脂酶。如在此所用的，术 语磷脂酶是具有对于磷脂活性的酶。磷脂，如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由外 部(sn-1)和中间(sn-2)位置被两个脂肪酸酯化、第三个位置被磷酸酯化 的甘油构成；磷酸可以进而被酯化成氨基醇。磷脂酶是参与磷脂水解的酶。 可以鉴别出几种类型的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其水解一个脂肪 酰基(分别在sn-1和sn-2位置)来形成溶血磷脂；和溶血磷脂酶(或磷脂 酶B)，其水解溶血磷脂中剩余的脂肪酰基。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸 二酯酶)分别释放二酰基甘油或磷脂酸。
术语磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶，例如，磷脂酶A(A1或A2)， 磷脂酶B活性，磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。在此结合本发明的酶所使 用的术语“磷脂酶A”意在涵盖具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。 可以通过具有其他活性的酶以及如例如具有磷脂酶活性的脂酶来提供磷脂 酶活性。磷脂酶活性可以例如来自具有磷脂酶副活性(side activity)的脂酶。 本发明的其他实施方案中，由基本上只具有磷脂酶活性的酶来提供磷脂酶 活性，且其中磷脂酶活性不是副活性。
磷脂酶可以是任何来源的，例如动物来源(如例如哺乳动物)，例如来 自胰腺(例如，牛或猪胰腺)，或蛇毒或蜂毒。或者，磷脂酶可以是微生 物来源的，例如，来自丝状真菌，酵母或细菌，如曲霉属或种，例如，黑 曲霉；网柄菌属(Dictyostelium)，例如D.discoideum；毛霉属，例如爪哇 毛霉(M.javanicus)，大毛霉(M.mucedo)，细胞毛霉(M.subtilissimus)； 脉孢霉属(Neurospora)，例如粗糙脉孢霉(N.crassa)；根毛霉属，例如 R.pusillus；根霉属，例如无根根霉(R.arrhizus)，日本根霉，葡枝根霉 (R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，例如大豆核盘菌(S.libertiana)； 发癣菌属(Trichophyton)，例如深红色发癣菌(T.rubrum)；Whetzelinia， 例如W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)， 枯草芽孢杆菌；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌 (C.freundii)；肠杆菌属(Enterbacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)， 阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华氏 菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)； 埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠埃希氏菌(E.coli)；克雷伯氏菌 (Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变性菌属(Proteus)， 例如普通变性菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，例如斯 氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙 门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如液化沙雷氏菌 (S.liquefasciens)，粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)， 例如弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如紫红链 霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔 森氏菌(Y.enterocolitica)。因此，磷脂酶可以是真菌的，例如来自核菌纲 (Pyrenomycetes)，如镰孢菌属，如大刀镰孢菌，异孢镰孢菌 (F.heterosporum)，腐皮镰孢菌的菌株，或尖孢镰孢菌菌株。磷脂酶还可 以来自曲霉属中的丝状真菌菌株，如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，臭 曲霉(Aspergillus foetidus)，日本曲霉，黑曲霉或米曲霉的菌株。优选的 商业磷脂酶包括LECITASETM和LECITASETMULTRA(从NovozymesA/S， Denmark可获得)。
磷脂酶的有效量为0.01至400LU/g DS，优选约0.1至100LU/g DS，更 优选1至50LU/g DS。此后可以使用本领域已知的标准方法来获得磷质酶 含量的进一步优化。
脂肪酸氧化酶
术语“脂肪酸氧化酶”意思是至少一种这样的酶。
本发明的内容中，“脂肪酸氧化酶”是水解底物亚油酸比水解底物丁香 醛连氮更高效的酶。“更高效”的意思是具有更高的反应速率。这可以使 用WO03/035972(在此引入作为参考)的实施例2中所述方法来测试，并 计算(1)对底物亚油酸每分钟提高的吸收值(234nm处的吸收值)，和(2) 对底物丁香醛连氮每分钟提高的吸收值(530nm处的吸收值)之间的差异， 即计算反应速率差异(RRD)＝(d(A234)/dt-d(A530)/dt)。如果RRD 高于零，所述的酶取得在此所定义的脂肪酸氧化酶的资格。如果RRD是零， 或低于零，所述的酶不是脂肪酸氧化酶。
