一种具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽及其制备方法和 应用 技术领域 本发明涉及四角蛤蜊， 具体涉及四角蛤蜊蛋白质水解得到的具有抗氧化活性的多 肽及其制备方法和应用。
背景技术 四角蛤蜊， 又叫方形马珂蛤、 白蛤或四角蛤， 俗称白蚬子、 泥蚬子、 布鸽头， 属于软 体动物门， 瓣鳃纲， 真瓣鳃目， 蛤蜊科。贝壳略呈四角形， 两壳相等， 侧膨胀， 壳面光滑呈白 色。斧足发达， 无足丝， 生活于浅海泥沙中， 是一种常见的海生贝类软体动物， 广泛分布于 我国南北沿海海域。江苏沿海多滩涂， 四角蛤蜊为优势贝类， 已实现了大规模人工养殖， 产 量高达 80000 吨 / 年。四角蛤蜊是一种重要的食用经济贝类， 其软体肉嫩鲜美， 营养丰富， 内含蛋白质， 脂肪， 碳水化合物， 钙、 铁、 磷及多种维生素。 四角蛤蜊不仅可以食用， 还具有药 用、 保健价值。传统中医理论认为蛤蜊味咸、 性寒、 无毒， 归胃、 肝、 膀胱经， 有多种的主治功 能。关于四角蛤蜊的研究主要集中于食品加工、 增养殖、 种属界定等方面。国内外针对四角 蛤蜊的开发应用多见以软体为原料加工罐头、 调味品、 饲料添加剂等， 而以药效功能为目标 的四角蛤蜊的医药、 保健品研究开发较少。四角蛤蜊活性物质研究多集中在小分子化学成 分 ( 如牛磺酸和 EPA)， 对其生物活性大分子物质， 诸如蛋白质和多糖的研究报道较少。
生物体内正常有氧代谢过程中会形成许多活性氧物质， 包括超氧阴离子自由基、 羟基自由基、 脂氧自由基、 过氧化氢等 ； 另外， 生物体也可经过传染、 离子辐射、 空气污染等 外源性侵入而产生活性氧。 体内活性氧自由基具有一定的功能， 如免疫和信号传导过程。 但 过多的活性氧自由基就会有破坏行为， 具有未成对电子的自由基可以引发细胞膜上的不饱 和脂肪酸脂质过氧化反应并与膜上的酵素结合， 导致细胞膜的完整性被破坏， 改变结构以 及通透性 ； 另外， 自由基同样可以和细胞内的蛋白质反应导致蛋白质变性， 进而使细胞内正 常功能无法进行， 并且自由基还会攻击 DNA 分子， 造成基因突变。大量研究已经证明， 老化 以及老化相关的疾病如癌症、 心血管、 自身免疫性疾病以及关节炎等的发生机理与体内自 由基产生过多或清除自由基能力下降有着密切的关系。因此充分利用四角蛤蜊资源， 将作 为主要成分的四角蛤蜊蛋白质， 利用酶解工艺对其进行加工， 然后制成具有抗氧化功能活 性且易于人体吸收的蛋白多肽具有重要意义。
发明内容 ：
发明目的 ： 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种抗氧化 功能好， 人体易吸收的四角蛤蜊蛋白多肽， 本发明另一个目的是提供该四角蛤蜊蛋白多肽 的制备方法和其应用。
技术方案 ： 为了实现以上目的， 本发明所采取的技术方案为 ：
一种具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽， 它是通过以下方法制备得到的 ： 首先 取四角蛤蜊软体洗净搅碎匀浆， 加入相当匀浆液重量 0.05％～ 0.5％的胰蛋白酶， 在 pH7.5至 8.5， 温度 45 ～ 55℃条件下酶解反应 30 至 90 分钟， 然后在 90 ～ 100℃水浴灭活酶 10 分 钟， 离心， 取上清液进行超滤， 截留分子量为 10 ～ 50kDa 的超滤液， 减压浓缩， 喷雾干燥得四 角蛤蜊蛋白多肽。
本发明提供的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制备方法， 具体包括以下步 骤：
首先取四角蛤蜊软体洗净， 搅碎匀浆， 得匀浆液， 加入相当匀浆液重量 0.05 ％～ 0.5％的胰蛋白酶， 在 pH7.5 至 8.5， 温度 45 ～ 55℃条件下酶解反应 30 至 90 分钟， 然后在 90 ～ 100℃水浴灭酶 10 分钟， 离心， 取上清液进行超滤， 截留分子量为 10 ～ 50kDa 的超滤 液， 超滤液减压浓缩即得四角蛤蜊蛋白多肽。
