技术领域
本发明涉及包含编码蛋白质的多核苷酸的表达系统，其中所述表达系统包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸编码至少一种诱导T细胞应答的蛋白质、肽或其变体，所述第二多核苷酸编码至少一种诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质、肽或其变体。本发明还涉及由所述表达系统编码的蛋白质混合物和包含所述表达系统或所述蛋白质混合物的细胞以及包含所述表达系统或所述蛋白质混合物的药物组合物。所述表达系统、多核苷酸、蛋白质、细胞和药物组合物可用于预防或治疗感染。本发明还涉及编码经修饰流感血凝素(HA)的核苷酸构建体和表达系统。
背景技术
感染性疾病仍然是人类的主要威胁。预防或治疗感染性疾病的一种方法是通过疫苗接种人工诱导免疫应答，所述疫苗接种是向个体施用抗原性材料使得产生对抗各抗原的适应性免疫应答。所述抗原性材料可以是结构完整但灭活(即，非感染性)或减毒(即，感染性降低)的病原体(例如，微生物或病毒)或者已被发现具有高免疫原性的病原体之纯化组分。诱导对抗病原体之免疫应答的另一方法是提供包含一种或更多种编码病原体之免疫原性蛋白质或肽之载体的表达系统。这样的载体可以是裸质粒DNA形式，或者通过使用病毒载体(例如基于经修饰痘苗病毒(例如，经修饰安卡拉痘苗病毒；MVA))或腺病毒载体来递送免疫原性蛋白质或肽。这样的表达系统的优点是包含良好表征的对环境条件具有低敏感性的组分。
在开发基于载体的表达系统时，一个特定目的是向患者应用这些表达系统以引发防御由各病原体引起之感染的免疫应答。但是，虽然诱导了对抗病原体的免疫原性应答，一些表达系统不能引发足够强从而完全防御由病原体所致感染的免疫应答。因此，仍然需要能够诱导对抗病原体(例如感染剂例如病毒)的保护性免疫应答的表达系统。
病毒
病毒是这样的一组病原体/感染剂：其没有自身代谢机制并且可以被认为是各宿主细胞的专性内寄生物，其使用宿主细胞装备(facilities)的至少一部分来进行病毒蛋白质表达和病毒复制。可以基于构成病毒基因组的核酸的类型(DNA/RNA)、链(单链(ss)或双链(ds))、意义(sense)(负义或正义)及其复制来对病毒进行分类(Baltimore分类)。因此，病毒一般分为DNA病毒和RNA病毒。病毒可进一步分为单链(ss)或双链(ds)DNA或RNA病毒，其基因组是单链核酸或双链核酸。一些病毒具有一部分是双链、一部分是单链的基因组(例如，嗜肝DNA病毒)。基因组的方向或“意义”和/或在制备用于预防或治疗病原体的药物和/或用于预防或治疗病原体的方法中，其中病原体在病毒的病毒生命周期中(特别是在ssRNA病毒或ssDNA病毒的生命周期中)起重要作用。正义ssRNA(+)基因组与细胞mRNA具有相同的方向，并且可以直接翻译为病毒蛋白质。在具有负义单链RNA基因组(ssRNA(-))的病毒的生命周期中，基因组序列有必要转录为可以被宿主细胞翻译为病毒蛋白质的正义mRNA。将包含正义和负义二者的单链基因组称为“双义”(例如，ssRNA(+/-)、ssDNA(+/-))。
虽然病毒的基因组可以相当大(例如，在DNA病毒的情况下)，但是，特别地，小RNA病毒进化发展出了以非常高效的方式表达其基因产物(例如，蛋白质和肽)的策略。这些策略之一是表达由病毒基因组编码的一种或更多种多蛋白(polyprotein)，所述多蛋白共翻译加工为或在翻译后加工为单一蛋白质和/或肽。该策略例如被一些具有正义基因组的双链(ds)RNA病毒或单链(ss)RNA病毒适应性改变。“包膜病毒”(例如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒、黄病毒、弹状病毒和甲病毒)被来源于宿主质膜的脂质双层包围(1)。
附着糖蛋白见于所有包膜病毒中并且通过其与宿主细胞质膜上的蛋白质或其它分子的碳水化合物部分或细胞粘附结构域结合来介导病毒包膜与宿主细胞质膜之间最初的相互作用。因而，附着糖蛋白在病毒与宿主细胞膜之间的间隙处形成桥。命名为“H”的附着糖蛋白具有血凝素活性，命名为“HN”的糖蛋白具有血凝素活性和神经氨酸酶活性。当附着糖蛋白既不具有血凝素活性也不具有神经氨酸酶活性时，将其命名为“G”。
副粘病毒
副粘病毒是一个动物病毒家族，其包含单链非区段化负义RNA。副粘病毒导致多种动物疾病和人疾病。副粘病毒的RNA基因组长度为15至19千碱基(kb)，并且编码6至10个基因。各基因在起始和结束处包含转录起始/终止信号，它们被转录为基因的一部分。由于称为“转录极性”的现象(其中最接近基因组3’端的基因与接近5’端的那些相比以更大的量转录)，副粘病毒的基因序列是保守的。各基因被转录之后，当RNA依赖性RNA聚合酶遇到基因间序列时，其暂停从而释放新的mRNA。当RNA聚合酶暂停时，其可能从RNA基因组解离。如果其解离，则其必须在前导序列处再进入基因组，而非继续转录基因组长度。因此，从前导序列越下游的基因，它们被RNA聚合酶转录得越少。副粘病毒的基因以成功感染所需的蛋白质的相对顺序排列。保守的基因顺序是核壳体-磷蛋白-基质-融合蛋白(Fusion)-附着蛋白(Attachment)-大(聚合酶)。
许多副粘蛋白基因组遵循所谓“六倍规则”。根据该规则，基因组的总长度几乎总是六的倍数。但是，亚家族肺病毒亚科的成员包括呼吸道合胞病毒(RSV)不遵循该规则。
呼吸道合胞病毒(RSV)
在世界范围内，名为呼吸道合胞病毒(RSV)的包膜病毒是婴儿和儿童病毒性下呼吸道疾病(LRTI)的最重要的原因(2)。在美国，估计每年有70,000至126,000名婴儿因RSV肺炎或细支气管炎住院，并且细支气管炎的住院率从1980年开始升高(3)。儿童在2岁前受到感染，并且WHO估计每年RSV在约6400万儿童中引起疾病并造成160,000例死亡。在工业化国家，就儿童的呼吸道疾病而言，RSV导致至少50％的住院，并且儿童中所有RSV感染的多达6％导致住院(4)。RSV感染不激发持续性的免疫力，因此人宿主经受终生的感染和再感染循环。虽然在传统上认为RSV是儿科病原体，但是RSV也在年长者和免疫受损的个体中引起严重疾病(5)。年长者中RSV疾病的负担与季节性流感的负担相当，并且估计成人中RSV相关疾病的经济影响大于流感，这与缺勤天数相关(6，7)。单克隆抗体预防在将具有重病高风险的婴儿的RSV住院率降低50％方面有效(8)。但是，目前没有有效的RSV疫苗或抗病毒疗法。
在二十世纪六十年代，经福尔马林灭活的(formalin-inactivated，FI)RSV疫苗对婴儿的灾难性作用阻碍了疫苗开发。该疫苗无法防御RSV感染并且诱导加重的呼吸道疾病(9)，其导致诱导高效价、弱中和、低亲和力的抗体，缺乏CD8+T细胞引发并且诱导偏向Th2的免疫应答(10、11和12)。有证据表明RSV削弱充分的适应性T细胞免疫应答的诱导(13)。
因此，非常需要不仅保护婴儿还增强年长者中免疫力并且在作为婴儿RSV感染之主要来源的兄弟姐妹和成人中减少RSV传播的有效疫苗。尤其期望能够在尚未感染RSV的个体(婴儿)中诱导中和抗体应答和强效且广泛之T细胞应答以引发T细胞应答或者在需要将记忆应答“重置”为较高水平的个体(年长者)中加强预先存在的T细胞应答的RSV疫苗。
正粘病毒
正粘病毒是一个RNA病毒家族，其包括5个属：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、传染性鲑鱼贫血症病毒属(Isavirus)和索戈托病毒属(Thogotovirus)。最近描述了第六个属。前三个属包含在脊椎动物(包括鸟、人和另一些哺乳动物)中导致流感的病毒。这3个流感病毒属的核蛋白和基质蛋白具有抗原性差异。A型流感病毒感染人、另一些哺乳动物和鸟，并导致了所有的流感大流行。B型流感病毒感染人和海豹。C型流感病毒感染人和猪。
正粘病毒家族的病毒包含6至8个区段的线性负义单链RNA。总基因组长度为12000至15000个核苷酸(nt)。最大的区段为2300至2500nt；第二大区段为2300至2500nt；第三大区段为2200至2300nt；第四大区段为1700至1800nt；第五大区段为1500至1600nt；第六大区段为1400至1500nt；第七大区段为1000至1100nt；第八大区段为800至900nt。基因组序列具有在两端重复的末端重复序列。5’端的末端重复长度为12至13个核苷酸。相同家族的属中3’端的核苷酸序列相同，主要针对RNA(区段)或针对所有RNA种类。3’端的末端重复序列长度为9至11个核苷酸。
流感病毒是最重要的呼吸道病原体之一。仅在美国，每年流感感染就造成20,000至40,000例死亡和100,000例住院(1)。流感感染之后，婴儿、年长者和具有受损心脏、肺部或免疫系统的个体有相当大的产生严重并发症的风险。
在预防疾病方面，免疫被证实是最有效的措施。所有现有流感疫苗的共同特征之一在于主要靶向诱导直接抗主要病毒包膜蛋白——血凝素(HA)的中和抗体。
发明概述
在第一方面，本发明提供了包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的表达系统，所述第一多核苷酸编码至少一种诱导T细胞应答的蛋白质、肽或其变体，所述第二多核苷酸编码至少一种诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质、肽或其变体。
在第二方面，本发明提供了由所述第一方面的表达系统编码的分离的蛋白质混合物。
在第三方面，本发明提供了包含所述第一方面之表达系统和/或所述第二方面之蛋白质混合物的分离的宿主细胞。
在第四方面，本发明提供了包含所述第一方面之表达系统或所述第二方面之蛋白质混合物以及可药用载体和/或赋形剂的组合物。
在第五方面，本发明提供了所述第一方面的表达系统、所述第二方面的蛋白质混合物、所述第三方面的细胞和所述第四方面的组合物，其用于特别是治疗或预防感染性疾病(优选病毒性疾病)的药物。
在第六方面，本发明提供了治疗或预防病毒性疾病的方法，其包括施用有效量的所述第一方面的表达系统、所述第二方面的蛋白质混合物、所述第三方面的细胞和所述第四方面的组合物。
在第七方面，本发明提供了增强免疫应答的方法，其包括施用所述第一方面的表达系统、所述第二方面的蛋白质混合物、所述第三方面的细胞以及所述第四方面的组合物。
在第八方面，本发明提供了编码流感血凝素(HA)的核苷酸构建体、包含这些核苷酸构建体的表达系统，和由该核酸构建体或表达系统编码的蛋白质或多蛋白，其中HA0切割位点具有多碱性氨基酸序列(multibasic sequence)。
在第九方面，本发明提供了多碱性氨基酸HA0切割位点在构建能够在体外和/或体内表达流感血凝素(HA)的表达系统中的用途。
在第十方面，本发明提供了由第八方面之表达系统编码的分离的蛋白质混合物。
在第十一方面，本发明提供了包含第八方面之核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白和/或第十方面之蛋白质混合物的分离的宿主细胞。
在第十二方面，本发明提供了包含第八方面之核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白或者第十方面之蛋白质混合物以及可药用载体和/或赋形剂的组合物。
在第十三方面，本发明提供了第八方面的核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白、第十方面的蛋白质混合物、第十一方面的细胞和第十二方面的组合物，其用于特别是治疗或预防流感病毒感染的药物。
在第十四方面，本发明提供了治疗或预防流感病毒感染的方法，其包括施用有效量的第八方面之核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白、第十方面之蛋白质混合物、第十一方面之细胞和第十二方面之组合物。
在第十五方面，本发明提供了增强免疫应答的方法，其包括施用第八方面的核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白、第十方面的蛋白质混合物、第十一方面的细胞和第十二方面的组合物。
上述概述不必然描述本发明的所有方面。
附图简述
图1：RSV疫苗多蛋白的示意图。conF0＝F蛋白的共有序列，2A＝口蹄疫病毒的翻译切割位点，conN＝N蛋白的共有序列，conM2-1＝M2-1蛋白的共有序列。
图2：疫苗抗原F0ΔTM-N-M2-1在哺乳动物细胞中高效加工。HeLa细胞裂解物的Western印迹分析；nt：未被转染的HeLa。RSV transf：经F0ΔTM-N-M2-1转染的HeLa细胞。RSV inf：用RSV株A感染的Hep2细胞。
图3：所分泌的F蛋白质形成同三聚体。经转染HeLa细胞上清液的Western印迹分析；RSV：经F0ΔTM-N-M2-1转染，F0：经F0ΔTM转染，对照：经空质粒转染。
图4：与单独的F蛋白相比，由疫苗多蛋白表达的F蛋白是更好的免疫原。A.用PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1感染的HeLa细胞上清液的Western印迹分析，其使用来自用F0ΔTM或F0ΔTM-N-M2-1免疫之小鼠的不同稀释度的血清来进行探测。B.图A的Western印迹的光密度扫描。数据表示为对应于蛋白质条带的面积的相对强度。
图5：通过单次肌内注射，RSV疫苗在小鼠中诱导强效的全身性T细胞免疫。使用RSV F蛋白和M蛋白的作图免疫显性肽进行PanAd3/F0ATM-N-M2-1免疫的Balb/C小鼠脾细胞的IFNg-Elispot测定。
图6：流感疫苗多蛋白的示意图。NP＝NP蛋白的共有序列，M1＝M1蛋白的共有序列，2A＝口蹄疫病毒的翻译切割位点，H1p＝H1N12009的HA蛋白的共有序列。
图7：经转染的HeLa细胞中H1p表达的Western印迹分析。用PVJ-H1p转染(泳道1)、用PVJ-H1转染(泳道2)和未经转染CTR(泳道3)的HeLa细胞的总裂解物。箭头显示对应于未切割(70kD)HA0形式和经切割(28Kd)HA2的条带。多克隆抗HA血清识别HA2蛋白片段中的表位。示出H1p蛋白被完全加工。
图8：膜展示的HA蛋白的全细胞FACS分析。直方图代表用野生型HA(右上图)和H1(右下图)转染的HeLa细胞的中值荧光分析。用针对H1p产生的超免疫小鼠多克隆血清孵育细胞，然后用缀合有PE的抗小鼠二抗孵育。在左上图和左下图中，用小鼠免疫前血清孵育细胞以设置背景荧光水平。
图9：H1p能够诱导较高的抗体效价。针对经包被之重组HA(H1N1California2009)进行ELISA测定。针对用H1和H1p免疫的动物之血清来测量抗体效价。通过血清的系列稀释来计算效价，并示出与背景相比高出三倍的OD值的稀释度。
图10：MDCK细胞的HA(H1N1Mexico2009)假型病毒感染更强效地被用H1p免疫之动物的血清中和。用H1p和NPM1H1p免疫之动物的血清针对经包被之重组HA(H1N1California2009)的ELISA测定结果。
图11：在三联抗原的情形下表达的H1p能够诱导更高的抗体效价。针对经包被之重组HA(H1N1California2009)的ELISA测定。针对用H1p和NPM1H1p免疫之动物的血清测量抗体效价。通过血清的系列稀释来计算效价，并示出与背景相比高出三倍的OD值的稀释度。
图12：在经转染的HeLa细胞中，NPM1H1p抗原表达的Western印迹分析显示该蛋白质被完全加工。用pNEB-NPM1H1p转染(泳道1)、用pNEB-NPM1转染(泳道2)和模拟转染(泳道3)的HeLa细胞的总裂解物。箭头显示对应于融合蛋白NPM1(70kD)的条带。使用抗-NP单克隆抗体来检测胞内蛋白质。
图13：从NPM1H1p加工得到的H1p展示在细胞膜上并且正确折叠。模拟转染(左图)或用NPM1H1p转染(右图)的HeLa细胞的全细胞FACS分析。用与HA茎区(stem region)中的构象表位结合的小鼠mAb C179孵育细胞，然后用缀合有PE的抗小鼠二抗孵育。
发明详述
在下文中详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以改变。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。除非另有限定，否则本文所使用的全部科技术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。
优选地，本文所使用的术语如″A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)″，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和H.编辑(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland中所述的定义。
在本说明书通篇中引用了若干文献。本文所引用文献(包括全部专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明、GenBank登记号序列提交等)的每一篇，无论在上文或下文中，均通过引用整体并入本文。这不应解释为承认本发明无权作为在先发明而先于这些公开内容。
定义
在本说明书和所附权利要求书通篇中，除非上下文另有需要，否则词语“包括”以及其变化形式例如“包含”和“含有”应理解为意在囊括所指出整数或步骤或者整数组或步骤组，但是不排除任何其他整数或步骤或者整数组或步骤组。
缩略语“F”或“F0”在本文中可互换使用，是指副粘病毒(优选RSV)的融合蛋白。
缩略语“G”是指副粘病毒(优选肺病毒亚科，更优选RSV)的糖蛋白。
缩略语“H”是指副粘病毒(优选麻疹病毒)的血凝素蛋白。
缩略语“HN”是指副粘病毒(特别是呼吸道病毒属、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)和腮腺炎病毒属(Rubulavirus))的血凝素-神经氨酸酶蛋白。
缩略语“N”是指副粘病毒(优选RSV)的核壳体蛋白。
缩略语“M”是指副粘病毒(优选RSV)的糖基化基质蛋白。
就副粘病毒而言，缩略语“M2”或“M2-1”是指副粘病毒(优选RSV)的非糖基化基质蛋白。
缩略语“P”是指副粘病毒(优选RSV)的磷蛋白。
就副粘病毒而言，缩略语“NS1”和“NS2”是指副粘病毒(优选RSV)的非结构蛋白1和2。
缩略语“L”是指副粘病毒(优选RSV)的聚合酶的催化亚基。
缩略语“HA”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的血凝素。
缩略语“HA0”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的血凝素亚基HA1和HA2的前体蛋白。
缩略语“H1p”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的经修饰血凝素。
缩略语“NA”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的神经氨酸酶。
缩略语“NP”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的核蛋白。
缩略语“M1”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的基质蛋白1。
就正粘病毒而言，缩略语“M2”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的基质蛋白M2。
就正粘病毒而言，缩略语“NS1”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的非结构蛋白1。
缩略语“NS2/NEP”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的非结构蛋白2(也称为NEP，核输出蛋白质)。
缩略语“PA”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的聚合酶亚基蛋白。
缩略语“PB1”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的聚合酶亚基蛋白。
缩略语“PB2”是指正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的聚合酶亚基蛋白。
缩略语“PB1-F2”或“PB1F2”是指由正粘病毒(优选流感病毒属，更优选A型流感病毒)的PB1基因区段中的交替读码框编码的蛋白质。
本文所使用的术语“表达系统”是指设计用于产生一种或更多种目的基因产物的系统。通常而言，这样的系统是“人工”设计的，即，通过可用于体外在无细胞系统中或体内在基于细胞的系统中产生目的基因产物的基因技术手段。应理解，本发明的表达系统不涵盖天然表达系统(例如天然病毒)。
“目的基因产物”通常指大分子，例如但不限于RNA、肽、多肽或蛋白质、或其区段、表位或片段。
在一个表达系统中，目的基因产物由一个或更多个核酸分子编码。将核酸分子理解为由核苷酸单体产生的多聚大分子。核苷酸单体包含核碱基、五碳糖(例如但不限于核糖或2’-脱氧核糖)和1至3个磷酸基团。通常而言，多核苷酸是通过各核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成的。在本发明的上下文中提及核酸分子包括但不限于核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用。
在无细胞表达系统中，将分离的多核苷酸用作体外翻译反应的模板。在基于细胞的表达系统中，多核苷酸包含在一个或更多个载体上。本文所使用的术语“载体”指能够被引入细胞或者将包含于其中的蛋白质和/或核酸引入细胞的蛋白质或多核苷酸或其混合物。在本发明的上下文中，优选由所引入的多核苷酸编码的目的基因基于载体的引入而在细胞中表达。合适的载体的实例包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
短语“T细胞应答的诱导”指病毒特异性CD4+或CD8+T细胞的产生或再刺激。本发明的表达系统可诱导或再刺激T细胞介导的、针对存在于由多核苷酸表达的病毒性蛋白质中的I类或II类MHC表位的适应性应答。可以通过本领域中已知的方法来测量这样的T细胞应答，优选地通过用覆盖整个病毒蛋白质的合成肽来离体再刺激T细胞并且分析增殖或干扰素-γ产生。