具体的实施方案中，RRD为至少0.05，0.10，0.15，0.20或至少0.25吸 收值单位/分钟。
具体的实施方案中，酶是清楚了解的。再进一步，对于WO03/035972 的实施例2的方法，调节酶剂量以获得234nm或530nm处每分钟最大的吸 收值提高。具体的实施方案中，最大的吸收值提高范围为0.05-0.50；0.07-0.4； 0.08-0.3；0.09-0.2；或0.10-0.25吸收值单位每分钟。酶剂量范围可以为例 如0.01-20；0.05-15；或0.10-10mg酶蛋白每ml。
或者，可以将“脂肪酸氧化酶”定义为能够比氧化丁香醛连氮更高效地 氧化不饱和脂肪酸的酶。可以在本申请实施例1中所述的标准血氧计装置 中在pH6和30℃下来比较酶的活性，包括丁香醛连氮或亚油酸作为底物。
具体的实施方案中，将脂肪酸氧化酶定义为归类于EC 1.11.1.3，或EC 1.13.11.-的酶。EC 1.13.11.-意思是其任何亚类，目前是四十九种：EC 1.13.11.1-EC 1.13.11.49。将EC 1.11.1.3命名为脂肪酸过氧化物酶，EC 1.13.1- 指作用于单个供体引入两个氧原子的加氧酶。
更具体的实施方案中，将EC 1.13.11.-酶归类于EC 1.13.11.12，EC 1.13.11.31，EC 1.13.11.33，EC 1.13.11.34，EC 1.13.11.40，EC 1.13.11.44或 EC 1.13.11.45，分别命名为脂肪氧合酶，花生四烯酸12-脂肪氧合酶，花生 四烯酸15-脂肪氧合酶，花生四烯酸5-脂肪氧合酶，花生四烯酸8-脂肪氧合 酶，亚油酸二醇酯合酶(linoleate diol synthase)，和亚油酸11-脂肪氧合酶。
脂肪酸氧化酶有效量的实例为0.001至400U/g DS(干固体)。优选， 脂肪酸氧化酶的使用量为0.01至100U/g DS，更优选0.05至50U/g DS， 再更优选0.1至20U/g DS。此后使用本领域已知的标准方法来获得脂肪酸 氧化酶含量的进一步优化。
脂肪氧合酶
优选的实施方案中，脂肪酸氧化酶是脂肪氧合酶(LOX)，归类于 EC1.13.11.12，其是催化多不饱和脂肪酸尤其是顺，顺-1，4-二烯例如亚油酸的 氧化并产生氢过氧化物的酶。但其他的底物也可以被氧化，例如单不饱和 脂肪酸。
微生物脂肪氧合酶可以来源自，例如，酿酒酵母，维氏高温放线菌 (Thermoactinomyces vulgaris)，尖孢镰孢菌，Fusarium proliferatum，绵状 高温霉，稻米梨孢霉(Pyricularia oryzae)和地霉属的菌株。来源自禾顶囊 壳(Gaeumannomyces graminis)的脂肪氧合酶的制备描述于WO02/20730 的实施例3-4中。来源自Magnaporthe salvinii的脂肪氧合酶在米曲霉中的 表达描述于WO02/086114的实施例2中，且可以使用标准方法来纯化这种 酶，如WO02/20730的实施例4中所述的。
脂肪氧合酶(LOX)还可以从植物种子中提取，如大豆，豌豆，鹰嘴豆 (chickpea)和菜豆(kidney bean)。或者，脂肪氧合酶可以从哺乳动物细胞 获得，例如，兔子的网织红细胞。
可以如“材料与方法”部分中所述的来测定脂肪氧合酶活性。
脂肪氧合酶(LOX)有效量的实例为0.001至400U/g DS(干固体)。 优选，脂肪氧合酶的使用量为0.01至100U/g DS，更优选0.05至50U/g DS， 再更优选0.1至20U/g DS。此后可以使用本领域已知的标准方法来获得脂 肪氧合酶含量的进一步优化。
碳水化合物源产生酶
术语“碳水化合物源产生酶”包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖产生者)，β- 淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖产生者)。碳水化合物源产生酶能够给 本发明方法中所用的发酵微生物提供能量用于产生乙醇和/或可以直接或间 接转化成所需的发酵产物，优选乙醇。碳水化合物源产生酶可以是属于定 义范围内的酶的混合物。特别考虑的混合物是至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶， 尤其是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。每葡糖淀粉 酶活性(AUG)的酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)之间的比例(AFAU每 AGU)在本发明的实施方案中为至少0.1，尤其是至少0.16，如0.12至0.50 的范围。
以下的部分列出了所涉及的葡糖淀粉酶，α-淀粉酶和β-淀粉酶的实例。
可以理解根据本发明所用的酶应当以有效量添加。
葡糖淀粉酶
根据本发明所用的葡糖淀粉酶可以来源自任何合适的来源，例如，来源 自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自曲霉属葡 糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Bole等，(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如WO92/00381，WO00/04136和 WO01/04273中所公开的(来自Novozymes，Denmark)；泡盛曲霉葡糖淀 粉酶(WO84/02921)，米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)， 或其变体或片段。