作为优选方案， 以上所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制备方法， 所 述的胰蛋白酶的加入量为四角蛤蜊匀浆液重量的 0.25％～ 0.5％。
作为其它优选方案， 以上所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制备方 法， 其中酶解反应的 pH 值为 8.5。
作为其它优选方案， 以上所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制备方 法， 其中酶解反应的温度为 45 度， 酶解反应的时间为 70 ～ 90 分钟。 作为优选方案， 所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽的制备方法， 其中酶 解液离心所得上清液进行超滤， 截留得到分子量为 10 ～ 30kDa 的超滤液， 即得四角蛤蜊蛋 白多肽。
为充分研究四角蛤蜊蛋白多肽的制备方法， 本发明经过以下实验筛选 ：
一、 蛋白水解酶的筛选实验
1.1 实验材料
四角蛤蜊 ： 采集于南通茅家港 ( 江苏省海洋与水产研究所提供 )。
1.2 主要试剂
供筛选的酶包括 ： 胃蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 胰蛋白酶， 购自于国药集团化学试剂有 限公司 ； 中性蛋白酶 ： 南京奥多福尼生物科技有限公司 ； Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 ： 美国 Thermo 公司 ； 二苯代苦味酰肼 (DPPH) ： Alfa 公司 ；
1.3 主要仪器与设备
BP 211D 电子天平 ： 德国 Sartorious 公司 ； Rotavapor R-210 旋转蒸发仪 ： 德国 BUCHI 公司 ； Spectra Max 190 酶标仪 ： 美国 AD 公司 ； 中空纤维膜 ( 截留分子量 10， 20， 50kDa) ： 天津爱生膜过滤技术有限公司 ； JJ-2 型组织捣碎匀浆机 ： 江苏省金坛市荣光仪器 制造公司 ； Avanti J-25 高速冷冻离心机 ： 德国 Backman 公司 ； DW-1 增力无极恒速搅拌器 ： 南京科尔仪器设备有限公司。
2. 方法
2.1 四角蛤蜊酶解液制备
四角蛤蜊软体洗净搅碎匀浆， 加入 3 倍重量的水配成混悬液， 再分别加入酶活力 单位为 500IU 的 4 种水解酶 ( 胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶和胃蛋白酶 )， 加酶量为匀 浆液重量的 0.2％， 在各自标注最佳条件 ( 胰蛋白酶 ： 50℃， pH ＝ 8.0 ； 木瓜蛋白酶 ： 55℃， pH ＝ 5.5 ； 中性蛋白酶 ： 50℃， pH ＝ 7.0 ； 胃蛋白酶 ： 37℃， pH ＝ 2.0) 下进行 2 小时酶解反应。 酶解结束后在 90℃水浴灭活酶 10 分钟， 4000rpm 离心 15 分钟， 取上清液进行超滤 ( 截留分
子量 50kDa)， 超滤液低温减压浓缩至原匀浆液体积， 得四种不同的四角蛤蜊酶解液。
2.2 还原能力的测定
采用普鲁士蓝反应法测定不同四角蛤蜊酶解液的还原能力。 比色管中分别加入受 试样品、 溶剂对照 2.5ml， 另加入磷酸盐缓冲液 (0.2mol/L， pH ＝ 7) 及 10mg/ml 铁氰化钾各 2.5mL， 混匀后于 50℃水浴 20 分钟， 然后加入 100mg/ml 三氯乙酸 2.5ml， 混匀后 3000rpm 离 心 10 分钟。准确移取上清液 2.5ml， 加入蒸馏水 2.0ml 以及 1mg/ml 三氯化铁 0.5ml， 混匀 后于 700nm 处测定吸光度值， 吸光度值 (OD 值 ) 越大表明还原力越强。
