氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料及其制备方法和应用技术领域
本发明涉及一种氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/盐酸阿霉素/PSCA抗体多功
能材料及其制备方法，属于纳米药物载体和纳米造影剂技术领域。
背景技术
碳元素是自然界最神奇的元素，在纳米世界里，碳元素的表现也同样令人吃
惊，2004年英国曼彻斯特大学的安德烈·K·海姆(Andre K.Geim)首次制造出石
墨烯，它是世界上最薄的新型二维纳米材料，其厚度仅为0.35nm。它的独特性
质吸引了无数科学家，可以说它是诸多新材料中最具有潜力的，被称为“奇迹材
料”，在工业、电力行业及电子产业都具有极大的应用前景。
与石墨相比，氧化石墨烯中含有羧基、羟基、羰基以及环氧基等化学基团，
其中羧基和羟基修饰在氧化石墨片的边缘处，羰基和环氧基位于氧化石墨烯层之
间，石墨原本是不溶于水的物质，氧化后氧化石墨烯具有极强的亲水性，容易分
散于极性介质中形成稳定的溶胶，这是由于氧化石墨烯表面这些活性基团的存
在。
20世纪50年代,科学家相继提出了氧化石墨烯的结构，主要是三大基本模型,
Ruess模型、Hofmann模型和Scholz-Boehm模型。一般认为，氧化石墨烯为二维
层状结构，层间含有大量的羟基和羧基酸性活性基团。目前，氧化石墨烯的研究
开始关注它在生物医药方面的应用，比如药物、基因运输，特别是癌症治疗靶向
药物传递系统的研究引起了非常大的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/盐酸阿霉素/PSCA
抗体多功能材料。这种药物载体在水中分散性好，生物相容性好，材料本身毒性
小，药物负载能力强，在磁共振成像中具有很好的应用。
本发明的另一个目的是为了提供这种双功能药物载体的制备方法，该方法具
有操作简单、原料易得和成本低廉等优点。
本发明的目的是这样实现的：
氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/盐酸阿霉素/PSCA抗体多功能材料的制备方
法，包括如下步骤：
（1）在纳米氧化石墨烯表面连接PAMAM：纳米氧化石墨烯分散在醇中并
活化，与含有第三代以均苯三甲酸为内核的聚酰胺-胺树枝状大分子的醇溶液混
合搅拌18～30hr，得到GO/PAMAM纳米材料；纳米氧化石墨烯与第三代聚酰
胺-胺树枝状大分子重量比为1：20～40；
（2）GO/PAMAM纳米材料溶解在有机溶剂中，加入三乙胺和二亚乙基三
胺五乙酸二酐，70～85℃下加热20～60min，停止加热后继续反应10～18hr，取
沉淀洗涤，得到GO/PAMAM/DTPA纳米材料；GO/PAMAM纳米材料与二亚乙
基三胺五乙酸二酐的重量比为4～8：1；
（3）GO/PAMAM/DTPA纳米材料与可溶性钆盐混合后，隔绝空气的条件
下35～50℃保温10～15hr，取沉淀用水透析12～30hr，得到氧化石墨烯
/PAMAM/DTPA-Gd纳米材料；钆元素与GO/PAMAM/DTPA纳米材料用量比为
0.002～0.01mmol/mg；
（4）连接抗PSCA抗体：氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd纳米材料经戊二醛
处理后，在pH=7.2～7.5的磷酸缓冲液中与抗前列腺癌干细胞抗原抗体PSCA在
0～6℃下反应10～16hr并洗涤；氧化石墨烯/PAMAM-DTPA-Gd纳米材料与抗前
列腺癌干细胞抗原抗体重量比为10000：1～10000：5。
步骤（1）中的纳米氧化石墨烯厚度为1～2nm，且表面带有羧基。
纳米氧化石墨烯制备方法包括如下步骤：石墨烯粉末用盐溶液膨胀后加入
95wt%～98wt%浓硫酸搅拌6～12hr，再加入KMnO4，混合物在35～40℃下搅
拌25～40min、在65～80℃下搅拌40～60min，然后在98~105℃下搅拌20～
35min；用过氧化氢终止反应，洗涤取固体，在水中超声分散。
步骤（1）中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺DEC和N-羟基琥珀酸
亚胺NHS活化纳米氧化石墨烯，纳米氧化石墨烯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳
二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺重量比为1：3～8：3～8；步骤（1）中所述的醇为
甲醇。
步骤（2）中，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺DMF；GO/PAMAM纳米材料
与三乙胺的重量比为1：4～8。
通过上述方法可以得到氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材
料。
