抗NGF抗体及其使用方法本申请为2003年12月24日提交的，发明名称为“抗NGF抗体及其使用方法”的PCT申请PCT/US03/41252的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2005年8月23日，申请号为200380109933.4。
相关申请的交互参照
本申请要求美国临时专利申请系列号60/436,905，其申请日为2002年12月24日；美国临时专利申请系列号60/443,522，其申请日为2003年1月28日以及美国临时专利申请系列号60/510,006，其申请日为2003年10月8日的优先权，所有此类专利在此全部引用作为参考。
发明背景
本发明涉及抗NGF抗体(如抗NGF拮抗剂抗体)。本发明进一步涉及此类抗体在治疗和/或预防疼痛，包括手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛及骨关节炎疼痛的用途。
关于联邦资助研究或研发的声明
本发明是在由DARPA授予的，合同号为DAAD19-03-C-0006的美国政府支持下进行的。本发明中美国政府可具有某些权利。
发明背景
神经生长因子(NGF)是鉴定的第一种神经营养蛋白，并且它在外周及中枢神经元的发育及存活中的作用已表征。已显示NGF在外周交感神经元及胚胎感觉神经元的发育以及基底前脑胆碱能神经元的发育中为关键存 活及维持因子。Smeyne等人，Nature 368：246-249(1994)和Crowley等人，Cell 76：1001-1011(1994)。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay和Harmer，Nature 337：362-364(1989))并且它的活性通过两种不同的膜结合受体：TrkA受体及p75共同神经营养蛋白受体(有时分别称为“高亲和性”及“低亲和性”NGF受体)介导。Chao等人，Science 232：518-521(1986)。对关于NGF的综述，参见Huang等人，Annu.Rev.Neurosci.24：677-736(2001)；Bibel等人，Genes Dev.14：2919-2937(2000)。已确定了NGF及NGF与trkA受体复合体的晶体结构。参见Nature 254：411(1991)；Nature 401：184-188(1996)。
神经生长因子(NGF)是鉴定的第一种神经营养蛋白，并且它在外周及中枢神经元的发育及存活中的作用已表征。已显示NGF在外周交感及胚胎感觉神经元的发育以及基底前脑胆碱能神经元的发育中为关键存活及维持因子。(Smeyne等人，Nature 368：246-249(1994)和Crowley等人，Cell 76：1001-1011(1994))。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay等人，Nature 337：362-364(1989))并且它的活性通过两种不同的膜结合受体TrkA酪氨酸激酶受体及与肿瘤坏死因子受体家族其它成员结构相关的p75受体介导(Chao，等人，Science 232：518-521(1986))。
除了它在神经系统中的作用外，越来越多地显示NGF参与在神经系统外的过程。例如，显示NGF增强血管生渗透性(Otten，等人，Eur JPharmacol.106：199-201(1984))、增强T细胞及B细胞免疫反应(Otten，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10059-10063(1989))、诱导淋巴细胞分化及肥大细胞增殖并引起自肥大细胞释放可溶性生物信号(Matsuda，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6508-6512(1988)；Pearce，等人，J.Physiol.372：379-393(1986)；Bischoff，等人，Blood 79：2662-2669(1992)；Horigome，等人，J.Biol.Chem.268：14881-14887(1993))。虽然显示经外源性加入的NGF能具有所有这些作用，重要的是注意只很少显示内源性NGF在体内任何这些过程中是重要的(Torcia，等人，Cell.85(3)：345-56(1996))。因此，抑制内源性NGF的生物活性的作用(如果 存在的话)究竟如何是不清楚的。
NGF是由许多细胞类型产生的，这些细胞类型包括肥大细胞(Leon，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3739-3743(1994))、B淋巴细胞(Torcia，等人，Cell 85：345-356(1996)、角质细胞(Di Marco，等人，J.Biol.Chem.268：22838-22846)、平滑肌细胞(Ueyama，等人，J Hypertens.11：1061-1065(1993))、成纤维细胞(Lindholm，等人，Eur.J.Neurosci.2：795-801(1990))、支气管上皮细胞(Kassel，等人，Clin.Exp.Allergy31：1432-40(2001))、肾血管系膜细胞(Steiner，等人，Am.J.Physiol. 261：F792-798(1991))及骨骼肌肌管(Schwartz，等人，J Photochem.Photobiol.B66：195-200(2002))。在神经系统外的多种细胞型上发现NGF受体。例如，在人单核细胞、T淋巴细胞及B淋巴细胞以及肥大细胞上发现TrkA。
在人患者以及在一些动物模型中观察到NGF水平增加与多种炎性疾病之间相关。这些疾病包括系统性红斑狼疮(Bracci-Laudiero，等人，Neuroreport 4：563-565(1993))、多发性硬化症(Bracci-Laudiero，等人，Neurosci.Lett.147：9-12(1992))、牛皮癣(Raychaudhuri，等人，Acta Derm.l′enereol.78：84-86(1998))、关节炎(Falcim，等人，Ann.Rheum.Dis.55：745-748(1996))、间质性膀胱炎(Okragly，等人，J.Urology 161：438-441(1999))及气喘(Braun，等人，Eur.J Immunol.28：3240-3251(1998))。
同样，外周组织中NGF水平升高与痛觉过敏及炎症相关并在许多关节炎形式中观察到。患类风湿性关节炎患者的滑膜表达高水平的NGF，而报道非炎症患者的滑膜未检测到NGF(Aloe，等人，Arch.Rheum.35：351-355(1992))。在实验诱导类风湿性关节炎的大鼠中观察到相似结果(Aloe，等人，Clin.Exp.Rheumatol.10：203-204(1992))。已报道在转基因关节炎小鼠中NGF水平增加伴随着肥大细胞数目的增加(Aloe，等人，Int.JTissue Reactions-Exp.Clin.Aspects 15：139-143(1993))。PCT公开号WO 02/096458公开了某些特性的抗NGF抗体在治疗多种NGF相关疾病如炎性疾病(例如，类风湿性关节炎)中的用途。已报道经纯化抗NGF抗体 注射到携带人肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的关节炎转基因小鼠中引起肥大细胞数降低且关节炎小鼠滑膜中组胺及P物质水平降低(Aloe等人，Rheumatol.Int.14：249-252(1995))。已显示外源性施用NGF抗体使关节炎小鼠中升高的TNF-α水平被降低(Manni等人，Rheumatol.Int.18：97-102(1998))。
同样，在人骨关节炎软骨细胞中观察到表达增加的NGF及高亲和性的NGF受体(TrkA)(Iannone等人，Rheumatology 41：1413-1418(2002))。
已报道了啮齿动物的抗NGF拮抗剂抗体。参见，例如，Hongo等人，Hybridoma(2000)19(3)：215-227；Ruberti等人，(1993)Cell.Molec.Neurobiol.13(5)：559-568。然而，当啮齿动物抗体治疗性应用于人时，在许多经治疗个体中发生了人抗鼠抗体反应。此外，已证实小鼠抗体的效应子功能在人中效率较低。因此，非常需要抗NGF拮抗剂抗体，包括人源化抗NGF拮抗剂抗体。
文中公开的所有参考文献、公开及专利申请书因此全部引用作为参考。
发明概述
文中公开的本发明涉及神经生长因子抗体。
另一方面，本发明为人源化及亲和力成熟抗体E3，其特异结合人及啮齿动物神经生长因子(“NGF”)。E3重链及轻链可变区的氨基酸序列分别在图1A(SEQ ID NO：1)及1B(SEQ ID NO：2)中显示。抗体E3的CDR部分(包括Chothia及Kabat CDR)在图1A及1B中概要描述。E3重链及轻链以及个别延伸CDR也在以下显示(参见，以下的“抗体序列”)。
另一方面，本发明为包含抗体E3(文中互换称为“E3”)片段或区域的抗体。在一个实施方案中，片段为如图1B显示的抗体E3的轻链。在另一实施方案中，片段为如图1A显示的抗体E3的重链。在另一实施方案中，所述片段包含来自抗体E3轻链和/或重链的一个或多个可变区。又在另一实施方案中，所述片段包含来自如图1A及1B显示的抗体E3轻链和/或重链的一个或多个互补性决定区(CDR)。
另一方面，本发明为包含轻链的抗体，所述轻链由保藏号为ATCC NO.PTA-4893或ATCC NO.PTA-4894的宿主细胞产生的多核苷酸编码。另一方面，本发明为包含重链的抗体，所述重链由保藏号为ATCC NO.PTA-4895的宿主细胞产生的多核苷酸编码。另一方面，本发明为包含(a)及(b)的抗体，所述(a)为由保藏号为ATCC NO.PTA-4894或ATCC NO.PTA-4893的宿主细胞产生的多核苷酸编码的轻链，所述(b)为由保藏号为ATCC NO.PTA-4895的宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链(文中为了方便，由经保藏宿主细胞产生的多核苷酸指的是具有保藏号ATCC NO.PTA-4894、PTA-4893及PTA-4895)。另一方面，本发明为包含由保藏号为ATCC NO.PTA-4894或ATCC NO.PTA-4893的宿主细胞产生的多核苷酸编码的轻链的轻链可变区的抗体。另一方面，本发明为包含由保藏号为ATCC NO.PTA-4895的宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链的重链可变区抗体。另一方面，本发明为包含(a)和(b)的抗体，所述(a)为由保藏号为ATCC NO.PTA-4894或ATCC NO.PTA-4893宿主细胞产生的多核苷酸编码的轻链的轻链可变区，所述(b)为由保藏号为ATCC NO.PTA-4895宿主细胞产生的多核苷酸编码重链的重链可变区。又在一方面，本发明为包含由(a)和/或(b)编码的一个或多个CDR的抗体，所述(a)为由保藏号为ATCC NO.PTA-4894的宿主细胞产生的多核苷酸，所述(b)为由保藏号为ATCC NO.PTA-4895宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链。
在一些实施方案中，抗体包含人重链IgG2a恒定区。在一些实施方案中抗体包含人轻链κ恒定区。在一些实施方案中，抗体包含经修饰恒定区，如免疫惰性的恒定区，例如，其不引起补体介导的溶解，或不刺激依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在其它实施方案中，如在Eur.JImmunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请号PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请号9809951.8中描述的对恒定区进行修饰。在其它实施方案中，抗体包含包含以下突变的人重链IgG2a恒定区：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)。Eur.J Immunol.(1999)29： 2613-2624。
另一方面，本发明提供了包含以下任意一项或多项的多肽(其可为抗体或不为抗体)：a)图1A及1B中显示的抗体E3的一个或多个CDR；b)来自图1A中显示抗体E3重链的CDR H3；c)来自图1B中显示抗体E3轻链的CDR L3；d)来自图1B中显示抗体E3轻链的三个CDR；e)来自图1A中显示抗体E3重链的三个CDR；和f)来自图1A及1B中显示抗体E3轻链的三个CDR及重链的三个CDR。本发明进一步提供了包含以下任意一项或多项的多肽(其可为抗体或不为抗体)：a)衍生自图1A及1B中显示抗体E3的一个或多个(一个、二个、三个、四个、五个或六个)CDR；b)衍生自图1A中显示抗体E3重链CDR H3的CDR；和/或c)衍生自图1B中显示抗体E3轻链CDR L3的CDR。在一些实施方案中，CDR可为Kabat CDR、Chothia CDR或Kabat及Chothia CDR的组合(文中称为“延伸”或“组合”CDR)。在一些实施方案中，多肽(如抗体)结合NGF(如人NGF)。在一些实施方案中，多肽包含文中描述的任意CDF构型(包括组合、变体等)。
一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：9的重链可变区，其中I34为S、L、V、A或I；且N35用N、T或S替代。文中为了方便，上下文中或涉及氨基酸时“替代”或“为”指的是对给定位置的氨基酸选择。清楚地是，替代或选择，可为SEQ ID或图中描述的氨基酸。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：10的重链可变区，其中M50为M、I、G、Q、S或L；A62为A或S；且L63为L或V。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：11的重链可变区，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G且其中Y110为Y、K、S、R或T。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：11的重链可变区，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G且其中Y110为任意氨基酸。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：11的重链可变区，其中G98为G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99为G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G且Y110为任意氨基酸。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：12的轻链可变区，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y且H32为H、N或Q。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：13的轻链可变区，其中I51为I、T、V或A且S56为S或T。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：14的轻链可变区，其中S91为S或E；K92为K、H、R或S且Y96为Y或R。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：14的轻链可变区，其中S91为S或E；K92为任意氨基酸；T93为任意氨基酸且其中Y96为Y或R。
一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含含有SEQ ID NO：9中显示的氨基酸序列，其中I34为S、L、V、A或I且N35为N、T或S。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：10中显示的氨基酸序列，其中M50为M、I、G、Q、S或L；A62为A或S且L63为L或V。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G且其中Y110为Y、K、S、R或T。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G且其中Y110为任意氨基酸。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中G98为G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99为G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G且其中Y110为任意氨基酸。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：12中显示的氨基酸序列，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y；且H32为H、N或Q。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：13中显示的氨基酸序列，其中I51为I、T、V或A且S56为S或T。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列，其中S91为S或E；K92为K、H、R或S且其中Y96为Y或R。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列，其中S91为S或E；K92为任意氨基酸；T93为任意氨基酸且其中Y96为Y或R。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体，包括人源化抗体)，其包含重链可变区，该重链可变区含有SEQ ID NO：9的CDR1区域，其中I34为S、L、V、A或I且N35为N、T或S；SEQ ID NO：10的CDR2区域，其中M50为M、I、G、Q、S或L；A62为A或S且L63为L或V和SEQ ID NO：11的CDR3区域，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G；其中Y110为Y、K、S、R或T。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：11的CDR3区域，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G；其中Y110为任意氨基酸。在其它实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：11的CDR3区域，其中G98为G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99为G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G且其中Y110为任意氨基酸。在一些实施方案中，多肽(如抗体)进一步包含抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其含有轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：12的CDR1区域，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y且H32为H、N或Q；SEQ ID NO：13的CDR2区域，其中I51为I、T、V或A且S56为S或T；以及SEQ ID NO：14的CDR3区域，其中S91为S或E；K92为K、H、R或S且其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：14的CDR3区域，其中S91为S或E；K92为任意氨基酸，且T93为任意氨基酸；其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，多肽(如抗体)进一步包含抗体重链。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含(a)及(b)，所述(a)为重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：9的CDR1区域，其中I34为S、L、V、A或I且N35为N、T或S；SEQ ID NO：10的CDR2区域，其中M50为M、I、G、Q、S或L；A62为A或S且L63为L或V；以及SEQ ID NO：11的CDR3区域，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G；其中Y110为Y、K、S、R或T；所述(b)为轻链可变区，其包含SEQ ID NO：12CDR1区域，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y且H32为H、N或Q；SEQ IDNO：13的CDR2区域，其中I51为I、T、V或A；S56为S或T；SEQ IDNO：14的CDR3区域，其中S91为S或E；K92为K、H、R或S及其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：14的CDR3区域，其中S91为S或E；K92为任意氨基酸。T93为任意氨基酸且其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：11的CDR3，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G；其中Y110为任意氨基酸。在其它实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：11的CDR3区域，其中G98为G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99为G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110为任意氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽进一步包含抗体轻链。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体，包括人源化抗体)，其包含SEQ ID NO：9中显示的氨基酸序列，其中I34为S、L、V A或I；且N35 为N、T或S；包含SEQ ID NO：10中显示的氨基酸序列，其中M50为M、I、G、Q、S或L；A62为A或S且L63为L或V；以及包含SEQ IDNO：11中显示的氨基酸序列，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G；其中Y110为Y、K、S、R或T。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中Y100为Y、L或R；且其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110为任意氨基酸。在其它实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中G98为G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99为G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G且其中Y110为任意氨基酸。在一些实施方案中，多肽(如抗体)进一步包含抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体，包括人源化抗体)，其包含SEQ ID NO：12中显示的氨基酸序列，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y；且H32为H、N或Q；包含SEQ ID NO：13中显示的氨基酸序列，其中I51为I、T、V或A且S56为S或T；以及包含SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列，其中S91为S或E；K92为K、H、R或S且其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列，其中S91为S或E；K92为任意氨基酸；T93为任意氨基酸且其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，多肽(如抗体)进一步包含抗体重链可变区。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含(a)及(b)，所 述(a)为SEQ ID NO：9中显示的氨基酸序列，其中I34为S、L、V A或I且N35为N、T或S；SEQ ID NO：10中显示的氨基酸序列，其中M50为M、I、G、Q、S或L；A62为A或S及L63为L或V；以及SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G；且其中Y110为Y、K、S、R或T；所述(b)为SEQ ID NO：12中显示的氨基酸序列，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y且H32为H、N或Q；SEQ ID NO：13中显示的氨基酸序列，其中I51为I、T、V或A且S56为S或T；以及SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列，其中S91为S或E；K92为K、H、R或S；且其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列，其中S91为S或E；K92为任意氨基酸；T93为任意氨基酸且其中Y96为Y或R。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G；其中Y110为任意氨基酸。在其它实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：11中显示的氨基酸序列，其中G98为G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99为G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110为任意氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽进一步包含抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含重链可变区，该重链可变区含有：(a)SEQ ID NO：9的CDR1区域，其中I34为S、L、VA或I且N35用N、T或S替代；(b)SEQ ID NO：10的CDR2区域， 其中M50为I、G、Q、S或L；A62为A或S且L63为L或V；(c)SEQID NO：11的CDR3区域，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G且其中Y110为Y、K、S、R或T；其中所述抗体结合NGF。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含轻链可变区，该轻链可变区含有：(a)SEQ ID NO：12的CDR1区域，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y及H32为H、N或Q；(b)SEQ ID NO：13的CDR2区域，其中I51为I、T、V或A且S56为S或T；和(c)SEQ ID NO：14的CDR3区域，其中K92为K、H、R或S且其中Y96为Y或R；其中所述抗体结合NGF。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含(a)包含以下的重链可变区：(i)SEQ ID NO：9的CDR1区域，其中I34用S、L、V A或I替代且N35用N、T或S替代；(ii)SEQ ID NO：10的CDR2区域，其中M50为I、G、Q、S或L；A62为A或S；且L63为L或V；和(iii)SEQ IDNO：11的CDR3区域，其中Y100为Y、L或R；其中Y101为Y或W；其中G103为G、A或S；其中T104为T或S；其中S105为S、A或T；其中Y106为Y、R、T或M；其中Y107为Y或F；其中F108为F或W；其中D109为D、N或G；其中Y110为Y、K、S、R或T；和(b)包含以下的轻链可变区：(i)SEQ ID NO：12的CDR1区域，其中S26为S或F；D28为D、S、A或Y且H32为H、N或Q；(ii)SEQ ID NO：13的CDR2区域，其中I51为I、T、V或A且S56为S或T；和(iii)SEQ ID NO：14的CDR3区域，其中S91为S或E；K92为K、H、R或S且其中Y96为Y或R；其中所述抗体结合NGF。
除了另外提到外，一个位置中氨基酸的选择(例如，替代)独立于任意其它位置中氨基酸的选择。
在一些实施方案中，多肽(如抗体)结合NGF(如人NGF)。在一 些实施方案中，多肽包含文中描述的任意CDR构型(包括组合、变体等)。
自文中描述显然地，文中应用的可变区编号方式为连续编号。本领域技术人员易于理解存在许多抗体编号系统(如Kabat及Chothia编号)，并且易于理解怎样将连续编号转换为另一种编号系统，如Kabat编号或Chothia编号。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含选自SEQ ID NO：46或50的氨基酸序列(如CDR3序列)。在其它实施方案中，所述多肽进一步包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7及8中显示的一个或多个氨基酸序列。在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14及15中显示的一个或多个氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含选自(a)SEQ ID NO：28和/或29；(b)SEQ ID NO：30和/或31；(c)SEQ ID NO：32和/或33；(d)SEQ ID NO：34和/或35；(e)SEQ ID NO：36和/或37；(f)SEQ ID NO：38和/或39以及(g)SEQ ID NO：40及41的氨基酸序列(如CDR区域，如CDRH1和/或CDRH2区域)。在一些实施方案中，多肽包含选自SEQ IDNO：28、30、32、34、36、38及40的氨基酸序列(如CDR H1区域)。在一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NOS：29、31、33、35、37、39及41的氨基酸序列(如CDR H2区域)。又在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7及8中显示的一个或多个氨基酸序列。又在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14及15中显示的一个或多个氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含选自(a)SEQ IDNOS：18和/或19；(b)SEQ ID NOS：20和/或21及(c)SEQ ID NOS：22和/或23的氨基酸序列(如CDR区域，如CDRL1和/或CDRL2区域)。在一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO：18、20及22的氨基酸序列(如CDR L1区域)。在一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO：19、21及23的氨基酸序列(如CDR L2区域)。在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8中显示的一个或多个氨基酸序列。 在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14及15中显示的一个或多个氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含选自(a)SEQ ID NO：51和/或52；(b)SEQ ID NO：55和/或56；(c)SEQ ID NO：57和/或58；(d)SEQ ID NO：59和/或60；(e)SEQ ID NO：61和/或62；(f)SEQ ID NO：63和/或64的氨基酸序列(如CDR区域，如CDRL3和/或CDRH3区域)。在一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO：51、55、57、59、61及63的氨基酸序列(如CDR L3区域)。在一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO：52、56、58、60、62及64的氨基酸序列(如CDR H3区域)。又在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：18、19、30及31中显示的一个或多个氨基酸序列。在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7及8中显示的一个或多个氨基酸序列。在其它实施方案中，多肽进一步包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14及15中显示的一个或多个氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其包含SEQ ID NO：61、63、18、19、30及31中显示的一个或多个氨基酸序列(如CDR区域)。
一方面，本发明提供了与NGF(如人NGF)高亲和性结合的抗NGF抗体(如拮抗剂抗体)。在一些实施方案中，高亲和性为(a)以KD低于约2nM(如约1nM、800pM、600pM、400pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM或50pM以下的任意一种)和/或koff低于约6x10-5s-1结合NGF；和/或(b)以IC50(存在约15pM的NGF)约200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM或10pM以下的任意一种抑制(降低和/或阻断)依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活；和/或(c)以IC50(存在约1.5pM的NGF)约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或1pM以下的任意一种抑制(降低和/或阻断)依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活；和/或(d)以IC50(存在约15pM的NGF)约150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或5pM 以下的任意一种抑制(降低和/或阻断)依赖大鼠NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活；和/或(e)以IC50(存在约1.5pM的NGF)约30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、1pM或1pM以下的任意一种抑制(降低和/或阻断)依赖大鼠NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活；和/或(f)和/或比结合trkA受体更高的亲和性结合NGF。