其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括提高热稳定性的变体：G137A和G139A (Chen等(1996)，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等 (1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301， 275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704)； 和在位置A435和S436引入Pro残基(Li等(1997)，Protein Engng.10， 1199-1204)。其他葡糖淀粉酶包括Athelia rolfsiis(之前命名为Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(参见美国专利No，4,727,026和(Nagasaka，Y.等，(1998) Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii(来自Corticium rolfsii的淀粉原料降解葡糖淀粉酶的纯化和 特性)，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330)，踝节菌属(Talaromyces) 葡糖淀粉酶，具体地来源自Talaromyces emersonii(WO99/28448)， Talaromyces leycettanus(美国专利No.Re.32,153)，Talaromyces duponti， 嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利No.4,587,215)。所考 虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是 C.theroamylolyticum(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum) (WO86/01831)。
可购得的包括葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER，SANTM EXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL， SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300 (来自Genencor Int)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)； G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
实施方案中，葡糖淀粉酶的加入量可以为0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10 AGU/g DS，如2AGU/g DS。
β-淀粉酶
至少根据本发明，β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)是给予外切作用(exo-acting) 的麦芽糖淀粉酶的传统命名，其催化直链淀粉，支链淀粉和相关葡萄糖聚 合物中的1，4-α-葡糖苷键的水解。麦芽糖单位以逐步的方式连续从非还原链 末端移除直至分子降解，或在支链淀粉的情况中，直至达到分支点。释放 的麦芽糖具有β异头构象，因此命名为β-淀粉酶。
已经从各种植物和微生物中分离出β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly， Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β- 淀粉酶的特征在于具有40℃至65℃的最佳温度，和4.5至7的最佳pH。可 购得的来自大麦的β-淀粉酶是来自Novozymes A/S，Denmark的 NOVOZYMTM WBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYMETM BBA 1500。
酶的产生
在此涉及的酶可以来源自或获得自任何合适的来源或，包括细菌，真菌， 酵母或哺乳动物来源。本文中术语“来源”(derived)意思从天然存在该 酶的生物体分离该酶，即，酶的氨基酸序列的同一性与天然酶相同。术语 “来源”还意味着酶可以在宿主生物体中重组产生，重组产生的酶具有与 天然酶相同的身份或具有改变的氨基酸序列，例如，具有一个或多个氨基 酸缺失，插入和/或取代，即重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或 片段，或是通过本领域已知的核酸改组(shuffling)方法产生的酶。天然酶 的意思范围内包括天然变体。此外，术语“来源”包括合成产生的酶，例 如通过肽合成。术语“来源”还包括已经改变的酶，例如通过糖基化，磷 酸化，或通过其他化学改变，不管是体内或体外。本文中术语“获得”(obtained) 的意思是所述酶具有与天然酶相同的氨基酸序列。该术语包括从天然存在 该酶的生物体分离的，或从重组表达该酶的同类或别种生物体分离的所述 酶，或合成生产的，例如通过例如肽合成生产的酶。对于重组生产的酶， 术语“获得”和“来源”指的是酶的身份(identity)而不是重组生产该酶宿主 生物体的身份。
