表达系统.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201180063466.0 (22)申请日 2011.12.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103442731 A (43)申请公布日 2013.12.11 (30)优先权数据 PCT/EP2010/007995 2010.12.30 EP (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2013.06.28 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2011/074307 2011.12.30 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2012/089833 EN

2、 2012.07.05 (73)专利权人 葛兰素史密斯克莱生物公司 地址 比利时里克林萨斯 (72)发明人 亚历山德拉维泰利 阿尔弗雷多尼科西亚 里卡尔多科尔泰塞 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 宋莉 (51)Int.Cl. A61K 39/155(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (56)对比文件 WO 2010/009277 A2,2010.01.21, Mathieu boxus et.al.DNA immunization with plasmids encoding fusion and nucleocapsid protein

3、s of bovine respiratory syncytial virus induces a strong cell mediated immunity and protects calves against challenge. JOURNAL OF VIROLGY .2007,6879-6889. M Connors et.al.Respiratory syncytial virus (RSV) F,G,M2(22K), and N proteins each induce resistance to RSV challenge, but resistance induced by

4、M2 and N proteins is relatively short-lived JOURNAL OF VIROLOGY .1991,1634-1637. 审查员 黄蕊 (54)发明名称 表达系统 (57)摘要 本发明涉及包含编码蛋白质的多核苷酸的 表达系统， 其中所述表达系统包含第一多核苷酸 和第二多核苷酸， 所述第一多核苷酸编码至少一 种诱导T细胞应答的蛋白质、 肽或其变体， 所述第 二多核苷酸编码至少一种诱导抗病原性B细胞应 答的蛋白质、 肽或其变体。 本发明还涉及由所述 表达系统编码的蛋白质混合物和包含所述表达 系统或所述蛋白质混合物的细胞以及包含所述 表达系统或所述蛋白质混合物

5、的药物组合物。 所 述表达系统、 多核苷酸、 蛋白质、 细胞和药物组合 物可用于预防或治疗感染。 本发明还涉及包含编 码经修饰流感血凝素(HA)的多核苷酸、 或者基本 由该多核苷酸组成或者由该多核苷酸组成的核 苷酸构建体。 权利要求书2页 说明书65页 序列表56页 附图6页 CN 103442731 B 2018.02.27 CN 103442731 B 1.表达系统， 其包含腺病毒载体， 所述腺病毒载体包含编码肺炎病毒蛋白的多核苷酸， 其中所述表达系统包含第一多核苷酸， 第二多核苷酸和第三多核苷酸， 所述第一多核苷酸 编码至少一种诱导T细胞应答的蛋白质、 肽或其变体， 所述第二多核苷酸编码

6、至少一种诱导 抗病原性B细胞应答的蛋白质、 肽或其变体， 且所述第三多核苷酸编码诱导T细胞应答的蛋 白质、 肽或其变体， 其中： 所述肺炎病毒是人呼吸道合胞病毒(RSV)； 所述第一多核苷酸编码的诱导T细胞应答的蛋白质、 肽或其变体是RSV的非结构和/或 内部蛋白质， 其选自基质蛋白M和M2； 所述第二多核苷酸编码的诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质、 肽或其变体是RSV的结构 和/或表面蛋白质， 其为融合蛋白质F， 和； 所述第三多核苷酸编码的诱导T细胞应答的蛋白质、 肽或变体是RSV的非结构和/或内 部蛋白质， 其为核蛋白N。 2.权利要求1的表达系统， 其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸

7、相连从而使它 们表达为人工多蛋白。 3.权利要求2的表达系统， 其中编码切割位点的多核苷酸位于所述第一多核苷酸与所 述第二多核苷酸之间。 4.权利要求3的表达系统， 其中所述切割位点是自切割位点或内肽酶切割位点， 所述自 切割位点选自下组： 小核糖核酸病毒、 口疮病毒(aphtoviruses)、 轮状病毒和锥虫的病毒性 2A肽或2A样肽。 5.权利要求3的表达系统， 其中所述切割位点是自切割位点或内肽酶切割位点， 其中所 述自切割位点是昆虫病毒的病毒性2A肽或2A样肽。 6.权利要求4的表达系统， 其中所述自切割位点是口蹄疫病毒的病毒性2A肽。 7.权利要求1-6中任一项的表达系统， 其中编