短语“B细胞应答的诱导”指产生IgG或IgA类免疫球蛋白的病毒特异性B细胞的产生或再刺激。本发明的表达系统可诱导或再刺激B细胞产生特异性针对由多核苷酸表达的病原性(例如，病毒性)抗原的抗体。可以用血清或粘膜免疫球蛋白的合成抗原通过ELISA(酶联免疫染色测定)测定来测量这样的B细胞应答。或者，可以通过病毒中和测定来测量所诱导的抗体效价。
短语“抗病原性B细胞应答的诱导”指产生IgG或IgA类免疫球蛋白的病毒特异性B细胞的产生或再刺激，其失活、清除、阻断和/或中和各病原体使得由该病原体引起的疾病不发作和/或症状得到缓解。这也称为针对病原体的“保护性免疫应答”。本发明的表达系统可诱导或再刺激B细胞产生特异性针对由多核苷酸表达的病原性(例如病毒性)抗原的抗体。可以用血清或粘膜免疫球蛋白的合成抗原通过ELISA(酶联免疫染色测定)测定来测量这样的B细胞应答。或者，可以通过病毒中和测定来测量所诱导的抗体效价。
短语“增强免疫应答”指加强或强化对抗免疫原(优选病原体，更优选病毒)的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。可以通过使用本文所述的测试和/或在本技术领域中公知的测试将由本发明表达系统引发的免疫应答与单独表达相同抗原/免疫原之表达系统的免疫应答进行比较来测量免疫应答的增强。
在一个表达系统中，目的基因可以由单个多核苷酸编码或者由若干分别的多核苷酸编码。在基于细胞的表达系统中，一个或更多个多核苷酸可以包含在一个或若干个分别的载体上。这些多核苷酸均可编码目的基因产物的全部或一部分。
此外，表达系统可包含调节目的基因表达的“表达调控序列”。通常而言，表达调控序列是多肽或多核苷酸，例如但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子或阻抑子。
因此，包含一个或更多个编码一种或更多种目的基因产物的多核苷酸的载体还可包含表达调控序列。对于包含多于一个编码一种或更多种目的基因产物之多核苷酸的载体，可通过一个或更多个表达调控序列一起或分别调控表达。更特别地，包含于载体上的各多核苷酸可以由分别的表达调控序列调控，或者包含在载体上的所有多核苷酸可以由单个表达调控序列调控。由单个表达调控序列调控的包含在单个载体上的多核苷酸优选地形成开放读码框。
术语“表达系统”还涵盖目的基因产物的表达，包括多核苷酸的转录、RNA剪接、翻译为多肽以及多肽或蛋白质的翻译后修饰。
术语“开放读码框”(open reading frame，ORF)指可以被翻译为氨基酸的核苷酸序列。通常而言，这样的ORF包含起始密码子、长度通常为3个核苷酸倍数的后续区，但在给定读码框中不包含终止密码子(TAG、TAA、TGA、UAG、UAA或UGA)。通常而言，ORF天然形成或者由人工构建(即，通过基因技术手段来实现)。ORF编码蛋白质，其中可以翻译为该蛋白质的氨基酸形成肽连接链。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，并且指氨基酸的任何肽连接链，无论长度或有否翻译后修饰。
本文所使用的术语“翻译后”指在核苷酸三联体翻译为氨基酸并且与序列中前一氨基酸形成肽键之后发生的事件。这样的翻译后事件可以在完整多肽形成之后发生或者在已被翻译的多肽的那些部分的翻译过程中发生。翻译后事件通常改变或修饰所得多肽的化学特性或结构特性。翻译后事件的实例包括但不限于例如氨基酸的糖基化或磷酸化或者肽链的切割(例如通过内肽酶来实现)等事件。
本文所使用的术语“共翻译”指在核苷酸三联体翻译为氨基酸链的过程中发生的事件。这些事件通常改变或修饰所得氨基酸链的化学特性或结构特性。共翻译事件的实例包括但不限于可彻底终止翻译过程或者干扰肽键形成从而产生两种分别的翻译产物的事件。
本文所使用的术语“多蛋白”或“人工多蛋白”指包含并非天然彼此连接的两条氨基酸链或者基本由其组成或者由其组成的氨基酸链。多蛋白可包含一种或更多种其它氨基酸链。各氨基酸链优选为完整蛋白质(即，覆盖整个ORF)或其片段、结构域或表位。多蛋白的各部分彼此可以永久连接或暂时连接。永久连接的多蛋白各部分是由单个ORF翻译出来的，并且在之后也不共翻译地分开或者在翻译后分开。暂时连接的多蛋白各部分也可以得自单个ORF，但由于翻译过程中分离而共翻译地分开或者由于肽链的切割(例如，通过内肽酶实现)而在翻译后分开。另外地或作为替代地，多蛋白各部分也可得自两个不同的ORF并且在翻译后连接(例如通过共价键实现)。
可以通过化学修饰进一步修饰可用于本发明的蛋白质或多蛋白(包括蛋白质衍生物、蛋白质变体、蛋白质片段、蛋白质区段、蛋白质表位和蛋白质结构域)。这意味着这样的经化学修饰的多肽包含除20种天然氨基酸以外的另一些化学基团。这样的另一些化学基团的实例包括但不限于糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。与亲本多肽相比，多肽的化学修饰可提供有利特性，例如提高的稳定性、增加的生物半衰期或提高的水溶性中的一种或更多种。适用于本发明可用之变体的化学修饰包括但不限于：PEG化、非糖基化亲本多肽的糖基化或者对存在于亲本多肽中的糖基化模式的修饰。适用于本发明可用之变体的这些化学修饰可共翻译地发生或在翻译后发生。
术语“区段”指可由大分子(例如，多肽、蛋白质或多蛋白)分成的大分子之任意部分。大分子可以由一个或更多个区段组成。由于大分子和/或单个区段的功能特性(例如，具有免疫反应特征或膜附着功能)或结构特性(例如核苷酸或氨基酸序列，或者二级结构或三级结构)，可以存在这样的区段。在本发明的上下文中，优选地，术语“区段”指蛋白质或多蛋白的一部分。特别优选地，这样的区段独立于蛋白质或多蛋白的其余部分而折叠和/或起作用。
“表位”(也称为“抗原决定簇”)是被免疫系统(尤其是被抗体、B细胞或T细胞)识别的大分子之区段。这样的表位是能够与抗体或其抗原结合片段结合的大分子部分或区段。在上下文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合。在本发明的上下文中，优选地，术语“表位”指被免疫系统识别的蛋白质或多蛋白之区段。表位通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定三维结构特征，以及特定带电特征。构象表位和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下丧失与前者(而非后者)的结合。
本文所使用的术语“结构域”指可独立于蛋白质链其余部分而进化、起作用和/或存在的蛋白质或多蛋白序列或结构(或相应的核苷酸序列)的区段。通常而言，蛋白质由一个或若干个结构域组成，各结构域为稳定的并且独立于蛋白质链其余部分而折叠的三维结构。这样的结构域通常在蛋白质中形成独立的功能单元(例如，跨膜结构域、免疫球蛋白样结构域或DNA结合结构域)。
本文所使用的术语蛋白质或区段“变体”应理解为这样的多肽(或区段)：与其来源多肽(或区段、表位或结构域)相比，氨基酸序列中具有一个或更多个变化。蛋白质变体来源的多肽也称为“亲本多肽”。同样，区段变体来源的区段称为“亲本区段”。通常而言，变体是人工构建的，优选地通过基因技术手段来实现。通常而言，亲本多肽是野生型蛋白质或野生型蛋白质结构域。在本发明的上下文中，还优选亲本多肽(或亲本区段)是两条或更多条野生型多肽(或野生型区段)的共有序列。此外，可用于本发明的变体还可以来源于亲本多肽的同系物、直系同源物或旁系同源物或者来自人工构建的变体，前提是所述变体表现出亲本多肽的至少一种生物活性。氨基酸序列变化可以是氨基酸互换、插入、缺失、N-末端截短或C-末端截短，或者这些变化的任意组合，其可在一个或若干个位点处发生。在一些优选实施方案中，可用于本发明的变体表现出总数目多至200(多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200)个氨基酸序列变化(即，互换、插入、缺失、N-末端截短和/或C-末端截短)。氨基酸互换可以是保守的和/或非保守的。在一些优选实施方案中，可用于本发明的变体与该变体来源的蛋白质或结构域相差多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸互换，优选保守性氨基酸变化。
作为替代地或另外地，本文所使用的“变体”可表征为与所述变体来源之亲本多肽或亲本多核苷酸的某一水平的序列同一性。更精确地说，在本发明的上下文中，蛋白质变体与其亲本多肽表现出至少80％的序列同一性。在本发明的上下文中，多核苷酸变体与其亲本多核苷酸表现出至少80％的序列同一性。优选地，蛋白质变体的序列同一性为20、30、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸的一段连续序列。优选地，多核苷酸变体的序列同一性是60、90、120、135、150、180、210、240、270、300或更多个核苷酸的一段连续序列。
就多肽和多核苷酸序列比较而言，在本说明书通篇使用了术语“至少80％序列同一性”。优选地，这一表达是指与各参照多肽或者与各参照多核苷酸具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。优选地，所述多肽与参照多肽在20、30、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸的一段连续序列或者相对于参照多肽的全长来说表现出所示序列同一性。优选地，所述多核苷酸与参照多核苷酸在60、90、120、135、150、180、210、240、270、300或更多个核苷酸的一段连续序列或者相对于参照多肽的全长来说表现出所示序列同一性。
另外地或作为替代地，变体可包含氨基酸缺失，其可以是N-末端截短、C-末端截短或内部缺失，或者这些的任意组合。这样的包含N-末端截短、C-末端截短和/或内部缺失的变体在本申请上下文中称为“缺失变体”或“片段”。术语“缺失变体”和“片段”在本文中可互换使用。片段可以是天然的(例如，剪接变体)或者其可以是人工构建的(优选地通过基因技术手段来实现)。优选地，与亲本多肽相比，片段(或缺失变体)在其N-末端和/或在其C-末端和/或内部具有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的缺失，优选在其N-末端，在其N-末端和C-末端或者在其C-末端。在将两条序列进行比较并且未特别给出待与另一序列进行比较以计算序列同一性百分比的参照序列的情况下，如果未另外特别指明，则参照待比较的两条序列中较长的序列来计算序列同一性。如果指出了参照序列，若未另外特别指明，则基于由SEQ ID所示的参照序列的全长来确定序列同一性。例如，与根据SEQ ID NO：1的蛋白质F的氨基酸序列相比，由50个氨基酸组成的肽序列可表现出10.04％(50/498)的最大序列同一性百分比，而长度为249个氨基酸的序列可表现出50.00％(249/498)的最大序列同一性百分比。
可以通过序列比对来确定核苷酸与氨基酸序列的相似度(即，序列同一性百分比)。可以使用本领域已知的若干算法来进行这样的比对：优选使用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877)、使用hmmalign(HMMER package，http://hmmer.wustl.edu/)或者使用CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.& Gibson，T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)，其可在例如http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html或http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clusta lw.html得到。优选使用的参数是默认参数，它们设置在http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html中。可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)来计算序列同一性(序列匹配)的级别。类似的算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中。用BLASTN程序(计分＝100，词长＝12)来进行BLAST多核苷酸检索以得到与编码F、N或M2-1的那些核酸同源的多核苷酸序列。用BLASTP程序(计分＝50，词长＝3)进行BLAST蛋白质检索以得到与F多肽、N多肽或M2-1多肽同源的氨基酸序列。为了得到空位比对(gapped alignment)以用于比较目的，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，使用各程序的默认参数。可以用已建立的同源性作图技术例如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics2003b，19Suppl1：I54-I62)或马尔科夫随机场(Markov random field)来补充序列匹配分析。在本申请中提及序列同一性百分比时，如果未特别另外指明，则相对于较长序列的全长来计算这些百分比。
除非另有指明，本发明的多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体包含遵循WIPO标准ST.25的标准单字母或三字母代码命名的氨基酸。如果未另外指明，所述单字母或三字母代码指示天然L氨基酸，并且氨基酸序列以从各蛋白质、肽或其变体的N-端到C-端的方向表示。
也可使用“杂交”作为两条核酸序列之间序列同一性或同源性的测量方法。根据标准杂交技术，可以使用编码本发明蛋白质的核酸序列或任意这些之一部分作为杂交探针。各探针与来自测试来源的DNA或RNA杂交指示测试来源中分别存在靶DNA或RNA。杂交条件对于本领域技术人员而言是已知的，并且可见于例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1991中。“温和的杂交条件”定义为等同于在30℃于2×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在50℃于1×SSC、0.1％SDS中清洗。“高度严格条件”定义为等同于在45℃于6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在65℃于0.2×SSC、0.1％SDS中清洗。
另外地或作为替代地，缺失变体的发生可以不是由于如上所述各氨基酸的结构缺失所致，而是由于这些氨基酸被抑制或者不能完成其生物学功能所致。通常而言，发生这样的功能缺失是由于氨基酸序列中的插入或互换使所得蛋白质的功能特性发生改变，例如但不限于所得蛋白质的化学特性的改变(即，疏水氨基酸与亲水氨基酸互换)、所得蛋白质的翻译后修饰的改变(例如，翻译后切割或糖基化模式)、或者二级蛋白质结构或三级蛋白质结构的改变。另外地或作为替代地，功能缺失也可以由于转录或转录后基因沉默(例如，通过siRNA)或者抑制性分子(例如但不限于蛋白质抑制剂或抑制性抗体)的存在与否而发生。
在本发明的上下文中，优选地，“功能缺失”的蛋白质(或区段或结构域或表位)指相应序列的氨基酸或核苷酸要么缺失要么存在但不能完成其生物学功能。
本文所使用的术语“共有”指代表多序列比对结果的氨基酸或核苷酸序列，其中将相关序列彼此进行比较。这样的共有序列包含最常在各位置处观察到的氨基酸或核苷酸。在本发明的上下文中，优选地，在用以获得共有序列的序列比对中使用的序列是在世界范围内暴发的多种不同疾病中分离的不同病毒亚型/血清型毒株的序列。将在序列比对中使用的各个体序列称为特定病毒“分离株”的序列。在实施例部分中提供了用以获得这样共有序列的数学方法的更详细描述。在对于给定位置未能确定“共有核苷酸”或“共有氨基酸”的情况中(例如，因为只比较了两个分离株)，则优选使用分离株中的每一个的氨基酸。评估所得蛋白质各自的诱导B细胞和/或T细胞的能力。
在本发明的上下文中，“肽接头”(或简称“接头”)指1至100个氨基酸的氨基酸序列。在一些优选实施方案中，本发明肽接头的最短长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。在另一些优选实施方案中，本发明肽接头的最大长度为100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个氨基酸或者更少。优选地，肽接头在连接在一起的两种氨基酸蛋白质、片段、区段、表位和/或结构域之间提供柔性。如果氨基酸小，则这样的柔性通常增加。因此，优选地，本发明的肽接头具有增加含量的小氨基酸，特别是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。优选地，肽接头的多于20％、30％、40％、50％、60％或更多的氨基酸是小氨基酸。在一个优选实施方案中，接头的氨基酸选自甘氨酸和丝氨酸。在一些特别优选的实施方案中，可以组合本发明肽接头的如上所示的优选最小长度和最大长度，如果这样的组合具有数学意义的话。在另一些优选实施方案中，本发明的肽接头是非免疫原性的；在一些特别优选的实施方案中，肽接头对于人而言是非免疫原性的。
本文所使用的术语“切割位点”指这样的氨基酸序列或核苷酸序列，其中该序列指导分割(例如因为它被切割酶识别)和/或可以被分割。通常而言，多肽链通过连接氨基酸的一个或更多个肽键的水解进行切割，多核苷酸链通过核苷酸之间的一个或更多个磷酸二酯键的水解进行切割。肽键或磷酸二酯键的切割可源于化学切割或酶切割。酶切割指通过蛋白水解酶实现的这些切割，所述蛋白水解酶包括但不限于限制性内切酶(例如，I型、II型、II型、IV型或人工限制性酶)和内肽酶或外肽酶或者内蛋白酶或外蛋白酶(例如，丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶)。通常而言，酶切割由于自切割而发生或者通过独立的蛋白水解酶而发生。蛋白质或多肽的酶切割可以共翻译发生或者在翻译后发生。因此，本文所使用的术语“内肽酶切割位点”指氨基酸或核苷酸序列中的切割位点，其中该序列被内肽酶(例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胶原酶、弗林蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内肽酶V8、组织蛋白酶)切割或者可以被内肽酶切割。作为替代地或另外地，本发明的多蛋白可以被自我蛋白酶(autoprotease)(即，在也包含蛋白酶的同一蛋白质分子中切割肽键的蛋白酶)切割。这样的自我蛋白酶的实例是黄病毒的NS2蛋白酶或双RNA病毒的VP4蛋白酶。
作为替代地，术语“切割位点”指分别阻止氨基酸或核苷酸之间形成肽键或磷酸二酯键的氨基酸序列或核苷酸序列。例如，由于多肽或多蛋白的共翻译自加工导致来自单一开放读码框的单个翻译事件的两种不连续翻译产物，从而可以阻止键形成。通常而言，这样的自加工是通过由假终止密码子序列引起的“核糖体跳过(ribosomal skip)”实现的，所述假终止密码子诱导翻译复合物从一个密码子移动到下一个密码子而不形成肽键。诱导核糖体跳过的序列的实例包括但不限于病毒性2A肽或2A样肽(在本文中统称为“2A肽”或者可互换地称为“2A位点”或“2A切割位点”)，其被若干病毒家族(包括小核糖核酸病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫(Trypanosoma))使用。最著名的是通常用于由单个ORF产生多重多肽的小核糖核酸病毒家族的鼻病毒和口蹄疫病毒的2A位点。
因此，本文所使用的术语“自切割位点”指氨基酸或核苷酸序列中这样的切割位点，其中该序列在不涉及任何其它分子进行这样切割的情况下被切割或者可以被切割，或者该序列中的肽键或磷酸二酯键形成在第一位置处被阻止(例如，通过如上所述的共翻译自加工来实现)。
应理解，切割位点通常包含若干氨基酸或者由若干密码子编码(例如，在“切割位点”不翻译为蛋白质而导致翻译干扰的情况下)。因此，切割位点还可用于肽接头目的，即，在空间上分离两个肽。因此，在一些实施方案中，“切割位点”既是肽接头还提供上述切割功能。在该实施方案中，切割位点可涵盖额外的N-末端和/或C-末端氨基酸。
本文所使用的术语“宿主细胞”指具有载体(例如，质粒或病毒)的细胞。这样的宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如真菌细胞、植物细胞或动物细胞)。
“可药用”意为经联邦政府或州政府的管控机构批准或者列于美国药典或其它一般认可的用于动物、更特别地用于人的药典中。
本文所使用的术语“载体”指在药理上无活性的物质，例如但不限于与治疗活性成分一起施用的稀释剂、赋形剂或载剂。这样的药物载体可以是液体或固体。液体载体包括但不限于无菌液体，例如盐水溶液和油，包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。还可以将盐水溶液和水性葡萄糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于注射用溶液。当静脉内或利用雾化器鼻内施用药物组合物时，优选的载体是盐水溶液。
合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中。
术语“组合物”旨在包括活性化合物与作为载体之包封材料的制剂，其提供胶囊，其中载体围绕活性组分(有或没有其它载体)，因此，活性成分与载体缔合。
术语“佐剂”指在细胞水平或体液水平增加、刺激、活化、加强或调节针对组合物之活性成分的免疫应答的试剂，例如，免疫佐剂刺激免疫系统针对实际抗原的应答但其本身没有免疫效应。这样的佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如，无机金属盐例如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如，皂角苷或鲨烯)、油基佐剂(如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、颗粒状佐剂(例如，免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒颗粒、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A或胞壁肽)、合成佐剂(例如，非离子型嵌段共聚物、胞壁肽类似物或合成脂质A)或合成多核苷酸佐剂(例如，多聚精氨酸或多聚赖氨酸)。