另一方面，本发明提供了多肽(如抗体)，其中多肽(a)以KD低于约2nM(如约1nM、800pM、600pM、400pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM或50pM以下的任意一种)和/或koff低于约6x10-1s-1结合NGF(如人NGF)；和/或(b)以IC50(存在约15pM的NGF)约200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM或10pM以下的任意一种)抑制依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活；和/或(c)以IC50(存在约1.5pM的NGF)约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或1pM以下的任意一种抑制依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活；和/或以高于结合trkA受体的亲和性结合NGF。在一些实施方案中，多肽(a)以KD约2nM以下结合NGF；和/或(b)以IC50约100pM或100pM以下抑制依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活，其中存在约15pM NGF下测定IC50；和/或(c)以IC50约10pM或10pM以下抑制依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活，其中IC50在存在约1.5pM NGF时测定。在一些实施方案中，多肽(a)以KD低于约100pM结合NGF；和/或(b)以IC50约20pM或20pM以下抑制依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活，其中IC50在存在约15pM NGF中测定；和/或(c)以IC50约2pM或2pM以下抑制依赖人NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活，其中IC50在存在约1.5pM NGF下测定。
如自文中描述显然地，自本发明中特别排除的为与小鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同氨基酸序列组成的多肽实施方案。Mab 911的延伸CDR序列在图1A及1B以及在SEQ ID NO：9-14中显示。
在一些实施方案中，本发明提供了任意以上多肽或抗体，进一步其中多肽(如抗体)是经分离的。在一些实施方案中，多肽(如抗体)是基本上纯化的。在其它实施方案中，多肽(如抗体)为亲和力成熟的。在其它实施方案中，抗体为拮抗剂抗体。在一些实施方案中，多肽(如抗体)包含人构架序列。在其它实施方案中，多肽(如抗体)包含一个或多个非人构架残基。在一些实施方案中，多肽(如抗体)以KD 2nM或2nM以下结合NGF(如人NGF)。在一些实施方案中，多肽包含相对于非人氨基酸序列(如可变区，如CDR序列，如构架序列)的一个或多个(如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或8个以上)进行人氨基酸替代。在一些实施方案中，多肽包含相对于亲代多肽氨基酸序列(如抗体911氨基酸序列，如SED ID NO：9-14中任意一种或多种)至少1个、至少2个或2个以上如至少3个、4个、5个、6个或6个以上氨基酸替代。在一些实施方案中，已相对于亲代抗体(如Mab 911)亲和性改变所述抗体的结合亲和性(在一些实施方案种，结合亲和性升高)。在其它实施方案中，抗体的结合亲和性低于trkA受体对NGF(如人NGF)的结合亲和性。在一些实施方案中，多肽可为抗体。在一些实施方案中，抗体为人抗体。在其它实施方案中，抗体为人源化抗体。在其它实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为亲和力成熟抗体。
本发明提供了多核苷酸(包括经分离多核苷酸)，其包含编码任意以上实施方案中的多核苷酸。
另一方面，本发明提供了经分离多核苷酸，其包含编码抗体E3(文中互换称为“E3”)片段或区域的多核苷酸。在一些实施方案中，片段为如图1B中显示抗体E3的轻链。在另一实施方案中，片段为如图1A中显示抗体E3的重链。在其它实施方案中，片段包含来自抗体E3轻链和/或重链的一个或多个可变区。在另一实施方案中，片段包含来自如图1A及1B中显示抗体E3的轻链和/或重链的一个或多个互补性决定区(CDR)。
另一方面，本发明为经分离多核苷酸，其包含编码抗体E3的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含图2及图3中显示的多核苷酸的一 种或两种。
另一方面，本发明为经分离多核苷酸，其编码保藏号为ATCC NO.PTA-4893或ATCC NO.PTA-4894的E3轻链。另一方面，本发明为经分离多核苷酸，其编码保藏号为ATCC NO.PTA-4895的E3重链。又另一方面，本发明为经分离多核苷酸，其包含(a)在保藏号为ATCC NO.PTA-4893或PTA-4894的多核苷酸中编码的可变区和(b)保藏号为ATCCNO.PTA-4895多核苷酸中编码的可变区。另一方面，本发明为经分离多核苷酸，其包含(a)保藏号为ATCC NO.PTA-4893或PTA-4894的多核苷酸中编码的一个或多个CDR；和/或(b)保藏号为ATCC NO.PTA-4895的多核苷酸中编码的一个或多个CDR。
另一方面，本发明提供了多核苷酸，其编码文中描述的任一抗体(包括抗体片段)或多肽。
另一方面，本发明提供了包含文中公开的任一多核苷酸的载体(包括表达及克隆载体)及宿主细胞。
如自文中描述显然地，本发明明确包括的为由与小鼠单克隆抗体911的多核苷酸序列相同的多核苷酸组成的多核苷酸实施方案。Mab 911的延伸CDR序列在图1A及1B以及在SEQ ID NO：9-14中显示。
另一方面，本发明为宿主细胞，其包含编码E3轻链的多核苷酸及编码E3重链的多核苷酸，其中编码E3轻链的多核苷酸具有保藏号ATCC NO.PTA-4893和/或ATCC NO.PTA-4894，编码E3重链的多核苷酸具有保藏号ATCC NO.PTA-4895。在一些实施方案中，宿主细胞包含(a)和/(b)的多核苷酸，所述(a)为保藏号ATCC NO.PTA-4893或PTA-4894的多核苷酸编码的可变区；所述(b)为保藏号为ATCC NO.PTA-4895的多核苷酸中编码的可变区。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码(a)和/(b)的多核苷酸，所述(a)为保藏号ATCC NO.PTA-4893或PTA-4894中多核苷酸编码的一个或多个CDR；所述(b)为保藏号ATCC NO.PTA-4895的多核苷酸编码的一个或多个CDR。在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。
另一方面，本发明为抗体E3结合的NGF复合体。另一方面，复合体为经分离的。另一方面，复合体为基本上纯的。
另一方面，本发明为文中描述任一抗体或多肽结合的NGF复合体。另一方面，复合体为经分离的。另一方面，复合体为基本上纯的。
另一方面，本发明为药物组合物，其包含文中描述的任一多肽(包括抗体如抗体E3)或多核苷酸，如包含抗体E3或包含抗体E3片段的抗体以及可药用赋形剂的药物组合物。
另一方面，本发明为产生抗体E3的方法，其包含制备包含编码抗体E3表达载体的宿主细胞；在允许产生抗体E3的条件下培养宿主细胞或其子代；以及纯化抗体E3。在一些实施方案中，表达载体包含图2及图3中显示的一种或两种多核苷酸序列。
另一方面，本发明为产生抗体E3的方法，其包含在合适细胞中表达编码E3轻链的多核苷酸及编码E3重链的多核苷酸，其中编码E3轻链的多核苷酸具有保藏号ATCC NO.PTA-4893和/或ATCC NO.PTA-4894，并且编码E3重链的多核苷酸具有保藏号ATCC NO.PTA-4895；通常接着回收和/或分离抗体。
另一方面，本发明提供了方法，所述方法为在合适细胞中通过表达编码抗体(可作为单一轻链或重链分别表达，或轻链及重链均可自一种载体表达)的一种或多种多核苷酸产生文中描述任意多肽(如抗体)，通常接着回收和/或分离目的抗体或多肽。
另一方面，本发明为方法，所述方法为用文中公开的任意多肽(包括抗体如抗体E3)拮抗NGF(如人NGF)生物学活性。在一个实施方案中，方法包含用文中描述的任意多肽(包括抗体E3)接触人神经生长因子，从而拮抗、降低、阻断或抑制NGF活性(如人神经生长因子活性)。
另一方面，本发明为方法，所述方法为用文中描述的任意多肽(包括抗体，如抗体E3)检测NGF。NGF的存在通过检测NGF与文中描述任意多肽(如抗体E3)的复合体进行检测。如文中应用的术语“检测”包括参照或不参照对照的定性和/或定量检测(测量水平)。
另一方面，本发明为通过施用有效量组合物治疗疼痛的方法，所述组合物包含抗体E3或文中描述的任意多肽(包括抗体)或多核苷酸实施方案。在一些实施方案中，疼痛为手术后疼痛。
另一方面，本发明为通过向个体施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体预防或治疗个体中类风湿性关节炎疼痛的方法。根据本发明已显示抗NGF拮抗剂抗体能抑制或阻断与类风湿性关节炎相关的疼痛。在一些实施方案中，在施用抗NGF拮抗剂抗体后约24小时内疼痛减轻。在一些实施方案中，在施用抗NGF拮抗剂抗体后约4天疼痛减轻。在一些实施方案中，个体中炎性疾病改善指征在观察到前或没有出现时疼痛减轻。
另一方面，本发明提供了在个体中降低类风湿性关节炎疼痛的发生率、改善类风湿性关节炎疼痛、抑制类风湿性关节炎疼痛、减轻类风湿性关节炎疼痛和/或延迟类风湿性关节炎疼痛的发作、发展或进展的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体。
另一方面，本发明为方法，所述方法为在个体中通过向个体施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体预防或治疗骨关节炎疼痛。
另一方面，本发明提供了治疗个体中与类风湿性关节炎相关的炎性恶病质(体重减轻)的方法，其包含施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体。另一方面，本发明提供了在个体中降低骨关节炎疼痛的发生率、改善骨关节炎疼痛、抑制骨关节炎疼痛、减轻骨关节炎疼痛和/或延迟骨关节炎疼痛发作、发展或进展的方法，所述方法包含向个体施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体。
另一方面，本发明提供了试剂盒及包含任意一种或多种文中描述组合物的组合物。一般以合适包装以及提供了适当说明书的这些试剂盒用于文中描述的任意方法。
无论是上下文作为药物的用途和/或用于制备药物，本发明也提供了用于文中描述任何用途的任意组合物及试剂盒。
附图简述
图1A：显示E3抗体重链可变区的氨基酸序列(标记为“6”及“5+亲和力成熟H3)。Chothia CDR及Kabat CDR分别通过下划线形式、加粗及斜体形式描述。图1A也显示以下重链可变区氨基酸序列的排列；(2)VH4-59人胚系受者序列(gremline acceptor sequence)(标记为“VH4-59”或“2”)；(3)用小鼠抗体911的延伸CDR移植的受者序列(标记为“经CDR移植”或“3”)；(4)包括V71K替代的经CDR移植受者序列(标记为“3+一个构架突变”或“4”)；(5)包含亲和力成熟CDR H1及H2的克隆(标记为“5”或“4+亲和力成熟H1，H2”)；以及抗体E3(如以上描述)。
图1B：显示E3抗体轻链可变区的氨基酸序列(标记为“5”及“4+亲和力成熟L3)。Chothia CDR及Kabat CDR分别通过下划线形式、加粗及斜体形式描述。图1B也显示以下轻链可变区氨基酸序列的排列：(2)O8人胚系受者序列(标记为“O8”或“2”)；(3)用小鼠抗体911延伸CDR移植的受者序列(标记为“经CDR移植”或“3”)；(4)经CDR移植受者序列(标记为“3+亲和力突变L1、L2”或“4”)；(5)包含亲和力成熟CDR L1及L2的克隆(标记为“5”或“4+亲和力成熟L3”)；及抗体E3(如以上描述)。
图2：显示包含编码抗体E3重链可变区多核苷酸序列的多核苷酸。
图3：显示包含编码抗体E3轻链可变区多核苷酸序列的多核苷酸。
图4：存在不同浓度人及大鼠NGF时描述依赖NGF的E13.5神经元存活的图。X轴对应于NGF浓度(ng/ml)且Y轴对应于经计数神经元。
图5：为存在0.04ng/ml人NGF(约1.5pM；下图显示)或0.4ng/ml人NGF(约15pM；上图显示)时比较多种Fab的NGF阻断作用的图。对E13.5小鼠三叉神经元在多种浓度Fab E3；鼠911Fab；及Fab H19-L129及Fab 8L2-6D5中的存活进行评估。对在每种NGF浓度下每种Fab的IC50(以pM表示)进行计算并在图9中显示。Fab E3强烈阻断依赖人NGF的三叉神经元存活，在存在15pM人NGF时IC50约21pM以及存在1.5pM人NGF时，IC50为约1.2pM。Fab 3C及H19-L129也强烈阻断依赖 人NGF的三叉神经元的存活。在两图中，X轴对应于抗体浓度(nM)且Y轴对应于经计数神经元。IC50大约为1.5pM NGF而15pM代表NGF的饱和浓度。
图6：为存在0.04ng/ml大鼠NGF(约1.5pM；下图显示)或0.4ng/ml大鼠NGF(约15pM；上图显示)时比较多种Fab的NGF阻断作用的图。对E13.5小鼠三叉神经元在多种浓度的Fab E3；鼠Fab 911；及FabH19-L129和8L2-6D5中的存活如以上描述进行评估。对在每种NGF浓度下每种Fab的IC50(以pM表示)进行计算并在图9中显示。Fab E3强烈阻断依赖人NGF的三叉神经元存活，在存在15pM大鼠NGF时，IC50约31.6pM以及存在1.5pM大鼠NGF时，IC50为约1.3pM。Fab 3C及H19-L129也强烈阻断依赖大鼠NGF的三叉神经元存活。IC50大约为1.5pM NGF而15pM代表NGF的饱和浓度。在两图中，X轴对应于抗体浓度(nM)且Y轴对应于经计数神经元。
图7为描述手术后24小时评估的静息疼痛并显示用0.02mg/kg、0.1mg/kg、0.6mg/kg或1mg/kg抗NGF抗体E3治疗降低疼痛的图。“＊”表示与阴性对照相比的统计学显著差异(p＜0.5)。
图8：为描述手术后24小时评估的静息疼痛并显示手术后两小时用0.5mg/kg抗NGF抗体E3注射治疗显著(p＜0.005)降低静息疼痛的图。
图9：为显示人NGF与小鼠抗体911(Fab)结合亲和性的BIAcore分析结果的图。小鼠911抗体以KD 3.7nM、koff 8.4x10-5s-1及kon 2.2x104M-1s-1结合NGF。
图10：为显示人NGF与抗体E3(Fab)(称作“3E Fab”)结合亲和性的BIAcore分析结果的图。E3以KD约0.07nM(以及kon约6.0x 105M-1s-1且koff约4.2x10-5s-1)结合人NGF。
图11：为如通过NGF与trkA(显示为黑圆)及NGF与p75(显示为空心正方形)之间检测的结合百分数评估的，描述抗体E3阻断NGF与其受体trkA及p75相互作用的图，X轴对应于抗体3E(Fab)的浓度且Y轴对应于NGF结合(最大RU百分率)。如通过降低信号(以RU测定) 所示的，Fab E3浓度增加阻断NGF与p75及trkA两者的相互作用。当抗体E3(Fab)浓度与NGF浓度相同时，观察不到NGF的结合(如通过零信号显示的)。
图12：为描述完整抗体E3及Fab E3的人NGF阻断能力的图。对存在人NGF及多种浓度Fab E3和抗体E3时的E13.5小鼠三叉神经元的存活进行评估。X轴对应于NGF结合位点(nM)且Y轴对应于三叉(TG)神经元的归一化计数。当完整抗体及Fab浓度对NGF结合位点(Fab有一个结合位点及完整抗体有两个结合位点)数目归一化时，完整抗体E3与Fab 3E显示以相似水平抑制依赖NGF的三叉神经元的存活。
图13：为描述在存在0.4ng/ml人NGF(饱和状态)时，多种浓度(20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128及0.0nM)抗体E3(实心三角形；称为“3E”)、抗体911(实心圆)及trkA受体免疫粘附素(阴影正方形；称作“trkA-Fc”)抑制E13.5三叉神经元依赖NGF存活的图。X轴对应于抗体浓度(nM)且Y浓度对应于经计数神经元。这些结果证实抗体E3阻断NGF显著好于小鼠单克隆抗NGF抗体911或trkA免疫粘附素。
图14：为描述抗NGF拮抗剂抗体E3(称为“图中3E”)或Fab 911甚至在抗体浓度高达200nM时，不抑制通过NT3、NT4/5及MSP促进的神经元存活的图。数据代表培养液中48小时后相对于每个实验中阳性对照(存在饱和NGF浓度时生长的三叉神经元100％存活)中观察到存活的平均百分率(对于每个数据点，均值±标准误，n＝3)。在存在非经加入神经营养蛋白(称为“对照”)、400pM NGF(称为“NGF-400pM)、10nMNT3(称为“NT3-10nM)或600pM MSP(称为“MSP-600pM)时，应用多种浓度(20nM、2nM或0.2nM)E3Fab(图中称为“3E”)及小鼠抗体911Fab。
图15为描述抗NGF拮抗剂抗体E3(Fab或完整抗体)(称为“图中3E”)或小鼠抗体911(Fab或完整抗体)，甚至在抗体浓度高达200nM时不抑制通过NT3、NT4/5及MSP促进的神经元存活的图。在无加入的 神经营养蛋白(称为“无因子”)、存在400pM NGF(称为“NGF-400pM)、10nM NT3(称为“NT3-10nM)或600pM MSP(称为“MSP-600pM)时，应用多种浓度(200nM及80nM)E3Fab、完整抗体、小鼠抗体911完整抗体及Fab。
图16：为描述抗NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不抑制通过BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节状神经元的存活的图。也对小鼠抗NGF拮抗剂抗体911进行检测并观察到相似结果。在无加入的神经营养蛋白(称为“无因子”)、存在400pM BDNF(称为“BDNF-400pM)、400pM NT4/5(称为“NT4/5-400pM)或2.5nM LIF(称为“LIF-2.5nM)时，对多种浓度(200nM或80nM)完整抗体E3(称为图中“3E”)、Fab E3、完整抗体911或Fab 911进行检测。
图17：为描述抗NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不抑制通过BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节状神经元存活的图。在存在非经加入神经营养蛋白(称为“无对照”)、400pM BDNF(称为“BDNF-400pM)、400pM NT4/5(称为“NT4/5-400pM)或2.5nM LIF(称为“LIF-2.5nM)时，对多种浓度(200nM、20nM、2nM)Fab E3(称为“图中3E”)或Fab911进行检测。
图18：为在D14及D19施用抗NGF抗体(E3及911)后证实关节炎大鼠(类风湿性关节炎模型)中伤害性反应的图。向关节炎小鼠施用E3(第14天及第19天，静脉内施用1mg/kg)、911(第14天及第19天，静脉内施用10mg/kg)或消炎痛(每天经口施用吲哚美辛(indomethacin)3mg/kg，进行10天)。发声强度值以mV表示为均值±平均标准误。
图19：为在D14及D19施用抗NGF抗体后证实大鼠关节炎(类风湿性关节炎模型)中抗NGF抗体对体重影响的图。向关节炎小鼠施用E3(第14天及第19天，静脉内施用1mg/kg)、911(第14天及第19天，静脉内施用10mg/kg，)或消炎痛(每天经口施用吲哚美辛(indomethacin)3mg/kg，进行10天)。体重值以克表示为均值±平均标准误。
图20：为在D14及D18施用不同剂量抗NGF抗体E3(0.003mg/kg、 0.03mg/kg、0.3mg/kg及5mg/kg)后证实关节炎大鼠(类风湿性关节炎模型)中伤害性反应的图。发声强度以mV表示为均值±平均标准误。
图21：为在D14及D18施用不同剂量的抗NGF抗体E3(0.03mg/kg、0.3mg/kg及5mg/kg)后证实关节炎大鼠(类风湿性关节炎模型)中抗NGF抗体E3对第14天(归一化到第14天)体重百分率作用的图。
图22：为在D14及D18施用不同剂量抗NGF抗体E3(0.03mg/kg、0.3mg/kg及5mg/kg)后证实关节炎大鼠(类风湿性关节炎模型)中抗NGF抗体E3对体重减轻作用的图。体重值归一化到第0天。
图23描述了E3重链可变区氨基酸序列(图23A)及轻链可变区氨基酸序列(图23B)，如用顺序编号、Kabat编号及Chothia编号进行编号。
发明详述
文中公开的本发明提供了以高亲和性结合NGF(如人NGF)的抗NGF拮抗剂抗体。本发明进一步提供了结合NGF的衍生自E3的抗体及多肽，以及制备和应用这些抗体的方法。在一些实施方案中，本发明提供了结合神经生长因子(“NGF”)的人源化抗体E3，以及制备和应用此抗体的方法。本发明也提供了结合NGF的E3多肽(包括抗体)，以及编码E3抗体和/或多肽的多核苷酸。
文中公开的本发明也提供了方法，所述方法为在个体中通过施用治疗有效量的抗NGF拮抗剂抗体用于预防和/或治疗类风湿性关节炎疼痛。
文中公开的本发明也提供了方法，所述方法在个体中通过施用治疗有效量的抗NGF拮抗剂抗体用于预防和/或治疗骨关节炎疼痛。
本发明也提供了用于调整抗体亲和性的方法及用于表征CDR区域的方法。
一般技术
除了另外说明外，本发明的实践应用本领域技术人员范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学常规 技术。此类技术在文献中，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press一书中；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press一书中；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis，编辑，1998)Academic Press一书中；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press一书中；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell，编辑1993-1998)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)一书中；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑)一书中；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)一书中；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987)一书中；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人，编辑，1994)一书中；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)一书中；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)一书中；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)一书中；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty，编辑，IRL Press，1988-1989)一书中；Monoclonal antibodies：a practicalapproach(P.Shepherd和C.Dean，编辑，Oxford University Press，2000)一书中；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)一书中；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，编辑，Harwood Academic Publishers，1995)一书中；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人，编辑，J.B.Lippincott Company，1993)一书中已清楚解释。
定义
“抗体”为通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点 能特异结合靶标，如碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等的免疫球蛋白分子。如文中应用的，该术语不仅仅包含完全多克隆或单克隆抗体，也包含其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白及包含抗原识别位点的任何其它经修饰构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任意类的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，抗体不必属于任意特定类。取决于免疫球蛋白重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可将免疫球蛋白归入不同类。免疫球蛋白主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于免疫球蛋白不同类的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构及三维构型是公知的。
“Fv”为包含完全抗原识别及结合位点的抗体片段。在两链Fv种类中，此区域由一个重链及一个轻链可变结构域以紧密的非共价连接的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链及一个轻链可变结构域可通过柔韧的肽接头共价连接以至轻链及重链可与两链Fv种类中相似的二聚体结构连接。在此种构型中每个可变结构域的三个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体表面的抗原结合特异性。然而，甚至单一可变结构域(或只包含对抗原特异的3个CDR的半个Fv)具有识别及结合抗原的能力，但一般低于完全结合位点的亲和性。
Fab片段也包含轻链恒定结构域及重链的第一个恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段不同，所述不同是由于在重链CH1结构域的羧基端加入的几个残基，其包括自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
“单克隆抗体”是指均质抗体群，其中单克隆抗体包含参与抗原选择性结合的氨基酸(天然存在或非天然存在)。单克隆抗体群高度特异，针对单一抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅仅包括完整单克隆抗体及全长单克隆抗体，也包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、以及包含具有目的特异性及结合抗原能力的抗原识别位点的任何其它经修饰构型的免疫球蛋白分子。对抗体 的来源或抗体制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)不欲进行限制。
如文中应用的，“人抗体”表示具有对应于由人产生抗体的氨基酸序列和/或用本领域已知或文中公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的定义包括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个此种实例为包含鼠轻链及人重链多肽的抗体。人抗体可用多种本领域已知的技术产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，此噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，1996，Nature Biotechnology，14：309-314；Sheets等人，1998，PNAS，(USA)95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等人，1991，J.Mol.Biol.，222：581)。人抗体也可通过将人免疫球蛋白基因座导入到转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠中制备。此方法在美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425及5,661,016中进行了描述。备选地，人抗体可通过永生化产生针对靶抗原的人B淋巴细胞(如B淋巴细胞可自个体回收或可体外进行免疫)制备。参见例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，1991，J Immunol.，147(1)：86-95；以及美国专利号5,750,373。
“嵌合抗体”是指此类抗体，其中每个重链及轻链的氨基酸序列的一部分与来源自特定物种或属于特定类抗体中的对应序列同源，而链的其余节段与另一物种中的对应序列同源。一般地，在这些嵌合抗体中，轻链及重链可变区模仿来源自哺乳动物一个物种的抗体可变区，而恒定部分与来源自另一物种的抗体序列同源。此类嵌合形式的一个明显的优越性为，例如，用易于获得的杂交瘤或来自非人宿主生物的B细胞可变区可方便地来源自现在已知的来源，与来源于例如，人细胞制备物的恒定区组合。可变区具有易于制备且特异性不受它的来源影响，恒定区来自人，当注射抗体时，来自人的恒定区比非人来源的恒定区不易引起对人受试者的免疫反应。然而，该定义不限于此具体实例。
“功能性Fc区域”有天然序列Fc区域的至少一个效应子功能。示例“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体；BCR)等。此类效应子功能一般需要Fc区域与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合并用本领域已知的多种测定法进行评估用于评估此类抗体效应子功能。
“天然序列Fc区域”包含与自然中发现的Fc区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。由于至少一个氨基酸修饰，“变体Fc区域”包含与天然序列Fc区域不同的氨基酸序列，但保持天然序列Fc区域的至少一个效应子功能。优选地，与天然序列Fc区域或亲代多肽的Fc区域相比，变体Fc区域具有至少一个氨基酸替代，例如在天然序列Fc区域或亲代多肽的Fc区域中自约一个至约十个氨基酸替代，优选自约一个至约五个氨基酸替代。文中变体Fc区域与天然序列Fc区域和/或亲代多肽的Fc区域优选具有至少约80％序列同一性，且最优选与其至少约90％序列同一性，更优选与其至少约95％序列同一性。
如文中应用的“依赖抗体的细胞介导细胞毒性”及“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的裂解。如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的，目的分子的ADCC活性可用体外ADCC测定法进行评估。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及NK细胞。备选地，或额外地，目的分子的ADCC活性可在体内，例如在Clynes等人，1998，PNAS(USA)，95：652-656中公开的动物模型中评估。
如文中应用的，“Fc受体”及“FcR”描述了结合抗体Fc区域的受体。优选的FcR为天然序列人FcR。此外，优选的FcR为结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚类受体，包括这些受体的等位变体及此类受体的备选剪接形式。FcγRII受体包括具有相似氨基酸序列但主要在胞浆结构域中不同的FcγRIIA(“活化受体”)及FcγRIIB(“抑 制受体”)。FcR在Ravetch和Kinet，1991，Ann.Rev.Immunol.，9：457-92；Capel等人，1994，Immunomethods，4：25-34；以及de Haas等人，1995，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41中进行了综述。“FcR”也包括负责母体IgG转移至胎儿的新生受体FcRn(Guyer等人，1976，J.Immunol.，117：587；及Kim等人，1994，J Immunol.，24：249)。
“补体依赖细胞毒性”及“CDC”是指在存在补体时靶标的溶解。补体活化途径通过补体系统的第一种组分(C1q)与和相关抗原复合的分子(例如，抗体)结合起始。为了评估补体的活化，例如在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol Methods，202：163(1996)中描述的，可进行CDC测定。
如文中应用的，互换应用的术语“E3”、“3E”及“抗体E3”是指包含分别在图1A(SEQ ID NO：1)及1B(SEQ ID NO：2)中显示的重链及轻链可变区氨基酸序列的抗体。抗体E3的CDR部分(包括Chothia及Kabat CDR)在图1A及1B中进行图表描述。图2及图3分别显示编码重链及轻链的多核苷酸，包含分别在图1A及1B中显示的重链及轻链可变区。E3的产生及表征在实例中描述。与E3相关的不同生物学功能包括但不限于，结合NGF及抑制NGF生物学活性和/或通过NGF信号介导的下游途径的能力；以及抑制小鼠E13.5三叉神经元依赖NGF的存活的能力。如文中讨论的，本发明所述的抗体可具有任意一种或多种这些特征。在一些实施方案中，术语“E3”是指由(a)为(b)编码的免疫球蛋白，所述(a)为具有保藏号ATCC NO.PTA-4893或ATCC NO.PTA-4894编码E3轻链的多核苷酸；所述(b)为具有保藏号ATCC NO.PTA-4895编码E3重链的多核苷酸。
如文中应用的，“免疫特异性”结合抗体的是指发生在抗体的抗原结合位点及由所述抗体识别的特异抗原之间的抗原特异结合相互作用(即在ELISA或其它免疫测定法中所述抗体与所述蛋白质反应，而不与不相关蛋白质发生可检测反应)。
“特异结合”或“优先结合”(文中互换应用)抗体或多肽的表位为 本领域公知的术语，并且确定此类特异或优先结合的方法也是本领域公知的。如果分子与特定细胞或物质反应或结合更频繁、更快、时间更长和/或亲和性更高于与备选细胞或物质的反应或结合，称此分子显示“特异结合”或“优先结合”。如果抗体以更大的亲和性、亲合力、更容易和/或时间更长于与其它物质的结合，那么抗体与靶“特异结合”或“优先结合”。例如，与NGF表位特异结合或优先结合的抗体为以更大的亲和性、亲合力、更容易和/或时间更长于与其它NGF表位或非NGF表位结合的抗体。通过阅读此定义也理解，例如特异或优选结合第一个靶的抗体可或不可特异或优先结合第二个抗体。如这样，“特异结合”或“优先结合”不必要(虽然可包括)专一结合。一般而言但不必要，谈及的结合表示优先结合。
文中互换应用的术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”是指任何长度的氨基酸多聚体。多聚体可为线性或分支的，它可包含经修饰氨基酸并且它可通过非氨基酸间隔。该术语也包含经天然或间插修饰的氨基酸多聚体；所述修饰为例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分连接。该定义内还包括例如包含一个或多个氨基酸类似物的(包括，例如非天然氨基酸等)多肽以及其它本领域已知的修饰的多肽。理解由于本发明所述多肽基于抗体，多肽可作为单链或结合的链存在。
文中互换应用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸多聚体并且包括DNA及RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰核苷酸或碱基和/或它们的类似物、或可通过DNA或RNA聚合酶掺入到多聚体中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰核苷酸，如甲基化核苷酸及它们的类似物。如果存在，核苷酸结构的修饰可在多聚物装配之前或之后进行。核苷酸的序列可通过非核苷酸组分间隔。聚合作用后多核苷酸可进一步修饰，如通过与标记组分结合来修饰。其它类型的修饰包括，例如“帽”、用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如具有不带电荷连接的修饰(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidates)、氨基甲酸酯(cabamates)等)及带电荷连接的修饰 (例如，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)等)、包含悬垂部分的修饰，例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、有嵌入剂的(例如，吖啶、补骨脂素(psoralen)等)的修饰、包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰、包含烷化剂的修饰、具有经修饰连接的(例如，α异头核酸等)，以及多核苷酸的未经修饰形式。此外，糖中通常存在的任何羟基可例如通过膦酸基、磷酸基取代，通过标准保护基保护，或活化以制备与额外核苷酸的额外连接，或可与固相载体连接。5’和3’端OH可磷酸化或用胺或自1至20个碳原子的有机帽化基团部分取代。其它羟基也可衍生成标准保护基。多核苷酸也可包含本领域公知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括，例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、景天庚酮糖、无环类似物及无碱基核苷类似物如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可由备选连接基替代。此备选连接基包括，但不限于其中磷酸酯由P(O)S(“硫代化物”)、P(S)S(“二硫代化物”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“formacetal”)替代的实施方案，其中每个R或R’独立地为H或由任选的包含醚(-O-)键、芳香基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代或非取代烷基(1-20C)。不需多核苷酸中的所有连接相同。前述描述应用于文中谈及的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