8、码接头的多核苷酸位于所述第二多核苷 酸与所述第三多核苷酸之间。 8.权利要求7的表达系统， 其中所述接头是柔性接头。 9.权利要求1-6中任一项的表达系统， 其中所述病毒载体选自： PanAd1、 PanAd2、 PanAd3、 ChAd55、 ChAd73、 ChAd83、 ChAd146、 ChAd147、 ChAd3、 ChAd4、 ChAd5、 ChAd6、 ChAd7、 ChAd8、 ChAd9、 ChAd10、 ChAd11、 ChAd16、 ChAd17、 ChAd19、 ChAd20、 ChAd22、 ChAd24、 ChAd26、 ChAd30、 ChAd31、 ChAd37

9、、 ChAd38、 ChAd44、 ChAd63和ChAd82。 10.权利要求7的表达系统， 其中所述病毒载体选自： PanAd1、 PanAd2、 PanAd3、 ChAd55、 ChAd73、 ChAd83、 ChAd146、 ChAd147、 ChAd3、 ChAd4、 ChAd5、 ChAd6、 ChAd7、 ChAd8、 ChAd9、 ChAd10、 ChAd11、 ChAd16、 ChAd17、 ChAd19、 ChAd20、 ChAd22、 ChAd24、 ChAd26、 ChAd30、 ChAd31、 ChAd37、 ChAd38、 ChAd44、 ChAd63和ChAd82

10、。 11.组合物， 其包含根据权利要求1-6中任一项所述的表达系统。 12.组合物， 其包含根据权利要求7的表达系统。 13.组合物， 其包含根据权利要求8的表达系统。 14.根据权利要求1-6中任一项所述的表达系统， 或权利要求11的组合物在制备用于治 疗或预防由RSV感染所致的疾病的药物中的用途。 15.根据权利要求10的表达系统， 或权利要求13的组合物在制备用于治疗或预防由RSV 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 103442731 B 2 感染所致的疾病的药物中的用途。 16.多核苷酸， 其包含权利要求1的所述第一、 第二和第三多核苷酸， 如SEQ ID NO:7中 所示。

11、权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 103442731 B 3 表达系统 技术领域 0001 本发明涉及包含编码蛋白质的多核苷酸的表达系统， 其中所述表达系统包含第一 多核苷酸和第二多核苷酸， 所述第一多核苷酸编码至少一种诱导T细胞应答的蛋白质、 肽或 其变体， 所述第二多核苷酸编码至少一种诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质、 肽或其变体。 本发明还涉及由所述表达系统编码的蛋白质混合物和包含所述表达系统或所述蛋白质混 合物的细胞以及包含所述表达系统或所述蛋白质混合物的药物组合物。 所述表达系统、 多 核苷酸、 蛋白质、 细胞和药物组合物可用于预防或治疗感染。 本发明还涉及编码经修饰流感 血凝

12、素(HA)的核苷酸构建体和表达系统。 背景技术 0002 感染性疾病仍然是人类的主要威胁。 预防或治疗感染性疾病的一种方法是通过疫 苗接种人工诱导免疫应答， 所述疫苗接种是向个体施用抗原性材料使得产生对抗各抗原的 适应性免疫应答。 所述抗原性材料可以是结构完整但灭活(即， 非感染性)或减毒(即， 感染 性降低)的病原体(例如， 微生物或病毒)或者已被发现具有高免疫原性的病原体之纯化组 分。 诱导对抗病原体之免疫应答的另一方法是提供包含一种或更多种编码病原体之免疫原 性蛋白质或肽之载体的表达系统。 这样的载体可以是裸质粒DNA形式， 或者通过使用病毒载 体(例如基于经修饰痘苗病毒(例如， 经修饰

13、安卡拉痘苗病毒； MVA)或腺病毒载体来递送免 疫原性蛋白质或肽。 这样的表达系统的优点是包含良好表征的对环境条件具有低敏感性的 组分。 0003 在开发基于载体的表达系统时， 一个特定目的是向患者应用这些表达系统以引发 防御由各病原体引起之感染的免疫应答。 但是， 虽然诱导了对抗病原体的免疫原性应答， 一 些表达系统不能引发足够强从而完全防御由病原体所致感染的免疫应答。 因此， 仍然需要 能够诱导对抗病原体(例如感染剂例如病毒)的保护性免疫应答的表达系统。 0004 病毒 0005 病毒是这样的一组病原体/感染剂： 其没有自身代谢机制并且可以被认为是各宿 主细胞的专性内寄生物， 其使用宿主细