术语“活性成分”指药物组合物或制剂中有生物学活性(即提供药物价值)的物质。药物组合物可包含一种或更多种活性成分，所述活性成分可以联合起作用或者彼此独立地起作用。
可以将活性成分配制为中性形式或盐形式。可药用盐包括与游离氨基形成的那些，例如由盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等衍生的那些，以及与游离羧基形成的那些，例如但不限于由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的那些。
本文所使用的“患者”意为任何可获益于用本文所述之肿瘤疫苗治疗的哺乳动物、爬行动物或鸟类。优选地，“患者”选自：实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家畜(包括例如，豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、龟、乌龟、蛇或蜥蜴)或者灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩和人类)。特别优选所述“患者”是人类。
如本文所使用地，疾病或病症的“治疗”意为实现以下之一或多个：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制或防止所治疗病症的症状特征发展；(c)抑制所治疗病症的症状特征恶化；(d)限制或防止在之前有该病症的患者中所述病症复发；以及(e)限制或防止在之前有该病症症状的患者中该症状复发。
本文所使用的疾病或病症的“防止”或“预防”意为防止所述疾病或病症在患者中发生。
如本文所使用的，“施用”包括体内施用，以及直接施用于离体组织(例如血管移植物)。
“有效量”是足以实现预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量将随例如以下因素而改变：药剂的性质、施用途径、待接受治疗剂的动物的大小和种类，以及施用目的。技术人员可以根据本领域中确立的方法来凭借经验确定对于每个个体而言的有效量。
本发明的实施方案
现在将对本发明进行进一步描述。在下述段落中，将对本发明的不同方面进行更详细的限定。除非清楚地指出情况相反，否则如此限定的各方面可以与任何其它方面相组合。特别地，指明优选或有利的任何特征可以与指明优选或有利的任何其它特征相组合。
在第一方面，本发明提供了表达系统，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸编码至少一种诱导T细胞应答的蛋白质、肽或其变体，所述第二多核苷酸编码至少一种诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质。本发明提供的优点之一是：如果同时施用诱导T细胞应答的蛋白质，则可以加强B细胞对诱导抗原性B细胞应答之蛋白质、肽或其变体的应答。
在本发明的上下文中，术语“表达系统”优选地指除所述第一多核苷酸和第二多核苷酸以外的一条或更多条核苷酸序列，其包含指导转录和翻译由所述第一多核苷酸和第二多核苷酸或任意其它多核苷酸编码的蛋白质的元件，其可包含在下文列举的优选实施方案中。这样的元件包括启动子元件和增强子元件，用以在无细胞系统或基于细胞的系统(优选基于细胞的系统)中指导mRNA转录。在另一实施方案中，其中所述多核苷酸提供为可进行翻译的RNA，可预见该表达系统包含翻译和/或稳定编码T细胞和B细胞诱导蛋白之RNA所必需的那些元件，例如，多聚A尾、IRES、帽结构等。
根据第一方面的一个优选实施方案，所述第一多核苷酸编码在宿主中诱导T细胞介导之免疫系统反应(即，免疫应答)的蛋白质。T细胞应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。如果蛋白质的肽在细胞中加工并且通过MHC I或MHC II途径呈递到T细胞的细胞表面上，则诱导了针对该蛋白质的T细胞应答。因此，在本发明的上下文中，优选地，使用这些蛋白质或其部分诱导T细胞应答，所述T细胞应答通常不暴露于例如不易接近B细胞的病毒之非结构蛋白或内在蛋白或者结构蛋白或内在蛋白的部分。
所述第二多核苷酸编码诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质、肽或其变体。B细胞应答是基于B淋巴细胞活化的免疫应答，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与该免疫应答的B细胞包括但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。因此，在本发明的上下文中，优选地，使用这些暴露于病毒外侧上的病原性(例如病毒的)蛋白质或其部分诱导B细胞应答(例如，病原体(病毒)外侧上的可接近B细胞的结构蛋白或者结构蛋白的至少那些部分)。
在本发明第一方面的一些实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸包含在不同载体上或者在同一载体上。因此，第一多核苷酸可包含在一个载体上，第二多核苷酸可包含在第二载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸可包含在同一载体上。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸包含在同一载体上。特别优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸与第二多核苷酸相连接使它们表达为多蛋白。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸形成开放读码框。
优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸表达为人工多蛋白。在本发明的上下文中，术语“人工多蛋白”指非天然的多蛋白，例如通过使用重组DNA技术产生的那些。因此，在该人工多蛋白中编码的蛋白质、肽或其变体优选地来自其基因组不编码包含由本发明的第一多核苷酸和第二多核苷酸(以及任选地，第三多核苷酸)编码的蛋白质、肽或变体的多蛋白的病原体。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸来自不编码多蛋白的病毒或者编码各多核苷酸具有不同次序和/或序列的多蛋白的病毒。更优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸来自选自以下的病毒：DNA病毒、负义单链(ssRNA(-))RNA病毒或双义RNA病毒。更优选地，所述病毒选自负义单链(ssRNA(-))RNA病毒。更优选地，所述病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。
在第一方面的一些优选实施方案中，诱导T细胞应答的蛋白质是病毒的非结构蛋白和/或内在蛋白，和/或诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质是病原体(优选病毒)的结构蛋白和/或表面蛋白，其中所述病毒优选地选自：DNA病毒、负链RNA病毒或双义RNA病毒。更优选地，所述病毒选自负义单链(ssRNA(-))RNA病毒。更优选地，所述病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。
优选地，结构(表面)蛋白和/或非结构(内在)蛋白的氨基酸序列包含一种或更多种不同病毒分离株的连续区段或共有序列。
在本发明的上下文中，优选地，术语“区段”指蛋白质或多蛋白的一部分。特别优选地，这样的区段独立于该蛋白质或多蛋白的其余部分而折叠和/或起作用，所述“区段”例如但不限于结构域、表位或其片段。应理解，在本发明的上下文中，蛋白质变体与其亲本多肽相比的不同之处在于氨基酸序列的变化，例如氨基酸互换、插入、缺失、N-末端截短或C-末端截短或者这些变化的任意组合，这些变化可在一个或若干个位点处发生，从而变体与其亲本多肽表现出至少80％的序列同一性。
在一些优选实施方案中，结构蛋白、肽或其变体是暴露于天然病原体(例如病毒)表面上的蛋白质或肽。优选地，结构蛋白和/或表面蛋白引发T细胞非依赖性免疫应答，例如但不限于抗体介导的免疫应答或补体系统的激活。在一个特别优选的实施方案中，结构蛋白和/或表面蛋白诱导抗体介导的免疫应答。这样的抗体介导之免疫应答基于B细胞的活化，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与该免疫应答的B细胞包括但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。
根据第一方面的一个优选实施方案，第二多核苷酸编码诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质或其变体。B细胞应答是基于B淋巴细胞活化的免疫应答，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与该免疫应答的B细胞包括但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。因此，在本发明的上下文中，优选地，使用这些暴露于病毒外侧上的蛋白质或其部分(例如，病毒外侧上易接近B细胞的结构蛋白和/或表面蛋白或者结构蛋白和/或表面蛋白的至少那些部分)诱导B细胞应答。抗病原性B细胞应答是针对病原体的B细胞应答，其灭活、消除、阻断和/或中和各病原体以使得由该病原体引起的疾病不发作和/或症状得到缓解。在本发明的一些优选实施方案中，抗病原性B细胞应答是通过这样的抗体实现的，所述抗体与病原性生物体的表面结合并且利用其Fc区吸引补体级联的第一组分以及启动“经典”补体系统的活化。这导致通过两种机制消除病原体。首先，抗体与补体分子的结合标示出病原体，用以在称为“调理作用”的过程中被吞噬细胞摄入。其次，一些补体系统组分形成膜攻击复合物以辅助抗体直接破坏病原体。作为替代地，抗病原性B细胞应答通过抗体与病原体结构蛋白结合从而阻断与细胞受体附着来实现。这样，抗体可中和感染。作为另一替代方案，抗病原性B细胞应答通过抗体结合病原体表面蛋白、融合肽(其对于病原体进入宿主细胞而言是必要的)的特定区域来实现。抗体结合致使蛋白质固定于预融合状态并阻断感染。本领域技术人员可通过使用本领域中公知的测试和/或测定来确定蛋白质或变体诱导抗病原性B细胞应答的能力。
在另一优选实施方案中，暴露于天然病毒表面上的蛋白质的膜附着结构域或其变体在功能上缺失，因此，要么在结构上缺失要么存在结构但不能实现其生物学功能。在一个特别优选的实施方案中，对应于膜附着结构域的氨基酸序列缺失。膜附着区的缺失用于确认诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质是由引入本发明表达系统的细胞所分泌的。
在又一优选实施方案中，诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质包含分泌信号，其将蛋白质靶向内质网(ER)。这样的分泌信号优选地在缺失膜附着结构域的情况下存在。本领域技术人员熟知多种这样的分泌信号，它们可以被用作异源分泌信号，例如，添加到诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质的N-末端。作为替代地或另外地，可以使用天然分泌信号，其例如存在于大多数结构和/或表面病毒蛋白质中。因此，如果天然地存在于各蛋白质中，则优选将分泌信号保持在经修饰的结构蛋白和/或表面蛋白中。
在第一方面的一些实施方案中，非结构蛋白是适于诱导T细胞介导之抗病原体(优选病毒)的免疫应答的保守性内在蛋白，所述免疫应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。因此，优选地，病原体(病毒)的诱导T细胞之蛋白质不包含分泌信号。
在本发明的上下文中，由第一多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的N-末端或C-末端。在一个优选实施方案中，由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的C-末端。
因此，本发明的一些实施方案具有式X-Y或Y-X，其中“X”代表诱导T细胞应答的蛋白质，“Y”代表诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质，“-”代表肽键。
在第一方面的一些优选实施方案中，编码切割位点的多核苷酸位于第一多核苷酸与第二多核苷酸之间。每种蛋白质可以与任何其它蛋白质组合以及任意两种蛋白质可以或者不可以通过切割位点相连或连接在本发明的范围内。
优选地，该切割位点是自切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列在不涉及任何其它分子进行这样切割的情况下被切割或者可以被切割，或者其中阻止了该序列第一位置处肽键的形成)或内肽酶切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列被内肽酶切割或者可以被内肽酶切割，所述内肽酶例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胶原酶、弗林蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内肽酶V8、组织蛋白酶)。更优选地，自切割位点是选自以下的2A切割位点：小核糖核酸病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫的病毒性2A肽或2A样肽，优选地，其中2A切割位点是口蹄疫病毒的2A肽。作为替代地或另外地，本发明的多蛋白可以被自我蛋白酶(即，在也包含蛋白酶的同一蛋白质分子中切割肽键的蛋白酶)切割。这样的自我蛋白酶的实例是黄病毒的NS2蛋白酶或双RNA病毒的VP4蛋白酶。
在本发明的上下文中，切割位点可位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的N-末端以及位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的C-末端。作为替代地，切割位点位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的C-末端以及位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的N-末端。
因此，本发明的一些实施方案具有式X-C-Y或Y-C-X，其中“X”代表诱导T细胞应答的蛋白质，“Y”代表诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质，“C”代表切割位点，“-”代表肽键。
在第一方面的一个优选实施方案中，该表达系统还包含编码病原体的蛋白质、肽或其变体的第三多核苷酸。
优选地，由第三多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体是诱导T细胞应答的蛋白质、肽或其变体，优选地，第三多核苷酸是作为诱导T细胞应答之非结构或内在蛋白质、肽或其变体的蛋白质、肽或其变体。
优选地，由第三多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体不同于由第一多核苷酸或第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体。优选地，由第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体彼此的不同之处在于它们包含不同蛋白质的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，编码接头的多核苷酸位于第二多核苷酸与第三多核苷酸之间。优选接头是柔性接头，优选地为包含根据SEQ ID NO：6(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly)的氨基酸序列的柔性接头。
在一些优选实施方案中，第三多核苷酸与第一多核苷酸和/或第二多核苷酸包含在不同载体或同一载体上。
因此，第一多核苷酸包含在一个载体上，第二多核苷酸包含在第二载体上，第三多核苷酸包含在第三载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸包含在同一载体上，第三多核苷酸包含在不同载体上，或者第一多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，第二多核苷酸包含在不同载体上，或者第二多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，第一多核苷酸包含在不同载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸包含在同一载体上。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸可以包含在同一载体上。特别优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸相连从而使它们表达为多蛋白。优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸形成开放读码框，并且优选地表达为多蛋白。
在该方面的一些优选实施方案中，由第二多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质来说的N-末端、或者由第二多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质来说的C-末端。
在该方面的一些更优选的实施方案中，第一多核苷酸位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质来说的N-末端，和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质来说的N-末端，或者位于由第二多核苷酸编码的蛋白质与由第一多核苷酸编码的蛋白质之间；或者由第一多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质来说的C-末端和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质来说的C-末端或者位于由第二多核苷酸编码的蛋白质与由第一多核苷酸编码的蛋白质之间。
本发明的一些优选实施方案具有式X-K-Y、Y-K-X、X-K-Y-Y、Y-Y-K-X、X-Y-K-Y、Y-K-Y-X、X-K-Y-K-Y、Y-K-Y-K-X、X-C-Y、Y-C-X、X-C-Y-Y、Y-Y-C-X、X-Y-C-Y、Y-C-Y-X、X-C-Y-C-Y、Y-C-Y-C-X、X-K-Y-C-Y、Y-C-Y-K-X、X-C-Y-K-Y或Y-K-Y-C-X，其中“X”代表编码至少一种诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质、肽或其变体的第二多核苷酸，“Y”代表编码至少一种诱导T细胞应答的蛋白质、肽或其变体的第一多核苷酸，“K”表示一个或更多个肽接头存在于该位置处，“C”表示一个或更多个切割位点存在于该位置处，“-”代表肽键。优选的排布是Y-K-Y-C-X或X-C-Y-K-Y。
更优选地，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白是适于诱导针对病毒的T细胞介导之免疫应答的保守性内在蛋白，所述免疫应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。
每种蛋白质可以与任何其它蛋白质组合以及任意两种蛋白质可以或不通过切割位点或接头肽连接或相连在本发明的范围内。
在一些优选实施方案中，包含第一多核苷酸和第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的载体选自：质粒、粘粒、噬菌体、病毒和人工染色体。更优选地，适于实施本发明的载体选自：质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(优选为λ噬菌体载体和丝状噬菌体载体)、病毒载体、腺病毒载体(例如，非复制性Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3载体或可进行复制的Ad4和Ad7载体)、腺相关病毒(AAV)载体(例如，5型AAV和2型AAV)、甲病毒载体(例如，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、辛德毕斯病毒(SIN)、森林脑炎病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合体)、疱疹病毒载体(例如，源自巨细胞病毒例如恒河猴巨细胞病毒(RhCMV)的载体)(14)、沙粒病毒(arena virus)载体(例如，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体(15))、麻疹病毒载体、痘病毒载体(例如，痘苗病毒，经修饰痘苗病毒安卡拉(MVA)、NYVAC(源自痘苗的哥本哈根毒株)；和禽痘载体：金丝雀痘(ALVAC)载体和鸡痘(FPV)载体)、水泡性口炎病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、病毒样颗粒和细菌孢子。在WO2005/071093中详细描述了载体ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82。在WO2010/086189中详细描述了载体PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147。特别优选地，所述载体选自MVA、ChAd63和PanAd3。