抗体的“可变区”是指单一或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。每个重链及轻链可变区由三个也已知为高变区的互补性决定区(CDR)连接的四个构架区(FR)组成。每条链的CDR由FR非常接近的连在一起，与来自其它链的CDR用于形成抗体的抗原结合位点。至少有两种技术用于确定CDR：(1)基于种间变异性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))一书中；以及(2)基于抗原-抗体复合体的晶体学研究(Chothia等人，(1989)Nature 342：877；Al-lazikani等人， (1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。如文中应用的，CDR可指由一种方法或两种方法组合定义的CDR。
抗体的“恒定区”是指单一或组合的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区。
如文中应用的，术语“神经生长因子”及“NGF”是指神生长因子或保持至少部分NGF生物学活性的神经生长因子的变体。如文中应用的，NGF包括所有哺乳动物物种，包括人、犬、猫、马或牛的天然序列NGF。
“NGF受体”是指由NGF结合或活化的多肽。NGF受体包括任何哺乳动物物种，包括但不限于人、犬、猫、马、灵长类动物或牛的TrkA受体及p75受体。
如文中应用的，“抗NGF拮抗剂抗体”(互换称为“抗NGF抗体”)是指能结合NGF并抑制NGF生物学活性和/或由NGF信号介导的下游途径的抗体。抗NGF拮抗剂抗体包含阻断、拮抗、抑制或降低(包括显著降低)NGF生物学活性，包括由NGF信号介导的下游途径如受体结合和/或引发对NGF细胞反应的抗体。对于本发明，明确理解术语“抗NGF拮抗剂抗体”包含所有前述经鉴定术语、标题和功能状态及特征由此NGF自身、NGF生物学活性(包括但不限于它的介导手术后疼痛任何方面的能力)或生物学活性的结果在任何有意义程度上的充分无效化、降低或中和。在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体结合NGF并防止NGF二聚化和/或结合NGF受体(如p75和/或trkA)。在其它实施方案中，抗NGF抗体结合NGF并防止trkA受体二聚化和/或trkA自磷酸化。文中提供了抗NGF拮抗剂抗体的实例。
NGF的“生物学活性”一般是指结合NGF受体和/或活化NGF受体信号途径的能力。无限制地，生物学活性包括任何一个或多个以下内容：结合NGF受体(如p75和/或trkA)的能力；促进trkA受体二聚化和/或trkA自动磷酸化的能力；活化NGF受体信号途径的能力；促进细胞分化、增殖、存活、生长及其它在细胞生理学中的变化，包括在神经元形态、突触发生、突触功能、神经递质和/或神经肽释放及损伤后的再生(对于神 经元，包括外周及中枢神经元)变化的能力；促进小鼠E13.5三叉神经元存活的能力以及介导疼痛，包括手术后疼痛的能力。
如文中应用的，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，无污染物)的，更优选至少90％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少98％纯的，更优选至少99％纯的材料。
“宿主细胞”包括可为或已经用于掺入多核苷酸插入物的载体受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然、意外或故意突变，子代与原亲代细胞可不必完全相同(形态学上或基因组DNA互补上)。宿主细胞包括用本发明所述多核苷酸体内转染的细胞。
如文中应用的，“治疗”为用于获得有利或目的临床结果的方法。对于本发明，有利或目的临床结果包括但不限于一个或多个以下内容：疼痛的任何方面的改善或减轻疼痛，包括急性、慢性、炎性、神经性、手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛的改善或减轻。对于本发明，有利或目的临床结果包括但不限于一个或多个以下内容：包括降低严重度、减轻一种或多种与疼痛相关的症状，包括疼痛的任何方面(如缩短疼痛持续时间、降低疼痛敏感性或感觉)。
药物、化合物或药物组合物的“有效量”为足可引起有利或目的结果包括临床结果如减轻或降低疼痛感觉的量。有效量可以以一次或多次施与进行施用。对于本发明，药物、化合物或药物组合物的有效量为足可治疗、缓解、降低疼痛强度和/或预防疼痛，包括手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和/或骨关节炎疼痛的量。在一些实施方案中，“有效量”可降低休息时的疼痛(静息疼痛)或经机械诱导疼痛(包括运动后疼痛)或静息及经机械诱导疼痛，并且在切开、割开、撕开或损伤之前、期间或之后施用和/或在疼痛刺激之前、期间或之后施用。如在临床应用中理解的，与另一种药、化合物或药物组合物联合可达到或达不到药、化合物或药物组合物的有效量。因此，在施用一种或多种治疗剂的上下文中可考虑“有效量”，如果单一制剂与一种或多种其它制剂联合可达到或实现目的结果可认为单 一制剂以有效量施用。
疼痛“降低的发生率”表示任何降低严重度(可包括降低时一般用于此疾病的其它药和/或治疗剂包括例如阿片剂的需要和/或量)、持续时间和/或频率(包括，例如在个体中延迟或增加手术后疼痛时间)。如本领域技术人员理解的，个体在他们对治疗的反应中可变化，并且同样，例如“在个体中降低类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛发生率”反应了施用抗NGF拮抗剂抗体，这是基于此施用可能引起在特定个体中这种发生率降低的合理期望。
“缓解”疼痛(如类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)或疼痛的一种或多种症状表示与不施用抗NGF拮抗剂抗体相比，减轻或改善疼痛的一种或多种症状。“缓解”也包括缩短或减少症状的持续时间。
“减轻”疼痛(如类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)或疼痛的一种或多种症状表示在用根据本发明所述抗NGF拮抗剂抗体治疗的个体中或个体群中，降低手术后疼痛的一种或多种不希望的临床表现的程度。
如文中应用的，“延迟”疾病的发展表示推迟、阻碍、减慢、阻止、稳定和/或延迟疼痛如手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛的进程。取决于病史和/或进行治疗的个体，此延迟的时间长度可变化。如对本领域技术人员明显地，足够的或显著的延迟可起到预防作用以致个体不发生疼痛。“延迟”症状发展的方法为与不用此方法相比，在给定期限降低发展症状可能性和/或在给定期限降低症状程度。这种比较一般基于用统计学上显著数目的受试者进行的临床研究。
如文中应用的“疼痛”是指任何病因学，包括急性及慢性疼痛以及任何有炎性组分的疼痛。疼痛的实例包括外科手术后疼痛、手术后疼痛(包括牙痛)、偏头痛、头痛及三叉神经痛及与烧伤、创伤或肾结石相关疼痛、与外伤(包括外伤性颅脑损伤)相关疼痛、神经性疼痛、与肌肉-骨骼疾病如类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、血清阴性(非类风湿)关节病、非关节性风湿症及关节周病症相关的疼痛以及与癌相关的疼痛(包括“突破疼痛”及与晚期癌症相关的疼痛)、外周神经病及疱疹后神经痛。 有炎性组分疼痛的实例(除以上描述的一些外)包括风湿性疼痛、与粘膜炎及痛经相关的疼痛。
“手术后疼痛”(互换称为“切口后疼痛”或“外伤后疼痛”)是指外伤如个体组织中切口、穿刺、切割、撕破或创伤(包括所有外科步骤，无论是侵入性或非侵入性引起)引起或导致的疼痛。如文中应用的，手术后疼痛不包括无外部物理外伤发生(引起或引发)的疼痛。在一些实施方案中，手术后疼痛为内部或外部(包括外周)疼痛以及偶然(如有外伤性创伤)或故意(如外科切口)发生的创伤、切口、外伤、撕伤或切割。如文中应用的，“疼痛”包括疼痛的伤害感受及感觉，并且疼痛可用本领域公知的疼痛分值及其它方法进行客观及主观的评估。如文中应用的，手术后疼痛包括异常性疼痛(即对正常非有害刺激物反应增强)及痛觉过敏(即对正常有害或不愉快刺激物反应增强)，所述异常性疼痛和痛觉过敏在性质上可以为热或机械(触觉)的。在一些实施方案中，疼痛的特征为热敏感性、机械敏感性和/或静息疼痛。在一些实施方案中，手术后疼痛包含经机械诱导疼痛或静息疼痛。在其它实施方案中，手术后疼痛包含静息疼痛。如本领域公知的，疼痛可为一级疼痛或二级疼痛。
“生物学样本”包含获自个体并可用于诊断或监测测定法中的多种样本型。此定义包含生物学来源的血液或其它液体样本、固体组织样本如活组织样本或组织培养物或其来源的细胞，以及其子代。该定义也包括在获得它们后以任何方式操作的样本，所述操作为例如通过试剂处理、增溶或浓缩某些组分如蛋白质或多核苷酸或包埋在半固体或固体基质中用于制备切片。术语“生物学样本”包含临床样本，并且也包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物学液体及组织样本。
“个体”为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于农用动物(如奶牛)、运动动物、宠物(如猫、狗及马)、灵长类动物、小鼠及大鼠。
如文中应用的，“载体”表示能在宿主细胞中递送，且优选表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸 DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂结合的DNA或RNA表达载体、脂质体中包裹的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，如生产者细胞。
如文中应用的，“表达控制序列”表示指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可为启动子，如构成型或诱导型启动子或增强子。表达控制序列与欲进行转录的核酸序列有效连接。
如文中应用的，“可药用载体”包括任何材料，当其与活性成分组合时，所述材料允许成分保持生物学活性而不与受试者的免疫系统反应。实例包括但不限于，任何标准药物载体如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水乳剂及多种型的湿润剂。用于气溶胶或肠胃外施用的优选稀释剂为磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过公知常规方法(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990一书，以及Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing，2000一书)进行制备。
如文中应用的术语“Koff”，欲指用于抗体自抗体/抗原复合体解离的解离速率常数(offrate constant)。
如文中应用的术语“Kd”，欲指抗体-抗原相互作用的解离常数。
抗体E3、经E3衍生抗体、组合物及使用方法
E3组合物、经E3衍生组合物以及制备组合物的方法
本发明包含组合物，其包括包含E3抗体或多肽；以及包含编码E3抗体或多肽序列的多核苷酸的药物组合物。如文中应用的，组合物包含一种或多种结合NGF的抗体或多肽(可为抗体或不为抗体)和/或一种或多种包含编码一种或多种结合NGF抗体或多肽的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适赋形剂，如包括缓冲剂的可药用赋形剂，其在本领域是公知的。
本发明也包含经分离抗体、多肽及多核苷酸实施方案。本发明也包含 基本上纯的抗体、多肽及多核苷酸实施方案。
本发明所述的抗体及多肽以以下任意(一种或多种)特征表征：(a)结合NGF的能力；(b)降低和/或抑制NGF生物学活性和/或通过NGF信号介导的下游途径的能力；(c)降低和/或抑制小鼠E13.5三叉神经元依赖NGF存活的能力；(d)缺乏与NT3、NT4/5和/或BDNF任何显著交叉反应性；(e)治疗和/或预防疼痛(包括手术后疼痛)的能力；(f)增强NGF清除的能力；(g)降低或抑制trkA受体活化的能力，例如用激酶受体活化测定法(KIRA)(参见美国专利号6,027,927)检测所述能力。
与亲代小鼠抗NGF单克隆抗体911比较，以高亲和性及慢解离动力学结合人NGF的抗体E3的结合特性在以下进行了概述。E3以约50倍高于亲代小鼠抗体911的亲和性结合人NGF。
抗体 KD Koff Kon
911(Fab) 3.7nM 9x10-5s-1 2.2x104M-1s-1
E3 0.07nM ＜4x10-5s-1 6x105M-1s-1
如通过体外测定法评估的，E3抗体及相关抗体也显示拮抗人NGF的强能力(参见实施例2及3)。例如抗体E3在存在15pM人NGF时，以IC50约21pM，并且在存在1.5pM人NGF时，以IC50约1.2pM拮抗小鼠E13三叉神经元依赖NGF的存活。
因此，另一方面，本发明所述的抗体或多肽进一步鉴定并表征为：(h)以低解离动力学(在一些实施方案中，KD约2nM以下和/或koff约6x10-5s-1以下的高亲和性结合人NGF)和/或(i)15pM NGF(在一些实施方案中，人NGF)时以IC50约100pM或以下和/或约1.5pM NGF时以IC50约20pM或以下抑制(阻断)小鼠E13.5三叉神经元依赖的NGF存活。
在一些实施方案中，抗体结合人NGF，而不显著结合来自另一脊椎动物物种(在一些实施方案中，哺乳动物)的NGF。在一些实施方案中，抗体结合人NGF以及一种或多种来自另一脊椎动物物种(在一些实施方案中，哺乳动物)的NGF。又在一实施方案中，抗体结合NGF而不与其它 神经营养蛋白(如相关神经营养蛋白、NT3、NT4/5和/或BDNF)显著交叉反应。在一些实施方案中，抗体结合NGF以及至少一种其它神经营养蛋白。在一些实施方案中，抗体结合哺乳动物物种如马或狗的NGF，但不显著结合来自其它哺乳动物物种的NGF。
在一些实施方案中，本发明为包含由保藏号为ATCC NO.PTA-4893或ATCC NO.PTA-4894的宿主细胞产生的多核苷酸编码的轻链的抗体。另一方面，本发明为包含由保藏号为ATCC NO.PTA-4895的宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链的抗体。本发明也包含多种形式的E3及等同抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白及包含目的特异性抗原(NGF)识别位点的任何其它经修饰E3构型。通过以上描述的任何(一种或多种)标准，对E3等同抗体，包括E3的抗体及多肽片段(可为抗体或不为抗体)及包含E3多肽片段的多肽进行鉴定和表征。
因此，本发明提供了任何以下内容，或包含任何以下内容的组合物(包括药物组合物)：(a)抗体E3；(b)抗体E3的片段或区域；(c)如图1B中显示抗体E3的轻链；(c)如图1A中显示E3抗体的重链；(d)来自抗体E3轻链和/或重链的一个或多个可变区；(e)图1A及1B中显示的抗体E3的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；(f)图1A中显示的来自抗体E3重链的CDR H3；(g)图1B中显示来自抗体E3轻链的CDR L3；(h)如图1B中显示来自抗体E3轻链的三个CDR；(i)图1A中显示来自抗体E3重链的三个CDR；(j)图1A及1B中显示来自抗体E3轻链的三个CDR及重链的三个CDR；以及(k)包含(b)至(j)中任意一项的抗体。如自文中描述明显地，特别自本发明排除的为由与小鼠单克隆抗体911氨基酸序列相同的氨基酸序列组成的多肽实施方案。单克隆抗体911的延伸CDR序列在图1A及1B以及在SEQ IDNO：9-14中显示。
抗体E3的CDR部分(包括Chothia及Kabat CDR)在图1A及1B中以图解描述，并由以下氨基酸序列组成：(a)重链CDR 1(“CDR H1”) GFSLIGYDLN(SEQ ID NO：3)；(b)重链CDR 2(“CDR H2”)IIWGDGTTDYNSAVKS(SEQ ID NO：4)；(c)重链CDR 3(“CDR H3”)GGYWYATSYYFDY(SEQ ID NO：5)；(d)轻链CDR 1(“CDR L1”)RASQSISNNLN(SEQ ID NO：6)；(e)轻链CDR 2(“CDR L2”)YTSRFHS(SEQ ID NO：7)；和(f)轻链CDR 3(“CDR L3”)QQEHTLPYT(SEQ ID NO：8)。CDR区域的确定正好在本领域的技术中。理解在一些实施方案中，CDR可为Kabat及Chothia CDR的组合(也称为“组合CDR”或“延伸CDR”)。在一些实施方案中，CDR包含Kabat CDR。在其它实施方案中，CDR为Chothia CDR。
在一些实施方案中，本发明提供了包含与E3的至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少三个、至少四个、至少5个CDR基本上同源(或在一些实施方案中，与E3或衍生自E3的所有6个CDR基本上同源)的至少一个CDR的抗体。其它实施方案包括具有与E3的或衍生自E3的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR基本上同源的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR的抗体。对于本发明，理解虽然与E3相比活性程度可变化(可更大或更小)，但是一般保持结合特异性和/或总活性(对于治疗和/或预防疼痛或抑制E13.5小鼠三叉神经元依赖NGF的存活)。
本发明也提供了多肽(可为抗体或不为抗体)，其包含具有任何以下内容的E3氨基酸序列(图1A及1B中显示)：E3序列的至少5个连续氨基酸、至少8个连续氨基酸、至少约10个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约25个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸，其中至少3个氨基酸来自E3可变区，理解由与小鼠单克隆抗体911氨基酸序列相同的氨基酸序列组成的实施方案是特别排除的。单克隆抗体911的延伸CDR序列在图1A及1B中，以及在SEQ ID NO：9-14中显示。在一个实施方案中，可变区来自E3轻链。在另一个实施方案中，可变区来自E3重链。在另一实施方案中，5个(或5个以上)连续氨基酸来自图1A及1B中显示的E3的互补性决定区(CDR)。
在另一实施方案中，本发明提供了多肽，其包含具有以下内容任一种 的氨基酸序列：E3序列的至少5个连续氨基酸、至少8个连续氨基酸、至少约10个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约25个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸，其中E3序列包含任何一个或多个以下内容：CDRH1的氨基酸残基L29、CDRH2的I50、CDRH3的W101和/或CDRH3的A103；和/或CDRL1的氨基酸残基S28、CDRL1的N32、CDRL2的T51、CDRL3的91E和/或CDRL3的H92，理解由与小鼠单克隆抗体911氨基酸序列相同氨基酸序列组成的实施方案是特别排除的。
如本公开自始至终显然地，顺序氨基酸编号方案用于指可变区的氨基酸残基(即每个可变区中的氨基酸残基按顺序编号)。如本领域公知的，当比较两种抗体或多肽，如E3抗体及E3变体(或疑为E3变体的多肽)时，Kabat和/或Chothia编号系统是有用的。本领域很好理解，根据需要，如何将顺序编号转换为Chothia和/或Kabat编号，例如用于在E3及另一多肽之间进行比较。图23描述了用顺序、Chothia及Kabat编号进行编号的E3可变区。此外，为便于比较，一般理解构架残基一般，但不是常常具有约相同数目的残基。然而，CDR大小可变化(即有一个或多个氨基酸残基的插入或缺失是可能的)。当比较E3抗体及候选E3变体时(例如，对于来自候选序列的CDR区域，所述候选序列长于其所比对的抗体E3的序列)，可按照以下步骤(虽然其它方法是本领域已知的)。候选抗体序列与E3抗体重链及轻链可变区比对。比对可通过手工，或用通常公认的计算机程序通过计算机进行。比对可通过用一些大多数Fab序列常用的氨基酸残基方便地进行。例如轻链及重链每个一般有常常在保守位置发现的两个半胱氨酸。理解候选变体抗体的氨基酸序列可较长(即具有经插入氨基酸残基)或较短(具有经缺失氨基酸残基)。后缀可加到残基数中以表明插入的额外残基，例如残基34abc。例如，对候选序列其例如与E3序列比对例如残基33及35，但在候选序列之间没有残基与残基35比对，则残基35简单地不指派给残基。在另一方法中，当比较不同长度CDR时，可在结构等同(例如，抗原-抗体复合体的相同位置)氨基酸之间进行比较 是一般公知的。例如，Chothia编号(Al-Lazikani等人，同前)一般(但不是所有情况下)将插入及缺失置于结构正确位置。结构等同物也可用X射线晶体分析法或双突变循环分析(double mutant cycle analysis)(参见Pons等人，(1999)Prot.Sci.8：958-968)推导或证明。
抗NGF抗体与NGF(如hNGF)的结合亲和性可为约0.10至约0.80nM、约0.15至约0.75nM以及约0.18至约0.72nM。在一些实施方案中，结合亲和性为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或约40pM以上。在一个实施方案中，结合亲和性为约2pM及22pM之间。在其它实施方案中，结合亲和性为约10nM以下、约5nM、约4nM、约3.5nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM。在一些实施方案中，结合亲和性为约10nM。在其它实施方案中，结合亲和性约10nM以下。在其它实施方案中，结合亲和性为约0.1nM或约0.07nM。在其它实施方案中，结合亲和性约0.1nM以下或约0.07nM以下。在其它实施方案中，结合亲和性为约10nM、约5nM、约4nM、约3.5nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM中的任意一种至约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM的任意一种。在一些实施方案中，结合亲和性为约10nM、约5nM、约4nM、约3.5nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM的任意一项。又在其它实施方案中，结合亲和性为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或高于约40pM。
抗体与NGF的结合亲和性可用本领域公知的方法确定。如在实施例中描述的，确定抗体与NGF的结合亲和性的一种途径是通过测定抗体单功能Fab片段的亲和性。为获得单功能Fab片段，抗体(例如，IgG)可用木瓜蛋白酶切割或重组表达。如在实施例中描述的，抗体的抗NGF Fab片段的亲和性可通过表面胞质共振(BlAcore3000TM表面胞质共振(SPR)系统，BIAcore，INC，Piscaway NJ)。此方法适用于确定抗体与任何物种NGF的结合亲和性，包括人NGF、另一脊椎动物(在一些实施方案中，哺乳动物)的NGF(如小鼠NGF、大鼠NGF、灵长类动物NGF)以及用于其它神经营养蛋白，如相关神经营养蛋白NT3、NT4/5和/或BDNF。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体或多肽可以IC50(存在约15pM NGF)约200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM或10pM以下中的任意一种抑制(降低和/或阻断)小鼠E13.5三叉神经元依赖人NGF的存活。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或多肽可以IC50(存在约1.5pM NGF)约50pM、40pM、30pM、10pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或1pM以下中的任意一种抑制(降低和/或阻断)小鼠E13.5三叉神经元依赖人NGF的存活。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或多肽可以IC50(存在约15pM NGF)约150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或低于5pM中的任意一种抑制(降低和/或阻断)小鼠E13.5三叉神经元依赖大鼠NGF的存活。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或多肽可以IC50(存在约1.5pM NGF)约30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、1pM或低于1pM抑制(降低和/或阻断)小鼠E13.5三叉神经元依赖大鼠NGF的存活。用于测定小鼠E13三叉神经元依赖NGF存活的方法是本领域已知的，并例如在实施例2中描述。
本发明也提供了制备任何此类抗体或多肽的方法。本发明所述的抗体可通过本领域已知的步骤制备，其中一些在实施例中阐述。多肽可通过抗体的蛋白水解或其它降解产生，通过如以上描述的重组方法(即，单一或融合多肽)产生或通过化学合成产生。抗体的多肽，特别是多达约50个氨 基酸的较短多肽一般通过化学合成制备。化学合成的方法是本领域已知的并可商业上获得。例如E3抗体可用固相方法通过自动化多肽合成仪产生，也参见美国专利号5,807,715；4,816,567及6,331,415。嵌合或杂合抗体也可用合成蛋白质化学的已知方法，包括使用交联剂的方法在体外制备。例如，免疫毒素可用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键进行构建。用于此目的合适试剂的实例包括亚氨基硫羟酸盐和4-巯基丁亚氨酸甲酯。
在另一备选方案中，抗体可用本领域公知的方法重组制备。在一个实施方案中，将包含编码抗体E3可变区及轻链区域序列(如图1A及1B中显示)的多核苷酸克隆到载体中用于在宿主细胞(例如，CHO细胞)表达或增殖。在另一实施方案中，将图2及3中显示的多核苷酸序列克隆到一种或多种载体中用于表达或增殖。编码目的抗体的序列可在宿主细胞的载体中维持并且然后将宿主细胞扩大并冷冻用于将来应用。载体(包括表达载体)及宿主细胞在文中进一步描述。用于在植物或乳中重组表达抗体的方法已公开。参见，例如，Peeters等人，(2001)Vaccine 19：2756；Lonberg，N.和D.Huszar(1995)Int.Rev.Immunol 13：65；以及Pollock等人，(1999)J Immunol Methods 231：147。用于制备抗体衍生物，例如人源化抗体、单链抗体等的方法是本领域已知的。
本发明也包含本发明所述抗体如E3的单链可变区片段(“ScFV”)。单链可变区片段可通过用短连接肽连接轻链和/或重链可变区制备。Bird等人，(1988)Science 242：423-426。连接肽的实例为桥接一个可变区羧基端与另一可变区氨基末端之间约3.5nm的(GGGGS)3(SEQ ID NO：15)。已涉及并应用了其它序列的接头(Bird等人，(1988))。接头又可进行修饰用于其它功能，如连接药或连接固相支持体。单链变体可重组或合成产生。对scFv的合成产生，可用自动化合成仪。对于scFv的重组产生，可将包含编码scFv多核苷酸的合适质粒导入到合适宿主细胞，其为真核细胞，如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞或原核细胞，如大肠杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可通过常规操作如连接多核苷酸制备。产生的scFv可用本领域已知的标准蛋白质纯化技术进行分离。
也包含其它形式的单链抗体，如双体(diabodies)。双体为二价、双特异抗体，其中VH及VL结构域在单一多肽链上表达，但所用接头太短而不能使同一链上的两个结构域配对，因此迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger，P.，等人(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。
抗体可为具有至少两种不同抗原结合特异性的双特异抗体、单克隆抗体。双特异抗体可用文中公开的抗体进行制备。用于制备双特异抗体的方法是本领域已知的(参见，例如Suresh等人，1986，Methods in Enzymology121：210)。一般地，双特异抗体的重组产生基于两种免疫球蛋白重链-轻链对共表达，所述两条重链具有不同特异性(Millstein和Cuello，1983，Nature 305，537-539)。
根据制备双特异抗体的方法，具有目的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选与包含至少部分铰链、CH2及CH3区域的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。优选在至少一种融合体中具有包含轻链结合所需的位点的第一个重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体，以及如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入到各自表达载体中，并共转染到合适宿主生物中。当构建体中应用不等比例的三种多肽链提供最佳产量时，这在实施方案中提供了调整所述三种多肽链相互比率的极大灵活性。然而，当以相等比率表达至少两种多肽链产生高产率或当比率不特别重要时，在一个表达载体中插入两种或所有三种多肽链的编码序列是可能的。
在一种方法中，双特异抗体由在一条臂上具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和在另一条臂上杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供了第二种结合特异性)组成。这只在一半双特异分子中具有免疫球蛋白轻链的不对称结构有助于目的双特异化合物自不想要的免疫球蛋白链组合分离。此方法在1994年3月3日公开的PCT公开号WO 94/04690中进行描述。
包含两个共价连接抗体的异源结合抗体(heteroconjugate antibody)也在本发明范围内。此类抗体用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(PCT申请公开号WO 91/00360及WO 92/200373；EP 03089)。异源结合抗体可用任何常规交联方法制备。合适的交联剂及技术是本领域公知的，并在美国专利号4,676,980中描述。
抗体可为人源化抗体，例如，如本领域已知的并在文中描述的。
抗体可如在1999年11月18日公开的PCT公开号WO 99/58572中描述的进行修饰。除了针对靶分子的结合结构域外，此类抗体包含具有与人免疫球蛋白重链恒定结构域所有或部分基本上同源的氨基酸序列的效应子结构域。此类抗体能结合靶标分子而不引发显著补体依赖的裂解，或靶的细胞介导的破坏。优选地，效应子结构域能特异结合FcRn和/或FcγRIIb。这些抗体一般基于衍生自两种或多种人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以此方式修饰的抗体优选用于慢性抗体治疗，以避免对常规抗体治疗的炎性反应及其它不利反应。
本发明包含抗体E3的修饰，包括不显著影响它们特性的功能等同抗体以及具有增强或降低活性的变体。多肽的修饰为本领域中的常规操作并进一步在实施例中示例。经修饰多肽的实例包括用氨基酸残基替代(包括保守性替代)、不显著有害改变功能活性的一个和多个氨基酸缺失或添加或者使用化学类似物的多肽。
如文中应用的，多肽“变体”为与天然蛋白质的不同处在于一个或多个替代、缺失、添加和/或插入，而导致所述多肽的免疫反应性基本上没有降低的多肽。换言之，变体特异结合抗原的能力相对于天然蛋白质可增强或不变，或相对于天然蛋白质可降低50％以下，并优选20％以下。多肽变体优选显示与经鉴定多肽至少约80％，更优选至少约90％以及最优选至少约95％同一性(如文中描述确定的)。
抗体的氨基酸序列变体可通过在抗体DNA中导入适当核苷酸变化或通过肽合成制备。此变体包括，例如，文中描述SEQ ID NO：1或2氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或替代。进行任何缺失、插入及替代的任 何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有目的特征。氨基酸变化也改变抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。
用于鉴定抗体某些残基或区域为诱变或修饰优选部位的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”并由Cunningham和Wells，1989，Science，244：1081-1085描述。鉴定了靶残基的残基或基团(例如，带电荷残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸及谷氨酸)并由中性或带负电荷氨基酸(最优选丙氨酸或多丙氨酸)替代以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后对证实对替代功能敏感性的那些氨基酸部位通过在或对替代的位置导入其它变体进行完善。因此，虽然预先确定了用于导入氨基酸序列变异的位点，突变本身的性质不需要预先确定。例如，为分析在给定位点突变的性能，在靶密码子或靶区域进行了丙氨酸扫描或随机诱变并对经表达抗体变体的目的活性进行筛选。如文中描述的，文库扫描诱变也可用于鉴定抗体中适合诱变或修饰的部位。
氨基酸序列插入包括长度为一个残基至包含一百或一百个以上残基多肽的氨基和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或与表位标记物融合的抗体。其它抗体分子的插入变体包括抗体的N或C端与增加抗体血清半衰期的酶或多肽的融合体。
替代变体在抗体部分中去除至少一个氨基残基并且在此位置插入一个不同的残基。替代诱变的最令人感兴趣的位点包括超变区，但也考虑FR改变。保守性替代在表1“保守性替代”标题下显示。如果此替代导致生物学活性的变化，然后可导入表1中称为“示例替代”，或如以下关于氨基酸类进一步描述的更多实质变化并对产物进行筛选。
表1：氨基酸替代
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抗体生物学特性的基本修饰是通过选择在它们的维持以下内容作用中显著不同的替代完成的，所述以下内容为：(a)在替代区域中的多肽主链结构，例如，折叠或螺旋构型，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。基于一般侧链性质，天然存在残基分为：
(1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；
(2)中性亲水：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；
(4)碱性：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；
(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和
(6)芳香性：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守性替代是通过将这些类之一中一个成员交换为另一类成员实施的。