14、胞装备(facilities)的至少一部分来进行病毒蛋白 质表达和病毒复制。 可以基于构成病毒基因组的核酸的类型(DNA/RNA)、 链(单链(ss)或双 链(ds)、 意义(sense)(负义或正义)及其复制来对病毒进行分类(Baltimore分类)。 因此， 病毒一般分为DNA病毒和RNA病毒。 病毒可进一步分为单链(ss)或双链(ds)DNA或RNA病毒， 其基因组是单链核酸或双链核酸。 一些病毒具有一部分是双链、 一部分是单链的基因组(例 如， 嗜肝DNA病毒)。 基因组的方向或 “意义” 和/或在制备用于预防或治疗病原体的药物和/ 或用于预防或治疗病原体的方法中， 其中病原体在病毒的

15、病毒生命周期中(特别是在ssRNA 病毒或ssDNA病毒的生命周期中)起重要作用。 正义ssRNA(+)基因组与细胞mRNA具有相同的 方向， 并且可以直接翻译为病毒蛋白质。 在具有负义单链RNA基因组(ssRNA(-)的病毒的生 命周期中， 基因组序列有必要转录为可以被宿主细胞翻译为病毒蛋白质的正义mRNA。 将包 含正义和负义二者的单链基因组称为 “双义” (例如， ssRNA(+/-)、 ssDNA(+/-)。 说 明 书 1/65 页 4 CN 103442731 B 4 0006 虽然病毒的基因组可以相当大(例如， 在DNA病毒的情况下)， 但是， 特别地， 小RNA 病毒进化发展出

16、了以非常高效的方式表达其基因产物(例如， 蛋白质和肽)的策略。 这些策 略之一是表达由病毒基因组编码的一种或更多种多蛋白(polyprotein)， 所述多蛋白共翻 译加工为或在翻译后加工为单一蛋白质和/或肽。 该策略例如被一些具有正义基因组的双 链(ds)RNA病毒或单链(ss)RNA病毒适应性改变。“包膜病毒” (例如正粘病毒、 副粘病毒、 逆 转录病毒、 黄病毒、 弹状病毒和甲病毒)被来源于宿主质膜的脂质双层包围(1)。 0007 附着糖蛋白见于所有包膜病毒中并且通过其与宿主细胞质膜上的蛋白质或其它 分子的碳水化合物部分或细胞粘附结构域结合来介导病毒包膜与宿主细胞质膜之间最初 的相互作用

17、。 因而， 附着糖蛋白在病毒与宿主细胞膜之间的间隙处形成桥。 命名为 “H” 的附 着糖蛋白具有血凝素活性， 命名为 “HN” 的糖蛋白具有血凝素活性和神经氨酸酶活性。 当附 着糖蛋白既不具有血凝素活性也不具有神经氨酸酶活性时， 将其命名为 “G” 。 0008 副粘病毒 0009 副粘病毒是一个动物病毒家族， 其包含单链非区段化负义RNA。 副粘病毒导致多种 动物疾病和人疾病。 副粘病毒的RNA基因组长度为15至19千碱基(kb)， 并且编码6至10个基 因。 各基因在起始和结束处包含转录起始/终止信号， 它们被转录为基因的一部分。 由于称 为 “转录极性” 的现象(其中最接近基因组3 端的

18、基因与接近5 端的那些相比以更大的量转 录)， 副粘病毒的基因序列是保守的。 各基因被转录之后， 当RNA依赖性RNA聚合酶遇到基因 间序列时， 其暂停从而释放新的mRNA。 当RNA聚合酶暂停时， 其可能从RNA基因组解离。 如果 其解离， 则其必须在前导序列处再进入基因组， 而非继续转录基因组长度。 因此， 从前导序 列越下游的基因， 它们被RNA聚合酶转录得越少。 副粘病毒的基因以成功感染所需的蛋白质 的相对顺序排列。 保守的基因顺序是核壳体-磷蛋白-基质-融合蛋白(Fusion)-附着蛋白 (Attachment)-大(聚合酶)。 0010 许多副粘蛋白基因组遵循所谓 “六倍规则” 。

19、 根据该规则， 基因组的总长度几乎总 是六的倍数。 但是， 亚家族肺病毒亚科的成员包括呼吸道合胞病毒(RSV)不遵循该规则。 0011 呼吸道合胞病毒(RSV) 0012 在世界范围内， 名为呼吸道合胞病毒(RSV)的包膜病毒是婴儿和儿童病毒性下呼 吸道疾病(LRTI)的最重要的原因(2)。 在美国， 估计每年有70,000至126,000名婴儿因RSV肺 炎或细支气管炎住院， 并且细支气管炎的住院率从1980年开始升高(3)。 儿童在2岁前受到 感染， 并且WHO估计每年RSV在约6400万儿童中引起疾病并造成160,000例死亡。 在工业化国 家， 就儿童的呼吸道疾病而言， RSV导致至少