这种氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料，用于可控制药
物释放的治疗癌症靶向和核磁共振T1造影剂。
进一步可以制备氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素复合
材料，步骤包括：
将氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料与含有盐酸阿霉
素、pH=7.2～7.5磷酸缓冲液在避光条件下搅拌反应16～30hr；盐酸阿霉素与氧
化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料重量比为1：1～1：2，优选
为2:3。
本发明首先采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯，然后将该氧化石墨烯
表面修饰3G的树枝状大分子（PAMAM），氧化石墨烯和以均苯三甲酸为内核的
树枝状大分子（PAMAM）之间通过生成酰胺键共价相连接；利用树枝状上面的
氨基修饰DTPA-Gd和PSCA抗体，盐酸阿霉素通过π-π键相互作用吸附到氧化
石墨烯上。氧化石墨烯具有双面结构，表面有很多活性基团，有非常好的生物相
容性和稳定性，药物负载能力强，能够很好的进行药物负载和运输，修饰上
DTPA-Gd后可以作为很好的T1造影剂，从而实现合成具有靶向治疗和MRI成像
的多功能材料的目的。同时所得材料具有良好的生物相容性，有利于材料在生物
医药领域的应用。
本发明的实施要点是：采用Hummers法和超声波法制备氧化石墨烯时，要
注意加入高锰酸钾的量和时间的掌握，要用1小时左右的时间来加入高锰酸钾，
最后超声的时间要长，这样制备的氧化石墨烯片层较薄，并且均匀。接DTPA-Gd
的时候温度是关键，要保证每一步的温度准确，急速的升降温对材料的制备都不
利。我们这种方法制备出的材料可以很好地分散于水中，并且具有良好的生物相
容性。对设备的要求低；所需原料价格低；副产物无公害，对环境无污染。本发
明具有创造性、新颖性和在癌症和肿瘤治疗方面有广泛实用性。
本发明的优点是：
1.制得的氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/盐酸阿霉素/PSCA抗体多功能材
料，药物负载量大，靶向效果明显，杀死癌细胞效果显著。
2.制备装置简单；
3.制备的氧化石墨烯片层较薄、分散性好、水溶性好；
4.原材料易得、价格低廉；
5.操作简单；对环境无污染。
6.是一种具有前列腺癌肿瘤细胞特异靶向性、药物负载和传输以及核磁共
振成像的多功能材料，在医药和生物等领域应用价值大。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的氧化石墨烯的红外光谱图（IR图）；图1中
的a是石墨，b是氧化石墨烯；
图2为本发明实施例1中制备的氧化石墨烯的原子力显微镜图片（AFM）；
图3为本发明实施例1中制备的氧化石墨烯的透射电镜照片（TEM）；
图4为本发明实施例2中制备的氧化石墨烯/PAMAM（a）和氧化石墨烯
/PAMAM/DTPA材料（b）的氨基密度分析；
图5为本发明实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA材料分散在
水中的T1加权成像图（a）和弛豫率R1(1/T1)与样品中钆浓度之间的线性关系图
（b）；
图6为本发明实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA材料分散在
水中的T2加权成像图（a）和弛豫率R2(1/T2)与样品中钆浓度之间的线性关系图
（b）；
图7为本发明实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA材料与PC-3
（a）和MCF-7（b）两种细胞的MTT毒性数据；
图8为本发明实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体材料与
PC-3和MCF-7两种细胞的T1加权成像图（a），信号强度图（b）和细胞吞噬
Gd离子的量（c）；
图9分别为本发明实施例4中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/
盐酸阿霉素材料载药量的紫外-可见光谱图（a）和平均载药量分布图（b）。经过
计算可知平均载药量为0.7415毫克/毫克；
图10为本发明实施例4中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸
阿霉素材料药物在pH=7.4和pH=5.3时累积释放图；
图11分别是实施例4氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉
素和盐酸阿霉素与PC-3和MCF-7两种细胞的MTT毒性数据；（a）和（b）分别
是氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素和盐酸阿霉素与PC-3