不参与维持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基也可替代，一般使用丝氨酸替代，以改善分子的氧化稳定性并防止错误交联。相反地，特别是当抗体为抗体片段如Fv片段时，可将半胱氨酸键加入抗体中以提高其稳定性。
氨基酸修饰可自改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计区域，如可变区。可变区的变化可改变结合亲和性和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR结构域中进行仅一至五个保守性地氨基酸替代。在其它实施方案中，在CDR结构域进行仅一至三个保守性氨基酸替代。又在其它实施方案中，CDR结构域为CDRH3和/或CDR L3。
修饰也包括糖基化及非糖基化多肽，以及具有其它翻译后修饰，例如不同糖的糖基化、乙酰化及磷酸化的多肽。抗体在它们恒定区的保守性部位糖基化(Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright和Morrison，1997，TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响 蛋白质的功能(Boyd等人，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe和Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)及糖蛋白部分之间分子内相互作用，所述分子内相互作用可影响糖蛋白构象和呈现的三维表面(Hefferis和Lund，同上，Wyss和Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)。基于特异识别结构，寡糖也可将给定糖蛋白靶定某些分子。也报道抗体的糖基化影响依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。特别地，报道具有催化二等分GlcNAc形成的糖基转移酶-β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)经四环素调节表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性(Umana等人，1999，Mature Biotech.17：176-180)。
抗体的糖基化一般为N-连接或O-连接。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸以及天冬酰胺-X-苏氨酸为酶连接碳水化合物部分与天冬酰胺残基的识别序列，其中所述X为除脯氨酸外的任何氨基酸。因此，在多肽中存在这些三肽序列产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸连接，尽管也可用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使它包含一个或多个以上描述的三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，方便的完成在抗体加入糖基化位点。通过在原抗体序列加入或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)，也可进行改变。
也可改变抗体的糖基化模式而不改变其根本的核苷酸序列。糖基化主要取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白，例如抗体的细胞型很少为天然细胞，抗体糖基化模式的变化是可预计的。(参见，例如，Hse等人，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了宿主细胞选择外，在抗体重组产生期间影响糖基化的因素包括生长方式、培养基组成、培养物密度、充氧、pH、纯化方案等等。提出了多种在特定宿主生物体改变糖基化模式的方法，包括导入或过表达参与寡糖产生的某些酶(美国专利号5,047,335；5,510,261及5,278,299)。糖基化， 或某些类的糖基化，可自糖蛋白中酶促去除，例如用内切糖苷酶H(EndoH)。此外，可将重组宿主细胞进行遗传改造使其某些类型多糖的加工中有缺陷。这些及相似技术是本领域公知的。
其它修饰方法包括用本领域已知的偶连技术，包括但不限于酶法、氧化取代及螯合作用。例如修饰可用于结合免疫测定法的标记物。经修饰E3多肽用本领域成熟方法制备并可用本领域已知标准测定法进行筛选，其中一些在以下及实施例中描述。
其它抗体修饰包括如在1999年11月8日公开的PCT公开号WO99/58572中描述的进行修饰的抗体。除了针对靶分子的结构域外，抗体还包含具有与人免疫球蛋白重链恒定结构域所有或部分基本上同源的氨基酸序列的效应子结构域。此类抗体能结合靶分子而不引靶标的显著的补体依赖的裂解或细胞介导的破坏。在一些实施方案中，效应子结构域能特异结合FcRn和/或FcγRIIb。这些抗体一般基于衍生自两种或多种人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。以此种方式修饰的抗体特别适用于慢性抗体治疗，以避免对常规抗体治疗的炎性及其它不利反应。
本发明也包含来自本发明所述抗体(如E3)或多肽的一个或多个片段或区域的融合蛋白。在一个实施方案中，提供了包含图1B中显示的可变轻链区至少10个连续氨基酸和/或图1A中显示的可变重链区至少10个氨基酸的融合多肽。在另一实施方案中，融合多肽包含如图1A及1B中显示的E3的轻链可变区和/或重链可变区。在另一实施方案中，融合多肽包含E3的一个和多个CDR。又在另一实施方案中，融合多肽包含抗体E3的CDR H3和/或CDR L3。在另一实施方案中，融合多肽包含任意一个或多个：CDRH1的氨基酸残基L29、CDRH2的I50、CDRH3的W101和/或CDRH3的A103；和/或CDRL1的氨基酸残基S28、CDRLl的N32、CDRL2的T51、CDRL3的91E和/或CDRL3的H92。对于本发明，E3融合蛋白包含一个或多个E3抗体及在天然分子中不结合的另一氨基酸序列，例如另一区域的异源序列或同源序列。示例的异源序列包括但不限于“标记物”如FLAG标记物或6His标记物。标记物是本领域公知的。
E3融合多肽可通过本领域已知的方法，例如合成或重组制备。一般地，本发明所述的E3融合蛋白通过表达用文中描述的重组方法制备的编码所述融合蛋白的多核苷酸进行制备，虽然它们也可通过本领域已知的其它方法，包括例如化学合成进行制备。
本发明也提供了包含与有助于偶联固相支持体的试剂(如生物素或抗生物素蛋白)结合(例如，连接)的E3抗体或多肽的组合物。为了简便，由于理解此类方法应用于文中描述的任何NGF结合实施方案，一般参考E3或抗体。结合一般是指连接文中描述的这些组分。连接(一般以密切结合固定这些组分至少用于施用)可以任何方式完成。例如，当试剂和抗体每种具有能与另一种反应的取代基时，该试剂及抗体之间的直接反应是可能的。例如，试剂和抗体之一上的亲核基团如氨基或巯基能与其另一试剂和抗体上的包羰基基团如酐或或酸卤化物，或与包含优良离去基团(例如，卤化物)的烷基发生反应。
本发明所述抗体或多肽可与标记试剂(备选称为“标记物”)如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其它标记物连接。一般提供(直接或间接)信号的标记物是本领域已知的。因此，本发明包括经标记抗体及多肽。
本发明所述抗体及多肽的能力，如结合NGF；降低或抑制NGF生物学活性；降低和/或阻断经NGF诱导E13.5小鼠三叉神经元的存活可用本领域已知的方法检测，其中一些方法在实施例中描述。
本发明也提供了包含抗体E3以及如本公开解释的，文中描述的任何或所有抗体和/或多肽的组合物(包括药物组合物)及试剂盒。
多核苷酸、载体及宿主细胞
本发明也提供了编码本发明所述抗体及多肽的经分离多核苷酸(包括包含图1A及1B中显示轻链及重链可变区多肽序列的抗体)，及包含多核苷酸的载体及宿主细胞。
因此，本发明提供了多核苷酸(或组合物，包括药物组合物)，其包 含编码任何以下内容的多核苷酸：(a)抗体E3；(b)抗体E3的片段或区域；(c)如图1B中显示抗体E3的轻链；(d)如图1A中显示抗体E3的重链；(e)来自抗体E3轻链和/或重链的一个或多个可变区；(f)图1A及1B中显示抗体E3的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；(g)来自图1A中显示抗体E3重链的CDR H3；(h)来自图1B中显示抗体E3轻链CDR L3；(i)来自图1B中显示抗体E3轻链的三个CDR；(j)来自图1A显示抗体E3重链的三个CDR；(k)来自图1A及1B中显示抗体E3轻链的三个CDR及重链的三个CDR；或(1)包含(b)至(k)中任意一项的抗体。在一些实施方案中，多核苷酸包含图2及图3中显示的一种或两种多核苷酸。
另一方面，本发明为编码保藏号为ATCC NO.PTA-4893或ATCCNO.PTA-4894的E3轻链的经分离多核苷酸。另一方面，本发明为编码保藏号为ATCC NO.PTA-4895的E3重链的经分离多核苷酸。又一方面，本发明为包含以下内容的经分离多核苷酸：(a)保藏号为ATCC NO.PTA-4894多核苷酸中编码的可变区和(b)保藏号为ATCC NO.PTA-4895多核苷酸中编码的可变区。另一方面，本发明为包含以下内容的经分离多核苷酸：(a)保藏号为ATCC NO.PTA-4894多核苷酸中编码的一个或多个CDR；和/或(b)保藏号为ATCC NO.PTA-4895多核苷酸中编码的一个或多个CDR。
另一方面，本发明提供了多核苷酸，其编码文中描述的任意抗体(包括抗体片段)及多肽。多核苷酸可通过本领域已知的方法制备。
另一方面，本发明提供了包含本发明所述任意多核苷酸的组合物(如药物组合物)。在一些实施方案中，组合物包含表达载体，其包含编码如文中描述E3抗体的多核苷酸。在其它实施方案中，组合物包含表达载体，其包含编码文中描述任意抗体或多肽的多核苷酸。又在其它实施方案中，组合物包含图2及图3中显示的一种或两种多核苷酸。表达载体以及多核苷酸组合物的施用在文中进一步描述。
另一方面，本发明提供了制备文中描述任意多核苷酸的方法。
本发明也包含与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可为单链(编码链或反义链)或双链的，且可为DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括包含内含子并以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子，以及不包含内含子的mRNA分子。其它编码或非编码序列可以，但不必要存在于本发明所述的多核苷酸中，并且多核苷酸可以，但不必要与其它分子和/或载体材料连接。
多核苷酸可包含天然序列(即编码抗体或其部分的内源性序列)或可包含此种序列的变体。多核苷酸变体包含一个或多个替代、添加、缺失和/或插入使所编码多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子不减少。对编码多肽免疫反应性的作用一般可如文中描述进行评估。变体优选显示与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列至少约70％同一性，更优选至少约80％同一性，最优选至少约90％同一性。
当如以下描述对最大对应性比对时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列是相同的，认为这两个多核苷酸或多肽序列是“同一”的。两个序列之间的比较一般通过在比较窗口比较序列以鉴定并比较序列相似性的局部区域进行。如文中应用的，“比较窗口”是指至少约20个连续位置，一般30至约75个，40至约50个位置的片段，其中在两个序列最佳比对后序列可与相同数目连续位置的参考序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可用生物信息学软件Lasergene suite(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Megalign程序用默认参数进行。这个程序具体体现了以下参考文献中描述的几种比对方案：在Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.在Dayhoff，M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，Washington DC第5卷，Suppl.3，第345-358页一书中；Hein J.，1990，Unified Approach to Alignment and Phylogenes第626-645页一书中，Methods in Enzymology第183卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA一书中；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，1989，CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.， 1988，CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.，Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
优选地，“序列同一性百分率”是通过在至少20个位置比较窗口比较两个最佳比对的序列确定的，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含20％或20％以下，一般5至15％，或10至12％的添加或缺失(即缺口)。百分率通过确定在两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基以产生匹配的位置数，将匹配位置数除以参考序列位置总数(即窗口大小)并将所得结果乘以100以得到序列同一性的百分率进行计算。
变体也可，或备选的与天然基因；或其部分或互补体基本同源。此多核苷酸变体能在中等严格条件下与编码天然抗体的天然存在DNA序列(或互补序列)杂交。
合适的“中等严格条件”包括在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)溶液中预洗；于50℃-65℃，5X SSC杂交过夜；接着用包含0.1％SDS的每种2X、0.5X及0.2X SSC于65℃洗涤两次，每次20分钟。
如文中应用的，“高度严格条件”或“高严格条件”为：(1)用高离子强度及高温洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠于50℃；(2)杂交期间用变性剂，如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲剂与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠于42℃；或(3)用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、经超声处理鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖于42℃，在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗以及于55℃50％甲酰胺中洗，接着于55℃由含有EDTA的0.1x SSC组成的高严格条件洗。技术人员可认识如何调整 温度、离子强度等等(如需要)以调整因子如探针长度等等。
本领域普通技术人员应当理解，作为遗传密码简并性的结果，有很多编码如文中描述的多肽的核苷酸序列。一些所述多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列有最低同源性。虽然如此，由于密码子选择差异而变化的多核苷酸是本发明特别考虑的。此外，包含文中提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明范围内。等位基因是作为核苷酸的一种或多种突变，如缺失、添加和/或替代结果而改变的内源基因。产生的mRNA及蛋白质可以，但不必要具有改变的结构或功能。等位基因可用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)进行鉴定。
本发明所述的多核苷酸可用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域公知的并且不需要在文中详细描述。本领域技术人员可用文中提供的序列及商品化DNA合成仪产生目的DNA序列。
对用重组方法制备多核苷酸，如文中进一步讨论的，包含目的序列的多核苷酸可插入到合适载体中，并且该载体又可导入到合适宿主细胞用于复制及扩增。多核苷酸可通过本领域已知的任何方法插入到宿主细胞中。细胞通过直接摄入、胞吞、转染、F-接合或电穿孔导入外源多核苷酸进行转化。一旦导入，外源多核苷酸可在细胞内作为非整合载体(如质粒)在细胞中保持或整合到宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可自宿主细胞通过本领域公知的方法分离。参见，例如，Sambrook等人(1989)。
备选地，PCR可以复制DNA序列。PCR技术是本领域公知的并在美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065及4,683,202以及PCR：The Polymerase Chain Reaction，Mullis等人编辑，Birkauswer Press，Boston(1994)一书中描述。
可用适当载体中的经分离DNA得到RNA并将其插入到合适宿主细胞中。例如，如在Sambrook等人，(1989)中示出的，当细胞复制并且DNA转录成RNA时，可用本领域技术人员公知的方法分离RNA。
合适的克隆载体可根据标准技术构建，或可自本领域可获得的大量克隆载体中选择。虽然经选择克隆载体可根据欲应用的宿主细胞而变化，有 用的克隆载体一般具有自身复制的能力、可具有特定限制性内切核酸酶的单一靶标和/或可携带用于选择包含载体的克隆的标记物基因。合适的实例包括质粒及细菌病毒，例如，pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物，mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA以及穿梭载体如pSA3及pAT28。这些及许多其它克隆载体自商业销售商如BioRad、Strategene及Invitrogen获得。
表达载体一般为包含根据本发明所述多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。暗示表达载体在宿主细胞中作为游离体或作为染色体DNA的整合部分必须是可复制的。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、粘粒及在PCT公开号WO 87/04462中公开的表达载体。载体组分一般可包括但不限于一个或多个以下内容：信号序列；复制起点；一种或多种标记物基因；合适的转录控制元件(如启动子、增强子及终止子)。对于表达(即翻译)，一般也需要一种或多种翻译控制元件，如核糖体结合位点、翻译起始位点及终止密码子。
包含目的多核苷酸的载体可通过许多适当方法中的任意一种导入到宿主细胞中，所述适当方法包括电穿孔、用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质转染；微粒轰击、脂转染及感染(例如，当载体为感染物如痘苗病毒时)。导入载体或多核苷酸的选择常常取决于宿主细胞的特征。
本发明也提供了包含文中描述多核苷酸任意一种的宿主细胞。能过表达异源DNA的任何宿主细胞可用于分离编码目的抗体、目的多肽或目的蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa及CHO细胞。也参见PCT公开号WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核细胞(如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))及酵母(如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酯因(S.pombe)或乳酸克鲁维醇母(K.lactis))。优选地，宿主细胞以约5倍高于、更优选10倍高于、甚至更优选20倍高于宿主细胞中(如果存在)的对应内源性抗体或目的蛋白质的水平表达cDNA。对特异结合NGF的宿主细胞的筛 选通过免疫测定法或FACS实现。可鉴定过表达目的抗体或蛋白质的细胞。
用E3及经E3衍生抗体的方法
结合NGF的抗体E3可用于鉴定或检测NGF的存在或缺乏。为了简便，理解这些方法应用于任何文中描述的NGF结合实施方案(如多肽)，一般参考E3或抗体。检测一般涉及生物学样本与文中描述的结合NGF的抗体接触并在NGF及特异结合NGF的抗体(例如，E3)之间形成复合体。此种复合体的形成可为体外或体内。如文中应用的术语“检测”包括参考或不参考对照的定性和/或定量检测(测量水平)。
多种已知方法的任意一种可用于检测，所述方法包括但不限于用结合多肽的抗体的免疫测定法，例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)等等；以及用于经编码多肽的功能测定法，例如结合活性或酶测定法。在一些实施方案中，对抗体进行了可检测标记。
E3及衍生物的诊断性用途
本发明所述的抗体及多肽可用于检测、诊断及监测与改变或异常NGF表达(在一些实施方案中，NGF表达升高或降低)(相对于正常样本)和/或不适当表达，如在通常缺乏NGF表达的组织和/或细胞中存在表达或在通常具有NGF表达的组织或细胞缺乏NGF表达)相关的病、疾病或病症。本发明所述的抗体及多肽进一步用于检测例如，对NGF敏感性或反应性改变或异常的相关疾病中NGF表达。在一些实施方案中，对来自怀疑患有以NGF表达敏感性或反应性改变或异常为特征或相关的疾病、病症(例如，其中NGF促进生长和/或转移的癌)的个体样本中的NGF表达进行了检测。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含患经改变或异常NGF表达个体的标本(样本)与本发明所述抗体或多肽接触的方法以及确定NGF水平是否不同于对照或比较标本的方法。在一些实施方案中，个体患心率失常、阿尔茨海默氏病和/或自主机能异常。
在其它实施方案中，本发明提供了包含接触个体的标本(样品)并确定NGF表达水平的方法。在一些实施方案中，个体被怀疑患以NGF表达经改变或异常敏感性或反应性为特征或相关的疾病、病症。在一些实施方案中，个体患小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或黑素瘤。
对于诊断性应用，抗体一般用可检测部分标记，所述可检测部分包括但不限于放射性同位素、荧光标记物及多种酶-底物标记物。将标记物结合抗体的方法是本领域已知的。在本发明的其它实施方案中，本发明所述的抗体不需要标记，并且本发明抗体的存在可用结合本发明所述抗体的经标记抗体进行检测。
本发明所述抗体可在任何已知测定法，如竞争结合测定法、直接及间接夹心测定法以及免疫沉淀测定法中应用。在Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques一书中的第147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
抗体也可用于体内诊断测定法，如体内成像。一般而言，抗体用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)标记使目的细胞或组织可用免疫闪烁照相术(immunoscintiography)进行定位。
根据本领域公知的技术，抗体也可用作病理学中的染色试剂。
E3及衍生物用于治疗目的的方法
抗体E3用于降低和/或阻断NGF的生物学活性。相信此拮抗活性用于治疗与内源性NGF产生相关的病理学疾病，如疼痛。一般而言，在这些实施方案中向个体施用有效量。因此，一方面，本发明提供了用文中公开的任意多肽(包括抗体如抗体E3)拮抗人NGF生物学活性的方法。在一个实施方案中，方法包含将人神经生长因子与文中描述的任意多肽(包括抗体E3)接触，从而人神经生长因子活性受到拮抗、降低、阻断或抑制。又在一实施方案中，患疼痛(如手术后疼痛或类风湿疼痛)个体用E3治疗。
为了简便，理解这些方法应用于文中描述的任意E3变体抗体及多肽， 一般谈及E3或抗体。
E3或E3片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)如单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白及包含具有目的特异性的抗原NGF识别位点的任何其它经修饰E3构型的多种剂型可用于施用。在一些实施方案中，E3抗体或其E3多种剂型可直接施用。在其它实施方案中，可施用E3或其E3的多种剂型(包括文中描述的任何组合物实施方案)以及可药用赋形剂可并施用多种剂型。可药用赋形剂是本领域公知的，并为有助于施用药理学有效物质的相对惰性物质。例如，赋形剂可形成形状或稠度，或作为稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿润剂及乳化剂，用于改变渗透性的盐、胶囊化剂、缓冲剂及皮肤穿透促进剂。赋形剂以及用于肠胃外及非肠胃外药物递送的剂型在Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing(2000)一书中示出。
在一些实施方案中，将这些试剂制备用于注射施用(例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌内等)，虽然也可用其它施用方式(例如，经口、粘膜、通过吸入、舌下等)。因此，E3抗体及其等同物优选与可药用载体如盐水、林格液、右旋糖溶液等等组合。特定剂量方案，即剂量、时间选择及重复取决于特定个体及该个体的医疗史。一般而言，可用任何以下剂量：施用至少约50mg/kg体重；至少约10mg/kg体重；至少约3mg/kg体重；至少约1mg/kg体重；至少约750μg/kg体重；至少约500μg/kg体重；至少约250μg/kg体重；至少约100μg/kg体重；至少约50μg/kg体重；至少约10μg/kg体重；至少约1μg/kg体重或低于1μg/kg体重的剂量。对于几天或几天以上的重复施用，取决于疾病，进行持续治疗直至出现疾病症状的目的抑制。示例剂量方案包含施用约2mg/kg的最初剂量，接着约1mg/kg抗NGF抗体的周维持剂量或接着每两周约1mg/kg的维持剂量。然而，取决于开业医生所希望达到的药物代谢动力学消退的模式，其它剂量方案是有用的。经验考虑如半衰期，一般有助于确定剂量。此治疗的进展通过常规技术及测定法易于监测。
在一些个体中，可需要一个以上的剂量。在治疗期间可确定及调整施 用频率。例如，基于欲进行治疗疼痛的类型及严重度，施用试剂是用于预防性或治疗性目的、以前治疗、患者的临床历史及对试剂的反应，以及主治医生的判定，可确定或调整施用频率。一般地临床医生施用抗NGF拮抗剂抗体(如E3)直至剂量达到目的结果。一些情况下，E3抗体的持久的持续释放剂型是适当的。用于完成持续释放的多种剂型及设备是本领域已知的。
在一个实施方案中，E3抗体(或多肽)的剂量可以在施用一次或多次的个体中＊经验确定。对个体施用增加剂量的E3。为评估E3或其它等价抗体的功效，可对疾病症状(如疼痛)的标记物进行监测。
例如，取决于受者的生理条件、施用目的是治疗性或预防性以及熟练开业医生已知的其它因素，根据本发明所述的方法施用抗体(如E3)或多肽可为连续的或间断的。抗体的施用在预选择时间期间可基本上为连续的或可为一连串的间隔剂量，例如在疼痛发展之前、期间或以后疼痛之前、期间、之前及以后，期间及以后、或之前、期间及以后。可在创伤、切割、外伤、手术以及可能引起手术后疼痛的任何事件之前、期间和/或以后施用。
其它剂型包括本领域已知的合适递送形式，包括但不限于载体如脂质体。参见，例如，Mahato等人，(1997)Pharm.Res.14：853-859。脂质体制剂包括但不限于细胞转染剂、多层脂质体及单层脂质体。
在一些实施方案中，可存在一种以上抗体或多肽。抗体可为单克隆或多克隆的。此类组合物可包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同抗体。抗体的混合物，如它们在本领域常常表示的，可特别用于治疗较广泛范围的个体群体。
编码本发明所述任何抗体或多肽(如抗体E3)的多核苷酸也可用于递送且在目的细胞中表达本发明所述的任何抗体或多肽。表达载体可用于直接表达E3抗体或多肽是显然的。表达载体可通过本领域已知的任何方法，如腹膜内、静脉内、肌内、皮下、鞘内、心室内、经口、肠内、肠胃外、鼻内、皮肤、舌下或通过吸入施用。例如，表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、经口施用、基因枪或经导管施用以及局部施用。本领 域技术人员熟悉表达载体的施用以获得外源蛋白质在体内的表达。参见，例如，美国专利号6,436,908；6,413,942及6,376,471。
也可用包含编码本发明所述任意抗体或多肽(如抗体E3)的多核苷酸的治疗性组合物定向递送。受体介导的DNA递送技术，例如在Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff，编辑)(1994)一书中；Wu等人，J Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等人，J Biol.Chem.(1991)266：338中描述。包含多核苷酸的治疗性组合物在约100ng至约200mg DNA范围内在基因治疗方案中用于局部施用。在所述基因治疗方案期间，也可应用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg以及约20μg至约100μg DNA的浓度范围。本发明所述的治疗性多核苷酸及多肽可用基因递送载体递送。基因递送载体可为病毒或非病毒来源(一般而言参见，Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185；以及Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。此类编码序列的表达可用内源性哺乳动物或异源启动子诱导。编码序列的表达可为构成型或调节型。
用于递送目的多核苷酸并在目的细胞中表达的基于病毒的载体是本领域公知的。示例性基于病毒的载体包括但不限于重组反转录病毒(参见，例如，PCT公开号WO 90/07936；WO94/03622；WO 93/25698；WO93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利号5,219,740；4,777,127；GB专利号2,200,651；以及EP专利号0345242)、基于甲病毒的载体(例如，辛德比斯病毒载体、Semliki森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCCVR-1246)及委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCCVR 1249；ATCC VR-532)以及腺伴随病毒(AAV)载体(参见，例如，PCT公开号WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938； WO95/11984及WO 95/00655)。如在Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的，也可应用施用与经杀死腺病毒连接的DNA。
也可用非病毒递送载体及方法，包括但不限于与经杀死腺病毒连接的或不与经杀死病毒连接的聚阳离子浓缩DNA(参见，例如，Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；经配体连接DNA(参见，例如，Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核细胞递送载体细胞(参见，例如，美国专利号5,814,482；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763及WO 97/42338)以及核电荷中和作用或与细胞膜融合。也可用裸DNA。示例性的裸DNA导入方法在PCT公开号WO 90/11092及美国专利号5,580,859中描述。可作为基因递送载体的脂质体在美国专利号5,422,120；PCT专利号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；以及EP专利号0524968中描述。其它方法在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411及在Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述。
对于文中描述的所有方法，当谈及抗NGF拮抗剂抗体也包括包含一个或多个这些制剂的组合物。这些组合物可进一步包含合适的赋形剂，如包括缓冲剂的可药用赋形剂，它们为本领域公知。本发明可单一应用或与其它常规治疗方法组合应用。
用抗NGF拮抗剂抗体治疗或预防类风湿性关节炎疼痛的方法
一些方面，本发明提供了在个体包括人及非人的哺乳动物中用于治疗和/或预防类风湿性关节炎疼痛的方法。因此，一方面，本发明提供了在个体中治疗类风湿性关节炎疼痛的方法，其包括施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体。抗NGF拮抗剂抗体是本领域公知的并在文中描述。
另一方面，本发明提供了在个体中用于降低、缓解、抑制、减轻和/或延迟类风湿性关节炎疼痛的发生、发展或进展发生率的方法。因此，在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体在患类风湿性关节炎个体疼痛发展前或疼痛发作时施用。
另一方面，本发明提供了在个体中用于治疗与类风湿性关节炎相关炎 性恶病质(体重减轻)的方法，其包括施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体(Roubenoff等人，Arthritis Rheum.40(3)：534-9(1997)；Roubenoff等人，J.Clin.Invest.93(6)：2379-86(1994))。
本领域中良好地建立了对类风湿性关节炎疼痛的诊断或评估。评估基于本领域已知方法进行，如用多种疼痛标准的患者疼痛特征。参见，例如，Katz等人，Surg Clin North Am.(1999)79(2)：231-52；Caraceni等人，JPain Symptom Manage(2002)23(3)：239-55，也用通常应用的测定疾病状态的标准如美国风湿病学学院(ACR)(Felson，等人，Arthritis and Rheumatism(1993)36(6)：729-740)、健康评定问卷(HAQ)(Fries，等人，(1982)J.Rheumatol.9：789-793)、Paulus标准(Paulus，等人，Arthritis and Rheumatism(1990)33：477-484)及关节炎影响测量标准(AIMS)(Meenam，等人，Arthritis and Rheumatology(1982)25：1048-1053)。抗NGF拮抗剂抗体可通过任何合适途径向个体施用。文中描述了不同施用途径的实例。
疼痛减轻可以减轻的时间过程为特征。因此，在一些实施方案中，在施用抗NGF拮抗剂抗体后约24小时观察到疼痛减轻。在其它实施方案中，在施用抗NGF拮抗剂抗体后约36、48、60、72小时或4天观察到疼痛减轻。又在其它实施方案中，在观察到与类风湿性关节炎相关炎性疾病改善征候前观察到疼痛减轻。在一些实施方案中，疼痛的频率和/或强度降低，和/或患疾病的患者的生活质量提高。
以下部分的章节中描述了用于这些方法的抗NGF抗体的制备及应用(“抗NGF拮抗剂抗体”；“抗NGF拮抗剂抗体的鉴定”；“抗NGF拮抗剂抗体的施用”)
用抗NGF拮抗剂抗体治疗或预防骨关节炎疼痛的方法
一些方面，本发明提供了在个体，包括人及非人哺乳动物中用于治疗和/或预防骨关节炎疼痛的方法。因此，一方面，本发明提供了在个体中治疗骨关节炎疼痛的方法，其包括施用有效量的抗NGF拮抗剂抗体。抗NGF 拮抗剂抗体是本领域已知的并在文中描述。
另一方面，本发明提供了在个体中用于降低、缓解、抑制、减轻和/或延迟骨关节炎疼痛发生、发展或进展发生率的方法。因此，在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体在患骨关节炎个体疼痛发展前或疼痛发作时施用。
在本领域中良好地建立了骨关节炎疼痛的诊断或评估。基于本领域已知方法进行评估，如用多种疼痛标准的患者疼痛特征。参见，例如，Katz等人，Surg Clin North Am.(1999)79(2)：231-52；Caraceni等人，J Pain Symptom Manage(2002)23(3)：239-55。例如，可用WOMAC移动疼痛标准(包括疼痛、强直及身体功能)以及100mm直观模拟标准(VAS)评估疼痛并评估对治疗的反应。