在一些优选实施方案中，所述表达系统用于药物中。在一些更优选的实施方案中，所述表达系统用于预防或治疗感染和/或制备用于预防或治疗感染的药物和/或用于预防或治疗感染的方法，其中所述感染优选为病毒感染，特别优选地用于预防或治疗病原体和/或制备用于预防或治疗病原体的药物和/或用于预防或治疗病原体的方法，其中所述病原体优选为病毒。优选地，所述表达系统用于预防或治疗由病毒引起的感染和/或制备用于预防或治疗病毒的药物和/或用于预防或治疗病毒的方法，其中所述病原体选自：DNA病毒、负义单链(ssRNA(-))RNA病毒或双义RNA病毒。更优选地，所述表达系统用于预防或治疗病毒和/或制备用于预防或治疗病毒的药物和/或用于预防或治疗由负义单链(ssRNA(-))RNA病毒引起的感染。更优选地，所述表达系统用于预防或治疗病毒和/或制备用于预防或治疗病毒的药物和/或用于预防或治疗由病毒引起的感染的方法，所述病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。
在一些优选实施方案中，所述表达系统用于增强免疫应答。在一些更优选的实施方案中，所述表达系统用于增强针对免疫原(优选病原体，更优选如上所述的病毒)的B细胞免疫应答。
根据第一方面的一个优选实施方案，第一多核苷酸编码诱导宿主中由T细胞介导之免疫系统反应(即免疫应答)的副粘病毒的病毒蛋白质或其变体，第二多核苷酸编码诱导针对副粘病毒之抗病原性B细胞应答的副粘病毒的病毒蛋白质或其变体。优选地，其病毒蛋白质由第一多核苷酸和第二多核苷酸编码的副粘病毒选自：肺病毒亚科、副粘病毒亚科、Fer-de-Lance-病毒、Nariva-病毒、Salem-病毒、Tupaia-副粘病毒、Beilong-病毒、J-病毒、Menangle-病毒、Mossmann-病毒和Murayama-病毒。在一些更优选的实施方案中，肺病毒亚科选自肺病毒，优选人呼吸道合胞病毒(RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV、火鸡鼻气管炎(rinotracheitis)病毒和偏肺病毒，优选人偏肺病毒(hMPV)和禽偏肺病毒。在一些更优选的实施方案中，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒(优选人副流感病毒1和3)和腮腺炎病毒(Rubulavirus)，优选人副流感病毒2和4。
在本发明第一方面的一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸包含在不同载体上或在同一载体上。因此，第一多核苷酸可包含在一个载体上，第二多核苷酸可包含在第二载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸可包含在同一载体上。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸包含在同一载体上。特别优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸和第二多苷酸相连从而使它们表达为多蛋白。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸形成开放读码框。
根据第一方面的一些优选实施方案，第一多核苷酸编码诱导宿主中由T细胞介导之免疫系统反应(即，免疫应答)的副粘病毒的病毒蛋白质或其变体。T细胞应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。如果蛋白质的肽在细胞内加工并通过MHC I或MHC II途径呈递到T细胞的细胞表面上，则诱导针对蛋白质的T细胞应答。因此，在本发明的上下文中，优选使用这些通常不暴露于病毒外侧上的病毒蛋白质或其部分诱导T细胞应答，例如病毒外侧上不易接近B细胞的非结构蛋白或内在蛋白或者结构蛋白或表面蛋白的一部分。
第二多核苷酸编码诱导针对副粘病毒之抗病原性B细胞应答的副粘病毒的病毒蛋白质或其变体。B细胞应答是基于B淋巴细胞活化的免疫应答，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与这样免疫应答的B细胞包括但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。因此，在本发明的上下文中，优选地，使用这些暴露于病毒外侧上的病毒蛋白质或其部分诱导抗病原性B细胞应答，例如在病毒外侧上易接近B细胞的结构蛋白或结构蛋白的至少那些部分。
根据第一方面的一个优选实施方案，第二多核苷酸编码诱导抗病原性B细胞应答的副粘蛋白的病毒蛋白质或其变体。B细胞应答是基于B淋巴细胞活化的免疫应答，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与这样免疫应答的B细胞包括但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。因此，在本发明的上下文中，优选地，使用这些暴露于病毒外侧上的病毒蛋白质或其部分诱导抗病原性B细胞应答，例如在病毒外侧上易接近B细胞的结构蛋白和/或表面蛋白或者结构蛋白和/或表面蛋白的至少那些部分。
在第一方面的一些优选实施方案中，诱导T细胞应答的副粘病毒之病毒蛋白质是副粘病毒的非结构蛋白和/或内在蛋白，和/或诱导抗病原性B细胞应答的副粘病毒之病毒蛋白质是副粘病毒的结构蛋白和/或表面蛋白。
优选地，结构(表面)蛋白和/或非结构(内在)蛋白的氨基酸序列包含一种或更多种不同副粘病毒分离株的保守区段或共有序列。
在一些优选的实施方案中，结构蛋白是暴露于天然副粘病毒表面的蛋白质或其变体。优选地，结构蛋白引发T细胞非依赖性免疫应答，例如但不限于抗体介导的免疫应答或补体系统的活化。在一个特别优选的实施方案中，结构蛋白和/或表面蛋白诱导抗体介导的免疫应答。这样的抗体介导之免疫应答基于B细胞的活化，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与这样免疫应答的B细胞包括但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。
在另一优选的实施方案中，暴露于天然副粘病毒表面上的蛋白质的膜附着结构域或其变体是功能缺失的，因此，要么在结构上缺失要么存在结构但不能实现其生物学功能。在一个特别优选的实施方案中，对应于膜附着结构域的氨基酸序列缺失。膜附着区的缺失用于确认诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质是由已引入本发明表达系统的细胞分泌的。
在又一优选的实施方案中，诱导抗病原性B细胞应答的副粘病毒蛋白质包含分泌信号，其将蛋白质靶向内质网(ER)。因此，如果天然地存在于各结构蛋白或表面蛋白中，则优选将分泌信号保持在经修饰的结构蛋白或表面蛋白中。
进一步优选地，天然副粘病毒的结构蛋白和/或表面蛋白选自融合蛋白(F)和任意附着糖蛋白G、H和NH。
附着糖蛋白见于所有包膜病毒中并且通过其与宿主细胞质膜上的蛋白质或其它分子的碳水化合物部分或细胞粘附结构域结合来介导病毒包膜与宿主细胞质膜之间的初始相互作用。因此，附着糖蛋白弥合了病毒和宿主细胞膜之间的间隙。命名为“H”的附着糖蛋白具有血凝素活性并且见于麻疹病毒和亨德拉尼帕病毒(henipavirus)中。命名为“NH”的糖蛋白具有血凝素活性和神经氨酸酶活性并且见于呼吸道病毒、rubulavirus和avulavirus中。当附着糖蛋白既没有血凝素活性也没有神经氨酸酶活性时，将其命名为“G”。G附着糖蛋白可见于所有肺病毒亚科的成员中。
融合蛋白“F”见于所有包膜病毒中，并且介导病毒包膜与宿主细胞质膜的融合。F是I型糖蛋白，其识别存在于其所结合的宿主细胞的细胞表面上的受体。F由以下组成：融合肽、邻近融合肽的跨膜结构域、接着两个七肽重复(HR)区(分别为HR1和HR2)。基于融合肽插入宿主细胞的质膜中，HR1区形成三聚卷曲螺旋结构，HR2区折叠回到其疏水凹槽中。这样，形成了拉着病毒脂质双层的发夹结构，细胞质膜更为靠近，并允许形成融合孔并且两个脂质双层的连续完全融合使得病毒衣壳进入宿主细胞的细胞质中。对于包膜病毒的介导融合之蛋白质而言，所有这些特征都是共同的。
在第一方面的一个优选实施方案中，F包含一种RSV分离株的F的氨基酸序列或者两种或更多种不同RSV分离株的共有氨基酸序列，或者基本由其组成或由其组成，所述氨基酸序列优选地根据SEQ ID NO：1，更优选地根据SEQ ID NO：2或其变体。
在第一方面的一些优选实施方案中，非结构蛋白是副粘病毒的保守性内在蛋白，其适于诱导针对副粘病毒的T细胞介导之免疫应答，所述免疫应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。因此，优选地，诱导T细胞的副粘病毒之蛋白质不包含分泌信号。
优选地，非结构蛋白和/或内在蛋白选自：核蛋白N、基质蛋白M和M2、磷蛋白P、非结构蛋白NS1和NS2，以及聚合酶的催化亚基(L)。
核蛋白N用于若干种功能，包括将RNA基因组包封进入核糖核酸酶抗性核衣壳。在病毒装配过程中，N还与M蛋白相互作用，并且在基因组的转录和复制过程中与P-L聚合酶相互作用。
基质蛋白M是副粘病毒中含量最高的蛋白质，并且被认为通过与整合膜蛋白的胞质尾以及核衣壳相互作用作为病毒形态的重要组织者。M2是第二膜相关蛋白，其未被糖基化并且主要见于肺病毒中。
在所有副粘病毒中，磷蛋白P与N蛋白和L蛋白结合并形成RNA聚合酶复合物的一部分。大蛋白质L是RNA依赖性RNA聚合酶的催化亚基。
尚未鉴定非结构蛋白NS1和NS2的功能。但是，已表明它们参与病毒性复制循环。
在一些优选的实施方案中，N包含一种RSV分离株的N的氨基酸序列或者两种或更多种不同RSV分离株的共有氨基酸序列，优选地根据SEQ ID NO：3，并且其中M2包含一种RSV分离株的M2的氨基酸序列或者两种或更多种不同RSV分离株的共有氨基酸序列，优选地根据SEQ ID NO：5。还优选地，N包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列，M2包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
在本发明的上下文中，由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白位于相对于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白来说的N-末端或C-末端。在一个优选的实施方案中，由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白位于相对于由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白来说的C-末端。
更特别地，N、M、M2、P、NS1、NS2或L可位于F、G、H或HN的N-末端或C-末端。优选地，N、M、M2、P、NS1、NS2或L位于F、G、H或HN的C-末端。在一个更优选的实施方案中，N或M2位于F的C-末端。在一个特别优选的实施方案中，N位于F的C-末端。
因此，本发明的一些实施方案具有式X-Y或Y-X，其中“X”代表F、G、H或HN，“Y”代表N、M、M2、P、NS1、NS2或L，“-”代表肽键。优选下述排布：
F-N、G-N、H-N、HN-N、F-M、G-M、H-M、HN-M、F-M2、G-M2、H-M2、HN-M2、F-P、G-P、H-P、HN-P、F-NS1、G-NS1、H-NS1、HN-NS1、F-NS2、G-NS2、H-NS2、HN-NS2、F-L、G-L、H-L、HN-L、N-F、N-G、N-H、N-HN、M-F、M-G、M-H、M-HN、M2-F、M2-G、M2-H、M2-HN、P-F、P-G、P-H、P-HN、NS1-FF、NS1-G、NS1-H、NS1-HN、NS2-F、NS2-G、NS2-H、NS2-HN、L-F、L-G、L-H或L-HN。
每种蛋白质可以与任何其它蛋白质相组合在本发明的范围内。
在第一方面的一些优选实施方案中，编码切割位点的多核苷酸位于第一多核苷酸与第二多核苷酸之间。
优选地，该切割位点为自切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列在不涉及任何其它分子进行这样切割的情况下被切割或者可以被切割，或者其中阻止了该序列第一位置处肽键的形成)或内肽酶切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列被内肽酶切割或者可以被内肽酶切割，所述内肽酶例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胶原酶、弗林蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内肽酶V8、组织蛋白酶)。更优选地，自切割位点是选自以下的2A切割位点：小核糖核酸病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫的病毒性2A肽或2A样肽，优选地，其中2A切割位点是口蹄疫病毒的2A肽。
在本发明的上下文中，切割位点可位于相对于由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白来说的N-末端，以及位于相对于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白来说的C-末端。作为替代地，切割位点可位于相对于由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白来说的C-末端，以及位于相对于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白来说的N-末端。更特别地，切割位点可位于相对于F、G、H或HN来说的C-末端或N-末端，以及相对于N、M、M2、P、NS1、NS2或L来说的C-末端或N-末端。在一个优选的实施方案中，切割位点位于相对于N、M、M2、P、NS1、NS2或L来说的N-末端，以及相对于F、G、H或HN来说的C-末端。特别优选地，切割位点位于相对于N来说的N-末端，以及相对于F来说的C-末端。
因此，本发明的一些实施方案具有式X-C-Y或Y-C-X，其中“X”代表F、G、H或HN，“Y”代表N、M、M2、P、NS1、NS2或L，“C”代表切割位点，以及“-”代表肽键。优选如下排布：
F-C-N、G-C-N、H-C-N、HN-C-N、F-C-M、G-C-M、H-C-M、HN-C-M、F-C-M2、G-C-M2、H-C-M2、HN-C-M2、F-C-P、G-C-P、H-C-P、HN-C-P、F-C-NS1、G-C-NS1、H-C-NS1、HN-C-NS1、F-C-NS2、G-C-NS2、H-C-NS2、HN-C-NS2、F-C-L、G-C-L、H-C-L、HN-C-L、N-C-F、N-C-G、N-C-H、N-C-HN、M-C-F、M-C-G、M-C-H、M-C-HN、M2-C-F、M2-C-G、M2-C-H、M2-C-HN、P-C-F、P-C-G、P-C-H、P-C-HN、NS1-C-FF、NS1-C-G、NS1-C-H、NS1-C-HN、NS2-C-F、NS2-C-G、NS2-C-H、NS2-C-HN、L-C-F、L-C-G、L-C-H或L-C-HN。特别地，优选F-C-N。
每种蛋白质可以与任何其它蛋白质组合并且任意两种蛋白质可以或不通过切割位点连接或相连在本发明的范围内。
在第一方面的优选实施方案中，所述表达系统还包含编码副粘病毒的非结构蛋白和/或内在蛋白或其变体的第三多核苷酸。优选地，非结构蛋白和/或内在蛋白来自选自以下的副粘病毒：肺病毒亚科、副粘病毒亚科、Fer-de-Lance-病毒、NariVa-病毒、Salem-病毒、Tupaia-副粘病毒、Beilong-病毒、J-病毒、Menangle-病毒、Mossmann-病毒和Murayama-病毒，更优选地，肺病毒亚科选自肺病毒，优选人呼吸道合胞病毒(RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV、火鸡鼻气管炎病毒，和偏肺病毒，优选人偏肺病毒和禽偏肺病毒。更优选地，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒(优选人副流感病毒1和3)和腮腺炎病毒(优选人副流感病毒2和4)。
在一些优选的实施方案中，第三多核苷酸与第一多核苷酸和/或第二多核苷酸包含在不同载体上或同一载体上。
因此，第一多核苷酸包含在一个载体上，第二多核苷酸包含在第二载体上，第三多核苷酸包含在第三载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸包含在同一载体上，第三多核苷酸包含在不同载体上，或者第一多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，第二多核苷酸包含在不同载体上，或者第二多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，第一多核苷酸包含在不同载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸包含在同一载体上。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸可包含在同一载体上。特别优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸相连从而使它们表达为病毒多蛋白。优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸形成开放读码框。
还优选地，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白是适于诱导针对病毒的T细胞介导之免疫应答的保守性内在蛋白，所述免疫应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。
优选地，非结构蛋白和/或内在蛋白选自核蛋白N、基质蛋白M和M2、磷蛋白P、非结构蛋白NS1和NS2以及聚合酶的催化亚基(L)。
在一些优选的实施方案中，N包含一种RSV分离株的N的氨基酸序列或者两种或更多种不同RSV分离株的共有氨基酸序列，优选地根据SEQ ID No：3，并且其中M2包含一种RSV分离株的M2的氨基酸序列或者两种或更多种不同RSV分离株的共有氨基酸序列，优选地根据SEQ ID NO：5。还优选地，其中N包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列，M2包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
优选地，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白不同于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白。
由第二多核苷酸和第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白彼此的区别在于它们包含不同病毒蛋白质的氨基酸序列。例如，这意味着由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白包含N蛋白质的氨基酸序列，而由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白包含M2蛋白质的氨基酸序列，或者反之亦然。
由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白可位于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白来说的N-末端或C-末端。在第一方面的一个优选实施方案中，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白位于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白来说的C-末端。更特别地，N或M2可位于N或M2的N-末端或C-末端，优选地，N位于M2的C-末端。
在一些优选的实施方案中，编码接头的多核苷酸位于第二多核苷酸与第三多核苷酸之间。优选接头是柔性接头，优选为包含根据SEQ ID NO：6之氨基酸序列的柔性接头。
在第一方面的一些实施方案中，由第二多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质来说的N-末端，或者由第二多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质来说的C-末端。
在该方面的一些更优选的实施方案中，第一多核苷酸位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质来说的N-末端，和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质来说的N-末端或者位于由第二多核苷酸编码的蛋白质与由第一多核苷酸编码的蛋白质之间；或者由第一多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质来说的C-末端，和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质来说的C-末端，或者位于由第二多核苷酸编码的蛋白质与由第一多核苷酸编码的蛋白质之间。更特别地，F、G、H或HN位于相对于N、M、M2、P、NS1、NS2或L来说的C-末端或N-末端，并且N、M、M2、P、NS1、NS2或L位于相对于N或M2来说的C-末端或N-末端。在一个优选的实施方案中，F位于相对于N来说的N-末端，M2位于相对于N来说的C-末端。