细胞孵育的MTT，（c）和（d）分别是氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗
体/盐酸阿霉素和盐酸阿霉素与MCF-7细胞孵育的MTT。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面通过实施例来详细说明本发明的技术内
容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
1）称取1g石墨烯粉末于烧杯中，再加入50g氯化钠，搅拌10min；往
烧杯中加入适量的蒸馏水，进行抽滤收集膨胀的石墨烯粉末；
2）将收集的膨胀的石墨烯粉末置于250mL的单颈烧瓶中，加入23mL的
98%的浓硫酸，磁力搅拌8h，缓慢逐步加入3g KMnO4，其间保持温度小于20℃；
3）混合物在35～40℃下磁力搅拌30min，然后在65～80℃下磁力搅拌
45min。加热反应结束后，往单颈烧瓶中加入46mL的蒸馏水，混合物在98～
105℃下磁力搅拌30min；加入140mL的蒸馏水和10mL的30%的H2O2，终止
反应；
4）用5%的HCl和蒸馏水将混合物反复离心和抽滤洗涤，将产物分散在水
中超声1h，得到纳米氧化石墨烯，溶液颜色为棕色。
图1为实施例1中制备的氧化石墨烯的红外光谱图（IR图），从红外光谱图
中看到，在1723cm-1处出现羧基上的C=O伸缩振动，说明石墨粉被氧化成氧化
石墨烯，表面带有羧基；图1中的a是石墨，b是氧化石墨烯。
图2为实施例1中制备的氧化石墨烯的原子力显微镜图片（AFM），从原子
力显微镜图上可以很清晰的看出氧化石墨烯片是平滑的，并且进过测量分析可知
石墨烯薄片的厚度大约是1.246nm，与文献所报道的单层石墨烯的厚度吻合，表
明单层的氧化石墨烯薄片已经成功制备；
图3为实施例1中制备的氧化石墨烯的透射电镜照片（TEM），从图上可以
看出石墨烯薄片状的结构非常明显，并且整体来看石墨烯并非完全平整，但是片
层很薄，在边缘处存在较为明显的褶皱与折叠现象发生，这是由于二维晶体的热
力学涨落所引起的。
实施例2
1）称取氧化石墨烯GO 40mg于烧杯中，加入100mL无水甲醇，加入1-(3-
二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酸亚胺NHS各0.2g，超声活
化1h；
另外称取PAMAM(3G)1g于50mL烧杯中，加入30ml无水甲醇，超声分
散1h；
超声分散结束后，把PAMAM(3G)溶液缓慢滴加到GO溶液中，室温下搅
拌24h；
反应结束后离心（12000rpm，12min）洗涤，制得GO/PAMAM(3G)纳米材
料；
2）称取20mg GO/PAMAM纳米材料，溶解于8mL无水DMF中；
加入0.18mL三乙胺（130mg），再加入4mg二亚乙基三胺五乙酸二酐
（DTPA），置于25mL烧瓶中，然后缓慢加热到80℃，持续30min，撤去热
源，常温搅拌一夜；
将反应后的材料用离心方法进行分离，先用含TEA 1％的DMF洗涤3
遍，水洗3遍，丙酮再洗3遍，干燥后储存于低温的环境中，得到连接二乙烯
五胺乙酸配体（DTPA）的GO/PAMAM纳米材料，即GO/PAMAM(3G)-DTPA纳
米材料；
3）将20mg GO/PAMAM-DTPA纳米材料和10ml pH=8缓冲液混合于25
mL烧瓶中，再加入40mg Gd(NO3)3.6H2O（0.09mmol），充分混合，再将反应液
密封好，缓慢地加热到40℃，恒温一夜；
将反应液离心，将沉淀物在蒸馏水中透析24h，除去没有反应的钆离子，
即得GO/PAMAM-DTPA-Gd纳米材料。
图4为实施例2中制备的氧化石墨烯/PAMAM（a）和氧化石墨烯
/PAMAM/DTPA材料（b）的氨基密度分析，测得GO/PAMAM纳米材料表面氨
基密度约为1.152×10-4mol/g，测得GO/PAMAM-DTPA纳米材料的表面氨基密
度为6.17×10-5mol/g，由此实验结果可以看出，纳米材料表面氨基还有剩余，可
以用来接靶向分子。
实施例3
1）秤取5mg实施例2所得到的氧化石墨烯/PAMAM-DTPA-Gd纳米材料
材料分散在含5%戊二醛的PBS(pH=7.4)缓冲溶液中，静置2h，把材料离心
分离出来，用PBS洗涤三次，然后重新分散在PBS(pH=7.4)缓冲溶液中，加入
10μL(浓度0.13μg/μL）PSCA抗体，将氧化石墨烯/PAMAM-DTPA-Gd纳米材
料与抗体一起培养；
2）在4℃搅拌12h；
3）反应结束后用PBS(pH=7.4)缓冲溶液洗数次，保存于4℃的PBS(pH=7.4)
缓冲溶液。得到的氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料具有良
好的水溶性。
图5为实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料分
散在水中的T1加权成像图（a）和弛豫率R1(1/T1)与样品中钆浓度之间的线性关
系图（b）；