抗NGF拮抗剂抗体可通过任何合适途径向个体施用。不同施用途径的实例在文中描述。
减轻疼痛可以减轻的时间过程为特征。因此，在一些实施方案中，在施用抗NGF拮抗剂抗体后约24小时观察到疼痛减轻。在其它实施方案中，在施用抗NGF拮抗剂抗体后约36、48、60、72小时或4天观察到疼痛减轻。在一些实施方案中，疼痛的频率和/或强度降低，和/或患疾病的患者的生活质量提高。
以下节中描述了用于这些方法的抗NGF抗体的制备及应用(“抗NGF拮抗剂抗体”；“抗NGF拮抗剂抗体的鉴定”；“抗NGF拮抗剂抗体的施用”)。
抗NGF拮抗剂抗体
本发明所述的方法(关于类风湿性关节炎疼痛及骨关节炎疼痛)用抗NGF拮抗剂抗体，所述抗NGF拮抗剂抗体是指阻断、抑制或降低(包括显著降低)NGF生物学活性包括通过NGF信号介导的下游途径，如受体结合和/或引发对NGF细胞反应的任何抗体分子。
抗NGF拮抗剂抗体应显示一个或多个以下特征：(a)结合NGF并 抑制NGF生物学活性或由NGF信号功能介导的下游途径；(b)预防、缓解或治疗类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛的任何方面；(c)阻断或降低NGF受体活性(包括TrkA受体二聚化和/或自磷酸化作用)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(降低)NGF合成、产生或释放。抗NGF拮抗剂抗体是本领域已知的，参见，例如，PCT公开号WO 01/78698、WO 01/64247、美国专利号5,844,092、5,877,016及6,153,189；Hongo等人，Hybridoma，19：215-227(2000)；Cell.Molec.Biol.13：559-568(1993)；基因库(GenBank)登录号U39608、U39609、L17078或L17077。
对于本发明，抗体与NGF以抑制NGF和/或抑制通过NGF信号功能介导的下游途径的方式反应。在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体识别人NGF。又在其它实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体特异结合人NGF。在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体不与相关的神经营养蛋白，如NT-3、NT4/5和/或BDNF显著结合。又在其它实施方案中，抗NGF抗体能结合NGF并有效抑制NGF与其TrkA和/或p75受体体内结合和/或有效抑制NGF活化其TrkA和/或p75受体。又在另一实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体为单克隆抗体。又在其它实施方案中，抗NGF抗体为人源化抗体(如文中描述的抗体E3)。在一些实施方案中，抗NGF抗体为人。在一个实施方案中，抗体为识别人NGF上一个或多个表位的人抗体。在另一实施方案中，抗体为识别人NGF上一个或多个表位的小鼠或大鼠抗体。在另一实施方案中，抗体识别选自灵长类动物、犬、猫、马及牛NGF上的一个或多个表位。又在进一步实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体实质上与选自MAb 911、MAb 912和MAb 938抗体中的一种或多种抗体结合相同的NGF表位(参见，Hongo，等人，Hybridoma 19：215-227(2000))。在其它实施方案中，抗体结合与Mab 911相同的表位。在其它实施方案中，抗体包含无免疫学活性(例如，不引发补体介导的裂解或依赖抗体细胞介导的细胞毒性(ADCC))的恒定区。ADCC活性可用美国专利号5,500,362公开的方法进行评估。在一些实施方案中，恒定区如在Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT公开号PCT/GB99/01441；和/或UK专利公开 号9809951.8中描述的进行修饰。
在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体为NGF拮抗剂的称为抗体“E3”的人源化小鼠抗NGF单克隆抗体、任何文中描述的E3相关抗体或其片段。
本发明有用的抗体可包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异抗体、异结合物抗体、单链抗体(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体以及包含目的特异性抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及经共价修饰抗体。抗体可为鼠源、大鼠源、人源或任何其它来源(包括嵌合或人源化抗体)。
抗NGF拮抗剂抗体与NGF(如hNGF)的结合亲和性可为约0.10至约0.80nM、约0.15至约0.75nM以及约0.18至约0.72nM。在一个实施方案中，结合亲和性在约2pM和22pM之间。在一些实施方案中，结合亲和性约10nM。在其它实施方案中，结合亲和性约10nM以下。在其它实施方案中，结合亲和性约0.1nM或约0.07nM。在其它实施方案中，结合亲和性约0.1nM以下或约0.07nM以下。在其它实施方案中，结合亲和性为约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM以下中的任意一种至约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM中的任意一种。在一些实施方案中，结合亲和性为约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM或约50pM以下中的任意一种。在一些实施方案中，结合亲和性低于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM以下中的任意一种。又在其它实施方案中，结合亲和性为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或约40pM以上。
确定抗体与NGF结合亲和性的一个途径是通过测定抗体单功能Fab片段的结合亲和性。为获得单功能Fab片段，可将抗体(例如，IgG)用木瓜蛋白酶切割或重组表达。抗体的抗NGF Fab片段的亲和性可通过表面胞质共振(BlAcore3000TM表面胞质共振(SPR)系统，BIAcore，INC， Piscaway NJ)确定。CM5芯片可根据供应者说明用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟琥珀酰亚胺(NHS)活化。可将人NGF(或任何其它NGF)用10mM乙酸钠pH 4.0稀释并以0.005mg/mL浓度注射到活化芯片。用通过单一芯片通道的可变流动时间，可获得两个范围的抗原密度：100-200反应单位(RU)用于详细的动力学研究并且500-600RU用于筛选测定法。芯片可用乙醇胺阻断。再生研究显示在200次以上注射中，Pierce洗脱缓冲剂(产品号21004，Pierce Biotechnology，Rockford IL)与4M NaCl(2∶1)混合物有效去除结合的Fab而保留芯片上hNGF活性。HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P29)用作BIAcore测定法的运行缓冲液。系列稀释(0.1-10x估计KD)的经纯化Fab样本以100uL/分钟注射1分钟并使解离时间达2小时。用已知浓度Fab(如通过氨基酸分析确定的)作为标准，Fab蛋白质的浓度通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳确定。用BIA评估程序，通过将数据拟合至1∶1朗缪尔结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994)Methods Enzymology 6：99-110)同时获得动力学结合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值以koff/kon计算。此方法适用于确定抗体与任何NGF，包括人NGF、其它脊椎动物的NGF(在一些实施方案中，哺乳动物)(如小鼠NGF、大鼠NGF、灵长类动物NGF)的结合亲和性，以及用于其它神经营养蛋白，如相关神经营养蛋白NT3、NT4/5和/或BDNF。
在一些实施方案中，抗体结合人NGF，而不与来自另一脊椎动物物种(在一些实施方案中，哺乳动物)显著结合。在一些实施方案中，抗体结合人NGF以及来自其它脊椎动物物种(在一些实施方案中，哺乳动物)的一种或多种NGF。在一些实施方案中，抗体结合人NGF以及来自其它脊椎动物物种(在一些实施方案中，哺乳动物)的一种或多种NGF。又在其它实施方案中，抗体结合NGF并与其它神经营养蛋白(如相关神经营养蛋白，NT3、NT4/5和/或BDNF)无显著交叉反应。在一些实施方案中，抗体结合NGF以及至少一种其它神经营养蛋白。在一些实施方案中，抗 体结合哺乳动物物种如马或狗的NGF，但不与来自其它哺乳动物物种的NGF显著结合。
表位可为连续或不连续的。在一个实施方案中，抗体基本上与选自如在Hongo等人，Hybridoma，19：215-227(2000)中描述的MAb 911、MAb 912及MAb938的抗体结合相同的hNGF表位。在另一实施方案中，抗体基本上与MAb 911结合相同的hNGF表位。又在另一实施方案中，抗体基本上与MAb 909结合相同的表位。Hongo等人，同上。例如，表位可包含一个或多个：hNGF可变区1(第23-35位氨基酸)中的K32、K34及E35残基；hNGF可变区4(第81-88位氨基酸)中的F79及T81残基；可变区4中的H84及K88残基；hNGF可变区5(第94-98位氨基酸)与hNGF C端(第111-118位氨基酸)之间的R103残基；hNGF前可变区1(第10-23位氨基酸)中的E11残基；hNGF可变区2(第40-49位氨基酸)与hNGF可变区3(第59-66位氨基酸)之间的Y52残基；hNGF C端中的L112及S113残基；hNGF可变区3中的R59及R69残基；或hNGF前可变区中的V18、V20及G23残基。此外，表位可包含一个或多个hNGF的可变区1、可变区3、可变区4、可变区5、N-端区域和/或C端区域。又在另一实施方案中，抗体显著降低hNGF的R103残基的溶剂接近性。应当理解虽然以上描述的表位与人NGF相关，一般技术人员可排列人NGF与其它物种NGF的结构并鉴定与这些表位的可能对应物。
一方面，可抑制NGF的抗体(例如，人抗体、人源化抗体、小鼠抗体、嵌合抗体)可用表达全长或部分NGF序列的免疫原制备。另一方面，可用包含过表达NGF的细胞的免疫原。可用的免疫原的另一实例为包含全长NGF的NGF蛋白质或部分NGF蛋白质。
抗NGF拮抗剂抗体可用本领域已知的任何方法制备。如文中进一步描述的宿主动物的免疫途径及方案一般与用于抗体刺激及产生的已建立及常规技术一致。用于产生人及小鼠抗体的一般技术是本领域已知的并在文中描述。
考虑了可将包括人或其抗体产生细胞的任何哺乳动物受试者进行操作 作为用于产生哺乳动物包括人、杂交瘤细胞系产生的基础。一般地，用一定量的免疫原包括如文中描述的免疫原腹膜内、肌内、经口、皮下、足底内和/或皮内接种宿主动物。
杂交瘤可用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256：495-497的常规体细胞杂交技术或如通过Buck，D.W.等人，In Vitro，18：377-381(1982)改进的体细胞杂交技术自淋巴细胞及永生化骨髓瘤细胞制备。在杂交中可应用可获得的骨髓瘤细胞系，包括但不限于X63-Ag8.653及来自美国加利福尼亚，圣地亚哥，Salk研究所，细胞分布中心的骨髓瘤细胞系。一般而言，技术涉及用融合剂如聚乙二醇或通过本领域技术人员公知的电方法融合骨髓瘤细胞及淋巴样细胞。融合后，将细胞自融合培养基分离并在选择生长培养基，如次黄苷-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中生长以去除未杂交的亲代细胞。文中描述的添加血清或未添加血清的任何培养基可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一备选方法，EBV永生化B细胞可用于产生本发明所述的抗NGF单克隆抗体。将杂交瘤扩增并传代，并根据需要通过常规免疫测定法步骤(例如，发射免疫测定法、酶联免疫测定法或荧光免疫测定法)对上清液抗免疫原活性进行测定。
可用作抗体源的杂交瘤包含产生NGF特异单克隆抗体或其部分的亲代杂交瘤的所有衍生物、子代细胞。
产生此类抗体的杂交瘤可用公知步骤在体外或体内生长。根据需要，通过常规免疫球蛋白纯化步骤如硫酸铵、凝胶电泳、透析、层析、超滤，单克隆抗体可自培养基或体液中分离。如果存在非目的活性，例如通过将制备物在附着在用连接至固相上的免疫原制备的吸附剂上流动，并将目的抗体自免疫原洗脱或释放。用人NGF或连接至下述蛋白质的包含靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物，可产生许多抗体(例如，单克隆抗体)，所述蛋白质为对预进行免疫物种具有免疫原性的蛋白质，如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，用双功能剂或衍生物例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、 N-羟琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOC12或R1N＝C＝NR(其中R及R1为不同烷基)连接。
根据需要，可对目的抗NGF拮抗剂抗体(单克隆或多克隆)测序并然后将多核苷酸序列克隆到载体中用于表达或增殖。编码目的抗体的序列可在宿主细胞的载体中维持并且然后可将宿主细胞增殖并冷冻用于以后应用。在备选方案中，多核苷酸序列可用于遗传操作以“人源化”抗体或改善抗体的亲和性或其它特征。例如，将恒定区进行改造以更类似人恒定区，以避免在人中如果抗体用于临床试验及治疗时的免疫反应。遗传操作抗体序列以在抑制NGF方面获得对NGF的更大亲和性及更大功效是令人希望的。可对抗NGF拮抗剂抗体制备一个或多个多核苷酸变化且仍保持它对NGF的结合能力对本领域技术人员是显然的。
人源化单克隆抗体一般有四个步骤：它们是：(1)确定起始抗体轻链及重链可变结构域的核苷酸并预测氨基酸序列(2)设计人源化抗体，即确定在人源化过程中应用的抗体构架区(3)现行的人源化方法学/技术以及(4)人源化抗体的转染及表达。参见，例如，美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；及6,180,370。
包含衍生自非人免疫球蛋白抗原结合位点的许多“人源化”抗体分子，包括具有啮齿动物V区或经修饰啮齿动物V区并且它们相关的互补决定区(CDR)与人恒定结构域融合的嵌合抗体。参见，例如，Winter等人，Nature 349：293-299(1991)，Lobuglio等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224(1989)，Shaw等人，J Immunol.138：4534-4538(1987)以及Brown等人，Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其它参考文献描述了在与适当人抗体恒定区融合前，移植到人支持构架区(FR)的啮齿动物CDR。参见，例如，Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)以及Jones等人，Nature 321：522-525(1986)。其它参考文献描述了通过重组修饰啮齿动物构架区支持的啮齿动物CDR。参见，例如，欧洲专利号0519596。对这些“人源化”分子进行 设计以降低限制在人受者中这些分子治疗性应用的持续时间及功效的针对啮齿动物抗人抗体部分的非目的免疫学反应。例如，可将抗体恒定区进行改造使它没有免疫学活性(例如，不引发补体裂解)。参见，例如，PCT公开号PCT/GB99/01441；英国专利号9809951.8。其它也可应用人源化抗体的方法由Daugherty等人，Nucl.Acids Res.19：2471-2476(1991)以及在美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671及6,350,861；以及PCT专利号WO01/27160中公开。
又在另一备选方案中，通过用经改造以表达特异人免疫球蛋白的可商品化获得小鼠可获得完全人抗体。设计产生更多目的(例如，完全人抗体)或更强效免疫反应的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。此类技术的实例为来自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的Xenomouse TM以及来自Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的 ![]()
及TC MouseTM。
在备选方案中，抗体可用本领域已知的任何方法重组制备及表达。在另一备选方案中，抗体可通过噬菌体展示技术重组制备。参见，例如，美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；及6,265,150；以及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。备选地，可用噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))自未经免疫供体免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外产生人抗体或抗体片段。根据这个技术，将抗体V结构域基因框内克隆到丝状噬菌体如M 13或fd的主要或次要包膜蛋白基因中，并在噬菌体粒子表面作为功能性抗体片段展示。由于丝状粒子包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择也产生对编码显示这些特性的抗体基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；对于综述，参见，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。一些V基因片段来源可用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)自来自经免疫小鼠脾V基因的小随机组合文库中分离了不同排列的抗恶唑酮抗体。可构建来自未免疫人供体的V基因库以及基本上根据Mark等人，J.Mol.Biol.222：581-597 (1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)描述的技术分离针对不同抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫反应中，抗体基因以高速率积聚突变(体细胞高变)。一些导入的变化赋予较高亲和性，并且显示高亲和性表面免疫球蛋白的B细胞优选在随后抗原攻击期间优选复制及分化。此天然过程可通过用已知为“链改组(chain shuffling)”Marks，等人，Bio/Technol.10：779-783(1992)的技术仿效。在这个方法中，通过噬菌体展示获得的“最初”人抗体的亲和性可通过用获自未免疫供者V结构域基因的天然存在变体(库)系列替代重链及轻链V区域基因得到改善。这个技术产生亲和性在pM-nM范围的抗体及抗体片段。Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述了用于制备非常大噬菌体抗体库(也称为“万物之母文库”)的策略。基因改组也可用于自啮齿动物抗体衍生人抗体，其中人抗体与起始啮齿动物抗体具有相似亲和性及特异性。根据也称为“表位印记”的这个方法，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因用人V结构域基因库替代，产生啮齿动物-人嵌合体。抗原的选择导致分离能恢复功能性抗原结合位点的人可变区，即表位支配(印记)配偶体(parter)的选择。当为了替代剩余啮齿动物V结构域重复此过程时，获得人抗体(参见1993年4月1日公开的PCT专利号WO 93/06213)。与常规通过CDR移植而对啮齿动物抗体人源化不同，这个技术提供了没有啮齿动物来源的构架或CDR残基的完全人源化抗体。
虽然以上讨论与人源化抗体有关，显然讨论的一般原理适用于按该原理制备抗体用于例如狗、猫、灵长类动物、马及牛。文中描述的人源化抗体的一个或多个方面可为组合的，例如CDR移植、构架突变及CDR突变也是显然的。
抗体可通过首先自宿主动物分离抗体及抗体产生细胞，获得基因序列并用基因序列在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组表达抗体进行重组制备。其它可用的方法为在植物(例如，烟草)或转基因乳中表达抗体序列。已公开了用于在植物或乳中重组表达抗体的方法。参见，例如，Peeters， 等人，Vaccine 19：2756(2001)；Lonberg，N.和D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65(1995)；以及Pollock，等人，J Immunol Methods 231：147(1999)。用于制备抗体衍生物例如人源化抗体、单链抗体等的方法是本领域已知的。
免疫测定法及流式细胞分选技术如荧光激活细胞分选术(FACS)也可用于分离对NGF特异的抗体。
抗体可与许多不同载体结合。载体可为有活性和/或无活性的。公知载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然及改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖及磁铁。对本发明，载体的性质可为可溶解或不溶解的。本领域技术人员用常规实验知道有或能确定可用于结合抗体的其它合适载体。在一些实施方案中，载体包含靶向心肌的部分。
用常规方法(例如，用能特异结合编码单克隆抗体重链及轻链基因的寡核苷酸探针)易于分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体(如在PCT公开号WO 87/04462中公开的表达载体)中，然后将所述表达载体转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见，例如PCT专利号WO 87/04462。也可将DNA修饰，例如，通过用人重链及轻链恒定结构域的编码序列替代同源鼠序列，Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851(1984)或通过将所有或部分编码非免疫球蛋白多肽的序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。在那种方式中，制备了对文中抗NGF单克隆抗体具有结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
可用本领域公知的方法表征抗NGF拮抗剂抗体。例如，一种方法是鉴定抗体结合的表位，或“表位绘制”。本领域有许多方法用于对蛋白质上表位位置作图及表征，包括例如，在Harlow和Lane，Using Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1999一书的第11章中描述的解决抗体-抗原复合体的晶体结构、竞争测定法、基因片段表达测定法以及基于合成肽测定法。在其它实例中，表位作图可用于确定抗NGF拮抗剂抗体结合的序列。表位作图可自多种来源，例如Pepscan系统(Edelhertweg 15，8219PH Lelystad，荷兰)商业性获得。表位可为线性表位，即包含一段氨基酸，或不必包含在一段氨基酸中，而是由氨基酸三维相互作用形成的构象表位。可分离或合成(例如，重组)多种长度肽(例如长至少4-6个氨基酸)并与抗NGF拮抗剂抗体用于结合测定法。在另一实例中，抗NGF拮抗剂抗体结合的表位可在系统筛选中用衍生自NGF序列重叠肽进行确定并确定被抗NGF拮抗剂抗体的结合。根据基因片段表达测定法，编码NGF的可读框随机或通过特异遗传构建体片段化并确定NGF的经表达片段与预检测抗体的反应性。例如，基因片段可通过PCR产生，并然后在存在放射性氨基酸时体外转录并翻译成蛋白质。然后抗体与放射性标记NGF片段的结合通过免疫沉淀法或凝胶电泳法确定。某些表位也可通过用在噬菌体粒子表面展示的随机肽序列大文库(噬菌体文库)鉴定。备选地，在简单的结合测定法中明确的重叠肽片段文库可检测与受试抗体的结合。在其它实例中，可进行抗原结合结构域诱变、结构域切换实验及丙氨酸扫描诱变以鉴定用于表位结合所需的充分和/或必需残基。例如，可用突变NGF进行结构域切换实验，其中NGF多肽多种片段用来自密切相关，但抗原性不同的蛋白质(如神经营养蛋白家族的另一成员)的序列替代(切换)。通过评估抗体与突变体NGF的结合，可评估特定NGF片段对抗体结合的重要性。
可用于表征抗NGF拮抗剂抗体的另一方法是用已知结合相同抗原即NGF上的多种片段的其它抗体进行竞争测定法以确定抗NGF拮抗剂抗体是否结合与其它抗体相同的表位。竞争测定法对本领域技术人员是公知的。如在Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)中描述的，对本发明竞争测定法中应用的抗体实例包括单克隆抗体911、912、938。
表达载体可用于直接表达抗NGF拮抗剂抗体。本领域技术人员对施用表达载体以体内获得外源蛋白质的表达是熟悉的。参见，例如，美国专 利号6,436,908；6,413,942；及6,376,471。表达载体的施用包括局部或全身施用，包括注射、经口施用、基因枪或插入导管施用及局部施用。在另一实施方案中，表达载体直接施用到交感干或神经节，或直接施用到冠状动脉、心房、心室或心包膜中。
也可用包含表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗性组合物定向递送。受体介导的DNA递送技术例如在Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff，编辑)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中进行了描述。在基因治疗规程中，含有多核苷酸的治疗组合物的局部给药范围是约100ng-约200mg DNA。在基因治疗规程中，也可使用约500ng-约50mg、约1μg-约2mg、约5μg-约500μg和约20μg-约100μg的浓度范围。可使用基因递送工具递送本发明的治疗多核苷酸和多肽。基因递送工具可以是病毒来源或非病毒来源的(一般参见，Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185和Kaplitt，NatureGenetics(1994)6：148)。使用内源性哺乳动物启动子或异源启动子诱导这类编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型表达，也可以是调节型表达。
用于递送和在目的细胞中的表达目的多核苷酸的基于病毒的载体是本领域众所周知的。代表性的基于病毒的运载工具包括(但不限于)重组逆转录病毒(参见，例如PCT公布号WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805；美国专利号5,219,740、4,777127；GB专利号2,200,651和EP0345242)、基于甲病毒的载体(例如辛德比斯病毒载体、西门利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、Ross River病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、 ATCC VR-1249ATCC VR-532)和腺伴随病毒(AAV)载体(参见，例如PCT公布号WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984和WO 95/00655)。也可如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147所述的施用连接至灭活腺病毒的DNA。
也可利用非病毒递送工具和方法，包括(但不限于)与灭活腺病毒连接或未连接的多聚阳离子浓缩的DNA(参见，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)、配体连接的DNA(参见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)、真核细胞递送工具细胞(参见，例如美国专利号5,814,482、PCT公布号WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763和WO 97/42338)和核电荷中和或与细胞膜的融合。也可使用裸DNA。代表性的裸DNA引入方法描述于PCT公布号WO 90/11092和美国专利号5,580,859。可作为基因递送工具的脂质体描述于美国专利号5,422,120、PCT公布号WO95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445和EP0524968。另外的方法描述于Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581。
抗NGF拮抗剂抗体的鉴定
抗NGF拮抗剂抗体可用本领域已知的方法进行鉴定或表征，由此对NGF生物学活性的降低、缓和或中和进行检测和/或测定。例如，美国专利号5,766,863及5,891,650中描述的激酶受体活化(KIRA)测定法可用于鉴定抗NGF制剂。这种ELISA型测定法通过测定受体蛋白酪氨酸激酶(下文中称为“rPTK”)例如TrkA受体的激酶结构域自磷酸化作用适合用于定性或定量测定激酶活性以及适合用于鉴定和表征所选rPTK例如TrkA的潜在拮抗剂。测定法的第一阶段涉及激酶受体例如TrkA受体的激酶结构域的磷酸化作用，其中受体在真核细胞的细胞膜存在。受体可为内源性受体或编码受体的核酸，或可转化到细胞中的受体构建体。一般地，第一固相(例如，第一测定板的孔)用此类细胞的基本上同源群(一般为哺乳动物细胞系)进行包被使细胞粘附在固相上。常常细胞是贴壁细胞并 因此与第一固相天然粘附。如果用“受体构建体”，它一般包含激酶受体及标记多肽的融合体。标记多肽被捕获剂(在测定法的ELISA部分中通常为捕获抗体)所识别。然后将分析物如候选抗NGF拮抗剂抗体与NGF一起加入到具有贴壁细胞的孔，使酪氨酸激酶受体(例如TrkA受体)暴露于(或接触)NGF及分析物。此测定法能鉴定通过其配体NGF抑制TrkA活化的抗体。暴露于NGF及分析物后，贴壁细胞用裂解缓冲液(其中具有溶解性去污剂)裂解并温和搅动，因此释放的细胞裂解物可直接用于测定法的ELISA部分，而不必浓缩或澄清。
然后如此制备的细胞裂解物易于用于测定法的ELISA阶段。作为ELISA阶段的第一步，第二固相(一般为ELISA微孔板的孔)用与酪氨酸激酶受体特异结合的，或对于受体构建体，与标记多肽特异结合的捕获剂(常常为捕获抗体)进行包被。进行第二固相的包被使捕获剂粘附在第二固相上。捕获剂一般为单克隆抗体，但如在文中实施例中描述的，也可用多克隆抗体。然后将获得的细胞裂解物暴露于或接触所粘附的捕获剂使受体或受体构建体粘附(或捕获在)第二固相上。然后进行漂洗步骤，以除去未结合细胞裂解物，留下被捕获受体或受体构建体。然后将粘附或捕获受体或受体构建体暴露于或接触在酪氨酸激酶受体中鉴定磷酸化酪氨酸残基的抗磷酸酪氨酸抗体。在一个实施方案中，抗磷酸酪氨酸抗体与催化非放射性显色试剂颜色变化的酶(直接或间接)缀合。因此，受体的磷酸化可通过随后试剂的颜色变化进行测定。酶可与抗磷酸酪氨酸抗体直接缀合，或缀合分子(例如生物素)可与抗磷酸酪氨酸抗体缀合并且酶可随后通过缀合分子与抗磷酸酪氨酸抗体缀合。最后，抗磷酸酪氨酸抗体与捕获受体或受体构建体的缀合例如通过显色试剂的颜色变化而测定。
抗NGF拮抗剂抗体也可通过孵育候选试剂与NGF并监测以下特征的任意一项或多项进行鉴定：(a)结合NGF并抑制NGF生物学活性或由NGF信号功能介导的下游途径；(b)抑制、阻断或降低NGF受体活化(包括TrkA二聚化和/或自磷酸化)；(c)增加NGF的清除；(d)治疗或预防类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛的任何方面；(e)抑制(降低) NGF合成、产生或释放。在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体通过孵育候选试剂与NGF并监测结合和/或伴随的NGF生物学活性的降低或中和进行鉴定。结合测定法可用经纯化的NGF多肽或用天然表达或转染以表达NGF多肽的细胞进行。在一个实施方案中，结合测定法为竞争结合测定法，其中对候选抗体与已知抗NGF拮抗剂竞争结合NGF的能力进行评估。此测定法可以多种形式进行，包括ELISA形式。在其它实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体通过孵育候选试剂与NGF并监测结合和伴随的trkA受体二聚化和/或自磷酸化的抑制进行鉴定。
在最初鉴定后，候选抗NGF拮抗剂抗体的活性可通过已知检测靶生物学活性的生物测定法进一步证实和推敲。备选地，可用生物测定法直接筛选候选物。例如，NGF在应答细胞中促进许多形态学可识别的变化。这些包括但不限于促进PC12细胞的分化及增强自这些细胞的神经突的生长(Greene等人，Proc Natl Acad Sci USA.73(7)：2424-8，1976)、促进神经突自应答感觉及交感神经节的外植体向外生长(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.Nerve growth factor.Physiol.Rev.48：534-569，1968)并促进依赖NGF的神经元如胚胎背根神经节、三叉神经节或交感神经节神经元的存活(例如，Chun & Patterson，Dev.Biol.75：705-711，(1977)；Buchman & Davies，Development 118：989-1001(1993)。因此，用于抑制NGF生物学活性的测定法需要培养NGF应答细胞与NGF以及分析物，如候选抗NGF拮抗剂抗体。在适当时间后，对细胞反应(细胞分化、神经突向外生长或细胞存活)进行测定。
候选抗NGF拮抗剂抗体阻断或中和NGF生物学活性的能力也可通过监测候选试剂在Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)中描述的胚胎大鼠背根神经节存活测定法中抑制NGF介导的存活进行评估。
抗NGF拮抗剂抗体的施用
抗NGF拮抗剂抗体可通过任何合适途径向个体(对于类风湿性关节炎及骨关节炎个体)施用。文中描述的实例不欲对可获得技术进行限制而 是对可获得技术的阐述，这对本领域技术人员是显然的。在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体根据已知方法如静脉内施用，例如作为大丸剂或在一段时间连续输注、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、舌下、滑液内、通过吸入剂、鞘内、经口、吸入或局部途径向个体施用。施用可为全身的，例如静脉内施用或可为局部的。商业上可获得的喷雾器用于液体剂型，包括用于施用的喷射喷雾器和超声波喷雾器。液体剂型可直接成喷雾状，而冻干粉剂在重新溶解后可成喷雾状。备选地，抗NGF拮抗剂抗体可用碳氟化合物剂型及压力定量气雾剂气溶胶化，或作为冻干及粉碎粉剂吸入。
在一个实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体通过位点特异或定向局部递送技术施用。位点特异或定向局部递送技术的实例包括抗NGF拮抗剂抗体的多种可植入贮库源或局部递送导管如输注导管、留置导管或套针、合成移植物、外膜套、分流器及支架或其它可植入设备、位点特异载体、直接注射或直接应用。参见，例如PCT公开号WO 00/53211及美国专利号5,981,568。
抗NGF拮抗剂抗体的多种剂型可用于施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂抗体可系统施用。在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体及可药用赋形剂可有多种剂型。可药用赋形剂是本领域已知的，并为有助于施用药学有效物质的相对惰性物质。例如，赋形剂可赋予形状或粘度，或作为稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿润剂及乳化剂、用于不同渗透性的盐、胶囊剂、缓冲剂及皮肤穿透促进剂。赋形剂以及用于肠胃外及非肠胃外药递送的剂型在Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing(2000)一书中示出。