20、50的住院， 并且儿童中所有RSV感染的多达 6导致住院(4)。 RSV感染不激发持续性的免疫力， 因此人宿主经受终生的感染和再感染循 环。 虽然在传统上认为RSV是儿科病原体， 但是RSV也在年长者和免疫受损的个体中引起严 重疾病(5)。 年长者中RSV疾病的负担与季节性流感的负担相当， 并且估计成人中RSV相关疾 病的经济影响大于流感， 这与缺勤天数相关(6， 7)。 单克隆抗体预防在将具有重病高风险的 婴儿的RSV住院率降低50方面有效(8)。 但是， 目前没有有效的RSV疫苗或抗病毒疗法。 0013 在二十世纪六十年代， 经福尔马林灭活的(formalin-inactivated， F

21、I)RSV疫苗对 婴儿的灾难性作用阻碍了疫苗开发。 该疫苗无法防御RSV感染并且诱导加重的呼吸道疾病 (9)， 其导致诱导高效价、 弱中和、 低亲和力的抗体， 缺乏CD8+T细胞引发并且诱导偏向Th2的 免疫应答(10、 11和12)。 有证据表明RSV削弱充分的适应性T细胞免疫应答的诱导(13)。 说 明 书 2/65 页 5 CN 103442731 B 5 0014 因此， 非常需要不仅保护婴儿还增强年长者中免疫力并且在作为婴儿RSV感染之 主要来源的兄弟姐妹和成人中减少RSV传播的有效疫苗。 尤其期望能够在尚未感染RSV的个 体(婴儿)中诱导中和抗体应答和强效且广泛之T细胞应答以引发T

22、细胞应答或者在需要将 记忆应答 “重置” 为较高水平的个体(年长者)中加强预先存在的T细胞应答的RSV疫苗。 0015 正粘病毒 0016 正粘病毒是一个RNA病毒家族， 其包括5个属： A型流感病毒属、 B型流感病毒属、 C型 流感病毒属、 传染性鲑鱼贫血症病毒属(Isavirus)和索戈托病毒属(Thogotovirus)。 最近 描述了第六个属。 前三个属包含在脊椎动物(包括鸟、 人和另一些哺乳动物)中导致流感的 病毒。 这3个流感病毒属的核蛋白和基质蛋白具有抗原性差异。 A型流感病毒感染人、 另一些 哺乳动物和鸟， 并导致了所有的流感大流行。 B型流感病毒感染人和海豹。 C型流感病毒感

23、染 人和猪。 0017 正粘病毒家族的病毒包含6至8个区段的线性负义单链RNA。 总基因组长度为12000 至15000个核苷酸(nt)。 最大的区段为2300至2500nt； 第二大区段为2300至2500nt； 第三大 区段为2200至2300nt； 第四大区段为1700至1800nt； 第五大区段为1500至1600nt； 第六大区 段为1400至1500nt； 第七大区段为1000至1100nt； 第八大区段为800至900nt。 基因组序列具 有在两端重复的末端重复序列。 5 端的末端重复长度为12至13个核苷酸。 相同家族的属中 3 端的核苷酸序列相同， 主要针对RNA(区段)或针

24、对所有RNA种类。 3 端的末端重复序列长 度为9至11个核苷酸。 0018 流感病毒是最重要的呼吸道病原体之一。 仅在美国， 每年流感感染就造成20,000 至40,000例死亡和100,000例住院(1)。 流感感染之后， 婴儿、 年长者和具有受损心脏、 肺部 或免疫系统的个体有相当大的产生严重并发症的风险。 0019 在预防疾病方面， 免疫被证实是最有效的措施。 所有现有流感疫苗的共同特征之 一在于主要靶向诱导直接抗主要病毒包膜蛋白血凝素(HA)的中和抗体。 0020 发明概述 0021 在第一方面， 本发明提供了包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的表达系统， 所述 第一多核苷酸编码至少一种

25、诱导T细胞应答的蛋白质、 肽或其变体， 所述第二多核苷酸编码 至少一种诱导抗病原性B细胞应答的蛋白质、 肽或其变体。 0022 在第二方面， 本发明提供了由所述第一方面的表达系统编码的分离的蛋白质混合 物。 0023 在第三方面， 本发明提供了包含所述第一方面之表达系统和/或所述第二方面之 蛋白质混合物的分离的宿主细胞。 0024 在第四方面， 本发明提供了包含所述第一方面之表达系统或所述第二方面之蛋白 质混合物以及可药用载体和/或赋形剂的组合物。 0025 在第五方面， 本发明提供了所述第一方面的表达系统、 所述第二方面的蛋白质混 合物、 所述第三方面的细胞和所述第四方面的组合物， 其用于特