因此，本发明的一些优选实施方案具有式X-K-Y、Y-K-X、X-K-Y-Y、Y-Y-K-X、X-Y-K-Y、Y-K-Y-X、X-K-Y-K-Y、Y-K-Y-K-X、X-C-Y、Y-C-X、X-C-Y-Y、Y-Y-C-X、X-Y-C-Y、Y-C-Y-X、X-C-Y-C-Y、Y-C-Y-C-X、X-K-Y-C-Y、Y-C-Y-K-X、X-C-Y-K-Y或Y-K-Y-C-X，其中“X”代表F、G、H或HN，“Y”代表N、M、M2、P、NS1、NS2或L，“K”表示一个或更多个肽接头存在于该位置处，“C”表示一个或更多个切割位点存在于该位置处，“-”代表肽键。优选的排布是X-C-Y-K-Y。更优选的排布如下：
F-K-N，G-K-N，H-K-N，HN-K-N，F-K-M，G-K-M，H-K-M，HN-K-M，F-K-M2，G-K-M2，H-K-M2，HN-K-M2，F-K-P，G-K-P，H-K-P，HN-K-P，F-K-NS1，G-K-NS1，H-K-NS1，HN-K-NS1，F-K-NS2，G-K-NS2，H-K-NS2，HN-K-NS2，F-K-L，G-K-L，H-K-L，HN-K-L，N-K-F，N-K-G，N-K-H，N-K-HN，M-K-F，M-K-G，M-K-H，M-K-HN，M2-K-F，M2-K-G，M2-K-H，M2-K-HN，P-K-F，P-K-G，P-K-H，P-K-HN，NS1-K-FF，NS1-K-G，NS1-K-H，NS1-K-HN，NS2-K-F，NS2-K-G，NS2-K-H，NS2-K-HN，L-K-F，L-K-G，L-K-H，L-K-HN，F-C-N，G-C-N，H-C-N，HN-C-N，F-C-M，G-C-M，H-C-M，HN-C-M，F-C-M2，G-C-M2，H-C-M2，HN-C-M2，F-C-P，G-C-P，H-C-P，HN-C-P，F-C-NS1，G-C-NS1，H-C-NS1，HN-C-NS1，F-C-NS2，G-C-NS2，H-C-NS2，HN-C-NS2，F-C-L，G-C-L，H-C-L，HN-C-L，N-C-F，N-C-G，N-C-H，N-C-HN，M-C-F，M-C-G，M-C-H，M-C-HN，M2-C-F，M2-C-G，M2-C-H，M2-C-HN，P-C-F，P-C-G，P-C-H，P-C-HN，NS1-C-FF，NS1-C-G，NS1-C-H，NS1-C-HN，NS2-C-F，NS2-C-G，NS2-C-H，NS2-C-HN，L-C-F，L-C-G，L-C-H，or 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最优选的排布是F-C-N-K-M2。
在一些优选的实施方案中，所述表达系统用于预防或治疗病毒感染，特别优选地用于预防或治疗副粘病毒感染(优选RSV感染)和/或制备用于预防或治疗副粘病毒感染(优选RSV感染)的药物，和/或用于预防或治疗副粘病毒感染(优选RSV感染)的方法。
在一些优选实施方案中，所述表达系统用于增强免疫应答，优选针对副粘病毒感染(优选RSV感染)的B细胞免疫应答。
根据第一方面的一个优选实施方案，第一多核苷酸编码诱导宿主细胞中由T细胞介导之免疫系统反应(即，免疫应答)的正粘病毒的病毒蛋白质或其变体，第二多核苷酸编码诱导针对正粘病毒的抗病原性B细胞应答的正粘病毒的病毒蛋白质或其变体。优选地，其病毒蛋白质由第一多核苷酸和第二多核苷酸编码的正粘病毒选自：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、索戈托病毒属和传染性鲑鱼贫血症病毒属。在一些更优选的实施方案中，正粘病毒是A型流感病毒，优选地选自以下亚型：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7。根据第一方面的一个优选实施方案，第二多核苷酸编码诱导针对正粘病毒的抗病原性B细胞应答的正粘病毒的病毒蛋白质或其变体。
根据第一方面的一些优选实施方案，第一多核苷酸编码诱导宿主中由T细胞介导之免疫系统反应(即，免疫应答)的正粘病毒的病毒蛋白质或其变体。T细胞应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。如果蛋白质的肽在细胞内加工并通过MHC I或MHC II途径呈递到T细胞的细胞表面上，则诱导针对蛋白质的T细胞应答。因此，在本发明的上下文中，优选地使用这些通常不暴露于病毒外侧上的病毒蛋白质或其部分来诱导T细胞应答，例如，在病毒外侧上不易接近B细胞的非结构蛋白或内在蛋白或者结构蛋白或表面蛋白的一部分。
根据第一方面的一个优选实施方案，第二多核苷酸编码诱导抗病原性B细胞应答的正粘病毒的病毒蛋白质或其变体。B细胞应答是基于B淋巴细胞活化的免疫应答，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与这样免疫应答的B细胞包括但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。因此，在本发明的上下文中，优选地，使用那些暴露于病毒外侧上的病毒蛋白质或其部分来诱导B细胞应答，例如在病毒外侧上易接近B细胞的结构蛋白和/或表面蛋白或者结构蛋白和/或表面蛋白的至少那些部分。
在第一方面的一个优选实施方案中，诱导T细胞应答的正粘病毒之病毒蛋白质是正粘病毒的非结构蛋白和/或内在蛋白，和/或诱导抗病原性B细胞应答的正粘病毒之病毒蛋白质是正粘病毒的结构蛋白和/或表面蛋白。
优选地，结构(表面)蛋白和/或非结构蛋白和/或内在蛋白的氨基酸序列包含一种或更多种不同正粘病毒分离株的保守性区段或共有序列。
在一些优选实施方案中，结构蛋白是暴露于天然正粘病毒表面上的蛋白质或其变体。优选地，结构蛋白和/或表面蛋白引发T细胞非依赖性免疫应答，例如但不限于抗体介导的免疫应答或补体系统的活化。在一个特别优选的实施方案中，结构蛋白和/或表面蛋白诱导抗体介导的免疫应答。这样的抗体介导之免疫应答基于B细胞的活化，其产生和分泌抗原特异性抗体。参与这样免疫应答的B细胞例如但不限于浆B细胞、记忆B细胞和B-1细胞。
在另一优选实施方案中，暴露于天然正粘病毒表面上的蛋白质的膜附着结构域或其变体在功能上缺失，因此，要么在结构上缺失要么存在结构但不能实现其生物学功能。在一个特别优选的实施方案中，对应于膜附着结构域的氨基酸序列缺失。膜附着区的缺失用于确认诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质是由引入本发明表达系统的细胞分泌的。
还优选地，天然正粘病毒的病毒性表面蛋白质选自血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。更优选地，天然正粘病毒的病毒性表面蛋白质是血凝素(HA)。
在第一方面的一个优选实施方案中，HA包含一种A型流感病毒分离株之HA的氨基酸序列或者两种或更多种不同A型流感病毒分离株的共有氨基酸序列，或者基本由其组成或者由其组成，所述氨基酸序列优选地根据SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：20，更优选地根据SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21或这些序列之一的变体。
在第一方面的一些优选实施方案中，非结构蛋白是正粘病毒的保守性内在蛋白，其适于诱导针对副粘病毒的T细胞介导之免疫应答，所述免疫应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。因此，优选地，正粘病毒的诱导T细胞之蛋白质不包含分泌信号。
优选地，非结构蛋白和/或内在蛋白选自：核蛋白NP、基质蛋白M1和M2、非结构蛋白NS1和NS2/NEP以及RNA聚合酶PA、PB1、PB2和蛋白质PB1-F2(PB1F2)。
核蛋白NP是包封负链病毒RNA的结构蛋白。NP是物种特异性的主要抗原决定簇之一。
蛋白质M1是流感病毒的基质蛋白。其在病毒包膜内侧形成包衣(coat)。M1蛋白与病毒RNA结合。其还具有多重调节功能，通过与宿主细胞组分相互作用来实现。调节机制包括从宿主细胞核输出病毒核糖核蛋白、抑制病毒转录中起作用，以及在病毒装配和出芽中起作用。M1蛋白在富含病毒血凝素、神经氨酸酶和M2跨膜蛋白的宿主细胞膜的膜片(patch)下形成层，并促进成熟病毒的出芽。
非结构NS1蛋白是由编码线性负义单链RNA NS基因区段的内在蛋白产生的，所述NS基因区段还编码介导vRNP输出的核输出蛋白或NEP(之前称为NS2蛋白)。由于其与dsRNA结合，NS1蛋白在体外阻断dsRNA活化之蛋白质激酶(PKR)的活化。该激酶磷酸化真核翻译起始因子2的α亚基(elF-2α)，导致翻译起始率下降。在不存在NS1时，在抗病毒应答过程中，该通路受到抑制从而中止所有蛋白质翻译，因而终止了病毒蛋白质的合成；但是，流感病毒NS1蛋白是规避宿主防御从而使病毒基因翻译发生的媒介。
在一些优选实施方案中，HA包含一种A型流感病毒分离株的HA的氨基酸序列或者两种或更多种不同A型流感病毒分离株的共有氨基酸序列，所述氨基酸序列优选地根据SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：21，NP包含一种A型流感病毒分离株的NP的氨基酸序列或者两种或更多种不同A型流感病毒分离株的共有氨基酸序列，所述氨基酸序列优选地根据SEQ ID NO：11，和/或M1包含一种A型流感病毒分离株的M1的氨基酸序列或者两种或更多种不同A型流感病毒分离株的共有氨基酸序列，所述氨基酸序列优选地根据SEQ ID NO：12。还优选地，NP包含根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列，并且M1包含根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在本发明的上下文中，由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白位于相对于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白来说的N-末端或C-末端。在一个优选实施方案中，由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白位于相对于由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白来数的C-末端。
更特别地，HA或NA可位于NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)的N-末端或C-末端。在一个优选实施方案中，M1位于HA的N-末端。
因此，本发明的实施方案具有式X-Y或Y-X，其中“X”代表HA或NA，优选HA，“Y”代表NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)，优选NP或M1，以及“-”代表肽键。优选的排布如下：
HA-NP、HA-M1、HA-M2、HA-NS1、HA-NS2/NEP、HA-PA、HA-PB1、HA-PB2、HA-PB1F2、NP-HA、M1-HA、M2-HA、NS1-HA、NS2/NEP-HA、PA-HA、PB1-HA、PB2-HA、PB1F2-HA、NA-NP、NA-M1、NA-M2、NA-NS1、NA-NS2/NEP、NA-PA、NA-PB1、NA-PB2、NA-PB1F2、NP-NA、M1-NA、M2-NA、NS1-NA、NS2/NEP-NA、PA-NA、PB1-NA、PB2-NA或PB1F2-NA。特别优选的排布是M1-HA。
每种蛋白质可以与任何其它蛋白质相组合在本发明的范围内。
在第一方面的一些优选实施方案中，编码切割位点的多核苷酸位于第一多核苷酸与第二多核苷酸之间。
优选地，该切割位点是自切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列在不涉及任何其它分子进行这样切割的情况下被切割或者可以被切割，或者其中阻止了该序列第一位置处肽键的形成)或内肽酶切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列被内肽酶切割或者可以被内肽酶切割，所述内肽酶例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胶原酶、弗林蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内肽酶V8、组织蛋白酶)。更优选地，自切割位点是选自以下的2A切割位点：小核糖核酸病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫的病毒性2A肽或2A样肽，优选地，其中2A切割位点是口蹄疫病毒的2A肽。作为替代地或另外地，本发明的多蛋白可以被自我蛋白酶(即，在也包含蛋白酶的同一蛋白质分子中切割肽键的蛋白酶)切割。这样的自我蛋白酶的实例是黄病毒的NS2蛋白酶或双RNA病毒的VP4蛋白酶。
在本发明的上下文中，切割位点可位于相对于由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白来说的N-末端和相对于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或表面蛋白来说的C-末端。作为替代地，切割位点可位于相对于由第一多核苷酸编码的结构蛋白和/或表面蛋白来说的C-末端和相对于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白来说的N-末端。更特别地，切割位点可位于相对于HA或NA来说的C-末端或N-末端以及相对于NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)来说的C末端或N末端。在一个优选实施方案中，切割位点位于相对于NP、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)来说的C-末端，以及相对于HA或NA来说的N-末端。特别优选地，切割位点位于相对于HA来说的N-末端以及相对于M1来说的C-末端。
因此，本发明的一些实施方案具有式X-C-Y或Y-C-X，其中“X”代表HA或NA(优选“HA”)，“Y”代表NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)(优选NP或M1)。“C”代表切割位点，“-”代表肽键。
优选的排布如下：
HA-C-NP、HA-C-M1、HA-C-M2、HA-C-NS1、HA-C-NS2/NEP、HA-C-PA、HA-C-PB1、HA-C-PB2、HA-C-PB1F2、NP-C-HA、M1-C-HA、M2-C-HA、NS1-C-HA、NS2/NEP-C-HA、PA-C-HA、PB1-C-HA、PR2-C-HA、PR1F2-C-HA、NA-C-NP、NA-C-M1、NA-C-M2、NA-C-NS1、NA-C-NS2/NEP、NA-C-PA、NA-C-PB1、NA-C-PB2、NA-C-PB1F2、NP-C-NA、M1-C-NA、M2-C-NA、NS1-C-NA、NS2/NEP-C-NA、PA-C-NA、PB1-C-NA、PB2-C-NA或PB1F2-C-NA。特别优选的排布是M1-C-HA。
每种蛋白质可以与任何其它蛋白质组合以及两种蛋白质可以或不通过切割位点连接或相连在本发明的范围内。
在第一方面的优选实施方案中，表达系统还包含编码正粘病毒的非结构蛋白和/或内在蛋白或其变体的第三多核苷酸。优选地，所述非结构蛋白和/或内在蛋白来自选自以下属的正粘病毒：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、索戈托病毒属和传染性鲑鱼贫血症病毒属。在一些更优选的实施方案中，正粘病毒是A型流感病毒，优选地选自A型流感病毒亚型：H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选A型流感病毒亚型H1N1。
在一些优选实施方案中，第三多核苷酸与第一多核苷酸和/或第二多核苷酸包含在不同载体上或同一载体上。
因此，第一多核苷酸包含在一个载体上，第二多核苷酸包含在第二载体上，第三多核苷酸包含在第三载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸包含在同一载体上，第三多核苷酸包含在不同载体上，或者第一多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，第二多核苷酸包含在不同载体上，或者第二多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，第一多核苷酸包含在不同载体上。作为替代地或另外地，第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸包含在同一载体上。优选地，第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸可以包含在同一载体上。特别优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸相连从而使它们表达为病毒多蛋白。优选地，包含在同一载体上的第一多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸形成开放读码框。
还优选地，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白是适于诱导针对病毒的T细胞介导之免疫应答的保守性内在蛋白，所述免疫应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM)细胞、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。
优选地，非结构蛋白和/或内在蛋白选自NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)，更优选NP或M1。
优选地，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白不同于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白。
由第二多核苷酸和第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白彼此的不同之处在于它们包含不同病毒蛋白质的氨基酸序列。例如，这意味着由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白包含M1蛋白的氨基酸序列，而由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白包含NP蛋白的氨基酸序列，或者反之亦然。
由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白可位于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白的N-末端或C-末端。在第一方面的一个优选实施方案中，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白位于由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白的C-末端。
在一些优选实施方案中，编码接头的多核苷酸位于第二多核苷酸与第三多核苷酸之间。优选地，接头是柔性接头，优选包含根据SEQ ID NO：6之氨基酸序列的柔性接头。
在第一方面的一些实施方案中，由第二多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质来说的N-末端，或者由第二多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质来说的C-末端。
在该方面的一些更优选的实施方案中，第一多核苷酸位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质来说的N-末端，和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质来说的N-末端或者位于由第二多核苷酸编码的蛋白质与第一多核苷酸编码的蛋白质之间；或者，由第一多核苷酸编码的蛋白质位于相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质来说的C-末端和/或任选的第三多核苷酸的蛋白质位于相对于由第一多核苷酸编码的蛋白质来说的C-末端或者位于由第二多核苷酸编码的蛋白质与由第一多核苷酸编码的蛋白质之间。更特别地，HA或NA位于相对于NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)来说的C-末端或N-末端。
在一个优选实施方案中，HA位于相对于M1来说的C-末端，NP位于相对于M1来说的N-末端。
因此，本发明的一些优选实施方案具有式X-K-Y、Y-K-X、X-K-Y-Y、Y-Y-K-X、X-Y-K-Y、Y-K-Y-X、X-K-Y-K-Y、Y-K-Y-K-X、X-C-Y、Y-C-X、X-C-Y-Y、Y-Y-C-X、X-Y-C-Y、Y-C-Y-X、X-C-Y-C-Y、Y-C-Y-C-X、X-K-Y-C-Y、Y-C-Y-K-X、X-C-Y-K-Y或Y-K-Y-C-X，其中“X”代表HA或NA，优选HA，“Y”代表NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)，优选NP或M1，“K”表示一个或更多个肽接头存在于该位置处，“C”表示一个或更多个切割位点存在于该位置处，“-”代表肽键。优选的排布是Y-K-Y-C-X。更优选的排布如下：