在一些实施方案中，将这些制剂制成用于通过注射(例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌内等)的剂型施用。因此，这些制剂可与可药用载体如生盐盐水、林格液、葡聚糖溶液等等组合。特定剂量方案，即剂量、时间及重复取决于特定个体及个体的医疗史。
抗NGF抗体可用任何合适方法，包括通过注射(例如，腹膜内、静 脉内、皮下、肌内等)施用。抗NGF抗体也可通过如文中描述的吸入施用。一般而言，对于抗NGF抗体的施用，最初候选剂量可为约2mg/kg。对于本发明，取决于以上阐述的因素，一般每日剂量可自约1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上的范围。例如，抗NGF抗体可在约1μg/kg、约10μg/kg、约20μg/kg、约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg或约2mg/kg施用。对几天或几天以上的重复施用要根据疾病而定，进行持续治疗直到对存在症状产生目的抑制或直到达到足够降低疼痛的治疗水平。示例剂量方案包含施用最初剂量约2mg/kg，接着为约1mg/kg抗NGF抗体的周维持量，或接着每两周约1mg/kg的维持量。然而，取决于开业医生希望达到的药物代谢动力学衰减模式，其它剂量方案是有用的。例如，在一些实施方案中，每周一至四次的剂量是可考虑的。此治疗的进程通过常规技术及测定法易于监测。剂量方案(包括应用的NGF拮抗剂)可随时间变化。
对于本发明，抗NGF拮抗剂抗体的适当剂量取决于应用的抗NGF拮抗剂(或其组合物)、欲治疗疼痛的类型及严重度、制剂是否用于预防或治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史及对制剂的反应以及主治医生的判定。一般地临床医生施用抗NGF拮抗剂抗体，直到达到目的结果的剂量。剂量和/或频率可随治疗过程而变化。
经验考虑如半衰期一般有助于确定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体如人源化抗体或完全人抗体可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主免疫系统攻击。施用频率可随治疗过程而确定及调整，并且一般而言但不是必需的基于疼痛的治疗和/或抑制和/或缓解和/或延迟。备选地，抗NGF拮抗剂抗体的持续连续释放剂型可为适当的。用于达到持续释放的多种剂型及设备是本领域已知的。
在一个实施方案中，用于抗NGF拮抗剂抗体的剂量可在施用一次或多次施用抗NGF拮抗剂抗体的个体中根据经验确定。个体施用增加剂量的抗NGF拮抗剂抗体。为评估抗NGF拮抗剂抗体的功效，可按照疼痛这 一指示物而评估。
例如，取决于受者生理状况、施用的目的是否为治疗性或预防性以及开业医生已知的其它因素，根据本发明所述方法施用抗NGF拮抗剂抗体可为连续或间断的。抗NGF拮抗剂抗体的施用在预选择的时间期间基本上可为连续的或可为一系列间断的剂量，例如疼痛发展之前、期间或以后；之前；期间；之前及以后；期间及以后；之前及期间；或疼痛发展之前、期间及以后。
在一些实施方案中，可存在一种以上抗NGF拮抗剂抗体。可存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的或五种以上抗NGF拮抗剂抗体。一般而言，这些抗NGF拮抗剂抗体具有不会相互存在不利影响的互补活性。
通过混合具有目的纯度的抗体与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing(2000))，对根据本发明应用的抗NGF拮抗剂抗体的治疗剂型以冻干剂型或液体溶液形式进行制备以用于储藏。可接受载体、赋形剂或稳定剂在应用的剂量及浓度对受者是无毒的，并可包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；盐如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯胺；苯索氯胺；酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(约10个残基以下)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子如钠；金属复合体(例如锌-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
通过本领域已知的方法，如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；以及美国专利号4,485,045及4,544,545中描述的方法制备包含抗NGF拮抗剂抗体的脂质体。具有增强循环时间的脂质体在美国专利号5,013,556中公开。特别有用的脂质体可通过用包含磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)脂类组合物的反相蒸发法产生。脂质体通过确定孔径的滤膜挤出以产生目的直径的脂质体。
活性成分也可以例如通过团聚技术或通过界面聚合作用包封于微囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊，包封在胶体药递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳粒及纳胶囊)或在微乳剂中。此类技术在Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing(2000)中公开。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质为有形状物体例如膜或微囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解乙酰乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT TM(由乳酸乙醇酸共聚物及醋酸亮比瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)、蔗糖醋酸异丁酸酯及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
用于体内施用的剂型必需为无菌的。这例如通过无菌滤膜过滤易于完成。治疗性抗NGF拮抗剂抗体组合物一般置于具有无菌接入口的容器，例如静脉内溶液袋或有皮下注射针可刺开塞子的瓶中。
根据本发明所述的组合物可以单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬液或栓剂用于经口、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
对于制备固体组合物如片剂，主要活性成分与药物载体例如常规片剂成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢二钙或树胶以及其它药物稀释剂例如水混合以形成包含均质混合的本 发明所述化合物或其无毒性可药用盐的固体预制剂组合物。当称这些预制剂组合物为均质时，表示活性成分在组合物中平均分散以便组合物可易于再分为等量有效单位剂型如片剂、丸剂及胶囊剂。然后此固体预制剂组合物再分为以上描述的包含0.1至约500mg本发明所述活性成分的单位剂型。可对新组合物的片剂或丸剂进行包衣或混合以提供提供延长作用益处的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂量及外剂量组分，外剂量组分为内剂量组分的包膜。两个组分可通过在胃中作为抵抗分解并允许内层组分完整地通过而进入十二指肠或延迟释放的肠层分开。多种材料可用于此类肠层或包衣层，此类材料如包括许多聚合酸以及聚合酸与此类材料如虫胶、鲸蜡醇及醋酸纤维素的混合物。
合适的表面活性剂尤其包括非离子制剂如聚氧乙烯山梨糖醇(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)及其它脱水山梨糖醇(例如，SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物方便的包含0.05及5％之间的表面活性剂，并可介于0.1及2.5％之间。应当理解如果必要，可加入其它成分，例如甘露醇或其它可药用载体。
用可商业获得的脂肪乳剂，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM可制备合适的乳剂。活性成分可在预混合乳剂组合物中溶解或备选地它可在油(例如，豆油、红花油、棉子油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中溶解并与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水形成乳剂。应当理解可加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂一般包含达20％，例如在5与20％之间的油。脂肪乳剂可包含0.1至1.0μm，尤其是0.1至0.5μm之间的脂肪滴，并具有pH在5.5至8.0的范围。
乳剂组合物可为通过混合神经生长因子抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)制备的组合物。
用于吸入或吹入的组合物包括在可药用水或有机溶剂中的溶液及悬液或其混合物以及粉剂。液体或固体组合物可包含如以上示出的合适可药用赋形剂。在一些实施方案中，组合物可通过经口或鼻呼吸途径施用用于局 部或全身效应。在优选无菌可药用溶剂中的组合物可通过应用气体进行喷雾。喷雾溶液可在喷雾设备直接呼吸或将喷物设备与面罩、帐篷或间歇正压呼吸机连接。溶液、悬液或粉剂组合物可优选经口或经鼻自以适当方式递送剂型的设备施用。
治疗功效可通过本领域公知的方法进行评估。
包含本发明所述抗体及多核苷酸的试剂盒
本发明也提供了试剂盒，其包含用于检测和/或治疗的抗体或多核苷酸。因此，在一些实施方案中，试剂盒包含抗体E3。在一些实施方案中，试剂盒包含文中描述的任何抗体或多肽。
另一方面，试剂盒可用于文中描述的任何方法，包括，例如治疗疼痛(包括手术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛及骨关节炎疼痛)的个体。本发明所述试剂盒有合适包装并可任选地提供额外组分，如用于文中描述任何方法中抗体应用的缓冲剂及说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括用于治疗疼痛的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含文中描述的抗NGF拮抗剂抗体及在个体中用于治疗和/或预防类风湿性关节炎疼痛的说明书。在其它实施方案中，试剂盒包含文中描述的抗NGF拮抗剂抗体及在个体中用于治疗和/或预防骨关节炎疼痛的说明书。在一些实施方案中，抗NGF拮抗剂抗体为抗体E3。
另一方面，本发明提供了试剂盒，其包含如文中描述编码E3多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含在文中描述任何方法中使用多核苷酸的说明书。
用于调节抗体亲和性的方法及用于表征CDR的方法
我们研发了用于表征抗体CDR和/或改变(如改善)多肽如抗体的结合亲和性的新方法，称为“文库扫描诱变”。一般而言，文库扫描诱变如以下作用。用本领域已知方法，将CDR中一个或多个氨基酸位点用两个或两个以上(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20个)氨基酸替代。这产生小克隆文库(在一些实施方案中，所分析的每个氨基酸位置对应一个小克隆文库，每个文库具有两个或两个以上成员的复杂度(如果每个位置有两个或两个以上氨基酸替代)。通常，文库也包括包含天然(未替代)氨基酸的克隆。对来自每个文库的小量克隆，例如约20-80个克隆(取决于文库的复杂度)对靶多肽的结合亲和性进行筛选并对增加、相同、降低或无结合的候选物进行鉴定。用于确定结合亲和性的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，结合亲和性用BIAcore表面胞质共振分析确定，所述BIAcore表面胞质共振分析用来检测在结合亲和性方面约2倍或2倍以上不同的结合亲和性。当起始抗体用相对高亲和性例如KD约10nM或10nM以下结合时，BIAcore是特别有用的。用BIAcore表面胞质共振的筛选在文中实施例中进行了描述。
在其它实施方案中，结合亲和性用Kinexa Biocensor、闪烁接近测定法、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN)、荧光猝灭、荧光迁移和/或酵母展示确定。在其它实施方案中，结合亲和性用合适的生物测定法进行筛选。
在一些实施方案中，用本领域已知的诱变方法(其中一些在文中描述)，在CDR中每个氨基酸位置用所有20种天然氨基酸替代(在一些实施方案中，每次一种氨基酸替代)。这产生小克隆文库(在一些实施方案中，对每个所分析的氨基酸位置对应一个小克隆文库)，每个文库具有20个成员(在每个位置如果使用所有20种氨基酸进行替代)的复杂度。
在一些实施方案中，欲筛选的文库包含在同一CDR或两个或两个以上CDR中的两个或两个以上位置的替代。因此，在一些实施方案中，文库包含一个CDR中的两个或两个以上位置的替代。在另一实施方案中，文库包含在两个或两个以上CDR中的两个或两个以上位置的替代。又在其它实施方案中，文库包含在3、4、5或5个以上位置的替代，其中所述位置在两个、三个、四个、五个或六个CDR中发现。在一些实施方案中，替代用低丰余密码子制备。参见，例如，Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109-18的表2。
在一些实施方案中，CDR为CDRH3和/或CDRL3。在其它实施方案中，CDR为一个或多个CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3。在一些实施方案中，CDR为Kabat CDR、Chothia CDR或延伸CDR。
可对具有结合改善的候选物进行测序，因此鉴定导致改善亲和性(也称为“经改善”替代)的CDR替代突变。例如，如实施例1中证实的，用此方法允许鉴定改善结合甚至当在同一氨基酸位置估计的18种其它替代导致不结合(即丧失抗体功能)时的单一替代。也可对结合的候选物测序，因此鉴定保持结合的CDR替代。
在一些实施方案中，进行多轮筛选。例如具有改善结合的候选物(每个候选物包含在一个或多个CDR的一个或多个位置处的氨基酸替代)也用于设计在每个经改善CDR位置(即在CDR的氨基酸位置，其中替代突变体显示经改善的结合)包含至少原初及替代氨基酸的第二个文库。此文库的制备及筛选或选择在以下进一步讨论。
文库扫描诱变也提供了用于表征CDR的方法，至于具有经改善结合、相同结合、降低结合或不结合的克隆频率也提供了关于每个氨基酸位置对抗体-抗原复合体稳定性重要性的信息。例如，如果当改变为所有20种氨基酸时，CDR位置保持结合，此位置鉴定为对抗原结合可能是不需要的位置。相反地，如果CDR位置只在小百分率的替代保持结合，此位置作为对CDR功能重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生关于CDR中可改变为许多不同氨基酸(包括所有20种氨基酸)的位置，以及CDR中不能改变或只可改变成几种氨基酸的位置的信息。此方面在实施例1中讨论并示例。
在一些实施方案中，具有改善亲和性的候选物在第二个文库中组合，所述第二个文库根据目的文库的复杂度或允许使用的目的筛选或选择方法，包括经改善氨基酸、在所述位置的原初氨基酸，可进一步包括额外替代。此外，根据需要，邻近氨基酸位置可随机化至至少两个或两个以上氨基酸。邻近氨基酸的随机化可允许在突变CDR中的额外构象灵活性，其 接下来可允许或有助于导入较大量改善的突变。在一些实施方案中，文库也包含在第一轮筛选中不显示改善亲和性的位置替代。
用本领域已知的方法，包括用BIAcore胞质共振分析对具有改善和/或经改变结合亲和性的文库成员的第二个文库进行筛选或选择，以及用任何用于选择的本领域已知方法，包括噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示选择。
用于调整抗体亲和性及表征CDR的方法
这些方法用于预筛选CDR氨基酸位置以鉴定改善结合或保持结合的氨基酸替代。重要残基的预鉴定、改善结合的替代和/或保持抗体功能的替代允许有效设计及筛选亲和力成熟文库。
本方法也用于表征CDR，并提供关于在CDR中用于结合抗原的每个氨基酸位置重要性的综合信息。本方法也可用于鉴定改善结合的替代。
每个位置可为随机的(在一些实施方案中，每次一个)小文库的用途，允许用灵敏方法如提供详细动力学信息的BIAcore筛选替代突变体。当筛选较大文库时，筛选方法通常是不实用的。取而代之，筛选方法如噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示一般用于鉴定保持结合的克隆。噬菌体展示及ELISA测定法可主要取决于自克隆制备的蛋白质样本浓度，并因此趋向于主要偏于具有表达增加、稳定性增加或毒性降低的克隆，而不是鉴定结合亲和性增加的克隆。此外，克隆表达水平的差异可掩饰结合亲和性的小改善。当具有高亲和性抗体用作起始材料时，此缺点是特别明显的，因为必须使用非常低水平的抗原，以使筛选足够严格。
相反地，本发明所述的方法，如每个位置的随机化(在一些实施方案中，每次一个位置)允许导入并表征例如在给定位置所有20种氨基酸替代的效果。此分析提供了在给定位置可耐受(即保持抗体结合)多少替代的信息，这接下来提供了每一氨基酸对抗体功能重要性相关的信息。进一步，甚至在给定位置许多或大部分替代产生非功能(不结合)抗体的情况下，可鉴定产生改善结合的替代。相反地，一般用于鉴定重要CDR位置的丙 氨酸扫描诱变提供关于丙氨酸的替代是否允许或防止结合的信息。通常，将防止结合的丙氨酸替代位置自亲和力成熟文库中去除。然而，许多情况下，在CDR位置丙氨酸可为弱替代物。
本发明也允许鉴定及表征单一CDR突变的效果。相反地，方法如噬菌体展示同时导入并选择许多突变，并因此潜在增加阳性突变由于在特定克隆中存在有害突变而被掩饰的危险。
本方法也用于改善亲和性而保持原初(起始)抗体的结合特异性，在本方法的范围允许鉴定小量导致改善结合亲和性的突变(例如，在单一CDR中1、2、3、4或5个突变)。相反地，方法如噬菌体展示一般用同时的多突变改善结合亲和性，这样可导致改变抗体特异性和/或增加不需要的交叉反应性。
提供了以下实施例用于阐述，但不用于限制本发明。
实施例
实施例1：小鼠拮抗剂抗NGF抗体911的人源化及亲和力成熟
A.总方法
以下总方法在本实施例中应用。
文库产生
如在Kay等人，(1996)，Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual，San Diego，Academic Press(参见第277-291页)一书中描述的，文库用简并寡核苷酸通过PCR盒诱变产生。掺杂密码子(doping codon)NNK用于随机化一个氨基酸位置以包括20种可能氨基酸。为随机化一个氨基酸位置以仅仅包括具有特异特性的一组氨基酸，如在Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109-18中描述的用掺杂密码子。如在Innis等人，(1990)PCR protocols：A guide to methods and applications(参见第177-183页)一书中描述的用重组PCR进行定点诱变。
小规模Fab制备
在96孔培养板中对小规模表达进行优化用于筛选Fab文库。从用Fab 文库转化大肠杆菌开始，挑取菌落均接种主培养板(LB琼脂+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)及工作培养板(2ml/孔，96孔/培养板包含1.5mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)。将两种培养板于30℃生长8-12小时。主培养板于4℃保存并且自工作培养板的细胞于5000转/分钟离心沉淀并用1mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG重新悬浮以诱导Fab的表达。细胞于30℃5小时表达后通过离心收获，然后在500μL HBS-EP缓冲液(100mM HEPES缓冲液pH 7.4、150mM NaCl、0.005％P20、3mM EDTA)中重新悬浮。HBS-EP重新悬浮细胞的裂解通过一轮冷冻(-80℃)然后于37℃融化获得。细胞裂解物于5000转/分钟离心30分钟以自包含Fab的上清液中分离细胞碎片。然后将上清液注射到BIAcore胞质共振器中以获得用于每个Fab的亲和性信息。表达Fab的克隆自主培养板获得以对DNA测序及用于大规模Fab产生并且详细特征如以下进行描述。
大规模Fab制备
为获得详细的动力学参数，自大量培养物中表达并纯化Fab。包含200mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖的锥形瓶用自经选择Fab表达的大肠杆菌克隆的5mL过夜培养物接种。克隆于30℃孵育直到OD550nm达到1.0，并然后通过用200ml+LB氨苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG替代培养基而诱导。于30℃5小时表达后，细胞通过离心沉淀，然后在10mL PBS(pH 8)中重新悬浮。细胞的裂解通过两轮冷冻/融化(分别为-80℃及37℃)获得。将细胞裂解物上清液装到用PBS，pH 8平衡的Ni-NTA超流动琼脂糖(Qiagen，Valencia.CA)柱上，然后用5个柱体积的PBS，pH 8洗。用PBS(pH 8)+300mM咪唑将不同的Fab洗脱在不同级分中。收集包含Fab的级分并在PBS中透析，然后在亲和性表征前通过ELISA定量。
完整抗体制备
对于完整抗体的表达，将重链及轻链可变区克隆到2个哺乳动物表达载体(对轻链为Eb.911.E3或Eb.pur.911.3E，且对重链为Db.911.3E；文 中描述)中对并用脂转染胺(lipofectemine)转染到HEK 293细胞用于瞬时表达。用A蛋白通过标准方法对抗体进行纯化。
Biacore测定法
抗NGF Fab和单克隆抗体的亲和性用BIAcore3000TM表面胞质共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)确定。根据供应者说明书，CM5芯片用N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。人NGF在10mM乙酸钠，pH 4.0中稀释并以0.005mg/mL浓度注射到经活化芯片上。用可变流动时间通过分别的芯片通道，获得两个范围的抗原密度：用于详细动力学研究的100-200反应单位(RU)以及用于筛选测定法的500-600RU。芯片通过乙醇胺阻断。再生研究显示Pierce洗脱缓冲剂(产品号21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)与4M NaCl(2∶1)混合物可有效去除结合的Fab而在芯片上保持hNGF活性200次注射以上。HBS-EP缓冲剂(0.01M HEPES，pH 7.4、0.15NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P29)用作所有BIAcore测定法的运行缓冲剂。
筛选测定法
对筛选BIAcore测定法进行优化以确定来自文库Fab克隆的亲和性。小量培养裂解物的上清液以50μl/分钟注射2分钟。用BIA评估软件对10至15分钟的解离时间用于确定单一指数解离速率(koff)。注射显示koff速率与用于产生文库的模板相同范围的样本(克隆8L2-6D5、koff 1x10-3s-1)用于确定以及达45分钟的解离时间为允许获得更好koff值。显示经改善(较慢)koff值的克隆以大规模进行表达并在经纯化蛋白质上确定完全动力学参数kon及koff。此测定法能检测亲和性约2倍或2倍以上的差异。
亲和性确定测定法
系列稀释(0.1-10x估计的KD)的经纯化Fab样本以100μL/分钟注射1分钟并且使解离时间达2小时。Fab蛋白质的浓度用标准Fab已知浓度(通过氨基酸分析确定)通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳确定。通过用BIA评估程序将数据拟合至1∶1朗缪尔结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam， L.Petersson，B.(1994)Methods Enzymology 6：99-110)中同时获得动力学结合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值通过koff/kon计算。
B.小鼠拮抗剂抗NGF抗体911的人源化及亲和力成熟
对小鼠拮抗剂抗NGF抗体911(参见Hongo等人，(2000)Hybridoma19(3)：215-227)进行选择用于人源化及亲和力成熟。单克隆抗体911以高亲和性结合人及大鼠NGF并显示与神经营养蛋白NT3、NT4/5或BDNF无显著交叉反应性。参见Hongo，同上。小鼠单克隆抗体911的木瓜蛋白酶切割的Fab片段用如以上描述的BIAcore分析确定。小鼠单克隆抗体911的木瓜蛋白酶切割Fab片段以KD约10nM结合人NGF。
如以下，在几步中进行人源化及亲和力成熟：
(1)制备CDR-移植模板将抗体911的轻链延伸CDR(即，包括Kabat及Chothia CDR区域两者)移植到具有JK2的人胚系受者序列08，并将抗体911的重链延伸CDR移植到具有JH4的人胚系受者序列VH4-59。人胚系受者序列的氨基酸序列在图1A及1B中显示。氨基酸编号是连续的。用以上描述的蛋白质构架，设计DNA序列用于编码具有鼠CDR人构架的合成基因。这些人源化重链及轻链结构域分别称为hVH及hVL。对密码子进行优化用于大肠杆菌及仓鼠应用。基本上如在Prodromou等人，(1992)ProteinEng 5(8)：827-9中描述的递归PCR，通过用每条链的两个短侧翼引物延长全长hVL及hVH的几个重叠寡核苷酸(长69-90个碱基)分别合成两个基因。将产生的正确长度的DNA片段进行凝胶纯化且然后克隆到大肠杆菌双顺反子表达质粒(氨苄青霉素抗性)中。抗体的表达在IPTG诱导的lacZ启动子控制下，与在Barbas(2001)Phage display：a laboratory manual，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press(参见，第2.10页的载体pComb3X)中描述相似。然而，修饰包括以下额外结构域的添加及表达：人κ轻链恒定结构域(参见基因库登录号CAA09181)及IgG2a人免疫球蛋白CHI恒定结构域(基因库登录号P01859)。
CDR移植抗体(也称为“模板”)可变区的氨基酸序列称为8L2-4D5，也在图1A及1B中显示。如以上描述通过BIAcore分析确定8L2-4D5的亲和 性。8L2-4D5以KD约38nM结合人NGF。
(2)在构架序列中导入点突变如在Innis等人，(1995)PCR strategies，San Diego，Academic Press一书中描述的，用重组PCR定点诱变将V71K替代导入到经CDR移植的重链中。此替代用对应的小鼠构架残基替代了人构架残基。产生的抗体称为8L2-6D5，并且8L2-6D5重链可变区的氨基酸序列在图1A显示。如以上描述用BIAcore分析确定8L2-6D5的亲和性。8L2-6D5的Fab片段以Kd约15nM结合人NGF。挑选8L2-6D5作为用于亲和力成熟的模板。
(3)CDR L1、L2、H1及H2的人源化及亲和力成熟可将CDR L1、L2、H1及H2进行人源化及亲和力成熟。对基于Chothia极限(canonical)结构鉴定了对CDR结构非必需的CDR L1、L2、H1及H2中的氨基酸位置(参见Al-Lazikani等人(1997)J.Mol.Biol.273(4)：927-48)并如以下进行随机化。对分别包含如表2所示的轻链突变或重链突变以及移植CDR L3或CDR H3的两个文库，用如Kay等人，(1996)Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual，San Diego，Academic Press一书中描述的简并寡核苷酸的PCR盒式诱变，用如在Balint等人，(1993)Gene137(1)：109-18中描述的掺杂(doping)密码子进行制备。一般而言，基于具有人胚系抗体序列的抗体911轻链及重链氨基酸序列的排列，将氨基酸残基改变为在人抗体中较常见的残基。除CDR H2第50位残基为甲硫氨酸外，野生型(未替代)氨基酸残基也在文库中代表，其中野生型甲硫氨酸不在文库中代表。甲硫氨酸残基易受氧化作用，因此，预计替代此残基可改善所产生抗体的稳定性。如以上描述，将Fab文库克隆到载体pComb3X加上人CH1及Cκ区域中。
表2：
1.重链H1/H2文库
CDR-H1
将I34变为F、L、V、S、P、T、A或I
N35变为N、T、S或Y
CDR-H2
将M50变为所有20种天然氨基酸
A62变为A或S
L63变为L或V
2.轻链L1/L2文库
CDR-L1
将S26变为S、A、V或F
将D28变为D、A、S或Y
将H32变为H、N、K、D、E、Q或Y
CDR-L2
将Y50变为Y、D、A或S
将I51变为I、T、A或V
将F54变为F或L
将S56变为S或T
对于亲和性筛选实验，每个文库进一步与对应的CDR移植轻链或重链配对(例如，H1/H2文库与CDR移植轻链配对)，表达抗体，并根据供应商的说明以及如以上描述的，用BIOCORE表面胞质共振(SPR)系统(BIAcore，Inc.Piscataway，NJ)对各克隆的人NGF亲和性进行筛选。确定koff、kon及kD。由于亲和性中一般大部分变化在koff速率中，且进一步由于koff速率不依赖于抗体浓度，因此将抗体克隆基于koff速率排列。
确定结合克隆的序列并且结合克隆序列在表3显示。
表3：L1及L2氨基酸序列、H1及H2氨基酸序列、以及在筛选H1/H2或L1/L2文库克隆的亲和性后对于结合克隆的动力学数据
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如以上表示的加粗氨基酸为随机化的。
＊KD用kon 4e4M-1s-1计算。
＊＊为了方便，文中应用的“e”表示“x 10”。因此4e4互换表示4x104。
包含以下替代的CDR保持结合：
CDR-H1
I34：S、L、V、I及A，结合。
N35：N、T及S，结合。
CDR-H2
M50：M、I、G、Q、S、L，结合。
A62：A及S，结合。
L63：L及V，结合。
CDR-L1
S26：S及F，结合。
D28：D、S、A、Y，结合。
H32：H、N、Q，结合。
CDR-L2
Y50：Y，结合。
I51：I、T、V、A，结合。
F54：F，结合。
S56：S及T，结合。
包含以下替代的CDR一般基于结合亲和性进行选择并与称为H19-L129的单一克隆组合：
CDR-H1：I34L；N35N(无变化)
CDR-H2：M50I；A62A(无变化)；L63V
CDR-L1：S26S(无变化)；D28S；H32N
CDR-L2：Y50Y(无变化)；I51T；F54F(无变化)；S56S(无变化)
将这些突变组合(通过PCR扩增H及L链，用限制性酶切割PCR产物及载体(pRN8)并进行3个片段的连接)成称为H19-L129的单一克隆，所述单一克隆也包括移植的H3及L3CDR。H19-L129重链及轻链可变区的序列在图1A及1B显示，并且表4显示CDR L1、L2、H1及H2的氨基酸序列。如用文中描述的BIAcore分析确定的，H19-L129以KD约1nM结合NGF。
表4：CDR H1、H2、L1和L2的氨基酸序列以及组合克隆H19-L129的动力学数据
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＊KD用kon 4e4M-1s-1计算。
(4)H3及L3CDR的亲和力成熟：H3及L3CDR的亲和力成熟在两步中进行。第一，在称为“文库扫描诱变”过程中，对H3及L3中的每个氨基酸残基进行分别的预筛选以鉴定突变导致与人NGF结合亲和性增加的氨基酸位置。基于文库扫描诱变结果(也称为“小文库随机分析”)，对H3及L3中的一组氨基酸位置进行筛选用于制备亲和力成熟文库，并如文中描述的BIAcore分析筛选亲和力成熟文库对人NGF的亲和性。应当理解一般可应用这些技术。
(a)文库扫描诱变
对H3及L3 CDR中的每个氨基酸位置进行分别的预筛选以鉴定导致 与人NGF结合亲和性增加的替代。在任何给定位置导致改善结合、相同结合、较差结合或不结合的氨基酸替代频率提供了涉及可改变为许多不同氨基酸(包括所有20种氨基酸)的CDR中位置以及涉及不可被改变或只可改变为几种氨基酸的CDR中位置的信息。也对导致亲和性增加的氨基酸替代进行鉴定。基于此筛选结果，对CDR H3及L3中的一组氨基酸位置进行筛选用于制备亲和力成熟文库。
制备分别的Fab文库，其中L3及H3CDR中的每个氨基酸每次随机化为所有20种氨基酸，产生一些(对轻链为5个文库以及对重链为13个文库)在每个氨基酸位置具有20种氨基酸可能性的复杂度的小文库。在所有情况下，文库由天然(即未变化)氨基酸代表。如在Kay等人，(1996)，Phage display of Peptides and Proteins：a laboratory manual，San Diego，Academic Press一书中描述的，用掺杂密码子NNK随机化一个氨基酸位置以包括20种可能氨基酸，通过具有简并寡核苷酸的PCR盒式诱变制备文库。由于CDR移植抗体的较低亲和性允许在筛选期间易于检测H3及L3突变中亲和性的差异，8L2-6D5(CDR移植抗体，具有构架突变V71K)作为用于文库构建的模板。因此，文库的每个成员包含具有一个氨基酸替代的CDR3(H3或L3)及5个移植CDR。
如文中描述的用BIAcore分析，对来自每个小文库的20-80个克隆进行筛选。用于BIAcore芯片的一个通道中样本与NGF的结合亲和性以及传感芯片的另一通道中通过结合五个组氨酸标记的抗体以检测重链C端组氨酸标记通过BIAcore对样本同时进行分析。用koff分类，将表达蛋白质的克隆分类为具有相同亲和性、较差亲和性、较好亲和性或无结合：这个分析结果在表5中显示。
表5：基于koff，将表达蛋白质的克隆分类为具有相同亲和性、较差亲和性、较好亲和性或无结合：
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对具有改善亲和性的所有克隆序列进行确定，显示导致亲和性增加的氨基酸替代的频率及身份。此外，保持与8L2-6D5克隆相似亲和性的几个克隆自每个文库筛选，以确定在给定位置允许的氨基酸替代，虽然替代不必要增加结合亲和性。此分析结果在表6中概述。
表6
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＊KD用kon 4e4M-1s-1计算。
几个突变导致结合亲和性增加与8L2-6D5模板相比，至少以下突变导致结合亲和性显著增加：(H_Y101W(CDR序列GGYWYGTSYYFDY(SEQ ID NO：46))；H_S105A(CDR序列GGYYYGTAYYFDY(SEQID NO：47))；H_S105T(CDR序列GGYYYGTTYYFDY(SEQ ID NO：48))；H_G103A(CDR序列GGYYYATSYYFDY(SEQ ID NO：49)；以及L_S91E(CDR序列QQEKTLPYT(SEQ ID NO：50))。
这个实验的结果用于指导用于产生亲和力成熟文库的氨基酸位置的选择。
此实验也提供了关于在任何给定位置导致改善结合、相同结合、较差结合或无结合的氨基酸替代频率的信息，如表5显示。此信息允许鉴定可改变为许多不同种氨基酸(包括所有20种氨基酸)的CDR中氨基酸位置以及可改变为几种氨基酸或非常少的几种氨基酸(在一些实施方案中，无氨基酸改变)的CDR中氨基酸位置。这些结果也证实增加结合亲和性的氨基酸替代。
(b)亲和力成熟
接下来，小文库随机分析的结果(以上)用于选择产生H3及L3CDR亲和力成熟的H3及L3文库的残基。对CDR H3的Y101及G103残基以及CDR L3的S91及K92残基进行选择用于产生H3及L3CDR亲和力成熟的H3及L3文库。
此文库在CDR移植克隆8L2-6D5中同时以及在H19-L129背景中分别组合了H3及L3的突变，并具有80个不同克隆的多样性。表7显示选择用于替代的氨基酸残基以及在每个位置替代的氨基酸。
表7.H3及L3中选择用于替代的氨基酸残基以及在每个位置替代的氨基酸
CDR-H3：
将Y101变为Y及W、C(注意包括C，因为在一个简并寡核苷酸中用密码子TRS也产生密码子C)。
将G103变为A、P、S
CDR-L3：
将S91变为E。
将K92变为所有二十种氨基酸。A、R、K及H，结合。
每一多肽作为Fab表达，并根据制造商说明及以上描述，用BIACORE分析对每个文库的96个分别的克隆筛选人NGF的亲和性。此分析的结果在表8中显示。
表8.