26、别是治疗或预防感染性疾 病(优选病毒性疾病)的药物。 0026 在第六方面， 本发明提供了治疗或预防病毒性疾病的方法， 其包括施用有效量的 所述第一方面的表达系统、 所述第二方面的蛋白质混合物、 所述第三方面的细胞和所述第 四方面的组合物。 说 明 书 3/65 页 6 CN 103442731 B 6 0027 在第七方面， 本发明提供了增强免疫应答的方法， 其包括施用所述第一方面的表 达系统、 所述第二方面的蛋白质混合物、 所述第三方面的细胞以及所述第四方面的组合物。 0028 在第八方面， 本发明提供了编码流感血凝素(HA)的核苷酸构建体、 包含这些核苷 酸构建体的表达系统， 和由该核酸

27、构建体或表达系统编码的蛋白质或多蛋白， 其中HA0切割 位点具有多碱性氨基酸序列(multibasic sequence)。 0029 在第九方面， 本发明提供了多碱性氨基酸HA0切割位点在构建能够在体外和/或体 内表达流感血凝素(HA)的表达系统中的用途。 0030 在第十方面， 本发明提供了由第八方面之表达系统编码的分离的蛋白质混合物。 0031 在第十一方面， 本发明提供了包含第八方面之核苷酸构建体、 表达系统或蛋白质 或多蛋白和/或第十方面之蛋白质混合物的分离的宿主细胞。 0032 在第十二方面， 本发明提供了包含第八方面之核苷酸构建体、 表达系统或蛋白质 或多蛋白或者第十方面之蛋白质

28、混合物以及可药用载体和/或赋形剂的组合物。 0033 在第十三方面， 本发明提供了第八方面的核苷酸构建体、 表达系统或蛋白质或多 蛋白、 第十方面的蛋白质混合物、 第十一方面的细胞和第十二方面的组合物， 其用于特别是 治疗或预防流感病毒感染的药物。 0034 在第十四方面， 本发明提供了治疗或预防流感病毒感染的方法， 其包括施用有效 量的第八方面之核苷酸构建体、 表达系统或蛋白质或多蛋白、 第十方面之蛋白质混合物、 第 十一方面之细胞和第十二方面之组合物。 0035 在第十五方面， 本发明提供了增强免疫应答的方法， 其包括施用第八方面的核苷 酸构建体、 表达系统或蛋白质或多蛋白、 第十方面的蛋

29、白质混合物、 第十一方面的细胞和第 十二方面的组合物。 0036 上述概述不必然描述本发明的所有方面。 0037 附图简述 0038 图1： RSV疫苗多蛋白的示意图。 conF0F蛋白的共有序列， 2A口蹄疫病毒的翻译 切割位点， conNN蛋白的共有序列， conM2-1M2-1蛋白的共有序列。 0039 图2： 疫苗抗原F0TM-N-M2-1在哺乳动物细胞中高效加工。 HeLa细胞裂解物的 Western印迹分析； nt： 未被转染的HeLa。 RSV transf： 经F0TM-N-M2-1转染的HeLa细胞。 RSV inf： 用RSV株A感染的Hep2细胞。 0040 图3： 所分

30、泌的F蛋白质形成同三聚体。 经转染HeLa细胞上清液的Western印迹分 析； RSV： 经F0TM-N-M2-1转染， F0： 经F0TM转染， 对照： 经空质粒转染。 0041 图4： 与单独的F蛋白相比， 由疫苗多蛋白表达的F蛋白是更好的免疫原。 A.用 PanAd3/F0TM-N-M2-1感染的HeLa细胞上清液的Western印迹分析， 其使用来自用F0TM 或F0TM-N-M2-1免疫之小鼠的不同稀释度的血清来进行探测。 B.图A的Western印迹的光 密度扫描。 数据表示为对应于蛋白质条带的面积的相对强度。 0042 图5： 通过单次肌内注射， RSV疫苗在小鼠中诱导强效的全

31、身性T细胞免疫。 使用RSV F蛋白和M蛋白的作图免疫显性肽进行PanAd3/F0ATM-N-M2-1免疫的Balb/C小鼠脾细胞的 IFNg-Elispot测定。 0043 图6： 流感疫苗多蛋白的示意图。 NPNP蛋白的共有序列， M1M1蛋白的共有序列， 2A口蹄疫病毒的翻译切割位点， H1pH1N12009的HA蛋白的共有序列。 说 明 书 4/65 页 7 CN 103442731 B 7 0044 图7： 经转染的HeLa细胞中H1p表达的Western印迹分析。 用PVJ-H1p转染(泳道1)、 用PVJ-H1转染(泳道2)和未经转染CTR(泳道3)的HeLa细胞的总裂解物。 箭