HA-K-NP，NP-K-HA，HA-K-NP-NP，NP-NP-K-HA，HA-NP-K-NP，NP-K-NP-HA，HA-K-NP-K-NP，NP-K-NP-K-HA，HA-C-NP，NP-C-HA，HA-C-NP-NP，NP-NP-C-HA，HA-NP-C-NP，NP-C-NP-HA，HA-C-NP-C-NP，NP-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-NP，NP-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-NP，NP-K-NP-C-HA，HA-K-NP-M1，HA-K-M1-NP，NP-M1-K-HA，M1-NP-K-HA，HA-NP-K-M1，HA-M1-K-NP，NP-K-M1-HA，M1-K-NP-HA，HA-K-NP-K-M1，HA-K-M1-K-NP，NP-K-M1-K-HA，M1-K-NP-K-HA，HA-C-NP-M1，HA-C-M1-NP，NP-M1-C-HA，M1-NP-C-HA，HA-NP-C-M1，HA-M1-C-NP，NP-C-M1-HA，M1-C-NP-HA，HA-C-NP-C-M1，HA-C-M1-C-NP，NP-C-M1-C-HA，M1-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-M1，HA-K-M1-C-NP，NP-C-M1-K-HA，M1-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-M1，HA-C-M1-K-NP，NP-K-M1-C-HA，M1-K-NP-C-HA，HA-K-NP-M2，HA-K-M2-NP，NP-M2-K-HA，M2-NP-K-HA，HA-NP-K-M2，HA-M2-K-NP，NP-K-M2-HA，M2-K-NP-HA，HA-K-NP-K-M2，HA-K-M2-K-NP，NP-K-M2-K-HA，M2-K-NP-K-HA，HA-C-NP-M2，HA-C-M2-NP，NP-M2-C-HA，M2-NP-C-HA，HA-NP-C-M2，HA-M2-C-NP，NP-C-M2-HA，M2-C-NP-HA，HA-C-NP-C-M2，HA-C-M2-C-NP，NP-C-M2-C-HA，M2-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-M2，HA-K-M2-C-NP，NP-C-M2-K-HA，M2-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-M2，HA-C-M2-K-NP，NP-K-M2-C-HA，M2-K-NP-C-HA，HA-K-NP-NS1，HA-K-NS1-NP，NP-NS1-K-HA，NS1-NP-K-HA，HA-NP-K-NS1，HA-NS1-K-NP，NP-K-NS1-HA，NS1-K-NP-HA，HA-K-NP-K-NS1，HA-K-NS1-K-NP，NP-K-NS1-K-HA，NS1-K-NP-K-HA，HA-C-NP-NS1，HA-C-NS1-NP，NP-NS1-C-HA，NS1-NP-C-HA，HA-NP-C-NS1，HA-NS1-C-NP，NP-C-NS1-HA，NS1-C-NP-HA，HA-C-NP-C-NS1，HA-C-NS1-C-NP，NP-C-NS1-C-HA，NS1-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-NS1，HA-K-NS1-C-NP，NP-C-NS1-K-HA，NS1-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-NS1，HA-C-NS1-K-NP，NP-K-NS1-C-HA，NS1-K-NP-C-HA，HA-K-NP-NS2/NEP，HA-K-NS2/NEP-NP，NP-NS2/NEP-K-HA，NS2/NEP-NP-K-HA，HA-NP-K-NS2/NEP，HA-NS2/NEP-K-NP，NP-K-NS2/NEP-HA，NS2/NEP-K-NP-HA，HA-K-NP-K-NS2/NEP，HA-K-NS2/NEP-K-NP，NP-K-NS2/NEP-K-HA，NS2/NEP-K-NP-K-HA，HA-C-NP-NS2/NEP，HA-C-NS2/NEP-NP，NP-NS2/NEP-C-HA，NS2/NEP-NP-C-HA，HA-NP-C-NS2/NEP，HA-NS2/NEP-C-NP，NP-C-NS2/NEP-HA，NS2/NEP-C-NP-HA，HA-C-NP-C-NS2/NEP，HA-C-NS2/NEP-C-NP，NP-C-NS2/NEP-C-HA，NS2/NEP-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-NS2/NEP，HA-K-NS2/NEP-C-NP，NP-C-NS2/NEP-K-HA，NS2/NEP-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-NS2/NEP，HA-C-NS2/NEP-K-NP，NP-K-NS2/NEP-C-HA，NS2/NEP-K-NP-C-HA，HA-K-NP-PA，HA-K-PA-NP，NP-PA-K-HA，PA-NP-K-HA，HA-NP-K-PA，HA-PA-K-NP，NP-K-PA-HA，PA-K-NP-HA，HA-K-NP-K-PA，HA-K-PA-K-NP，NP-K-PA-K-HA，PA-K-NP-K-HA，HA-C-NP-PA，HA-C-PA-NP，NP-PA-C-HA，PA-NP-C-HA，HA-NP-C-PA，HA-PA-C-NP，NP-C-PA-HA，PA-C-NP-HA，HA-C-NP-C-PA，HA-C-PA-C-NP，NP-C-PA-C-HA，PA-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-PA，HA-K-PA-C-NP，NP-C-PA-K-HA，PA-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-PA，HA-C-PA-K-NP，NP-K-PA-C-HA，PA-K-NP-C-HA，HA-K-NP-PB1，HA-K-PB1-NP，NP-PB1-K-HA，PB1-NP-K-HA，HA-NP-K-PB1，HA-PB1-K-NP，NP-K-PB1-HA，PB1-K-NP-HA，HA-K-NP-K-PB1，HA-K-PB1-K-NP，NP-K-PB1-K-HA，PB1-K-NP-K-HA，HA-C-NP-PB1，HA-C-PB1-NP，NP-PB1-C-HA，PB1-NP-C-HA，HA-NP-C-PB1，HA-PB1-C-NP，NP-C-PB1-HA，PB1-C-NP-HA，HA-C-NP-C-PB1，HA-C-PB1-C-NP，NP-C-PB1-C-HA，PB1-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-PB1，HA-K-PB1-C-NP，NP-C-PB1-K-HA，PB1-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-PB1，HA-C-PB1-K-NP，NP-K-PB1-C-HA，PB1-K-NP-C-HA，HA-K-NP-PB2，HA-K-PB2-NP，NP-PB2-K-HA，PB2-NP-K-HA，HA-NP-K-PB2，HA-PB2-K-NP，NP-K-PB2-HA，PB2-K-NP-HA，HA-K-NP-K-PB2，HA-K-PB2-K-NP，NP-K-PB2-K-HA，PB2-K-NP-K-HA，HA-C-NP-PB2，HA-C-PB2-NP，NP-PB2-C-HA，PB2-NP-C-HA，HA-NP-C-PB2，HA-PB2-C-NP，NP-C-PB2-HA，PB2-C-NP-HA，HA-C-NP-C-PB2，HA-C-PB2-C-NP，NP-C-PB2-C-HA，PB2-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-PB2，HA-K-PB2-C-NP，NP-C-PB2-K-HA，PB2-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-PB2，HA-C-PB2-K-NP，NP-K-PB2-C-HA，PB2-K-NP-C-HA，HA-K-NP-PB1F2，HA-K-PB1F2-NP，NP-PB1F2-K-HA，PB1F2-NP-K-HA，HA-NP-K-PB1F2，HA-PB1F2-K-NP，NP-K-PB1F2-HA，PB1F2-K-NP-HA，HA-K-NP-K-PB1F2，HA-K-PB1F2-K-NP，NP-K-PB1F2-K-HA，PB1F2-K-NP-K-HA，HA-C-NP-PB1F2，HA-C-PB1F2-NP，NP-PB1F2-C-HA，PB1F2-NP-C-HA，HA-NP-C-PB1F2，HA-PB1F2-C-NP，NP-C-PB1F2-HA，PB1F2-C-NP-HA，HA-C-NP-C-PB1F2，HA-C-PB1F2-C-NP，NP-C-PB1F2-C-HA，PB1F2-C-NP-C-HA，HA-K-NP-C-PB1F2，HA-K-PB1F2-C-NP，NP-C-PB1F2-K-HA，PB1F2-C-NP-K-HA，HA-C-NP-K-PB1F2，HA-C-PB1F2-K-NP，NP-K-PB1F2-C-HA，PB1F2-K-NP-C-HA，HA-K-M1，M1-K-HA，HA-K-M1-M1，M1-M1-K-HA，HA-M1-K-M1，M1-K-M1-HA，HA-K-M1-K-M1，M1-K-M1-K-HA，HA-C-M1，M1-C-HA，HA-C-M1-M1，M1-M1-C-HA，HA-M1-C-M1，M1-C-M1-HA，HA-C-M1-C-M1，M1-C-M1-C-HA，HA-K-M1-C-M1，M1-C-M1-K-HA，HA-C-M1-K-M1，M1-K-M1-C-HA，HA-K-M1-M2，HA-K-M2-M1，M1-M2-K-HA，M2-M1-K-HA，HA-M1-K-M2，HA-M2-K-M1，M1-K-M2-HA，M2-K-M1-HA，HA-K-M1-K-M2，HA-K-M2-K-M1，M1-K-M2-K-HA，M2-K-M1-K-HA，HA-C-M1-M2，HA-C-M2-M1，M1-M2-C-HA，M2-M1-C-HA，HA-M1-C-M2，HA-M2-C-M1，M1-C-M2-HA，M2-C-M1-HA，HA-C-M1-C-M2，HA-C-M2-C-M1，M1-C-M2-C-HA，M2-C-M1-C-HA，HA-K-M1-C-M2，HA-K-M2-C-M1，M1-C-M2-K-HA，M2-C-M1-K-HA，HA-C-M1-K-M2，HA-C-M2-K-M1，M1-K-M2-C-HA，M2-K-M1-C-HA，HA-K-M1-NS1，HA-K-NS1-M1，M1-NS1-K-HA，NS1-M1-K-HA，HA-M1-K-NS1，HA-NS1-K-M1，M1-K-NS1-HA，NS1-K-M1-HA，HA-K-M1-K-NS1，HA-K-NS1-K-M1，M1-K-NS1-K-HA，NS1-K-M1-K-HA，HA-C-M1-NS1，HA-C-NS1-M1，M1-NS1-C-HA，NS1-M1-C-HA，HA-M1-C-NS1，HA-NS1-C-M1，M1-C-NS1-HA，NS1-C-M1-HA，HA-C-M1-C-NS1，HA-C-NS1-C-M1，M1-C-NS1-C-HA，NS1-C-M1-C-HA，HA-K-M1-C-NS1，HA-K-NS1-C-M1，M1-C-NS1-K-HA，NS1-C-M1-K-HA，HA-C-M1-K-NS1，HA-C-NS1-K-M1，M1-K-NS1-C-HA，NS1-K-M1-C-HA，HA-K-M1-NS2/NEP，HA-K-NS2/NEP-M1，M1-NS2/NEP-K-HA，NS2/NEP-M1-K-HA，HA-M1-K-NS2/NEP，HA-NS2/NEP-K-M1，M1-K-NS2/NEP-HA，NS2/NEP-K-M1-HA，HA-K-M1-K-NS2/NEP，HA-K-NS2/NEP-K-M1，M1-K-NS2/NEP-K-HA，NS2/NEP-K-M1-K-HA，HA-C-M1-NS2/NEP，HA-C-NS2/NEP-M1，M1-NS2/NEP-C-HA，NS2/NEP-M1-C-HA，HA-M1-C-NS2/NEP，HA-NS2/NEP-C-M1，M1-C-NS2/NEP-HA，NS2/NEP-C-M1-HA，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最优选地，排布是NP-K-M1-C-HA。
每种蛋白质可以与任何其它蛋白质组合以及任何两种蛋白质可以或不通过切割位点或接头肽连接或相连在本发明的范围内。
在一些优选实施方案中，所述表达系统用于预防或治疗病毒性感染，特别优选地用于预防或治疗正粘病毒感染，优选流感病毒感染，更优选A型流感病毒感染，和/或制备用于预防或治疗正粘病毒感染(优选流感病毒感染、更优选A型流感病毒感染)的药物，和/或用于预防或治疗正粘病毒感染(优选流感病毒感染，更优选A型流感病毒感染)的方法。
在一些优选实施方案中，所述表达系统用于增强免疫应答，优选针对正粘病毒感染(优选流感病毒感染，更优选A型流感病毒感染)的B细胞免疫应答。
在该方面的一个优选实施方案中，HA根据所述第八方面来限定。
特别优选地，由第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸编码的病毒多蛋白具有根据SEQ ID NO：13的氨基酸或其变体和/或由具有核酸序列SEQ ID NO：14或其变体的多核苷酸编码。优选地，经编码的三联抗原蛋白NP-M1-H1p通过2A序列被加工成胞质NP-M1融合蛋白和跨膜H1p蛋白。
在一些优选实施方案中，所述表达系统用于预防或治疗正粘病毒感染，优选A型流感病毒感染。
在一些更优选的实施方案中，所述表达系统用于增强免疫应答，优选针对正粘病毒蛋白(优选A型流感病毒蛋白)的B细胞免疫应答。
在一些优选实施方案中，包含第一多核苷酸和第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的载体选自：质粒、粘粒、噬菌体、病毒和人工染色体。更优选地，适于实施本发明的载体选自：质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体，优选λ噬菌体载体和丝状噬菌体载体、病毒载体、腺病毒载体(例如，非复制性Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3载体或者可进行复制的Ad4和Ad7载体)、腺相关病毒(AAV)载体(例如，5型AAV和2型AAV)、甲病毒载体(例如，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、辛德毕斯病毒(SIN)、森林脑炎病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合体)、疱疹病毒载体(例如，源自巨细胞病毒如恒河猴巨细胞病毒(RhCMV)的载体(14))、沙粒病毒载体(例如，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体(15))、麻疹病毒载体、痘病毒载体(例如，痘苗病毒、经修饰痘苗病毒安卡拉(MVA)，NYVAC(源自痘苗的哥本哈根毒株)以及禽痘载体(金丝雀痘(ALVAC)载体和鸡痘(FPV)载体)、水泡性口炎病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、病毒样颗粒和细菌孢子。在WO2005/071093中详细描述了载体ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82。在WO2010/086189中详细描述了载体PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147。特别优选地，所述载体选自MVA、ChAd63和PanAd3。
在一些优选实施方案中，所述表达系统用于药物。在一些更优选的实施方案中，所述表达系统用于预防或治疗病毒性感染，特别优选地用于预防或治疗RSV感染。
在第二方面，本发明提供了由第一方面的表达系统编码的分离的蛋白质混合物。优选地，所述分离的蛋白质混合物包含、基本包含或含有一种或更多种由第一方面之表达系统编码的病毒性蛋白质。
在一些优选实施方案中，所述分离的蛋白质混合物用于药物。在一些特别优选的实施方案中，所述分离的蛋白质混合物用于预防或治疗病毒性感染，特别优选地用于预防或治疗RSV感染或者预防或治疗A型流感感染。
在第三方面，本发明提供了包含第一方面之表达系统和/或第二方面之蛋白质混合物的分离的宿主细胞。应理解，这样的宿主细胞包括但不限于原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，真菌细胞、植物细胞或动物细胞)。
在一些优选实施方案中，所述宿主细胞用于药物。在一些特别优选的实施方案中，所述宿主细胞用于预防或治疗病毒性感染，特别优选用于预防或治疗RSV感染，或者预防或治疗A型流感感染。
在第四方面，本发明提供了包含第一方面之表达系统或第二方面之蛋白质混合物以及可药用载体和/或赋形剂的组合物。优选地，这样的组合物是药物组合物。
第四方面的组合物包含治疗有效量的所述化合物(优选为纯化形式)和合适量的载体以提供用于适当地施用于患者的形式。该制剂应适合施用模式。
所述组合物可采用溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。可以将所述组合物与传统粘合剂以及载体(例如甘油三酯)一起配制为栓剂。
为了制备本发明的药物组合物，可药用载体可以是固体或液体。
固体形式的组合物包括粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、扁囊剂(cachet)、栓剂和可分散颗粒。固体赋形剂可以是一种或更多种物质，其还可以作为稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片崩解剂或包封材料。在粉末中，赋形剂优选为极细的固体，其与本发明的极细的抑制剂混合。在片剂中，活性成分与具有必要粘合特性的载体以合适的比例混合并以期望形状和大小压缩。合适的赋形剂是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。为了制备栓剂，首先将低熔点蜡(例如脂肪酸甘油酯的混合物或可可油)熔解，如通过搅拌将活性组分均匀地分散于其中。然后将熔融的均匀混合物倒入便利大小的模具中，冷却，从而固化。可以使用片剂、粉末、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂作为适于经口施用的固体剂型。
液体形式的组合物包括溶液、混悬液和乳液，例如水、盐水溶液、水性葡萄糖、甘油溶液或水/丙二醇溶液。当静脉内或通过雾化器鼻内施用药物组合物时，优选的载体是盐水溶液。就肠胃外注射而言，可以将液体制备物配制于溶液中，例如水性聚乙二醇溶液中。
在该方面的一个特别优选的实施方案中，药物组合物为溶液、混悬液或乳液形式并且通过雾化器鼻内施用。
优选地，药物组合物为单位剂型。以这样的形式，组合物可进一步分为包含适当量之活性组分的单位剂量。单位剂型可以为包装组合物，所述包装包含离散量的组合物，例如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉末。此外，单位剂型可以是胶囊、注射小瓶、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以是适当数目的任意这些的包装形式。
如果期望，组合物还可包含微量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
此外，这样的组合物还可包含其它药理学活性物质，例如但不限于佐剂和/或另外的活性成分。
在本发明的上下文中，佐剂包括但不限于这样的佐剂的实例，其包括但不限于无机佐剂、有机佐剂、油基佐剂、细胞因子、颗粒状佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、合成佐剂或合成多核苷酸佐剂。
另外的活性成分包括但不限于其它疫苗化合物或组合物。优选地，所述另外的活性成分是另一病毒性疫苗，更优选为针对DNA病毒、负义单链(ssRNA(-))RNA病毒或双义RNA病毒的疫苗。还优选地，所述病毒选自负义单链(ssRNA(-))RNA病毒。更优选地，所述病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。优选地，所述另外的活性成分是针对副粘病毒的疫苗，所述副粘病毒优选地选自：肺病毒亚科、副粘病毒亚科、Fer-de-Lance-病毒、Nariva-病毒、Salem-病毒、Tupaia-副粘病毒、Beilong-病毒、J-病毒、Menangle-病毒、Mossmann-病毒和Murayama-病毒。特别优选地，肺病毒亚科选自肺病毒(例如，人呼吸道合胞病毒(RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV)和偏肺病毒(例如，人偏肺病毒、禽偏肺病毒)。特别优选地，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒(例如，人副流感病毒1和3)和腮腺炎病毒(例如，人副流感病毒2和4)。作为替代地或另外地，所述另外的活性成分优选为针对正粘病毒的另一病毒性疫苗，更优选地所述正粘病毒选自以下属：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、索戈托病毒属和传染性鲑鱼贫血症病毒属。在一些更优选的实施方案中，正粘病毒是A型流感病毒，优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选为A型流感病毒亚型H1N1。
在第五方面，本发明提供了第一方面的表达系统、第二方面的分离的蛋白质混合物、第三方面的分离的宿主细胞或第四方面的组合物，用于治疗或预防病毒性疾病。