2.3 羟自由基清除能力测定
采用不同酶解液对 Fenton 体系产生的羟自由基清除率的体外实验进行测定。 取 0.2ml 的 FeSO4-EDTA 混 合 液 (10.0mmol/L) 于 试 管 中， 加 人 0.5ml 的 2- 脱 氧 核 糖 溶 液 (10.0mmol/L) 和 0.6ml 四角蛤蜊酶解液， 用磷酸缓冲液 (pH ＝ 7.4， 0.1mol/L) 定容至 1.8mL， 再加人 0.2mLH2O2(10.0mol/L)， 混匀后置于 37℃恒温水浴中反应 1h。 然后加入 2.8％ (w/w) 三氯乙酸 (TCA) 溶液 1.0mL， 在 4000rpm 下离心 20 分钟， 取上清液 2.0ml 于另一支试 管中， 加入 1.0％ (w/w) 硫代巴比妥酸 (TBA) 溶液 1.0ml， 混匀后置沸水浴反应 15 分钟， 冷却 后稀释 5 倍， 在 532nm 波长处测吸光度值。 酶解液对羟自由基的清除效果用清除率 (SA/％ ) 表示， 按下式计算 ：
清除率 SA(％ ) ＝ [(Ac-As)/(Ac-A0)]×100％
式中 ： Ac 为不加清除剂的吸光度， As 为加入四角蛤蜊酶解液后的吸光度， A0 为试 剂空白的吸光度。
2.4DPPH 自由基清除能力测定
取四角蛤蜊酶解液 1ml 分别加入到干净的 10ml 具塞试管中， 再加入 0.6mmol/L DPPH 甲醇溶液 0.5ml， 然后以甲醇补充体积至 5ml， 30 分钟室温避光反应后于 517nm 处测定 吸光值 A， 空白组以等体积甲醇溶液代替 DPPH 溶液， 对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液， 并以等体积蒸馏水和甲醇混合液空白调零。按下式计算 ：
清除率 SA(％ ) ＝ [1-(Ai-Aj)/A0]×100％
式中 ： A0 为对照组吸光度， Ai 为样品组吸光度， Aj 为空白组吸光度。
2.5 超氧阴离子自由基清除能力测定
采 用 邻 苯 三 酚 自 氧 化 法 进 行 测 定。 量 取 50mmol/L， pH 8.20Tris-HCl 缓 冲 液 4.7ml， 加入 0.1ml 四角蛤蜊酶解液， 置于 25 ℃水浴保温 20 分钟， 然后加入 25 ℃预温的 3mmol/L 的邻苯三酚溶液 ( 用 10mmol/LHCl 配制 )0.2ml， 迅速摇匀后倒入比色皿中， 在 319nm 下每隔 1 分钟测定吸光值一次， 共反应 9 分钟， 用 10mmol/L HCl 溶液为空白调零， 对 照组以等体积去离子水代替样品。作吸光度随时间变化曲线的回归方程， 其斜率为邻苯三 -2 酚的自氧化速率 V， 按下式计算样品对 O 的清除率。
清除率 SA(％ ) ＝ [1-V1/V0]×100％
式中 ： V1 为样品组的吸光度随时间的变化率， V0 为空白对照组组吸光度随时间的 变化率。
3. 结果与讨论
3.1 酶的筛选 ： 具体实验结果如表 1 所示 ：
表 14 种蛋白酶酶解液的抗氧化能力 ( 浓度 5mg/ml，5n ＝ 3)101979652 A CN 101979657
说明书4/9 页由表 1 实验结果表明， 本发明筛选的 4 中蛋白水解酶中， 胰蛋白酶水解的四角蛤蜊 酶解液对 DPPH 自由基、 羟自由基及超氧阴离子自由基的清除能力均强于木瓜蛋白酶、 中性 蛋白酶和胃蛋白酶。且从实验结果表明， 四角蛤蜊胃蛋白酶的酶解液还原能力最强， 且对 DPPH 自由基、 羟自由基及超氧阴离子自由基的清除能力强于木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。因 此水解四角蛤蜊的蛋白酶优选胰蛋白酶或者胃蛋白酶， 作为最佳方案， 水解酶优选胰蛋白 酶。
由于羟自由基清除率是反映抗氧化作用的重要指标， 故本发明以清除羟自由基能 力作为考察指标， 进行胰蛋白酶酶解工艺的优化和考察。
二、 胰蛋白酶酶解工艺的单因素实验