32、头显示对应于未 切割(70kD)HA0形式和经切割(28Kd)HA2的条带。 多克隆抗HA血清识别HA2蛋白片段中的表 位。 示出H1p蛋白被完全加工。 0045 图8： 膜展示的HA蛋白的全细胞FACS分析。 直方图代表用野生型HA(右上图)和H1 (右下图)转染的HeLa细胞的中值荧光分析。 用针对H1p产生的超免疫小鼠多克隆血清孵育 细胞， 然后用缀合有PE的抗小鼠二抗孵育。 在左上图和左下图中， 用小鼠免疫前血清孵育细 胞以设置背景荧光水平。 0046 图9： H1p能够诱导较高的抗体效价。 针对经包被之重组HA(H1N1California2009) 进行ELISA测定。 针对用H1

33、和H1p免疫的动物之血清来测量抗体效价。 通过血清的系列稀释 来计算效价， 并示出与背景相比高出三倍的OD值的稀释度。 0047 图10： MDCK细胞的HA(H1N1Mexico2009)假型病毒感染更强效地被用H1p免疫之动 物 的 血 清 中 和 。 用H 1 p 和 N P M 1 H 1 p 免 疫 之 动 物 的 血 清 针 对 经 包 被 之 重 组 H A (H1N1California2009)的ELISA测定结果。 0048 图11： 在三联抗原的情形下表达的H1p能够诱导更高的抗体效价。 针对经包被之重 组HA(H1N1California2009)的ELISA测定。 针

34、对用H1p和NPM1H1p免疫之动物的血清测量抗 体效价。 通过血清的系列稀释来计算效价， 并示出与背景相比高出三倍的OD值的稀释度。 0049 图12： 在经转染的HeLa细胞中， NPM1H1p抗原表达的Western印迹分析显示该蛋白 质被完全加工。 用pNEB-NPM1H1p转染(泳道1)、 用pNEB-NPM1转染(泳道2)和模拟转染(泳道 3)的HeLa细胞的总裂解物。 箭头显示对应于融合蛋白NPM1(70kD)的条带。 使用抗-NP单克隆 抗体来检测胞内蛋白质。 0050 图13： 从NPM1H1p加工得到的H1p展示在细胞膜上并且正确折叠。 模拟转染(左图) 或用NPM1H1p

35、转染(右图)的HeLa细胞的全细胞FACS分析。 用与HA茎区(stem region)中的构 象表位结合的小鼠mAb C179孵育细胞， 然后用缀合有PE的抗小鼠二抗孵育。 0051 发明详述 0052 在下文中详细描述本发明之前， 应理解， 本发明不限于本文所述的特定方法、 方案 和试剂， 因为它们可以改变。 还应理解， 本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目 的， 而不旨在限制本发明的范围， 本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。 除非另有限 定， 否则本文所使用的全部科技术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相 同。 0053 优选地， 本文所使用的术语如 A multil

36、ingual glossary of biotechnological terms： (IUPAC Recommendations) ， Leuenberger， H.G.W， Nagel， B.和H.编辑 (1995)， Helvetica Chimica Acta， CH-4010Basel， Switzerland中所述的定义。 0054 在本说明书通篇中引用了若干文献。 本文所引用文献(包括全部专利、 专利申请、 科学出版物、 制造商的说明书、 说明、 GenBank登记号序列提交等)的每一篇， 无论在上文或 下文中， 均通过引用整体并入本文。 这不应解释为承认本发明无权作为在先发明而

37、先于这 些公开内容。 0055 定义 0056 在本说明书和所附权利要求书通篇中， 除非上下文另有需要， 否则词语 “包括” 以 说 明 书 5/65 页 8 CN 103442731 B 8 及其变化形式例如 “包含” 和 “含有” 应理解为意在囊括所指出整数或步骤或者整数组或步 骤组， 但是不排除任何其他整数或步骤或者整数组或步骤组。 0057 缩略语 “F” 或 “F0” 在本文中可互换使用， 是指副粘病毒(优选RSV)的融合蛋白。 0058 缩略语 “G” 是指副粘病毒(优选肺病毒亚科， 更优选RSV)的糖蛋白。 0059 缩略语 “H” 是指副粘病毒(优选麻疹病毒)的血凝素蛋白。 0