在该方面的一些优选实施方案中，病毒性疾病是由DNA病毒、负义单链(ssRNA(-))RNA病毒或双义RNA病毒引起的。还优选地，所述病毒选自负义单链(ssRNA(-))RNA病毒。更优选地，所述病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。所述副粘病毒优选地选自：肺病毒亚科、副粘病毒亚科、Fer-de-Lance-病毒、Nariva-病毒、Salem-病毒、Tupaia-副粘病毒、Beilong-病毒、J-病毒、Menangle-病毒、Mossmann-病毒和Murayama-病毒。更优选地，肺病毒亚科选自肺病毒(例如，人呼吸道合胞病毒(RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV)和偏肺病毒(例如，人偏肺病毒、禽偏肺病毒)。更优选地，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒(例如，人副流感病毒1和3)和腮腺炎病毒(例如，人副流感病毒2和4)。作为替代地或另外地，病毒性疾病优选地由正粘病毒引起，所述正粘病毒更优选地选自以下属：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、索戈托病毒属和传染性鲑鱼贫血症病毒属。在一些更优选的实施方案中，正粘病毒是A型流感病毒，优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选为A型流感病毒亚型H1N1。
在第六方面，本发明提供了治疗或预防病毒性疾病的方法，其包括施用有效量的第一方面的表达系统、第二方面的分离的蛋白质混合物、第三方面的分离的宿主细胞或第四方面的组合物用于治疗或预防病毒性疾病。
在该方面的一些优选实施方案中，所述病毒性疾病是由DNA病毒、负义单链(ssRNA(-))RNA病毒或双义RNA病毒引起的。还优选地，病毒选自负义单链(ssRNA(-))RNA病毒。更优选地，病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。所述副粘病毒优选地选自：肺病毒亚科、副粘病毒亚科、Fer-de-Lance-病毒、Nariva-病毒、Salem-病毒、Tupaia-副粘病毒、Beilong-病毒、J-病毒、Menangle-病毒、Mossmann-病毒和Murayama-病毒。更优选地，肺病毒亚科选自肺病毒(例如，人呼吸道合胞病毒(RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV)和偏肺病毒(例如，人偏肺病毒、禽偏肺病毒)。更优选地，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒(例如，人副流感病毒1和3)和腮腺炎病毒(例如，人副流感病毒2和4)。作为替代地或另外地，病毒性疾病优选地由正粘病毒引起，所述正粘病毒更优选地选自以下属：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、索戈托病毒属和传染性鲑鱼贫血症病毒属。在一些更优选的实施方案中，正粘病毒是A型流感病毒，优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选A型流感病毒亚型H1N1。
在第七方面，本发明提供了用于增强针对免疫原之免疫应答的方法，其包括施用第一方面的表达系统、第二方面的蛋白质混合物、第三方面的细胞和第四方面的组合物。
在该方面的一些优选实施方案中，免疫原是病原体，更优选地，免疫原是病毒。优选地，所述病毒选自：DNA病毒、负义单链(ssRNA(-))RNA病毒或双义RNA病毒。还优选地，所述病毒选自负义单链(ssRNA(-))RNA病毒。更优选地，所述病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。所述副粘病毒优选地选自：肺病毒亚科、副粘病毒亚科、Fer-de-Lance-病毒、Nariva-病毒、Salem-病毒、TuDaia-副粘病毒、Beilong-病毒、J-病毒、Menangle-病毒、Mossmann-病毒和Murayama-病毒。更优选地，肺病毒亚科选自肺病毒(例如，人呼吸道合胞病毒(RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV)和偏肺病毒(例如，人偏肺病毒、禽偏肺病毒)。更优选地，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒(例如，人副流感病毒1和3)和腮腺炎病毒(例如，人副流感病毒2和4)。作为替代地或另外地，病毒性疾病优选地由正粘病毒引起，所述正粘病毒更优选地选自以下属：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、索戈托病毒属和传染性鲑鱼贫血症病毒属。在一些更优选的实施方案中，正粘病毒是A型流感病毒，优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选A型流感病毒亚型H1N1。
在第八方面，本发明提供了编码流感血凝素(HA)的核苷酸构建体、包含这些核苷酸构建体的表达系统和由所述核苷酸构建体编码的蛋白质或多蛋白，其中HA0切割位点具有多碱性氨基酸序列。
该方面的核酸构建体包含编码经修饰之流感血凝素(HA)的多核苷酸，或者基本由其组成或由其组成，其中通过引入一个或更多个碱性氨基酸来修饰HA0切割位点。优选地，在经修饰的HA中，HA基因共有序列的HA0切割位点被H5N1的多碱性氨基酸切割位点(其被遍在蛋白酶切割)所取代从而得到经完全加工的HA(H1p)。
流感血凝素(HA)是属于流感病毒表面上存在的病毒血凝素家族的蛋白质。它是抗原性糖蛋白，其负责使病毒与受感染的细胞结合。HA蛋白质(例如流感血凝素)与膜上具有唾液酸的细胞(例如上呼吸道中的细胞或红细胞)结合。至少存在16种不同的HA抗原。这些血清型和亚型命名为H1至H16。
HA具有两种功能：
1.通过与含唾液酸的受体结合来识别靶细胞。
2.通过使宿主内含体膜与病毒膜(包膜)相融合来介导病毒基因组进入靶细胞。详细来讲，HA与存在于其靶细胞表面上的单糖唾液酸结合。然后细胞膜吞入病毒，包住病毒的膜部分形成内含体。然后，内含体被酸化并被运送入溶酶体中。一旦内含体中的pH降至约6.0，HA分子的初始折叠结构就变得不稳定，导致其部分解折叠，释放其肽链的疏水部分。该融合肽插入内含体膜。然后，其余的HA分子再折叠成新结构并使病毒膜与内含体膜融合从而使病毒的内含物(包括其RNA基因组)释放到细胞的胞质中。
为了实现其膜融合潜能，HA0必须被宿主细胞蛋白酶切割为HA1和HA2。切割发生在连接HA1和HA2亚基的接头序列处，其位于部分表面暴露的环上。流感HA的H0切割位点位于H1N1亚型(SEQ ID NO：8的339至344位氨基酸)、H5N1亚型(SEQ ID NO：10的337至346位氨基酸)和H3N2(SEQ ID NO：20的340至350位氨基酸)中的约340位氨基酸处。本领域技术人员可通过所属技术领域中公知的方法来进行序列比对和序列同一性分析从而确定流感病毒HA的其它亚型中H0切割位点的位置。亚型H1N1和H3N2的A型流感病毒HA需要被宿主细胞蛋白酶切割以转变为融合感受态(fusion-competent state)。流感病毒的蛋白质裂解活化可发生在高尔基体中或者发生在受感染细胞的质膜处，以及在胞外空间中和在靶细胞囊泡中，因此切割位点和各活化蛋白酶的性质对于流感病毒的生物学特性以及治疗干预而言都具有重要意义。亚型H5N1的HA显示在切割位点处具有若干精氨酸残基和赖氨酸残基，其中R-X-R/K-R共有序列对于高效切割而言是必不可少的。另外，得到证据表明HA的切割可发生在反面高尔基网(TGN)中。已证实这些病毒被弗林蛋白酶活化。
氨基酸序列SEQ ID NO：8是源自NCBI流感病毒资源数据库中标注H1N1亚型(从2009年4月至9月在世界范围内流行)的829条序列之比对的共有序列。除了天然H0蛋白酶切割位点被源自H5N1的多碱性氨基酸位点取代以外，氨基酸序列SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：8相同。氨基酸序列SEQ ID NO：10是源自NCBI流感病毒资源数据库中标注H5N1亚型(从1990年至2009年在世界范围内感染人)的259条序列之比对的共有序列。氨基酸序列SEQ ID NO：20是A型流感病毒亚型H3N2(毒株A/惠灵顿/01/2004(H3N2))的HA序列。氨基酸序列SEQ ID NO：21基于SEQ ID NO：20，其中天然H0蛋白酶切割位点被源自H5N1的多碱性氨基酸位点所取代。
氨基酸序列SEQ ID NO：11是基于不同流感亚型共有序列的比对设计的NP共有序列。此外，SEQ ID NO：11的NP序列缺少用以提高胞质表达的位于6至8位氨基酸(TRK至AAA)处的核定位信号
氨基酸序列SEQ ID NO：12是通过比对所比对的不同共有序列并且选择各位置处最常见的氨基酸而得到的M1共有序列。
在该方面的一个优选实施方案中，核酸构建体和/或包含该核酸构建体的表达系统包含用以直接转录和翻译HA和任选的其它由核苷酸构建体和/或表达系统编码的蛋白质的元件，它们可包括于下文给出的一些优选实施方案中。这样的元件包括用以在无细胞系统或基于细胞的系统(优选基于细胞的系统)中直接转录mRNA的启动子元件和增强子元件。在另一实施方案中，其中所提供的多核苷酸为可翻译RNA，可设想表达系统包含翻译和/或稳定编码HA之RNA和/或诱导T细胞之蛋白质所必须的那些元件，例如多聚A-尾、IRES、帽结构等。
在该方面的一个优选实施方案中，核酸构建体编码包含经修饰之H0切割位点的HA蛋白质、肽或其变体，其中HA选自以下HA亚型：H1、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或其变体或其共有序列，或者一种或更多种选自以下之HA亚型的共有序列或其变体：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16。优选地，HA亚型选自H1、H2、H3、H7、H9、H10或其变体或其共有序列，或者一种或更多种选自以下之HA亚型的共有序列或其变体：H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10。更优选地，包含经修饰之H0切割位点的HA蛋白、肽或其变体是来自亚型H1的HA或其变体。更优选地，编码核苷酸构建体之HA的多核苷酸具有序列SEQ ID NO：9。
在该方面的一个优选实施方案中，核酸构建体编码HA蛋白质、肽或其变体，其中通过用碱性氨基酸取代至少一个非碱性氨基酸和/或通过将至少一个碱性氨基酸引入H0切割位点的序列来修饰H0切割位点。优选地，碱性氨基酸选自：精氨酸(Arg；R)、赖氨酸(Lys；K)和组氨酸(His，H)。更优选地，碱性氨基酸选自精氨酸(Arg；R)和赖氨酸(Lys；K)。
优选地，切割位点包含6至12个氨基酸的序列，更优选为10至12个氨基酸。
优选地，形成H0切割位点的多肽氨基酸的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％是碱性氨基酸。
优选地，HA0切割位点具有选自以下的序列：PQRERRRKKR(SEQ ID NO：15)、PQRESRRKKR(SEQ ID NO：16)、PQGERRRKKR(SEQ ID NO：17)、PLRERRRKR(SEQ ID NO：18)和PQRETR(SEQ ID NO：19)。最优选地，HA0切割位点具有序列PQRERRRKKR(SEQ ID NO：15)。
在表1中，将H1N1毒株的H0切割位点的序列和H5N1毒株的H0切割位点的序列就其各自HA氨基酸链进行了比较。在第一行中，示出了高致病性H5N1亚型的H0多碱性氨基酸切割位点的共有序列。在第二行中，示出了H1N1野生型毒株的HA的H0切割位点的氨基酸序列。在第三行中，示出了H1p蛋白中的多碱性氨基酸切割位点的改造序列，代替天然序列。
表1
H5N1切割位点 LATGLRNS PQRERRRKKR GLFGAIA...... H1N1切割位点 LATGLRNV PSIQSR GLFGAIA...... H1p切割位点 LATGLRNI PQRERRRKKR GLFGAIA......
在本发明第八方面的一些实施方案中，核酸构建体是编码经修饰HA的表达系统的一部分和第二多核苷酸。在该表达系统中，编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸包含在不同载体上或在同一载体上。因此，编码经修饰HA的多核苷酸可以包含在一个载体上，第二多核苷酸可以包含在第二载体上。作为替代地或另外地，编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸可以包含在同一载体上。优选地，编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸包含在同一载体上。特别优选地，包含在同一载体上的编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸相连从而使它们表达为多蛋白。优选地，编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸形成开放读码框。
优选地，编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸表达为人工多蛋白。在本发明的上下文中，术语“人工多蛋白”指非天然多蛋白，例如通过使用重组DNA技术产生的那些。因此，在该人工多蛋白质中编码的蛋白质、肽或其变体优选地源自这样的病原体：其基因组不编码包含由本发明之编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或变体的多蛋白。优选地，编码经修饰HA的多核苷酸和第二多核苷酸都源自A型流感病毒。
在第八方面的一些优选实施方案中，第二多核苷酸编码诱导T细胞应答的蛋白质或其变体，并且其优选为A型流感病毒的非结构蛋白和/或内在蛋白。优选地，由第二多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白选自：NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)。
优选地，经修饰HA的氨基酸序列和/或由第二多核苷酸编码的非结构(内在)蛋白包含一种或更多种不同病毒分离株的连续区段或共有序列。
在本发明的上下文中，优选地，术语“区段”指蛋白质或多蛋白的一部分。特别优选地，这样的区段独立于所述蛋白质或多蛋白的其余部分而折叠和/或起作用，例如但不限于其结构域、表位或片段。应理解，在本发明的上下文中，蛋白质变体与其亲本多肽比较的不同之处在于氨基酸序列的变化，例如氨基酸互换、插入、缺失、N末端截短或C末端截短，或者这些变化的任意组合，它们可发生在一个或若干个位点处，从而变体与其亲本多肽表现出至少80％的序列同一性。
在另一优选实施方案中，经修饰HA的膜附着结构域或其变体在功能上缺失，因此，要么在结构上缺失要么存在结构但不能实现其生物学功能。在一个特别优选的实施方案中，对应于膜附着结构域的氨基酸序列缺失。膜附着区的缺失用于确认诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质是由引入本发明表达系统的细胞所分泌的。
在该方面的又一优选实施方案中，经修饰的HA包含分泌信号，其将蛋白质靶向内质网(ER)。这样的分泌信号优选地在缺失膜附着结构域的情况下存在。本领域技术人员熟知多种这样的分泌信号，可以将其用作异源分泌信号，例如，添加到经修饰HA的N-末端。作为替代地或另外地，可以使用天然分泌信号，其例如存在于大多数结构病毒蛋白质和/或表面病毒蛋白质中。因此，如果天然地存在于各蛋白质中，则优选分泌信号保持在经修饰的结构蛋白和/或表面蛋白中。
在第八方面的一些实施方案中，非结构蛋白是适于诱导针对病原体的T细胞介导之免疫应答的保守性内在蛋白质，所述免疫应答涉及抗原特异性T淋巴细胞的活化，所述抗原特异性T淋巴细胞例如但不限于细胞毒性T细胞(CTL)、辅助性T细胞(TH细胞)、中央记忆性T细胞(TCM细胞)、效应记忆性T细胞(TEM细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)。因此，优选地，病原体的T细胞诱导蛋白质不包含分泌信号。
在本发明的上下文中，经修饰HA或其变体位于相对于由第二多核苷酸编码之蛋白质、肽或其变体来说的N-末端或C-末端。在一个优选实施方案中，由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体位于相对于经修饰HA或其变体来说的N-末端。
在第八方面的一些优选实施方案中，编码切割位点的多核苷酸位于经修饰HA或其变体与第二多核苷酸之间。任意两种蛋白质可以或不通过切割位点连接或相连在本发明的范围内。
优选地，该切割位点是自切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列在不涉及任何其它分子进行这样切割的情况下被切割或者可以被切割，或者其中阻止了该序列第一位置处肽键的形成)或内肽酶切割位点(即，氨基酸序列中这样的切割位点，其中该序列被内肽酶切割或者可以被内肽酶切割，所述内肽酶例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、胶原酶、弗林蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内肽酶V8、组织蛋白酶)。更优选地，自切割位点是选自以下的2A切割位点：小核糖核酸病毒、昆虫病毒、Aphtoviridae、轮状病毒和锥虫的病毒性2A肽或2A样肽，优选地，其中2A切割位点是口蹄疫病毒的2A肽。作为替代地或另外地，本发明的多蛋白可以被自我蛋白酶(即，在也包含蛋白酶的同一蛋白质分子中切割肽键的蛋白酶)切割。这样的自我蛋白酶的实例是黄病毒的NS2蛋白酶或双RNA病毒的VP4蛋白酶。
在本发明的上下文中，切割位点可位于相对于经修饰HA或其变体来说的N-末端以及相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的C-末端。作为替代地，切割位点可位于相对于经修饰HA或其变体来说的C-末端以及相对于由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体来说的N-末端。
在第八方面的一个优选实施方案中，表达系统还包含编码病原体之蛋白质、肽或其变体的第三多核苷酸。
优选地，由第三多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体不同于经修饰HA或其变体或者由第二多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体。优选地，由第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸编码的蛋白质、肽或其变体彼此的不同之处在于它们包含不同蛋白质的氨基酸序列。
在第八方面的一些优选实施方案中，第三多核苷酸编码诱导T细胞应答的蛋白质或其变体，并且其优选为A型流感病毒的非结构蛋白和/或内在蛋白。优选地，由第三多核苷酸编码的非结构蛋白和/或内在蛋白选自NP、M1、M2、NS1、NS2/NEP、PA、PB1、PB2或PB1-F2(PB1F2)。
在一些优选实施方案中，编码接头的多核苷酸位于第二多核苷酸与第三多核苷酸之间。优选接头是柔性接头，优选为包含根据SEQ ID NO：6(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly)的氨基酸序列的柔性接头。
在一些优选实施方案中，第三多核苷酸与编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和/或第二多核苷酸包含在不同载体上或者在同一载体上。
因此，编码经修饰HA或其变体的多核苷酸包含在一个载体上，第二多核苷酸包含在第二载体上，第三多核苷酸包含在第三载体上。作为替代地或另外地，编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和第二多核苷酸包含在同一载体上，第三多核苷酸包含在不同载体上，或者编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，第二多核苷酸包含在不同载体上，或者第二多核苷酸和第三多核苷酸包含在同一载体上，编码经修饰HA或其变体的多核苷酸包含在不同载体上。作为替代地或另外地，编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸包含在同一载体上。优选地，编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸可以包含在同一载体上。特别优选地，包含在同一载体上的编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和第二多核苷酸以及第三多核苷酸相连从而使它们表达为多蛋白。优选地，包含在同一载体上的编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和第二多核苷酸及第三多核苷酸形成开放读码框。
在该方面的一些优选实施方案中，包含编码经修饰HA或其变体的多核苷酸和第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的载体选自质粒、粘粒、噬菌体、病毒和人工染色体。更优选地，适于实施本发明的载体选自质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(优选为λ噬菌体载体和丝状噬菌体载体)、病毒载体、腺病毒载体(例如，非复制性Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3载体或可进行复制的Ad4和Ad7载体)、腺相关病毒(AAV)载体(例如，5型AAV和2型AAV)、甲病毒载体(例如，委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、辛德毕斯病毒(SIN)、森林脑炎病毒(SFV)和VEE-SIN嵌合体)、疱疹病毒载体(例如，源自巨细胞病毒如恒河猴巨细胞病毒(RhCMV)的载体(14))、沙粒病毒载体(例如，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体(15))、麻疹病毒载体、痘病毒载体(例如，痘苗病毒、经修饰痘苗病毒安卡拉(MVA)，NYVAC(源自痘苗的哥本哈根毒株)以及禽痘载体(金丝雀痘(ALVAC)载体和鸡痘(FPV)载体)、水泡性口炎病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、病毒样颗粒和细菌孢子。在WO2005/071093中详细描述了载体ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82。在WO2010/086189中详细描述了载体PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147。特别优选地，所述载体选自MVA、ChAd63和PanAd3。