酶还可以是纯化的。如在此所用的术语“纯化的”涵盖这样的酶，其来 源自微生物，而不具有该微生物的其他成分。术语“纯化的”还涵盖这样 的酶，其获得自天然生物体，而不具有该天然生物体的其他成分。酶可以 是纯化的，只具有少量的其他蛋白质存在。“其他蛋白质”的表述具体涉 及其他酶。如在此所用的术语“纯化的”还涉及除去其他成分，具体是其 他蛋白质，最具体地是存在于本发明的酶所来源的细胞中的其他酶。酶可 以是“基本上纯的”，即，没有产生其的生物体的其他成分，即，例如， 重组产生酶的宿主生物体。优选实施方案中，酶至少75％(w/w)纯，更优 选至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至 少98％或至少99％纯。另一优选实施方案中，酶是100％纯。
根据本发明所用的酶可以是适用于在此所述方法中的任何形式，如例如 干粉或颗粒，非粉化颗粒，液体，稳定化的液体，或受保护酶的形式。例 如美国专利No.4,106,991和4,661,452中所公开的来产生颗粒，并可以任选 地通过本领域已知的方法来包衣。例如可以根据确定的方法通过加入稳定 剂来稳定液体酶制剂，这些稳定剂如糖，糖醇或另一种多元醇，乳酸或另 一种有机酸。根据EP238,216中所公开的方法来制备受保护的酶。
尽管本发明方法内容中没有特意提及，可以理解以“有效量”来使用酶 或试剂。
材料与方法
酶：
α-淀粉酶A：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体： I181*+G182*+N193F，公开于美国专利No.6,187,576中并应要求可从 NovozymesA/S，Denmark获得。
麦芽糖淀粉酶A：来源自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖 淀粉酶，公开于美国专利No.4,598,048中并应要求可从NovozymesA/S， Denmark获得。
用于碘滴定方法的储液
0.1N I2
将1.3g I2和2.0g KI溶解于100mL去离子水中。
方法：
同源性(同一性)的测定
术语多肽“同源性”意思是两个氨基酸序列之间的同一性程度。通过本 领域已知的计算程序来适当地测定同一性，如，GCG程序包中提供的GAP (Program Manual for the Wisconsin Package，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711) (Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology， 48，443-453)。使用以下的设定来用于多肽序列比较：GAP形成罚分(creation penalty)3.0和GAP延伸罚分(extension penalty)0.1。
α-淀粉酶活性(KNU)
使用马铃薯淀粉作为底物来测定淀粉分解活性。该方法基于酶对变性马 铃薯淀粉的分解，反应后将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初，形成蓝 黑色，但在淀粉的分解过程中，蓝色变淡并逐渐转变成红棕色，与有色玻 璃标准相比较。
1个千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为标准条件下(即，37℃+/-0.05； 0.0003M Ca2+；和pH5.6)糊精化5260mg淀粉干物质Merck Amylum solubile 的酶含量。
更详细描述该分析方法的文件包EB-SM-0009.02/01应要求可以从 Novozymes A/S，Denmark获得，在此包括该文件作为参考。
FAU活性的测定
1个真菌α-淀粉酶单位(FAU)定义为每小时降解5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6，批号9947275)的酶含量，基于以下的标准条件：
底物 可溶性淀粉
温度 37℃
pH 4.7
反应时间 7-20分钟
酸性α-淀粉酶活性的测定(AFAU)
以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)来测量酸性α-淀粉酶活性，相对于 酶标准来测定。
所用的标准是AMG 300L(来自Novozymes A/S，Denmark，野生型黑 曲霉G1葡糖淀粉酶，还公开于Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102) 和WO92/00381)。该AMG中的中性α-淀粉酶在室温存储3周后从约1 FAU/mL跌落至低于0.05FAU/mL。
根据以下的描述来测定该AMG标准中的酸性α-淀粉酶活性。该方法中， 将1个AFAU定义为标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶含量。
碘与淀粉但不与降解产物形成蓝色的复合物。因此颜色的强度直接与淀 粉浓度成比例。在特定的分析条件下使用反比色法(reverse colorimetry)以 淀粉浓度的降低来测定淀粉酶活性。
α-淀粉酶
淀粉+碘 → 糊精+寡糖
40℃，pH2.5
蓝色/紫色(violet) t＝23秒 脱色(decoloration)
标准条件/反应条件： (每分钟)
底物： 淀粉，约0.17g/L
缓冲剂： 柠檬酸盐，约0.03M
碘(I2)： 0.03g/L
CaCl2： 1.85mM
pH： 2.50±0.05
培养温度： 40℃
反应时间： 23秒
波长： λ＝590nm
酶浓度： 0.025AFAU/mL
酶工作范围： 0.01-0.04AFAU/mL
这些优选的更多详细内容可在EB-SM-0259.02/01中找到，应要求可以 从Novozymes A/S，Denmark获得，并引入作为参考。
酸性α-淀粉酶单位(AUU)
可以以AUU(酸性α-淀粉酶单位)来衡量酸性α-淀粉酶活性，这是一 种绝对方法。1个酸性淀粉酶单位(AUU)是指这样的酶量：标准条件下每 小时将1g淀粉(100％干物质)转化成产物，该产物与已知浓度的碘溶液反 应后，与颜色基准在620nm具有相同的透射(transmission)。