38、060 缩略语 “HN” 是指副粘病毒(特别是呼吸道病毒属、 禽腮腺炎病毒属(Avulavirus) 和腮腺炎病毒属(Rubulavirus)的血凝素-神经氨酸酶蛋白。 0061 缩略语 “N” 是指副粘病毒(优选RSV)的核壳体蛋白。 0062 缩略语 “M” 是指副粘病毒(优选RSV)的糖基化基质蛋白。 0063 就副粘病毒而言， 缩略语 “M2” 或 “M2-1” 是指副粘病毒(优选RSV)的非糖基化基质 蛋白。 0064 缩略语 “P” 是指副粘病毒(优选RSV)的磷蛋白。 0065 就副粘病毒而言， 缩略语 “NS1” 和 “NS2” 是指副粘病毒(优选RSV)的非结构蛋白1和 2。

39、 0066 缩略语 “L” 是指副粘病毒(优选RSV)的聚合酶的催化亚基。 0067 缩略语 “HA” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的血凝素。 0068 缩略语 “HA0” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的血凝素亚基 HA1和HA2的前体蛋白。 0069 缩略语 “H1p” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的经修饰血凝 素。 0070 缩略语 “NA” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的神经氨酸酶。 0071 缩略语 “NP” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的核蛋白。 0072 缩略语

40、“M1” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的基质蛋白1。 0073 就正粘病毒而言， 缩略语 “M2” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病 毒)的基质蛋白M2。 0074 就正粘病毒而言， 缩略语 “NS1” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病 毒)的非结构蛋白1。 0075 缩略语 “NS2/NEP” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的非结构 蛋白2(也称为NEP， 核输出蛋白质)。 0076 缩略语 “PA” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的聚合酶亚基 蛋白。 0077 缩略语 “PB1” 是指正粘病

41、毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的聚合酶亚基 蛋白。 0078 缩略语 “PB2” 是指正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病毒)的聚合酶亚基 蛋白。 0079 缩略语 “PB1-F2” 或 “PB1F2” 是指由正粘病毒(优选流感病毒属， 更优选A型流感病 毒)的PB1基因区段中的交替读码框编码的蛋白质。 0080 本文所使用的术语 “表达系统” 是指设计用于产生一种或更多种目的基因产物的 系统。 通常而言， 这样的系统是 “人工” 设计的， 即， 通过可用于体外在无细胞系统中或体内 说 明 书 6/65 页 9 CN 103442731 B 9 在基于细胞的系统中产生目的基

42、因产物的基因技术手段。 应理解， 本发明的表达系统不涵 盖天然表达系统(例如天然病毒)。 0081 “目的基因产物” 通常指大分子， 例如但不限于RNA、 肽、 多肽或蛋白质、 或其区段、 表位或片段。 0082 在一个表达系统中， 目的基因产物由一个或更多个核酸分子编码。 将核酸分子理 解为由核苷酸单体产生的多聚大分子。 核苷酸单体包含核碱基、 五碳糖(例如但不限于核糖 或2 -脱氧核糖)和1至3个磷酸基团。 通常而言， 多核苷酸是通过各核苷酸单体之间的磷酸 二酯键形成的。 在本发明的上下文中提及核酸分子包括但不限于核糖核酸(RNA)和脱氧核 糖核酸(DNA)。 术语 “多核苷酸” 和 “核

43、酸” 在本文中可互换使用。 0083 在无细胞表达系统中， 将分离的多核苷酸用作体外翻译反应的模板。 在基于细胞 的表达系统中， 多核苷酸包含在一个或更多个载体上。 本文所使用的术语 “载体” 指能够被 引入细胞或者将包含于其中的蛋白质和/或核酸引入细胞的蛋白质或多核苷酸或其混合 物。 在本发明的上下文中， 优选由所引入的多核苷酸编码的目的基因基于载体的引入而在 细胞中表达。 合适的载体的实例包括但不限于质粒、 粘粒、 噬菌体、 病毒或人工染色体。 0084 短语 “T细胞应答的诱导” 指病毒特异性CD4+或CD8+T细胞的产生或再刺激。 本发明 的表达系统可诱导或再刺激T细胞介导的、 针对存

44、在于由多核苷酸表达的病毒性蛋白质中 的I类或II类MHC表位的适应性应答。 可以通过本领域中已知的方法来测量这样的T细胞应 答， 优选地通过用覆盖整个病毒蛋白质的合成肽来离体再刺激T细胞并且分析增殖或干扰 素-产生。 0085 短语 “B细胞应答的诱导” 指产生IgG或IgA类免疫球蛋白的病毒特异性B细胞的产 生或再刺激。 本发明的表达系统可诱导或再刺激B细胞产生特异性针对由多核苷酸表达的 病原性(例如， 病毒性)抗原的抗体。 可以用血清或粘膜免疫球蛋白的合成抗原通过ELISA (酶联免疫染色测定)测定来测量这样的B细胞应答。 或者， 可以通过病毒中和测定来测量所 诱导的抗体效价。 0086