1、 温度单因素实验
四角蛤蜊软体洗净搅碎匀浆， 加入 3 倍重量的水配成混悬液， 再分别加入酶活力 单位为 500IU 的胰蛋白酶， 加酶量为匀浆液重量的 0.5％， 在 pH 8.0， 酶解反应时间 120 分
钟下， 考察温度因素对产物多肽抗氧化活性影响实验， 分别考察 40 ℃、 45 ℃、 50 ℃、 55 ℃、 60℃和 65℃酶解得到的四角蛤蜊水解多肽对羟自由基的清除率活性， 见图 1 所示， 由结果 可知， 在温度 45-50℃时羟自由基清除率达峰值， 这是因为该温度下酶活最强， 活性多肽得 率最高， 所以抗氧化活性最强 ； 当温度在 50 ℃以上时， 温度开始对酶活起抑制作用， 使底 物降解为目的产物的速率下降。因此， 最适宜四角蛤蜊蛋白胰蛋白酶的酶解温度为 45 ～ 50℃。
2、 时间单因素实验
四角蛤蜊软体洗净搅碎匀浆， 加入 3 倍重量的水配成混悬液， 再分别加入酶活力 单位为 500IU 的胰蛋白酶， 加酶量为匀浆液重量的 0.5％， 在 pH 8.0， 温度 50℃下， 考察酶 解反应时间对产物多肽抗氧化活性的影响实验， 分别考察 20 分钟、 40 分钟、 60 分钟、 80 分 钟、 100 分钟、 120 分钟酶解得到的四角蛤蜊蛋白多肽对羟自由基的清除率活性， 见图 2 所 示。实验结果表明， 随着酶解时间的延长， 酶解液的羟自由基清除率逐渐增加， 反应时间在 80 分钟时羟自由基清除率处于峰值， 但时间超过 100 分钟时， 随着反应时间的延长， 清除率 反而下降， 这是因为随时间的延长， 水解成分的条件下， 活性多肽进一步被酶解成无活性的 小肽， 所以酶解液整体活性降低。因此， 选择酶解时间为 70 ～ 90 分钟为宜。
3、 pH 单因素实验
四角蛤蜊软体洗净搅碎匀浆， 加入 3 倍重量的水配成混悬液， 再分别加入酶活力 单位为 500IU 的胰蛋白酶， 加酶量为匀浆液重量的 0.5％， 温度 50℃下酶解 80 分钟， 考察酶解反应 pH 对产物多肽抗氧化活性的影响实验， 分别考察 pH 值分别为 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0 酶解得到的四角蛤蜊蛋白多肽对羟自由基的清除率活性， 见图 3 所示。 由图 3 的实 验结果表明， 在碱性 pH 范围 7.5 ～ 8.5 间， 羟自由基清除率较优， 当 pH 值为 8.5 时， 羟自由 基清除率最大， 而 pH 大于 8.5 时羟自由基清除率递减， 说明在 pH 7.5 ～ 8.5 左右是酶作用 于底物产生活性肽的最佳范围。因此， 最适宜四角蛤蜊蛋白酶解 pH 值为 7.5 ～ 8.5。
4、 加酶量单因素实验
四角蛤蜊软体洗净搅碎匀浆， 加入 3 倍重量的水配成混悬液， 再分别加入一定量 的酶活力单位为 500IU 的胰蛋白酶， 在 pH ＝ 8.5、 温度 50℃下酶解 80 分钟， 考察加酶量对 产物多肽抗氧化活性的影响实验， 考察酶 - 底物比 ( 酶 - 底物比按加酶量占匀浆液总重量 的百分比计 ) 分别为 0.05％、 0.1％、 0.25％、 0.5％、 0.75％时酶解得到的四角蛤蜊蛋白多 肽对羟自由基的清除率活性， 见图 4 所示。实验结果表明， 不加酶时匀浆液滤过组分的羟自 由基清除率仅为 41.23％， 而在酶 - 底物比为 0.05％时酶解产物的羟自由基清除率可高达 达到 79.7％ ； 随着酶 - 底物比的增大， 产物的羟自由基清除率逐渐增加， 在酶 - 底物比增大 到 0.25％以上时， 产物的羟自由基清除率达最大 ； 然而， 增大酶 - 底物比超过 0.25％时， 产 物的羟自由基清除率呈现下降趋势。 其原因为 ： 随着酶浓度的增加其底物逐渐达到饱和， 当 出现酶浓度过饱和时， 过饱和的酶就可能会作用于具有活性的多肽， 使其降解生成无活性 的小肽， 而降低活性肽的含量。 因此， 胰蛋白酶加入量占四角蛤蜊蛋白匀浆液重量百分比为 0.25％～ 0.5％为宜。 三、 四角蛤蜊胰蛋白酶酶解工艺正交实验