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＊KD用kon 4e4M-1s-1计算。
基于结合亲和性，选择最佳克隆E3(互换称为“3E”)及3C用于进一步表征。E3包含以下CDR替代：CDR-H3：Y101W、G103A；以及CDR-L3：S91E、K92H，它们可组合为单一克隆，所述单一克隆也包括以下L1、L2、H1及H2突变：
CDR-H1：I34L；
CDR-H2：M50I；L63V；
CDR-L1：D28S；H32N；
CDR-L2：I51T。
E3重链及轻链可变区的序列在图1A及1B中显示。3C包含以下CDR替代：CDR-L3：S91E；K92R；CDRH3：Y101W；G103A，它们组合成也包括描述克隆3E的L1、L2、H1及H2突变的单一克隆。
将3E及3C序列克隆到哺乳动物表达载体用于产生Fab及完整抗体，并在HEK293细胞表达并用Ni-NTA或A蛋白亲和层析纯化。纯化蛋白质通过氨基酸分析进行精确定量。
除了在芯片上应用100RU NGF以防止再结合作用外，根据制造商说明及如以上描述的，用BIAcore分析对Fabs E3及3C与人NGF的结合亲和性进行测定。简而言之，将几个浓度的抗体(Fab)注射到具有100RU经固定人NGF的CM5芯片上进行2分钟，并使之解离1800秒。小鼠抗体911(Fab)作为对照进行分析。根据制造商的说明用BIA评估软件对数据进行分析。抗体E3及911的分析结果在图9及图10中显示。E3以KD约0.07nM(并且以kon约6.0e5M-ls-1且koff约4.2e-5s-1)结合人NGF。3C以KD约0.35nM(koff约1.4E-5)结合人NGF。相反地，小鼠抗体911以KD 3.7nM、koff 8.4x10-5s-1且kon 2.2x104Ms-k结合NGF。
基于高结合亲和性，对抗体E3(互换称为3E)进行选择用于进一步分析。为检测E3防止NGF与NGF受体trkA及p75相互作用的能力，将2.5nM人NGF与0至50nM抗体E3(Fab)进行预混合并孵育一小时。孵育后，将样本以10μl/分钟注射到包含260RU p75(第2通道)及600RUtrkA(第3通道)的BIAcore CM5芯片上并确定结合百分率。这个分析结 果在图11显示。如通过信号(在RU中测定的)降低显示的，Fab E3浓度增加阻断了NGF与p75及trkA的相互作用，表明Fab E3阻断了人NGF与trkA及p75的相互作用。当抗体E3(Fab)浓度与NGF浓度(约2.5nMNGF浓度)相等时，没有观察到NGF结合(如通过零信号显示的)。当NGF浓度与抗体3E浓度相同时，发生的NGF受体结合零百分率的事实表明2.5nM NGF至少十倍高于E3对NGF的kD并处于平衡。
实施例2：用小鼠E13.5三叉神经元存活测定法评估抗NGF抗体阻抗NGF的能力
Fab E3或完整抗体E3阻断NGF活性的能力通过体外测定抗体抑制依赖NGF的小鼠E13.5三叉神经元的存活能力进行评估。三叉神经节包含受面部区域神经支配的皮肤感觉神经元。由于需要NGF支持三叉神经元的存活，小鼠E13.5三叉神经元的存活是评估抗NGF拮抗剂抗体阻断NGF活性的敏感测定法。例如，在NGF的饱和浓度，通过培养48小时存活接近于100％。相反，在没有NGF时培养48小时，5％以下神经元存活。
如以下进行存活测定法：对定时交配怀孕Swiss Webster雌小鼠通过CO2吸入进行安乐死。去除子宫角并提取胚胎期E13.5胚胎以及将胚胎头部去除。用电解尖锐的钨针解剖三叉神经节，然后将神经节用胰蛋白酶消化，机械解离并以每孔200-300个细胞的密度在聚-L-鸟氨酸及层粘连蛋白包被的96孔培养板于明确规定的无血清培养基中培养。
抗NGF Fab或抗体的阻断活性通过向三叉神经元加入不同剂量的抗NGF抗体Mab 911(Fab)、8L2-6D5；H19-L129；E3及3C；以及以下家度的人或大鼠NGF进行评估所述浓度为0.4ng/ml(～15pM；此浓度代表用于存活的NGF饱和浓度)以及0.04ng/ml(～1.5pM；此浓度在IC50附近)。培养48小时后，如以下将细胞在Biomek FX液体处理工作站上(Beckman Coulter)进行自动免疫细胞化学方法：用含4％甲醛、5％蔗糖及PBS固定；用含0.3％Triton X-100的PBS透化处理；用5％正常山羊血清、0.11％BSA的PBS阻断非特异结合位点；并用初级及二级抗体相 继孵育以检测神经元。初级抗体为经建立的神经元表型标记物，是针对蛋白质基因产物89.5的兔多克隆抗体(PGP9.5，Chemicon)。二级抗体为与标记培养中存在的所有细胞的核染料Hoechst 33342(Molecular Probes)一起的Alexa Fluor 488山羊抗兔(Molecular Probes)。在Discovery-I/GenII图像仪(Universal Imaging Corporation)上进行图像采集及图像分析。在用于Alexa Fluor 488及Hoechst 33342的两个波长自动获得图像，由于核染色在所有孔中存在，用作参考点的核染色用于图像仪的基于图像自动焦点系统。选择对每孔适当的目标及成像位点数目以覆盖每个孔的全部表面。基于它们与抗PGP9.5抗体的特异染色，建立自动图像分析以对培养48小时后每孔存在的神经元数进行计数。基于图像小心开端及形态学及荧光强度应用的选择性滤波器得到每孔神经元的精确计数。
这个实验的结果证实Fab E3以高亲和性阻断NGF活性。结果在图4-6及表9显示。
图4为显示在存在不同浓度人及大鼠NGF时依赖NGF的E13.5神经元存活的图。
图5为在存在0.04ng/ml人NGF(约1.5pM；图5中的下图显示)或0.4ng/ml人NGF(约15pM；图5中的上图显示)时比较不同Fab阻断NFG作用的图。1.5pM NGF在NGF促进存活的EC50附近，而15pM代表NGF的饱和浓度。在不同浓度Fab E3；鼠911Fab；及H19-L129Fab以及8L2-6D5Fab中对E13.5小鼠三叉神经元的存活如以上进行评估。在每个NGF浓度，对每个Fab IC50(以pM表示)进行计算并在表9中显示。Fab E3强烈阻断依赖人NGF的三叉神经元的存活，在存在15pM人NGF时约21pM的IC50，以及在存在1.5pM人NGF时约1.2pM的IC50。Fab 3C及H19-L129也强烈阻断依赖人NGF的三叉神经元的存活。
图6为在存在0.04ng/ml大鼠NGF(约1.5pM；在图6的下图中显示)或0.4ng/ml大鼠NGF(约15pM；在图6的上图中显示)时比较多种Fab的NGF阻断作用的曲线图。1.5pM NGF在EC50附近，而15pM代表NGF的饱和浓度。在多种浓度Fab E3；鼠911Fab；以及H19-L129Fab 及8L2-6D5Fab中对E13.5小鼠三叉神经元的存活如以上描述进行评估。在每个NGF浓度，对每个Fab计算EC50(以pM表示)并在表9显示。Fab E3强烈阻断依赖大鼠NGF的三叉神经元的存活，在存在15pM大鼠NGF约31.6pM的IC50，以及在存在1.5pM大鼠NGF时约1.3pM的IC50。
表9：
人NGF IC50(存在15pM NGF) IC50(存在1.5pM NGF)
pM pM
8L2-6D5Fab 1580.5 461.8
H19-L129Fab 60.1 9.6
3E Fab ＜21.0 ＜1.2
3C Fab 80.9 5.6
911Fab 322.3 63.5
大鼠NGF IC50(15pM NGF)
IC50(1.5pM NGF)
pM pM
8L2-6D5Fab 730.3 169.4
H19-L129Fab 31.0 6.0
3E Fab ＜8.3 ＜1.3
3C Fab 31.6 6.0
911Fab 161.0 34.6
在不同实验中，我们比较了在存在0.4ng/ml(饱和浓度)人NGF时完整抗体E3及Fab 3E抑制依赖NGF的E13.5神经元的存活。分析结果在图12中显示。当完整抗体及Fab的浓度归一至NGF结合位点数(Fab具有一个结合位点且完整抗体具有两个结合位点)，显示完整抗体E3及 Fab 3E与抑制依赖NGF的存活具有相似水平。由于完整抗体与NGF二聚体的结合，这些结果证实没有亲合作用。
在另一实验中，我们比较了在存在0.4ng/ml(饱和状态)时，多种浓度(20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128及0.0nM)抗体E3、抗体911及trkA受体免疫粘附素(由NGF受体trkA细胞外结构域与免疫球蛋白Fc结构域CH2-CH3融合组成)抑制依赖NGF的E13.5神经元存活的能力。这些结果在图13中显示。这些结果证实抗体E3阻断NGF好于抗体911或trkA免疫粘附素。
实施例3：用小鼠三叉神经元及结节神经元存活测定法评估抗NGF抗体E3的特异性
在存在饱和浓度的NGF、NGF相关神经营养蛋白NT3或NGF不相关神经营养性因子、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)时，通过测定抗体抑制小鼠E17/18三叉神经元体外存活的能力对抗体E3特异阻断NGF活性的能力进行评估。由于需要NGF维持这些神经元存活的浓度高于维持E13.5TG神经元存活所需要的NGF水平，小鼠E17/18三叉神经元的存活是评估抗NGF拮抗剂抗体的NGF阻断活性的敏感测定法，这些神经元的存活也通过NT3或MSP维持；因此，这些神经元的存活也是评估抗NGF拮抗剂抗体是否也阻断NT3或MSP的敏感测定法。
抗体E3特异阻断NGF活性的能力也通过测定抗体在存在饱和浓度BDNF或NT4/5时抑制小鼠结节E17神经节存活的能力进行评估。结节神经元的存活通过BDNF或NT4/5维持；因此，这些神经元的存活是评估抗NGF拮抗剂抗体的BDNF或NT4/5阻断能力的敏感测定法。
如以下进行存活测定法：对定时交配怀孕Swiss Webster雌小鼠通过CO2吸入进行安乐死。取出子宫角并取出(胚胎期的第17或18天)胚胎且将胚胎头部去除。将三叉及结节神经节解剖并清洗。然后将神经节用胰蛋白酶消化，机械解离并以每孔200-300个细胞的密度培养在聚-L-鸟氨酸及层粘连蛋白包被的4孔培养板(Greiner)的明确无血清培养基中。
E17/18三叉神经元在不加入神经营养性因子(阴性对照)或在存在饱和浓度人NGF(400pM及15pM)(阳性对照)；NT3(400pM)；或MSP(600pM)中生长。建立包括不同浓度E3及911Fab以及完整抗体的双份培养物。Fab及完整抗体的浓度以每个结合位点(例如，完整抗体包含两个结合位点，而Fab包含一个结合位点)标明。
E17结节神经元在不存在加入的神经营养性因子(阴性对照)或有饱和浓度BDNF(400pM)(阳性对照)或NT4/5(400pM)或NGF不相关生长因子ILF(白细胞介素抑制因子)中生长。由于这个实验的目的是检测抗体的特异性，应用高浓度神经营养蛋白。建立包括加入或不加入抗体E3及911的双份培养物。培养48小时后，通过用相差显微镜手工计数，确定在每种条件下在每孔中存活的神经元总数。
这些实验的结果证实E3及911抗体完全阻断NGF对E18三叉神经元的存活促进作用。相反，E3及911抗体对通过NT3或MSP促进的三叉神经元的存活没有作用，或对通过BDNF或NT4/5或LIF促进的结节神经元的存活没有作用。这些结果证实抗体E3对NGF具有选择特异性，在浓度1000倍至10,000倍高于对NGF阻断的有效浓度时，这些抗体与其它NGF相关神经营养蛋白(NT3、NT4/5、BDNF)之间没有检测到相互作用。此外，这些结果证实在加入抗体或Fab E3观察到的依赖NGF神经元在添加NGF培养物中神经元的死亡是由于此类抗体与NGF之间的特异相互作用而不是由于一般毒性作用。对小鼠抗NGF拮抗剂抗体911也进行了检测，并且也观察到相似结果。注意由于应用高浓度的神经营养蛋白，抗体E3及911这两者的滴定条件均非常接近并且由于这些抗体与NGF的结合亲和性的差异在此类条件下较不明显，也预计它们以相似水平结合NGF。
这些实验的结果在图14、15、16及17中显示。对每个实验数据显示为在培养48小时后相对于阳性对照中观察到的存活(例如，分别在存在饱和NGF浓度生长时的三叉神经元100％存活，且在存在饱和BDNF浓度时生长结节神经元的100％存活)的平均存活百分率(±平均标准误，对每个数据点n＝3)。图14-15为显示抗NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3，甚至 在抗体浓度高达200nM时不抑制通过NT3及MSP促进存活的图。相反地，20nM抗体E3或Fab 3E和Fab 911完全阻断经NGF引发的存活。也对小鼠抗NGF拮抗剂抗体911进行了检测，并观察到相似结果。特别地，图14为在存在不加入神经营养蛋白(称为“对照”)、400pM NGF(称为“NGF-400pM)、10nM NT3(称为“NT3-10nM)或600pM MSP(称为“MSP-600pM)时，显示比较不同浓度(20nM、2nM或0.2nM)E3Fab(图中称为“3E”)及小鼠抗体911Fab对E18三叉神经元存活作用的图。图15为描述在存在不加入神经营养蛋白(称为“无因子”)、400pM NGF(称为“NGF-400pM)、10nM NT3(称为“NT3-10nM)或600pM MSP(称为“MSP-600pM)时，比较不同浓度(200nM和80nM)E3Fab及完整抗体及小鼠抗体911完整抗体以及Fab对E17三叉神经元存活作用的图。
图16-17为显示抗NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不抑制通过BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节神经元的图。也对小鼠抗NGF拮抗剂抗体911进行检测，并观察到相似结果。特别地，图16为在无加入的神经营养蛋白(称为“无因子”)、400pM BDNF(称为“BDNF-400pM)、400pMNT4/5(称为“NT4/5-400pM)或2.5nM LIF(称为“LIP-2.5nM)时，显示比较不同浓度(200nM或80nM)完整抗体E3(称为“图中的3E”)、Fab E3、完整抗体911或Fab 911对E17结节神经元存活作用的图。图17为描述在无加入的神经营养蛋白(称为“对照”)、存在400pM BDNF(称为“BDNF-400pM)、400pM NT4/5(称为“NT4/5-400pM)或2.5nM LIF(称为“LIP-2.5nM)时，显示比较不同浓度(200nM、20nM、2nM)Fab E3(称为“图中的3E”)、或Fab 911对E17结节神经元存活作用的图。
实施例5：制备抗体E3的哺乳动物表达载体并在哺乳动物细胞中表达
对三种哺乳动物表达载体进行设计并构建用于抗体E3在哺乳动物细胞中的表达。
载体Db.911.3E为包含E3抗体重链可变区及人IgG2a恒定区的表达载体，并适合用于重链的瞬时或稳定表达，由Db.911.3E由对应于以下区域的核苷酸序列组成，所述区域的核苷酸为：小鼠巨细胞病毒启动子区域(第1-612位核苷酸)；合成内含子(第619-1507位核苷酸)；DHFR编码区域(第707-1267位核苷酸)；人生长激素信号肽(第1525-1602位核苷酸)；抗体3E重链可变区(第1603-1965位核苷酸)；包含以下突变的人重链IgG2a恒定区：所述突变为A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2a序列；参见，Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；SV40晚期多腺苷酸化信号(第2974-3217位核苷酸)；SV40增强子区域(第3218-3463位核苷酸)；噬菌体f1区域(第3551-4006位核苷酸)以及β内酰胺酶(AmpR)编码区域(第4443-5300位核苷酸)。Db.911.3E于2003年1月8日保藏在ATCC，并指定ATCC保藏号PTA-4895。
载体Eb.911.3E为包含E3抗体轻链可变区及人κ链恒定区的表达载体，并适合用于轻链的瞬时表达。Eb.911.3E由对应于以下区域的核苷酸序列组成的，所述区域为：小鼠巨细胞病毒启动子区域(第1-612位核苷酸)；EF-1内含子(第619-1142位核苷酸)；人生长激素信号肽(第1173-1150位核苷酸)；抗体E3轻链可变区(第1251-1571位核苷酸)；人κ链恒定区(第1572-1892位核苷酸)；SV40晚期多腺苷酸化信号(第1910-2153位核苷酸)、SV40增强子区域(第2154-2399位核苷酸)；噬菌体f1区域(第2487-2942位核苷酸)以及β内酰胺酶(AmpR)编码区域(第3349-4236位核苷酸)。Eb.911.3E于2003年1月8日保藏在ATCC，并指定ATCC保藏号PTA-4893。
载体Eb.pur.911.3E为包含E3抗体轻链可变区及人κ恒定区的表达载体，并适合用于轻链的稳定表达。Eb.pur.911.3E由对应于以下区域的核苷酸序列组成：小鼠巨细胞病毒启动子区域(第1-612位核苷酸)；人EF-1内含子(第619-1758位核苷酸)；pac基因(嘌呤霉素R)编码区域(第739-1235位核苷酸)；hsp705’UTR区域(第1771-1973位核苷酸)；人生长激素信号肽(第1985-2062位核苷酸)；抗体E3轻链可变区(第 2063-2383位核苷酸)；人κ链恒定区(第2384-2704位核苷酸)；SV40晚期多腺苷酸化信号(第2722-2965位核苷酸)；SV40增强子区域(第2966-3211位核苷酸)；噬菌体f1区域(第3299-3654位核苷酸)以及β内酰胺酶(AmpR)编码区域(第4191-5048位核苷酸)。Eb.pur.911.E3于2003年1月8日保藏在ATCC，并指定ATCC保藏号PTA-4894。
如以下进行瞬时细胞表达：在150mm培养皿中将CHO及HEK293T细胞用25μg每种质粒(即，一种质粒包含重链且一种质粒包含轻链)瞬时共转染。根据制造商的说明将DNA与100μl脂转染胺2000(Invitrogen)混合。将DNA-脂类复合体在无血清或无抗生素的DMEM/F12中接触细胞5小时。在该孵育后，将培养基改变为无任何添加剂的Opti-MEM(Invitrogen)作用两天用于表达。用随后的培养基替换连续达四次对包含抗体的细胞上清液进行收获。上清液用MapSelect A蛋白树脂(Amershambiosciences 17-5199-02)进行亲和层析纯化。抗体在0.3M甘氨酸、pH 8的0.6M NaCl缓冲液中与A蛋白树脂结合，然后用pH 3的0.1M柠檬酸盐缓冲液洗脱。包含抗体的级分立即用pH 8.0的1M Tris缓冲液中和，然后将抗体级分在PBS中透析并浓缩。
实施例6：抗NGF抗体E3在治疗手术后疼痛中是有效的
我们用模仿手术后疼痛的疼痛模型评估用抗体E3治疗的功效。抗体E3包含以下突变的人重链IgG2a恒定区：A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野生型IgG2a序列；参见Eur.J Immunol.(1999)29：2613-2624)；人轻链κ恒定区；以及表1A及1B中显示的重链及轻链可变区。
动物重量在220-240克之间的雄性Sprague Dawley大鼠购自Harlan(Wisconsin)并在手术前在动物设施中适应一周。
手术手术基于如Brennan，等人，Pain 64：493-501(1996)描述的步骤。用空气混合物中的2％异氟醚(isoflurane)对动物进行麻醉并通过鼻锥体在手术期间维持。右后足趾面用聚乙烯吡咯烷酮碘填塞处理，自踵边缘0.5cm起始并延伸到脚趾，通过皮肤及筋膜中央纵向切开1-cm。在弯 曲位置对足部用尺子测量。用弯镊提起跖肌并纵向切开。肌肉通过起点及插入点的完全深度切开。手术全过程通过应用网垫压力控制出血。伤口用两个褥式缝合(5-0ethilon黑单纤丝)闭合。此缝合打5-6个结，第一个结打的宽松。伤口部位用杆菌肽溶液擦拭。在行为检测开始前动物在干净笼中恢复及休息两小时或两小时以上。
评估静息疼痛累积疼痛分值用于评估与重量承受相关疼痛。将动物置于干净塑料笼中的塑料网孔(格子：8mm2)上，将所述塑料笼在平台(h：18″)上升高便于检查它们的足下部。20分钟适应期后，以0至2分评估重量承受程度。如果足发白或压在网孔上给0分，表明完全的重量承受。如果足在刚接触网格就缩回皮肤，皮肤无发白或凹痕给1分。如果足完全离开网孔给2分。如果大鼠仍在休息，则将足退缩认为是2分。对每只动物每5分钟观察1分钟，进行30分钟。在1/2小时期间获得的总共6分值(0-12)用于评估经切开足部的疼痛。也对2分值频率进行计算并用于评估动物足剧烈疼痛或全部保护的发生率。在手术前24小时(基线)，以及手术后2小时、24小时、48小时及72小时对每只动物进行检测。这个实验的结果在图1显示，图1描述了用35mg/kg抗NGF小鼠抗体911治疗动物中观察到的累积静息疼痛分值。这些结果证实用NGF抗体治疗显著降低手术后静息疼痛。重量承受与动物怎样乐意应用四肢有好的相关性，因此为减轻疼痛的有效方法。
在切开前15小时，以不同抗体浓度(每千克动物体重0.004、0.01、0.02、0.1、0.6及1mg)腹膜内注射(i.p.)E3抗体。阴性对照组不注射抗体但用盐溶液进行腹膜内注射。在手术后24小时的检测前30分钟，以0.01mg/kg腹膜内注射芬太尼作为阳性对照。每次试验中，对每一情况包含8只动物(每组n＝8)，并且对照组有56只动物。如以上进行手术并且对累积疼痛分值进行测定。手术后24小时对静息疼痛进行评估。
如图7显示的，当以0.02mg/kg至1mg/kg剂量施用时，手术后人源化抗NGF抗体E3显著降低静息疼痛(p＜0.05)。“＊”表示与对照显著差异(p＜0.05)。用0.02mg/kg治疗至少与用0.01mg/kg芬太尼治疗减 轻疼痛行为同样有效。该芬太尼剂量为该强效阿片样物质正常人剂量的10倍。
在另一实验中，在手术后施用时，对E3抗体在降低手术后疼痛的功效进行检测。在手术后两小时静脉内注射(i.v.)抗体E3(0.5mg/kg)。对照组不施用抗体但静脉内注射盐溶液。进行手术并在手术后24小时对表示为累积疼痛分值的静息疼痛进行评估。如图8中显示的，当抗体在切开后2小时施用时，在切开后二十四小时用抗NGF抗体治疗显著降低静息疼痛(p＜0.05)。这些结果证实在手术后施用时，E3抗体有效减轻手术后疼痛。
实施例7：在类风湿性关节炎大鼠模型中抗NGF拮抗剂抗体911止痛作用评估
与用作参照物质的吲哚美辛比较，用发声试验对在大鼠中经完全弗氏佐剂(CFA)诱导慢性关节炎的抗NGF抗体911的止痛作用(参见，Hongo等人，Hybridoma 19(3)：215-227(2000))进行研究。
本研究中包括在实验期开始时重150g至220g的五十(50)只雄性Lewis大鼠(LEWIS LEW/Crl Ico)(Charles River比利时)。所有动物在开始实验前至少适应5天并在全部研究中于温度(19.5-24.5℃)、相对湿度(45-65％)及12小时光/黑暗周期控制条件房间饲养，并自由采食经过滤自来水及标准实验室颗粒饲料(U.A.R，法国)。在尾巴上对动物进行个体鉴定。
在第0天(D0)，通过在尾中皮内注射0.05ml乳酪分支杆菌(Mycobaterium butyricum)(Difco，美国)悬液的矿物油(10mg/ml)在大鼠中诱导关节炎。第14天(D14)，根据它们后足温和弯曲时发声能力且用对每只后足及前足的炎症分值评估的关节炎指数(参见，Kuzuna等人，Chem.Pharm.Bull.(东京)23：1184-1191(1975)；Pearson等人，Arthritis Rheum.2：440-459(1959))，研究中包括关节炎大鼠。基于以下标准对动物进行打分：0分：外表正常；1分：红斑；2分：轻微水肿 的红斑；3分：无僵硬的强烈炎症；4分：僵硬。研究中只包括在温和弯曲时能发声并表现为2或3分的动物。
研究中包括四组，每组10只大鼠。对于第1组(载体)，第14天(D14)，选择后，大鼠静脉内施用载体(盐水)。第18天(D18)，通过温和弯曲后足对疼痛强度进行评估并对每只动物的发声水平强度进行记录。对于第2组(4天)，在第14天，选择后，大鼠静脉内施用911(10mg/kg)。第18天(D18)，24小时后通过温和弯曲后足对疼痛强度进行评估并对每只动物的发声水平强度进行记录。对于第3组(24小时)，注射CFA后第17天，大鼠静脉内施用911(10mg/kg)。通过温和弯曲后足疼痛强度进行评估并对每只动物的发声水平强度进行记录。对于第4组(吲哚美辛)，第18天(D18)，经口施用吲哚美辛(10mg/kg)后一小时通过温和弯曲后足对疼痛强度进行评估，对每只动物的发声水平强度也进行记录。受检测物质在体积5ml/kg下通过静脉内途径以未知及随机方式施用，而吲哚美辛在体积10ml/kg下通过经口途径进行施用。
[0402]抗NGF抗体911的镇痛作用在表10中显示。对每组结果表达为评估的疼痛强度及记录的每只动物在mV(均值±SEM)中的发声水平以及自载体治疗组均值计算的疼痛强度变化的百分率。经治疗组及载体组之间统计学显著性在单向方差分析法后用剩余变量邓奈特检验(Dunnett’s test)进行确定(P＜0.05)。
表10.大鼠中完全弗氏佐剂诱导的慢性关节炎中911的镇痛作用
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结果表达为均值±sem
每组n＝10只大鼠
第0天(D0)：通过施用CFA诱导慢性关节炎
载体：盐水
在D14或D17静脉内施用911(10mg/kg)并在D18进行疼痛测定。
在D18经口施用吲哚美辛(10mg/kg)并在剂量施用后一小时进行疼痛测定。
邓奈特检验：＊表示与经载体治疗组相比有显著差异P＜0.05
如表10中显示的，单次施用抗体后24小时或4天，在类风湿大鼠模型中，抗NGF抗体911显著降低疼痛。
实施例8：类风湿性关节炎大鼠模型中抗NGF拮抗剂抗体E3及911的药理学作用
抗NGF拮抗剂抗体E3及911的药理学作用(抗炎症及镇痛作用)在大鼠中经完全弗氏佐剂(CFA)诱导的慢性关节炎模型中与用作内部阳性对照物质的吲哚美辛比较进行研究。E3及911的镇痛作用通过测定伤害性反应进行评估。抗炎作用通过足体积、关节炎指数(炎症分值)、体重及后足重量进行评估。在实验结束时，进行足细胞因子水平(IL-6、IL-1β、TNF-α及TGF-β1)、血清中循环TGF-β1、E3及911血浆浓度、生物学参数及X射线摄影术。
实验方法
1.研究设计
本研究中包括80只5周龄雄性Lewis大鼠(LEWIS Lew/Ico)(Charles River Laboratories，比利时)。所有动物在开始实验前至少适应5天并在全部研究中，于温度(19.5-24.5℃)、相对湿度(45-65％)及12小时光/黑暗周期控制条件房间饲养，并自由采食经过滤自来水及标准实验室颗粒饲料(SAFE，法国)。一旦进入动物设施，将它们每笼饲养5只并在任何 检测前观察10天适应期。在尾巴上对动物进行个体鉴定。
研究中包括五组，每组10只动物(来自Charles River Laboratories-比利时的5周龄雄Lewis大鼠-LEWIS Lew/Ico)：第1组。非关节炎大鼠/盐水(载体)，大丸剂静脉内施用，n＝10；第2组：关节炎大鼠/盐水(载体)，大丸剂静脉内施用，n＝10；第3组：关节炎大鼠/吲哚美辛3mg/kg，每天经口施用，进行10天，n＝10；第4组：关节炎大鼠/E3，1mg/kg，大丸剂静脉内施用，n＝10；第5组：关节炎大鼠/911，10mg/kg，大丸剂静脉内施用，n＝10。剂量以游离活性物质(mg/kg)方式表达。E3及911自贮存液临时制备成在盐水中的目的浓度。E31mg/kg∶3.41mL贮存液(0.88mg/ml)q.s.p.15mL盐水。91110mg/kg∶12mL贮存液(2.5mg/ml)q.s.p.15mL盐水。所有经稀释溶液(静脉内注射前)用0.20μm无菌过滤膜进行灭菌；经稀释溶液pH及摩尔渗透压浓度值在每次静脉内注射前测定。在第一次静脉内施用前，盐水、E3及911的摩尔渗透压浓度(mosm/L)分别为278、269及308；盐水、E3及911的pH分别为5.93、6.76、6.71。第二次静脉内施用前，盐水、E3及911的摩尔渗透压浓度(mosm/L)分别为280、270及309；盐水、E3及911的pH分别为5.86、6.72及6.59。
关节炎诱导后第14天及第19天，用5mL/kg体积的E3或911或盐水以经编号的随机顺序通过大丸剂静脉内注射施用。非关节炎组在第14天及第19天，用5mL/kg体积的盐水通过大丸剂静脉内注射施用。吲哚美辛在1％甲基纤维素中临时制备。吲哚美辛用10mL/kg体积于关节炎诱导后第14天至第23天进行10天，每天一次通过以经编号的随机顺序经口途径(p.o.)施用。
2.关节炎的诱导