标准条件/反应条件
底物： 可溶性淀粉，浓度约20g DS/L
缓冲剂： 柠檬酸盐，约0.13M，pH＝4.2
碘溶液： 40.176g碘化钾+0.088g碘/L
自来水 15°-20°dH(德国硬度)
pH： 4.2
培养温度： 30℃
反应时间： 11分钟
波长： 620nm
酶浓度： 0.13-0.19AAU/mL
酶工作范围： 0.13-0.19AAU/mL
淀粉应当是Lintner淀粉，这是实验室用作比色指示剂的稀糊淀粉。通 过稀释盐酸处理的天然淀粉来获得Lintner淀粉，使得其保留与碘产生蓝色 的能力。更多的详细内容可以在EP0140410B2中找到，在此包括其公开内 容作为参考。
葡糖淀粉酶活性(AGI)
葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡糖苷酶)将淀粉转化成葡萄糖。在此通过用 于活性测定的葡萄糖氧化酶方法来测定葡萄糖的量来。该方法描述于 Starch-Glucoamylase Method with Subsequent Measurement of Glucose with Glucose Oxidase(淀粉-葡糖淀粉酶方法，随后用葡萄糖氧化酶来测量葡萄 糖)“Approved methods of the American Association of Cereal Chemists” Vol.1-2 AACC，来自American Association of Cereal Chemists，(2000)；ISBN： 1-891127-12-8的部分76-11中。
1个葡糖淀粉酶单位(AGI)是在方法的标准条件下每分钟形成1微摩 尔葡萄糖的酶量。
标准条件/反应条件：
底物： 可溶性淀粉
浓度约16g干物质/L。
缓冲剂： 醋酸盐，约0.04M，pH＝4.3
pH： 4.3
培养温度： 60℃
反应时间： 15分钟
反应终止： 加入NaOH至浓度约为0.2g/L(pH～9)
酶浓度： 0.15-0.55AAU/mL。
淀粉应当是Lintner淀粉，这是实验室用作比色指示剂的稀糊 (thin-boiling)淀粉。通过稀释盐酸处理的天然淀粉来获得Lintner淀粉，使得 其保留与碘产生蓝色的能力。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为标准条件下每分钟水解1微摩 尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为：37℃，pH4.3，，底物：麦芽糖23.2mM， 缓冲剂：醋酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析仪系统。将变旋酶加入葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存 在的任何α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与以上提 及的反应中的β-D-葡萄糖反应，形成NADH，使用光度计在340nm处测定， 用来衡量初始葡萄糖浓度。 AMG培养： 底物： 麦芽糖23.2mM 缓冲剂： 醋酸盐0.1M pH： 4.30±0.05 培养温度： 37℃±1 反应时间： 5分钟 酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL 颜色反应： GlucDH： 430U/L 变旋酶： 9U/L NAD： 0.21mM 缓冲剂： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl pH： 7.60±0.05 培养温度： 37℃±1 反应时间： 5分钟 波长： 340nm
更详细描述该分析方法的文件包(EB-SM-0131.02/01)应要求可从 Novozymes A/S，Denmark获得，在此包括该文件作为参考。
角质酶活性(LU)
使用甘油三丁酸酯作为底物测定水解脂肪活性来测定角质酶活性。该方 法基于酶对甘油三丁酸酯的水解，并将碱消耗作为时间的函数来表示。1个 脂酶单位(LU)定义为标准条件下(即，30℃；pH7.0；使用阿拉伯胶作为 乳化剂和甘油三丁酸酯作为底物)每分钟释放1微摩尔可滴定丁酸的酶量。 更详细描述该分析方法的文件AF95/5应要求可从Novozymes A/S，Denmark 获得，在此包括该文件作为参考。
脂肪氧合酶活性
通过监控氢过氧化物的形成在25℃用分光光度法来测定脂肪氧合酶活 性。对于标准分析，将10微升酶加入1ml石英比色皿中，比色皿含有980 微升25mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)和10微升底物溶液(用0.2％(v/v)吐温 20分散的10mM亚油酸(不应长期保存))。通常通过将酶充分稀释来确 保在头一分钟内的转换最大为加入底物的10％。跟踪(follow)234nm处的吸 收值，并根据曲线的线性部分估算速率。假定顺-反-共轭(过氧)羟基脂肪 酸具有23,000M-1cm-1的分子消光系数。
标准碘滴定方法
将少量等份试样(10-20mL)的液化物质在试管中煮沸几分钟
在冰浴中冷却
加入10-12滴碘溶液
混合并将样品置于冰水中约10分钟
实施例
实施例1
用α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶液化
将α-淀粉酶A和麦芽糖淀粉酶A加入干磨碎玉米(30％固体)的浆液 中，加热至85℃并保持2小时。将该系统的物理效应与只用α-淀粉酶A进 行的液化相比较。
用α-淀粉酶A和麦芽糖淀粉酶A制得的醪液使用标准的碘滴定方法显 示出较少的凝沉淀粉，并具有较低的粘度。