本发明选取酶解 pH 值、 温度、 加酶量和酶解时间四个因素， 每个因素在单因素筛 4 选结果数值附近选 3 个水平， 选用 L9(3 ) 正交试验， 对胰蛋白酶水解四角蛤蜊工艺进一步 的优化。实验结果如表 2 和表 3 所示。
表 2L9(34) 正交试验结果的极差分析表
表 3 胰蛋白酶酶解物对羟自由基清除作用方差分析表方程的确定系数＝ 0.980( 调整确定系数＝ 0.922)
由表 2 中 R 值及表 3 中方差分析可知 ： 影响酶解液羟自由基清除作用的主次因素 是： pH 值＞温度＞水解时间＞加酶量， 进一步的显著性检验表明， pH 值 ( 因素 C) 对产物自 由基清除达到显著水平 (P ＜ 0.05)。因此根据正交实验结果表明， 四角蛤蜊蛋白胰蛋白酶 酶解物对羟自由基清除能力最佳的酶解条件是 pH 为 8.5， 温度 45℃， 时间 90 分钟， 酶-底 物比为 0.5％。表明本发明提供的胰蛋白酶酶解四角蛤蜊制备抗氧化多肽工艺的合理性和 科学性。
经实验研究表明， 本发明提供的四角蛤蜊蛋白多肽具有很好的抗氧化活性， 因此 本发明所述的四角蛤蜊蛋白多肽可应用于制备抗氧化抗衰老药物。
本发明提供的四角蛤蜊蛋白多肽， 可以将四角蛤蜊蛋白多肽和药学上可接受的载 体制备成颗粒剂、 胶囊剂、 片剂剂、 丸剂等剂型药物。
将本发明提供的四角蛤蜊蛋白多肽制成片剂时， 把四角蛤蜊蛋白多肽和乳糖或玉 米淀粉， 需要时加入润滑剂硬脂酸镁， 混合均匀， 整粒， 然后压片制成片剂。
本发明提供的四角蛤蜊蛋白多肽制成胶囊剂时把四角蛤蜊蛋白多肽和载体乳糖 或玉米淀粉混合均匀， 整粒， 然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明提供的四角蛤蜊蛋白多肽制成颗粒剂时， 把四角蛤蜊蛋白多肽和稀释剂乳 糖或玉米淀粉、 环糊精混合均匀， 过筛、 整粒， 干燥， 制成颗粒剂。
本发明所述的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽也可以在制备抗氧化抗衰老 保健品或食品添加剂中的应用。
有益效果 ： 本发明提供的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽具有以下优点 ：
本发明提供的具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽， 实验结果表明具有很好的抗 氧化活性， 酶解后得到的蛋白多肽分子量小， 人体服用后更易于吸收 ； 本发明提供的具有抗 所得工艺各参数设计合理， 能 氧化活性四角蛤蜊蛋白多肽的制备方法， 经过大量实验筛选， 够充分利用四角蛤蜊丰富资源， 将四角蛤蜊高分子蛋白质酶解得到既具有强抗氧化活性， 又易于人体吸收的蛋白多肽 ； 本发明提供的四角蛤蜊蛋白多肽可以用于制备成抗氧化抗衰 老药品或者抗氧化抗衰老保健品或食品添加剂， 应用范围广泛， 具有良好的经济和社会效 应。
附图说明
图 1 为温度单因素实验中不同温度和自由基清除率的相关结果图。图 2 为时间单因素实验中不同时间和自由基清除率的相关结果图。 图 3 为 pH 单因素实验中不同 pH 值和自由基清除率的相关结果图。 图 4 为加酶量单因素实验中不同加酶量和自由基清除率的相关结果图。具体实施方式 ：
根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例 1 一种具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽， 它是通过以下方法制备得 到：
具体步骤为 ： 四角蛤蜊软体洗净， 搅碎匀浆， 得匀浆液， 然后加入占四角蛤蜊匀浆 液重量 0.25％的胰蛋白酶， 在 pH 8.5， 温度 45℃条件下酶解 80 分钟， 酶解结束后在 90℃水 浴灭酶 10 分钟， 4000rpm 离心 15 分钟， 取上清液进行超滤， 截留分子量为 10-30kDa 的超滤 液， 超滤液减压浓缩， 喷雾干燥得四角蛤蜊蛋白多肽。