在第0天(D0)，通过尾部皮内注射0.05ml乳酪分支杆菌悬液在70只大鼠中诱导关节炎。一组10只大鼠不接受任何皮内注射(非关节炎大鼠)。第14天(D14)，本研究包括的关节炎大鼠为以下标准：与非关节炎组(足体积测定如以下描述)的平均足体积(左足及右足体积的均值)相比，所有经包括大鼠显示平均足体积(左足及右足体积的均值)升高至 少0.30ml；所有被包括大鼠在温和弯曲(如以下进行伤害性反应测定)显示发声；并且所有被包括大鼠显示每只后足的关节炎指数分值为2-3(弃去分值为0、1或4的动物)。
3.体重
自第0天至第24天(除了治疗前：D1、D2、D8、D9、D10周末期间天)每天对动物的重量称量一次。除了D14(上午7:30-9:00am)及D24(上午7:30-8:00)外，所有测定在上午9:00至12:00之间进行。
3.足体积的测定
对每只大鼠(关节炎及非关节炎大鼠)的右后足及左后足体积用体积测量器测量。测量在以下时间(诱导关节炎后)进行：第14天(大丸剂静脉内或经口施用前)；及第24天(最后一次大丸剂静脉内注射后5天或最后经口施用后24小时)。所有测量在上午9:00及12:00进行。通过WinDas软件收集并保存所有数据。
4.关节炎指数
关节炎指数用对每只后足及前足(关节炎大鼠)的炎症分值进行评估：0分：外观正常；1分：红斑；2分：轻微水肿的红斑；3分：无僵硬的剧烈炎症；4分：僵硬。此评估在以下时间(诱导关节炎后)进行：第14天(大丸剂静脉内或经口施用前)；及第24天(最后一次大丸剂静脉内注射后5天或最后经口施用后24小时)。所有测量在下午2:00及3:00(D14)、上午8:00至9:00am(D 24)之间进行。通过WinDas软件收集并保存所有数据。
5.伤害性反应的测定(发声试验)
伤害性反应通过用操作者手指以4至5秒间隔重复2次温和弯曲右后足及左后足(关节炎大鼠)进行评估。对每只动物每只后足(2次：右后足：s1及s3；2次：左后足：s2及s4)的发声水平强度进行记录。此评估在以下时间(诱导关节炎后)进行：第14天(大丸剂静脉内或经口施用前)；第18天(第二次大丸剂静脉内注射前或或经口施用后1小时)；及第24天(一次大丸团剂静脉内注射后5天或最后经口施用后24小时)。除了在 D14(上午7:30-9:00)及D 24(上午7:30-9:00)外，所有测量在上午8:00至9:00am之间进行。
6.血液收集用于E3或911浓度及循环TOP-1及血液参数的测定
第24天(足体积及关节炎指数测定以及发声试验后)，用异氟醚(在氧气及一氧化二氮混合物中)的一般麻醉下，血液样本(约800-1000μl)自眶后窦用微量加液器通过毛细作用进行收集。
E3或911浓度(第2、4及5组)的测量：在包含Li-肝素(冰上维持)试管中收集一部分血液样本并于2500-3000g离心10分钟。获得血浆样本(至少100μL)，在液氮中冷冻，储存在-80℃。一个样本轻微溶血(经载体处理的关节炎大鼠#36)。
循环TFG-β(第1-2-3-4-5组)的测定：在微管中收集一部分血液样本用于在室温制备血清。样本收集后，在离心前将血液混合并凝结30分钟。将试管于约6000g离心3分钟。将每份血清样本(至少100μL，除了大鼠#52及#53外)分装并于-20℃储存直至用于TFG-β分析的样本活化。这些分装物(50管)自研究结束保存6个月。一些样本有轻微溶血(经载体处理的非关节炎大鼠：#2、#5、#9、#10；经载体处理的关节炎大鼠：#53、#63；E3-处理的关节炎大鼠#31、#51；911处理的关节炎大鼠#52、#62及#64)。TFG-β水平用人TFG-β1ELISA试剂盒(参考号DB100，批号212258及213610，R&D系统-法国)测定。
用于血液参数的血液收集(第1-2-3-4-5组：50管)：在包含K3-EDTA(至少100μL)的试管中收集血液样本。参数的确定在收集当天进行并且不储存样本。血液参数包括红血细胞、白血细胞、血小板、血红蛋白、用血液细胞计数器测定的血细胞比容(D24)。由于样本凝结(经载体处理的非关节炎大鼠：#10；经E3处理的关节炎大鼠：#59、#67；经911处理的关节炎大鼠：#16)，一些血液参数没有测定。
7.足细胞因子水平
第24天(最后一次大丸剂静脉内注射后5天或最后一次经口施用后24小时)(X射线摄影后)，称量每只动物后足(关节炎及非关节炎大鼠) 重量并收集到经标记聚乙烯管中。组织样本在液氮中冷冻并于-80℃储存。
关节匀浆的制备：将冷冻后足用生物粉碎器制成粉状。然后将粉状后足置于50ml尖底离心管中，所述离心管中包含添加50μl抗蛋白酶混合物的3ml PBS，并用Ultra-Turrax匀浆器(50％最大速度)在冰上进行匀浆。然后将匀浆于4℃，2000x g离心15分钟并将上清液通过0.2μmSartorius过滤器过滤，分装并于-80℃储存直至应用。
细胞因子水平测定：根据制造商的方法，对TFG-α(大鼠TFG-αELISA试剂盒，参考号RTA00，批号213718，R&D系统-法国)、IL-1β(大鼠IL-1βELISA试剂盒，参考号RLB00，批号212435，R&D系统-法国)、IL-6(大鼠IL-6ELISA试剂盒，参考号R6000，批号211773、214008及214362，R&D系统，法国)及TFG-β1(人TFG-β1ELISA试剂盒，参考号DB100，批号212258及213610，R&D系统，法国)细胞因子水平用双份测定。分装的后足匀浆物于-80℃储存。
8.X射线分析
第24天，收集血液后，将动物处死并获得X射线摄影(后足)用于评估关节损伤。X射线分析集中于两只后足的关节糜烂、关节间隙、骨外膜异常。通过观看七个不同项目对所有放射线摄影进行分析：所述七个项目为软组织损伤、畸形、脱矿质作用、关节间隙、糜烂、骨发生及骨膜反应。对于每只动物，通过观看最差后足状况对前六个项目单独进行分析。通过观看尾部对骨膜反应进行分析。对每个项目，分值自0(正常)至4(最大损伤)。因此总分自0至28。不了解动物(经处理或未处理)的同一阅读者对放射摄影术进行解释。
9.观察
由于未知原因，一只动物(#65)在吲哚美辛施用后D23(D23施用前)死亡。
10.结果的分析及表达
在每个时间点，每组中10只大鼠中，所有结果作为均值±平均标准误报道。足体积以自右足及左足体积的均值计算的ml表达。关节炎指数自 对每4只足中获得的总分值计算。伤害性反应通过记录以mV表示的每只动物(4个值的均值：2次/足)的发声水平强度进行评估。伤害性反应抑制的百分率自经载体处理的关节炎组的均值[(经载体处理的关节炎组均值-经治疗关节炎组均值/经载体处理的关节炎组均值)＊100]进行计算。体重以克表达。后足(左足及右足)重量以克表达。每只后足的细胞因子水平(IL-6、IL-lβ、TNF-α及TGF-β1)以pg/ml表达。循环水平的TGF-β1以pg/ml表达。每个参数(脱矿质作用、糜烂、骨膜反应、软组织损伤、关节间隙、骨形成、畸形)的放射指数及总放射指数(总分值)自每个参数获得的总分值进行计算。当相等变量或常态检验失败时，经载体治疗组(关节炎大鼠)及经载体治疗组(非关节炎大鼠)值之间差异的组内显著性通过Student t检验或Mann-Whitney秩和检验进行评估。经载体治疗组(关节炎大鼠)及E3及911及吲哚美辛治疗组之间离差的组内显著性通过单向变异数分析的变量分析接着通过非配对邓奈特t检验进行评估。认为P≤0.05的概率是显著的。所有统计学分析通过SigmastatTM软件进行。
结果
1.伤害性反应(发声试验)
如表11及图8中显示的，D14，在经载体、吲哚美辛、E3及911治疗关节炎组，伤害性反应分别为4147±331、4386±235、4644±367及4468±143。与经载体治疗关节炎组(D 18：1511±398对5279±326mV；D24：1552±508对5905±345mV)相比，在D18及D24，每天经口施用吲哚美辛3mg/kg(10天)后强烈并显著降低伤害性反应分别约-3768mV(抑制％：71％)及-4353mV(抑制％：74％)。与经载体治疗关节炎组(D18：1112±401对5279±326mV；D 24：0±00对5905±345mV)相比，在D18及D24，E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)强烈并显著降低伤害性反应约-4167mV(抑制％：79％)及-5905mV(抑制％：100％)。与经载体治疗关节炎组(D18：1347±492对5279±326mV；D24：547±307对5905±345mV)相比，在D18及D24，911(在D14及D192天静脉内施 用10mg/kg)强烈并显著降低伤害性反应分别为约-3932(抑制％：74％)及-5358mV(抑制％：91％)。
表11.在大鼠类风湿性关节炎中静脉内注射E3及911(2天：D14-D19)后对伤害性反应的作用
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值以mV表达为均值±平均标准误
除了D24用于吲哚美辛(n＝9)外，每组n＝10
邓奈特t检验：＊P≤0.05对经载体治疗关节炎大鼠
2.体重
如表12及图19显示的，自D0至D14由于关节炎的建立，观察到关节炎大鼠中，体重增长显著降低。D14(选择天)，与非关节炎大鼠相比，显示关节炎大鼠体重显著降低(289±2对217±4g)(Student t检验P＜0.05)。然而，检测到在所有关节炎组中，重量(D14)无显著差异。与经载体治疗关节炎组(261±5对218±3g)相比，自D17至D24，在经吲哚美辛治疗组(每天3mg/kg进行10天)的体重适当及显著增加，最大增加为D24时的约43g。与经载体治疗关节炎组(264±5g对218±3g)相比，自 D17至D24，在经E3治疗(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)后，体重适当及显著增加，最大增加为D24时的约46g。与经载体治疗关节炎(265±7对218±3g)相比，自D18至D24，在经911治疗(在D14及D19静脉内施用10mg/kg)后，体重适当及显著增加，最大增加为在D24时的约47g。
表12.大鼠类风湿性关节炎中E3及911静脉内注射(2天：D14-D19)后对体重的影响
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值以克表达为均值±平均标准误。除了D23及D24用于吲哚美辛的动 物数(n＝9)外，每组n＝10只动物
邓奈特t检验：＊P≤0.05对经载体治疗关节炎大鼠
3.足体积
在D14，进行随机化以获得足体积的同质组。如表13中显示的，在D14，在关节炎组的后足体积(右足及左足体积的均值)显著高于非关节炎组(2.10±0.05对1.44±0.02mL(Student t检验P＜0.05))。与经载体治疗关节炎组相比，吲哚美辛(每天3mg/kg经口施用进行10天)显著降低足体积约0.75mL(D24)(1.59±0.03mL对2.34±0.08mL)。与经载体治疗关节炎组相比，E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)轻微并显著增加足体积约0.37mL(2.71±0.09mL对2.34±0.08mL)。与经载体治疗关节炎组相比，911(在D14及D19静脉内施用10mg/kg)轻微并显著增加足体积约0.36mL(2.70±0.11mL对2.34±0.08mL)。
表13.大鼠类风湿性关节炎中E3及911静脉内注射(2天：D14-D19)后对足体积的影响
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值以mL表达为均值±平均标准误。
除了D24用于吲哚美辛的动物数(n＝9)外，每组n＝10只动物
邓奈特t检验：＊P≤0.05对经载体治疗关节炎大鼠
4.关节炎指数
如表14显示的，在D14，在经载体、吲哚美辛、E3及911治疗的关节炎组，关节炎指数分别为10.1±0.8、8.7±0.6、10.2±0.4及9.4±0.7。与经载体治疗关节炎组相比，在每天经口施用3mg/kg(进行10天)后，吲哚美辛强烈并显著降低关节炎指数(2.7±0.7对10.7±0.6)，最大降低约8.0。与经载体治疗关节炎组相比，E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)不影响关节炎指数(11.4±0.4对10.7±0.6)。与经载体治疗关节炎组比，911(在D14及D19静脉内施用10mg/kg)不影响关节炎指数(10.9±0.7对10.7±0.6)相。
表14.大鼠类风湿性关节炎中E3及911静脉注射(2天：D14-D19)后对关节炎指数的影响
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值以均值±平均标准误(分值)表示
除了吲哚美辛(n＝9)外，每组n＝10只动物
邓奈特t检验：＊P≤0.05对经载体治疗关节炎大鼠
5.足细胞因子水平
如表15中显示的，在D24，与非关节炎的经载体治疗组相比，在关节炎的经载体治疗组中左足及右足细胞因子水平增加最大约3.5(IL-1β)、4(TNF-α)及1.8(TGF-β1)倍。对于右足及左足中的IL-6水平，观察到两组之间无显著差异。在左足及右足中，关节炎组的细胞因子水平相似：对IL-6、IL-1β、TNF-α及TGF-β1分别为259.7±38.5对219.2±32.4、4802.8±365.5对4007.1±380.4、17.8±1.6对18.6±1.9及9735.0±1219.8对9161.4±846.1pg/ml。与经载体治疗组相比，在右足中每天经口施用3mg/kg(进行10天)后，吲哚美辛轻微但显著降低TGF-β1水平约1.3倍(7057.4±335.6对9161.4±846.1)，而不改变IL-6、TNF-α或IL-1β水平。在左足中，观察到相似但不显著作用。与经载体治疗组相比，在两只足中，E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)不影响IL-6、IL-1β、TNF-α或TGF-β1水平。与经载体治疗组相比，在右足中，911(在D14及D19静脉内施用10mg/kg)增加IL-1β水平(6215.3±666.7对4007.1±380.4)。在两只足中，对其它细胞因子水平无作用。
表15.在类风湿性关节炎大鼠中E3及911静脉内注射(D14及D19，2天)后对足细胞因子水平的作用
左足细胞因子水平
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右足细胞因子水平
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值以pg/ml表示为均值±平均标准误
除了对于非关节炎/载体组(右足)、关节炎/载体组(左足)和吲哚美辛外(n＝9)外，每组n＝10只动物
邓奈特t检验：＊对经载体治疗关节炎大鼠P≤0.05
6.循环TGF-β1的测定
如表16中显示的，在D24，与非关节炎经载体治疗组相比，在关节炎经载体治疗组中，血清TGF-β1水平增加(81715.7±1984.1对60269.9±2142.8)。与经载体治疗关节炎组相比，在每天经口施用3mg/kg(进行10天)后，吲哚美辛显著降低血清TGF-β1水平约1.5倍(57222.2±3194.1对81715.7±1984.1)。E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)及911(在D14和D19静脉内施用10mg/kg)显著降低血清TGF-β1水平使在经E3及911治疗组中的细胞因子水平可与经载体治疗非关节炎组的细胞因子水平相当(分别为69408.8±3926.7及67214.5±3649.4，对60269.9±2142.8)。
表16.类风湿性关节炎大鼠中E3及911静脉内注射(在D14及D19，2天)后对血清TGF-β1水平的影响
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值以pg/ml表示为均值±平均标准误
除了对于非关节炎/载体组(右足)、关节炎/载体组(左足)和吲哚美辛外(n＝9)外，每组n＝10只动物
邓奈特t检验：＊对经载体治疗的关节炎大鼠P≤0.05
7.血液学参数
如表17中显示的，与经载体治疗的非关节炎大鼠相比，血液学参数如白血细胞及血小板在经载体治疗的关节炎大鼠中较高(Student t检验P＜0.05)。而红血细胞、血红蛋白及血细胞比容不变(Student t检验P＞0.05)。与经载体治疗的关节炎组相比，在每天经口施用吲哚美辛3mg/kg(进行10天)后，吲哚美辛不影响血液参数。与经载体治疗的关节炎组相比，E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)不影响血液参数。与经载体治疗的关节炎组相比，911(在D14及D19静脉内施用10mg/kg)不影响血液参数。
表17.大鼠类风湿性关节炎中E3及911静脉内注射(在D14及D19，2天)后对血液参数的作用(在D24测定)
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值表示为均值±平均标准误
变异数分析：对经载体治疗的关节炎大鼠P＞0.05
7.后足重量
如表18中显示的，在经载体治疗的关节炎大鼠中左后足及右后足重量大于在经载体治疗的非关节炎大鼠中左后足及右后足的重量(分别为3.43±0.11对1.98±0.01及3.32±0.12对1.99±0.02g)(Student t检验或Mann-Withney P＜0.05)。与经载体治疗的关节炎组相比，在每天经口施用3mg/kg(进行10天)后，吲哚美辛显著降低后足重量(左后足：2.23±0.04对3.43±0.11g；右后足：2.20±0.05对3.32±0.12g)。与经载体治疗的关节炎组相比，E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)只显著降低左 后足重量(左后足：3.86±0.14对3.43±0.11g；右后足：3.72±0.13对3.32±0.12g)。与经载体治疗的关节炎组相比，911(在D14及D19静脉内施用10mg/kg)只显著增加右后足重量(左后足：3.73±0.12对3.43±0.11g；右后足：3.83±0.15对3.32±0.12g)。
表18.大鼠类风湿性关节炎中静脉内注射(在D14及D192天)后E3及911对后足重量的作用(在D24测定)
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值以克表示为均值±平均标准误
除了对于吲哚美辛外(n＝9)，每组n＝10只动物
邓奈特t检验：＊对经载体治疗的关节炎大鼠P≤0.05
8.X-射线分析
如表19中显示的，在经载体治疗的非关节炎大鼠中观察到总分值0.0±0.0。经载体治疗的关节炎大鼠具有总分值15.1±1.3，脱矿质作用(2.4±0.3)、糜烂(2.7±0.3)、软组织损伤(3.1±0.2)及关节间隙(3.3±0.2)；骨膜反应的中等分值(1.0±0.3)、骨形成(0.8±0.2)及畸形(1.8±0.2)。与经 载体治疗的关节炎组相比，吲哚美辛(每天经口施用3mg/kg进行10天)强烈及显著降低总分值约10.7(4.4±0.9对15.1±1.3)。与经载体治疗的关节炎组相比，E3(在D14及D19静脉内施用1mg/kg)不影响总分值(14.2±1.3对15.1±1.3)。与经载体治疗的关节炎组相比，911(在D14及D19静脉内施用10mg/kg)不影响总分值(15.4±1.0对15.1±1.3)。
表19.大鼠类风湿性关节炎中静脉内注射(在D14及D192天)后E3及911对X射线参数的作用(在D24测定)
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值表示为均值±平均标准误
除了对于吲哚美辛外(n＝9)，每组n＝10只动物
邓奈特t检验：＊对经载体治疗的关节炎大鼠P≤0.05
结论
在以上描述的实验条件下，E3(静脉内施用1mg/kg 2天：D14-D19) 及911(静脉内施用10mg/kg 2天：D14-D19)显示强烈镇痛作用，但在此关节炎模型中不显示显著的抗炎作用。
实施例9：在类风湿性关节炎大鼠模型中不同剂量抗NGF抗体E3的作用
在关节炎大鼠中，通过研究施用E3与疼痛降低之间剂量反应关系进一步研究E3产生降低疼痛的能力。如以上描述，大鼠用佐剂进行处理以诱发关节炎。没有用佐剂注射的十只大鼠用作非关节炎对照。佐剂注射后十四天，基于以上阐述标准，将动物定性用于研究中，将十只大鼠随机加入到八组中，并对它们发声反应的强度进行检测。然后，如以上描述的，在第14天对它们施用盐水或0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg或5mg/kg的E3抗体。在第16、18、20及24天，对动物的发声反应进行检测。发声测试后第18天，用盐水或相同剂量E3对动物重新施用。在第14天开始，每天对动物称重。因此，在第14及18天，对动物用给定剂量抗体或盐水施用两次，并在第14、16、18、20及24天对疼痛评估五次。数据在表20-22中及图20-22中显示。
表20.类风湿性关节炎大鼠中不同剂量E3对伤害性反应(发声强度)的影响。发声强度值以mV的均值平均标准误表达
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用不同剂量抗NGF抗体E3对疼痛诱导发声的作用(表20中显示的数据)通过用双向秩和变异数分析进行统计分析以比较用经载体治疗的关节炎动物与用给定剂量抗体E3治疗的关节炎动物之间配对获得的结果。在受检测E3的所有水平均有高度显著作用(p＜0.0001)。甚至在最低检测剂量(0.003mg/kg E3)，发声中的差异是显著的(p＜0.0001)。
如表20及图20中显示的，与以上实验相同，用1mg/kg抗体E3治疗显示快速及强烈减轻了疼痛。两天(检测的最早时间点)内，发声强度降 低90％。用较低浓度E3治疗也强烈减轻了疼痛，虽然在较低剂量下减轻疼痛需要较长时间显现。在第24天，除了受检测的最高剂量外，功效明显降低可能是由于受试大鼠的血浆E3真正水平的降低在免疫反应之后发生。低至0.003mg/kg的剂量在这个模型提供至少部分疼痛减轻是显然的。
表21.类风湿性关节炎大鼠中不同剂量E3对体重的影响(校正到第14天)
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表22.类风湿性关节炎大鼠中不同剂量E3对体重的影响(校正到第0天)
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用不同剂量抗NGF抗体E3治疗动物对体重的作用通过双向变异数分析进行分析以比较用载体治疗的关节炎动物与用给定剂量抗体E3的关节炎动物之间配对获得的结果。用校正到第14天的重量数据(表21)，0.03mg/kg E3剂量导致体重的显著变化(p＜0.005)。在所有较高剂量E3中，经治疗及未经治疗关节炎动物之间的差异是显著的(p＝≤0.0001)。用校正到第0天的重量数据(表22)，0.03mg/kg E3剂量导致体重中的显著变 化(p＜0.002)。在所有较高剂量E3中，经治疗及未经治疗关节炎动物之间的差异是显著的(p＜0.0001)。
又与较早研究相一致的是，用E3治疗的大鼠显示的体重减轻不如经盐水治疗的关节炎大鼠明显(表22及图22)。实际上，用高剂量抗体E3治疗大鼠恢复了较早的重量减轻，并实际上快于它们的非关节炎同伴的重量增加(表21及图21)。
生物材料的保藏
以下生物材料(大肠杆菌(Escherichia coli))保藏在美国，弗吉尼亚，Manassas，10801 University Boulevard，美国典型培养物保藏中心(ATCC)：
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载体Eb.911.3E为编码E3轻链可变区的多核苷酸；载体Eb.pur.911.3E为编码E3轻链可变区的多核苷酸，并且载体Db.911.3E为编码E3重链可变区的多核苷酸。
该保藏在国际公认用于专利程序及其规程的微生物保藏(布达佩斯条约)的布达佩斯条约规定下制备。这保证了自保藏日期有活力培养物维持30年。此保藏物根据布达佩斯条约可通过ATCC获得，并根据Rinat神经科学公司及ATCC之间的协议。所述协议保证在相关美国专利发布时或任何美国或外国专利申请公开时，无论哪个先公开，公众永久及不受限制获得保藏培养物子代，并保证由美国专利商标局认为根据35USC第122节及与其相关规则(包括特别谈及886OG 638的37CFR第1.14节)确定的人可获得子代。
本申请的代理人同意如果在合适条件下培养时，保藏材料的培养物死亡或丢失或破坏，立即通知将材料用另一同样培养物替代。保藏材料的可获得性不构成准许违背任何政府当局根据其专利法的授权而实施本发明。
抗体序列
重链可变区(Kabat CDR以下划线表示；Chothia CDR以粗体及斜体表示)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLI![]()
WIRQPPGKGLEWIG ![]()
![]()
RVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR ![]()
WGQGTLVTVS(SEQ ID NO：1)
轻链可变区(Kabat CDR以下划线表示；Chothia CDR以粗体及斜体表示)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ![]()
WYQQKPGKAPKLLIY ![]()
GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC ![]()
GQGTKLEIKRT(SEQ IDNO：2)
E3重链延伸CDR
CDRH1：GFSLIGYDLN(SEQ ID NO：3)
CDRH2：IIWGDGTTDYNSAVKS(SEQ ID NO：4)
CDRH3：GGYWYATSYYFDY(SEQ ID NO：5)
E3轻链延伸CDR
CDRL1：RASQSISNNLN(SEQ ID NO：6)
CDRL2：YTSRFHS(SEQ ID NO：7)
CDRL3：QQEHTLPYT(SEQ ID NO：8)
小鼠单克隆抗体911延伸CDR
911重链延伸CDR
CDRH1：GFSLIGYDIN(SEQ ID NO：9)
CDRH2：MIWGDGTTDYNSALKS(SEQ ID NO：10)
CDRH3：GGYYYGTSYYFDY(SEQ ID NO：11)
911轻链延伸CDR
CDRL1：RASQDISNHLN(SEQID NO：12)
CDRL2：YISRFHS(SEQ ID NO：13)
CDRL3：QQSKTLPYT(SEQ ID NO：14)
E3重链氨基酸序列(完全)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：16)
3E轻链氨基酸序列(完整抗体)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHXVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：17)
3E重链核苷酸序列(完整抗体)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA(SEQ ID NO：65)
3E重链可变结构域核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCCGACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTG ATGGAACCACAGACTATAATTCAGCTGTAAATCCGCGTCACCTCTCAAAAGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：66)
3E轻链核苷酸序列(完整抗体)
GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTTCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAG GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA(SEQ IDNO：67)
3E轻链可变结构域核苷酸序列
GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTCACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGC(SEQ ID NO：68)
应当理解文中描述的实施例及实施方案只用于阐述目的并且根据其的多种改变或变化是本领域技术人员考虑的并包括在本申请的精神及范围内。
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