图6为实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料分
散在水中的T2加权成像图（a）和弛豫率R2(1/T2)与样品中钆浓度之间的线性关
系图（b），T1和T2成像信号强度随着Gd离子浓度的增加而改变，具体表现为：
T1成像信号强度随着Gd离子浓度的增加图像明显变亮；T2成像信号强度随着
Gd离子浓度的增加图像明显变暗。弛豫率随着样品浓度的增加呈线性增长，纵
向驰豫系数为r1为8.34Gd Mm-1s-1,横向驰豫系数r2为12.47Gd Mm-1s-1,并且在
0.5T下的r2/r1值为1.5，适合做T1造影剂。这些数据也说明
GO/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA纳米材料可以作为一个很好的T1造影剂；
图7为实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料与
PC-3和MCF-7两种细胞的MTT毒性数据，随着GO/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体
多功能材料的浓度的增大，PC-3和MCF-7细胞的活力没有发生明显的减小。
当浓度高达200μg/mL的样品与PC-3和MCF-7两种细胞孵育24小时后，两种
细胞仍旧保持大于85%的细胞活力。这些结果表明，
GO/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材料在这样的浓度下对PC-3和MCF-7
两种细胞的细胞毒性较低。
图8为实施例3中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体纳米材料标记
的PC-3和MCF-7两种细胞的T1加权成像图（a），信号强度图（b）和细胞吞噬
Gd离子的量（c），随着Gd离子浓度的增加两种细胞的T1加权成像逐渐变亮，
信号强度逐渐增加，综合分析看出高表达细胞PC-3的T1加权成像增强效果更
加明显，这一方面说明PSCA抗体的良好靶向作用，一方面说明材料很适合作为
T1造影剂。
实施例4
1）取30mg实施例3制备的GO/PAMAM-DTPA-Gd/PSCA抗体多功能材
料在20mL的盐酸阿霉素的PBS溶液中（pH=7.4）室温下避光搅拌24h；
2）离心分离，用PBS溶液洗涤离心所得到的固体到离心液为无色，室温
下真空干燥得到GO/PAMAM-DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素药物传输材料；
3）剩余的药物含量通过测量离心液（含洗涤液）的紫外吸收，取在490nm
处的吸收值来计算。从而也可以算出载在氧化石墨烯/PAMAM-DTPA-Gd/PSCA
材料上的药品的量。平行三次实验，载药量取平均值。
盐酸阿霉素负载量的计算通过测量离心液（含洗涤液）和原溶液的紫外吸收，
取在490nm处的吸收值来计算。
图9分别为实施例4中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉
素材料载药量的紫外图和平均载药量分布图。根据药物和氧化石墨烯
/PAMAM/DTPA-Gd作用前后的UV-vis吸收的差值可计算出载药量。经过计算可
知平均载药量为0.74毫克/毫克；
图10为实施例4中氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素
材料药物在pH=7.4和pH=5.3时累积释放100%图，从图中可以看出，承载药物
的GO/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA杂化材料的DOX的释放是pH值响应的和持续
的，能够做到可控制性释放和缓慢释放药物的作用。在pH=7.4时，DOX的释放
量缓慢，并且很少，24h时药物仅释放了6.5%，72h时药物释放了8%，然而在
pH=5.3时，DOX的释放量增大，24h时药物已经释放了38.5%，当72h后，药
物的释放达到了40%，这是因为在酸性条件下，DOX的亲水性和溶解性大大增
加；
图11分别是氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素材料和
盐酸阿霉素与PC-3和MCF-7两种细胞共孵育后的MTT毒性数据；（a）和（b）
分别是氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素和盐酸阿霉素与
PC-3细胞孵育的MTT数据，（c）和（d）分别是氧化石墨烯
/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素和盐酸阿霉素与MCF-7细胞孵育的
MTT数据。
从结果可以看到，氧化石墨烯/PAMAM/DTPA-Gd/PSCA抗体/盐酸阿霉素多
功能材料对癌细胞的杀伤效果比单纯的盐酸阿霉素要好，并且，对高表达和低表
达的癌细胞都有杀伤效果，但是对高表达的癌细胞杀伤效果更是明显。