在该方面的一些优选实施方案中，核苷酸构建体或表达系统或包含该核苷酸构建体或表达系统之多核苷酸的载体可包括调节目的基因表达的“表达调控序列”。通常而言，表达调控序列是多肽或多核苷酸，例如但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子或阻抑子。
在该方面的一个特别优选的实施方案中，根据本发明第一方面的一些实施方案针对包含编码来自正粘病毒的蛋白质、肽或其变体(优选来自A型流感病毒的蛋白质、肽或变体)的表达系统来对表达系统进行限定。
在一些优选实施方案中，第八方面的核酸构建体和/或表达系统用于药物。在一些更优选的实施方案中，该方面的核酸构建体、表达系统或蛋白质用于预防或治疗A型流感病毒感染和/或制备用于预防或治疗A型流感病毒感染的药物和/或用于预防或治疗A型流感病毒感染的方法。
在一些优选实施方案中，表达系统用于增强免疫应答。在一些更优选的实施方案中，表达系统用于增强针对A型流感病毒感染(更优选地如本发明第一方面所限定的A型流感病毒)的抗病原性B细胞免疫应答。
在第九方面，本发明提供了如第八方面所限定的多碱性氨基酸HA0切割位点在体外和/或体内构建能够表达第八方面之经修饰流感血凝素(HA)的核酸构建体或表达系统的用途。此外，该方面提供了由根据该方面构建的核酸构建体或表达系统编码的分离的蛋白质混合物、蛋白质和/或多蛋白。
在第十方面，本发明提供了由第八方面的表达系统编码的分离的蛋白质混合物。优选地，所述分离的蛋白质混合物包含、基本包含或含有由第八方面的核酸构建体或表达系统编码的一种或更多种蛋白质或多蛋白。在一些优选实施方案中，分离的蛋白质混合物用于药物。在一些特别优选的实施方案中，分离的蛋白质混合物用于预防或治疗病毒性感染，特别优选地用于预防或治疗A型流感病毒感染和/或制备用于预防或治疗A型流感病毒感染的药物和/或用于预防或治疗A型流感病毒感染的方法。
在第十一方面，本发明提供了包含第八方面的核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白和/或第十方面的蛋白质混合物的分离的宿主细胞。应理解，这样的宿主细胞包括但不限于原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，真菌细胞、植物细胞或动物细胞)。在该方面的一些优选实施方案中，所述宿主细胞用于药物。在一些特别优选的实施方案中，所述宿主细胞用于预防或治疗A型流感病毒感染和/或制备用于预防或治疗A型流感病毒感染的药物和/或用于预防或治疗A型流感病毒感染的方法。
在第十二方面，本发明提供了包含第八方面的核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白或者第十方面的蛋白质混合物以及可药用载体和/或赋形剂的组合物。优选地，这样的组合物是药物组合物。
第十二方面的组合物包含治疗有效量的所述化合物(优选为纯化形式)与合适量的载体以提供用于适当施用于患者的形式。制剂应当适于施用形式。
组合物可采用溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。可以将组合物与传统粘合剂以及载体(例如甘油三酯)一起配制为栓剂。
为了制备本发明的药物组合物，可药用载体可以是固体或液体。
固体形式的组合物包括粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒。固体赋形剂可以是一种或更多种物质，其还可以作为稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片崩解剂或包封材料。在粉末中，赋形剂优选为极细的固体，其与本发明的极细的抑制剂混合。在片剂中，活性成分与具有必要粘合特性的载体以合适的比例混合并以期望形状和大小压制。合适的赋形剂是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。为了制备栓剂，首先将低熔点蜡(例如脂肪酸甘油酯的混合物或可可油)熔解，如通过搅拌将活性组分均匀地分散于其中。然后将熔融的均匀混合物倒入便利大小的模具中，冷却，从而固化。可以使用片剂、粉末、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂作为适于经口施用的固体剂型。
液体形式的组合物包括溶液、混悬液和乳液，例如水、盐水溶液、水性葡萄糖、甘油溶液或水/丙二醇溶液。当静脉内或通过雾化器鼻内施用药物组合物时，优选的载体是盐水溶液。就肠胃外注射而言，可以将液体制备物配制于溶液中，例如水性聚乙二醇溶液中。
在该方面的一个特别优选的实施方案中，药物组合物为溶液、混悬液或乳液形式并且通过雾化器鼻内施用。
优选地，药物组合物为单位剂型。以这样的形式，组合物可进一步分为包含适当量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以为包装组合物，所述包装包含离散量的组合物，例如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉末。此外，单位剂型可以是胶囊、注射小瓶、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以是适当数目的任意这些的包装形式。
如果期望，组合物还可包含微量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
此外，这样的组合物还可包含其它药理学活性物质，例如但不限于佐剂和/或另外的活性成分。
在本发明的上下文中，佐剂包括但不限于这样的佐剂的实例，其包括但不限于无机佐剂、有机佐剂、油基佐剂、细胞因子、颗粒状佐剂、病毒颗粒、细菌佐剂、合成佐剂或合成多核苷酸佐剂。
所述另外的活性成分包括但不限于其它疫苗化合物或组合物。优选地，另外的活性成分是另一病毒性疫苗，更优选为针对DNA病毒、负义单链(ssRNA(-))RNA病毒或双义RNA病毒的疫苗。还优选地，所述病毒选自负义单链(ssRNA(-))RNA病毒。更优选地，所述病毒选自包膜ssRNA(-)病毒，更优选地选自副粘病毒和正粘病毒。优选地，所述另外的活性成分是针对副粘病毒的疫苗，所述副粘病毒优选地选自：肺病毒亚科、副粘病毒亚科、Fer-de-Lance-病毒、Nariva-病毒、Salem-病毒、Tupaia-副粘病毒、Beilong-病毒、J-病毒、Menangle-病毒、Mossmann-病毒和Murayama-病毒。特别优选地，肺病毒亚科选自肺病毒(例如，人呼吸道合胞病毒(RSV)、鼠肺炎病毒、牛RSV、绵羊RSV、山羊RSV)和偏肺病毒(例如，人偏肺病毒、禽偏肺病毒)。特别优选地，副粘病毒亚科选自呼吸道病毒(例如，人副流感病毒1和3)和腮腺炎病毒(例如，人副流感病毒2和4)。作为替代地或另外地，所述另外的活性成分优选为针对正粘病毒的另一病毒性疫苗，所述正粘病毒更优选地选自以下属：A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属、索戈托病毒属和传染性鲑鱼贫血症病毒属。在一些更优选的实施方案中，正粘病毒是A型流感病毒，优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选为A型流感病毒亚型H1N1。
在第十三方面，本发明提供了第八方面的核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白、第十方面的蛋白质混合物、第十一方面的细胞和第十二方面的组合物，其用于药物特别是治疗或预防A型流感病毒感染的药物。A型流感病毒优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选为A型流感病毒亚型H1N1。
在第十四方面，本发明提供了治疗或预防A型流感病毒感染的方法，其包括施用有效量的第八方面的核苷酸构建体、表达系统或蛋白质或多蛋白、第十方面的蛋白质混合物、第十一方面的细胞和第十二方面的组合物。A型流感病毒优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选为A型流感病毒亚型H1N1。
在第十五方面，本发明提供了增强免疫应答的方法，其包括施用第八方面的核苷酸构建体或表达系统或蛋白质或多蛋白、第十方面的蛋白质混合物、第十一方面的细胞和第十二方面的组合物。在该方面的一个优选实施方案中，该方法增强针对A型流感病毒的免疫应答。A型流感病毒优选地选自A型流感病毒亚型H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2、H10N7，更优选为A型流感病毒亚型H1N1。
下述实施例仅为本发明的示例性说明并且不应解释为以任何方式限制如由所述权利要求书所示的本发明的范围。
实施例
实施例1：设计和合成编码经优化之RSV抗原的DNA
共有序列疫苗
存在基于分离株进行疫苗设计的若干计算替代方案。一种方法是重建最近的共用祖先(most recent common ancestor，MRCA)序列(9)。在该类型的分析中，祖先状态是对过去存在过的实际序列的评估(即，其直接来自重建历史)。另一类型的计算分析是树中心(center of the tree，COT)法。COT法鉴定无根谱系(unrooted phylogeny)上的一点，其中使从该点到谱系上的各顶端之间的平均进化距离最小化。该方法的提出者指出，因为COT是谱系上的一点，所以所评估的COT序列将与所评估的祖先序列具有同样的优点。参见，例如，美国申请2005/0137387A1。但是，该COT方法非常复杂，以致于降低了其对于大的和异源性数据集的实用性，例如流感序列数据库并不适用于该技术。总之，MRCA法和COT法不适用于复杂的流感序列数据库。
第三类型的计算分析是共有序列法。因为共有序列包含最常在各位置处观察到的氨基酸，其可能代表病毒的最合适状态。因此，从复制的角度来讲，通过选择异于共有序列的序列来有效规避免疫应答可导致较不合适(less fit)的病毒。共有序列法侧重于大量采样的亚系(sublineage)并且不再强调离群值。这样，本文所使用的方法比其他类型的计算分析更直接。此外，这些方法可采用RSV的整个数据集。共有序列的一个优点是它使疫苗毒株与流行分离株之间的遗传差异最小化，有效地将多样性水平降低一半，因此其可具有增强的引起交叉反应应答的潜力。
疫苗设计
为了设计本发明的疫苗抗原，从国家生物技术信息中心(NCBI)RSV资源数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得RSV的F0-、N-和M2-1蛋白的蛋白质序列。蛋白质序列选自不同的RSV亚型A毒株。
通过使用MUSCLE版本3.6并应用多数决定原则来比对F-蛋白的所有非相同序列从而得到F0共有序列。基于比对不同RSV序列来设计疫苗的F0共有序列。进行BLAST分析(其代表“基本的局部比对检索工具”并且可通过NCBI公开地得到)来测量疫苗共有F0序列的序列相似性。相对于人呼吸道合胞病毒A2毒株而言，与数据库中的所有RSV序列相比较而计算的共有序列的最高平均相似性为100％。
此外，疫苗的F0序列缺少位于525至574位氨基酸的跨膜区用以分泌F0ΔTM。
最后，对疫苗F0ΔTM序列进行密码子优化用以在真核细胞中表达。
通过使用MUSCLE版本3.6并且采用多数决定原则比对N-蛋白的所有非相同序列来得到疫苗的N共有序列。N共有序列的BLAST分析发现与人呼吸道合胞病毒A2毒株的最佳比对。然后，对疫苗的N序列进行密码子优化以用于在真核细胞中表达。
通过使用MUSCLE版本3.6并且采用多数决定原则比对M2-1蛋白的所有非相同序列来得到M2-1共有序列。M2-1共有序列的BLAST分析发现与人呼吸道合胞病毒A2毒株的最佳比对。最后，对疫苗M2-1序列进行密码子优化以用于在真核细胞中表达。
疫苗F0ΔTM序列与N序列被口蹄疫病毒的切割序列2A间隔开。疫苗N序列和M2-1序列被柔性接头(GGGSGGG；SEQ ID NO：6)分隔开。
最后，将经密码子优化的病毒基因克隆为单个开放读码框F0ΔTM-N-M2-1。图1中给出了抗原组合物的示意图。
编码F0ΔTM和F0ΔTM-N-M2-1的DNA质粒的产生
优化F0ΔTM、N和M2-1共有序列用于哺乳动物表达，包括添加Kozak序列和密码子优化。化学合成编码多抗原疫苗的DNA序列，然后在CMV启动子的调控下通过合适的限制酶EcoRV和NotI亚克隆到pVJTetOCMV穿梭载体中。
PanAd3病毒载体RSV疫苗的产生
产生病毒载体RSV疫苗PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1，其包含通过柔性接头融合的编码F0ΔTM、N和M2-1共有蛋白质的多蛋白。
3型倭黑猩猩腺病毒(Bonobo Adenovirus type3，PanAd3)是新的具有提高的血清阳性率的腺病毒毒株并且已在之前描述。
通过切除侧翼为同源区的抗原序列和体外酶重组来进行从质粒载体pVJTetOCMV/F0ΔTM-N-M2-1将F0ΔTM-N-M2-1克隆进PanAd3前腺病毒载体(pre-Adeno vector)中。
哺乳动物细胞中抗原表达的分析
为了控制病毒性抗原的特定组合高效地表达并且正确地加工到哺乳动物细胞中，用10μg的编码F0ΔTM-N-M2-1抗原的DNA质粒转染Hela细胞。将细胞培养36小时，之后收集上清液并制备细胞裂解液。通过SDS-PAGE分离蛋白质并印迹到尼龙滤器上。使用针对M病毒蛋白质产生的小鼠单克隆抗体(mAb8)(获赠于Dr.Geraldine Taylor)来显示所表达的蛋白质。
如图2和3所示，融合的病毒蛋白质N-M2-1非常高效地通过2A切割位点从多蛋白释放并且被mAb8识别为主要条带。非常少的高分子量前体以稳定态存在于细胞中。将用RSV毒株A感染的Hep-2细胞的裂解物用作对照。
细胞培养基的非还原SDS-PAGE和Western印迹分析显示，缺失跨膜区的F蛋白质分泌到上清液中(参见图3，泳道RSV)。上清液中F蛋白质的分子量与同三聚F蛋白(其为其天然构型)相同。
实施例2：小鼠的疫苗免疫原性
通过DNA免疫产生抗F抗体
通过DNA质粒注射和电穿孔(GET)以初次免疫和在初次免疫三周后加强免疫的方案，使用编码F0ΔTM-N-M2-1或单独F0ΔTM的DNA质粒来免疫小鼠。在加强免疫并合并两周后收集经免疫小鼠的血清。
利用非还原SDS-PAGE分离以MOI250用PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1感染的Hela细胞的上清液，印迹到尼龙滤器上，并用来自用F0ΔTM或F0ΔTM-N-M2-1免疫的小鼠的不同稀释度之血清进行探测。
如图4A和B所示，由在疫苗抗原情形下表达的F蛋白产生的抗体效价比由单独的F-蛋白引起的抗体效价高出至少30倍。因此，F0ΔTM-N-M2-1抗原在诱导小鼠的B细胞应答方面具有优越的免疫原特性。
T细胞应答
在小鼠中评价具有RSV疫苗抗原F0ΔTM-N-M2-1之黑猩猩腺病毒载体PanAd3的免疫效力。
通过在四头肌中肌内注射递增剂量的PanAd3/F0ΔTM-N-M2-1来免疫多组Balb/C小鼠。免疫4周之后，处死小鼠并使用来自RSV F蛋白和M蛋白(肽GWYTSVITIELSNIKE(F51至66位氨基酸)、肽KYKNAVTEL(F85至93位氨基酸)和肽SYIGSINNI(M282至290位氨基酸))的作图的免疫显性肽来对脾细胞进行IFNγ-Elispot测定。
如图5所示，针对已知的RSV F蛋白和M蛋白的Balb/C免疫显性表位观察到了强的T细胞应答。
实施例3：由H1p引起的中和抗体的诱导
改造为包含来自H5N1之多碱性氨基酸HA0切割位点的新的嵌合H1p蛋白在转染的HeLa细胞中高效表达并被完全切割。如图7所示，具有野生型切割位点的等同蛋白质H1并未在HeLa细胞中被切割。
为了控制使嵌合H1p蛋白正确地展示在细胞膜上，使用多克隆抗-HA血清进行全细胞FACS结合测定，从而在细胞表面上显示转染蛋白质。如图8所示，H1p与对应的野生型HA蛋白质一样高效地暴露于细胞膜上。
为了测量H1p的免疫效力，用编码经修饰Hip和未经修饰H1(分别为PVJ-H1p和PVJ-H1)的质粒DNA载体免疫Balb/C小鼠。针对经纯化重组HA蛋白(H1N1California2009)，通过ELISA对来自经免疫动物的血清进行分析。由改造的H1p蛋白质引起的抗HA效价出乎意料地高于由具有野生型蛋白酶切割位点的HA引起的那些(图9)。
为了确认和扩展这些结果，在基于细胞培养的测定中，测试来自经H1和H1p免疫之动物的血清的中和以Flu HA蛋白假型的(pseudotyped)逆转录病毒载体的感染的能力。假病毒粒子对单个循环的感染具有感染性，其中它们表达报告基因荧光素酶。图10示出在对MDCK细胞进行的HA(H1N1Mexico2009)假型病毒颗粒感染测定中的血清中和能力。结果确认与由H1蛋白所诱导的相比，由H1p引起的抗体具有更大的中和活性。
实施例4：由包含NP、M1和H1p的多蛋白引起的提高的抗体效价
H1p和NPM1H1p的免疫效力的头对头比较(head to head comparison)显示在三联抗原的情况下表达的HA蛋白与单独HA相比诱导更高的抗体效价。图11示出ELISA测定的结果，其中重组HA(H1N1California2009)包被在96孔板的底部。将用H1p和NPM1H1p免疫的动物之血清的系列稀释物置于板上，并用抗小鼠IgG二抗显示所结合的IgG。如已针对RSV抗原所观察的，内在抗原(NP和M1)与表面暴露的抗原(HA)的共表达提高了针对后一蛋白质的体液应答。
实施例5：包含NP、M1和H1p的新FLU抗原的加工
为了控制疫苗抗原蛋白质的表达和加工，在CMV启动子的调控下，用包含NPM1H1p的表达质粒转染HeLa细胞。在转染48小时后收获细胞。裂解半数细胞用于Western印迹分析(图12)，用市售抗体C179(Okuno Y，JVI1994)(其结合HA蛋白的茎区)孵育另外一半细胞(图13)，并进行FACS分析。总细胞裂解物的Western印迹分析示出特有的70kDa带，其对应于NPM1融合蛋白(图12)。这表明抗原被完全并且正确地从2A切割位点处加工。图13示出随后所释放的H1p蛋白质展示在细胞膜上并且正确折叠，如通过使用与HA茎区结合的构象依赖性抗体C179所检测地。因此，包含NP、M1和H1p的新FLU抗原被正确加工并且所释放的HA蛋白质展示在细胞表面上并被构象抗体所识别。
参考文献
1)Ono & Fteed，(2005)，Adv.Virus Res.，273：5419-5442
2)Collins P et al.，(1996).Parainfluenza viruses，1205-1241.In Fields et al.(ed.)，Fields Virology.Lippincot-Raven Publishers，Philadelphia(PA)USA
3)Shay DK et al.，(1999)，Bronchiolitis-Associated Hospitalizations Among US Children，1980-1996.JAMA282：1440-1446
4)Simoes EA & Carbonell-Estrany X(2003)，Pediatr Infect Dis J22：S13-8；discussion S18-20.
5)Collins PL & Graham BS(2008)，J Vifol82：2040-55
6)Falsey AR et al.，(2005)，N Engl J Med352：1749-59
7)Fleming DM & Elliot AJ(2007)，Eur Respir J30：1029-31
8)Cardenas S et al.，(2005)，Expert Rev Anti Infect Ther3：719-26
9)Kim HW et al.，(1969)，Amer J Epidemiol89：422-434
10)Delgado MF et al.，(2009)，Nat Med15：34-41
11)Graham BS et al.，(1993)，J Immunol151：2032-2040
12)Polack FP et al.，(2002)，J Exp Med196：859-865
13)Castilow EM & Varga SM，(2008)，Future Virol3：445-454
14)Hansen S et al.，(2011)，Nature473：523-527
15)Flatz，L et al.(2010)，Nature Med16：339-345
序列表-自由文本信息
SEQ ID NO：1F蛋白质最小序列
SEQ ID NO：2F0ΔTM
SEQ ID NO：3N蛋白最小序列
SEQ ID NO：4RSV的N蛋白
SEQ ID NO：5RSV的M2-1蛋白
SEQ ID NO：6肽接头
SEQ ID NO：7F0ΔTM-N-M2-1
SEQ ID NO：8HA亚型H1共有序列
SEQ ID NO：9HA亚型H1共有序列经修饰的H0切割位点
SEQ ID NO：10HA亚型H5共有序列
SEQ ID NO：11NP共有序列
SEQ ID NO：12M1共有序列
SEQ ID NO：13NP-M1-HA(氨基酸序列)
SEQ ID NO：14NP-M1-HA(核酸序列)
SEQ ID NO：15H0切割位点序列
SEQ ID NO：16H0切割位点序列
SEQ ID NO：17H0切割位点序列
SEQ ID NO：18H0切割位点序列
SEQ ID NO：19H0切割位点序列
SEQ ID NO：20HA亚型H3毒株A/惠灵顿/01/2004(H3N2)
SEQ ID NO：21HA亚型H3毒株A/惠灵顿/01/2004(H3N2)经修饰的H0切割位点