45、短语 “抗病原性B细胞应答的诱导” 指产生IgG或IgA类免疫球蛋白的病毒特异性B 细胞的产生或再刺激， 其失活、 清除、 阻断和/或中和各病原体使得由该病原体引起的疾病 不发作和/或症状得到缓解。 这也称为针对病原体的 “保护性免疫应答” 。 本发明的表达系统 可诱导或再刺激B细胞产生特异性针对由多核苷酸表达的病原性(例如病毒性)抗原的抗 体。 可以用血清或粘膜免疫球蛋白的合成抗原通过ELISA(酶联免疫染色测定)测定来测量 这样的B细胞应答。 或者， 可以通过病毒中和测定来测量所诱导的抗体效价。 0087 短语 “增强免疫应答” 指加强或强化对抗免疫原(优选病原体， 更优选病毒)的体液 免

46、疫应答和/或细胞免疫应答。 可以通过使用本文所述的测试和/或在本技术领域中公知的 测试将由本发明表达系统引发的免疫应答与单独表达相同抗原/免疫原之表达系统的免疫 应答进行比较来测量免疫应答的增强。 0088 在一个表达系统中， 目的基因可以由单个多核苷酸编码或者由若干分别的多核苷 酸编码。 在基于细胞的表达系统中， 一个或更多个多核苷酸可以包含在一个或若干个分别 的载体上。 这些多核苷酸均可编码目的基因产物的全部或一部分。 0089 此外， 表达系统可包含调节目的基因表达的 “表达调控序列” 。 通常而言， 表达调控 序列是多肽或多核苷酸， 例如但不限于启动子、 增强子、 沉默子、 绝缘子或阻

47、抑子。 说 明 书 7/65 页 10 CN 103442731 B 10 0090 因此， 包含一个或更多个编码一种或更多种目的基因产物的多核苷酸的载体还可 包含表达调控序列。 对于包含多于一个编码一种或更多种目的基因产物之多核苷酸的载 体， 可通过一个或更多个表达调控序列一起或分别调控表达。 更特别地， 包含于载体上的各 多核苷酸可以由分别的表达调控序列调控， 或者包含在载体上的所有多核苷酸可以由单个 表达调控序列调控。 由单个表达调控序列调控的包含在单个载体上的多核苷酸优选地形成 开放读码框。 0091 术语 “表达系统” 还涵盖目的基因产物的表达， 包括多核苷酸的转录、 RNA剪接、

48、翻 译为多肽以及多肽或蛋白质的翻译后修饰。 0092 术语 “开放读码框” (open reading frame， ORF)指可以被翻译为氨基酸的核苷酸 序列。 通常而言， 这样的ORF包含起始密码子、 长度通常为3个核苷酸倍数的后续区， 但在给 定读码框中不包含终止密码子(TAG、 TAA、 TGA、 UAG、 UAA或UGA)。 通常而言， ORF天然形成或者 由人工构建(即， 通过基因技术手段来实现)。 ORF编码蛋白质， 其中可以翻译为该蛋白质的 氨基酸形成肽连接链。 0093 术语 “蛋白质” 、“多肽” 和 “肽” 在本文中可互换使用， 并且指氨基酸的任何肽连接 链， 无论长度或

49、有否翻译后修饰。 0094 本文所使用的术语 “翻译后” 指在核苷酸三联体翻译为氨基酸并且与序列中前一 氨基酸形成肽键之后发生的事件。 这样的翻译后事件可以在完整多肽形成之后发生或者在 已被翻译的多肽的那些部分的翻译过程中发生。 翻译后事件通常改变或修饰所得多肽的化 学特性或结构特性。 翻译后事件的实例包括但不限于例如氨基酸的糖基化或磷酸化或者肽 链的切割(例如通过内肽酶来实现)等事件。 0095 本文所使用的术语 “共翻译” 指在核苷酸三联体翻译为氨基酸链的过程中发生的 事件。 这些事件通常改变或修饰所得氨基酸链的化学特性或结构特性。 共翻译事件的实例 包括但不限于可彻底终止翻译过程或者干扰肽键形成从而产生两种分别的翻译产物的事 件。 0096 本文所使用的术语 “多蛋白” 或 “人工多