实施例 2 一种具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽， 它是通过以下方法制备得 到：
具体步骤为 ： 四角蛤蜊软体洗净， 搅碎匀浆， 得匀浆液， 然后加入占四角蛤蜊匀浆 液重量 0.5％的胰蛋白酶， 在 pH 8.0， 温度 55℃条件下酶解 90 分钟， 酶解结束后在 100℃水 浴灭酶 10 分钟， 4000rpm 离心 15 分钟， 取上清液进行超滤， 截留分子量为 10-50kDa 的超滤 液， 超滤液减压浓缩， 喷雾干燥得四角蛤蜊蛋白多肽。
实施例 3 一种具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽， 它是通过以下方法制备得 到：
具体步骤为 ： 四角蛤蜊软体洗净， 搅碎匀浆， 得匀浆液， 然后加入占四角蛤蜊匀浆 液重量 0.1％的胰蛋白酶， 在 pH 7.5， 温度 55℃条件下酶解 70 分钟， 酶解结束后在 90℃水 浴灭酶 10 分钟， 4000rpm 离心 15 分钟， 取上清液进行超滤， 截留分子量为 30-50kDa 的超滤 液， 超滤液减压浓缩， 喷雾干燥得四角蛤蜊蛋白多肽。
实施例 4 一种具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽， 它是通过以下方法制备得 到：
具体步骤为 ： 四角蛤蜊软体洗净， 搅碎匀浆， 得匀浆液， 然后加入占四角蛤蜊匀浆 液重量 0.5％的胰蛋白酶， 在 pH 8.5， 温度 45℃条件下酶解 80 分钟， 酶解结束后在 100℃水 浴灭酶 10 分钟， 4000rpm 离心 15 分钟， 取上清液进行超滤， 截留分子量为 20-50kDa 的超滤 液， 超滤液减压浓缩， 喷雾干燥得四角蛤蜊蛋白多肽。
实施例 5 抗氧化实验
1. 材料及设备
实施 1-4 制备得到的 4 种四角蛤蜊蛋白多肽 ； Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 ： 美国 Thermo 公司 ； 二苯代苦味酰肼 (DPPH) ： Alfa 公司。BP 211D 电子天平 ： 德国 Sartorious 公 司； Spectra Max190 酶标仪 ： 美国 AD 公司 ； 恒温透视水槽， 上海实验仪器总厂 ； UV-1700 分 光光度仪， 日本 Shimadzu 公司。
2. 方法2.1 供试溶液制备
取上述实施例 1-4 制备的 4 中四角蛤蜊蛋白多肽， 精密称量， 加蒸馏水配制成 100μg/ml 的供试溶液。
2.2 还原能力的测定
采用普鲁士蓝反应法测定不同四角蛤蜊酶解液的还原能力。 比色管中分别加入受 试样品、 溶剂对照 2.5ml， 另加入磷酸盐缓冲液 (0.2mol/L， pH ＝ 7) 及 10mg/ml 铁氰化钾各 2.5mL， 混匀后于 50℃水浴 20 分钟， 然后加入 100mg/ml 三氯乙酸 2.5ml， 混匀后 3000rpm 离 心 10 分钟。准确移取上清液 2.5ml， 加入蒸馏水 2.0ml 以及 1mg/ml 三氯化铁 0.5ml， 混匀 后于 700nm 处测定吸光度值， 吸光度值 (OD 值 ) 越大表明还原力越强。
2.3 羟自由基清除能力测定
采用不同酶解液对 Fenton 体系产生的羟自由基清除率的体外实验进行测定。 取 0.2ml 的 FeSO4-EDTA 混合液 (10.0mmol/L) 于试管中， 加人 0.5ml 的 2- 脱氧核糖溶液 (10.0mmol/L) 和 0.6ml 供试品溶液， 用磷酸缓冲液 (pH ＝ 7.4， 0.1mol/L) 定容至 1.8mL， 再 加人 0.2mLH2O2(10.0mol/L)， 混匀后置于 37℃恒温水浴中反应 1h。然后加入 2.8％ (w/w) 三氯乙酸 (TCA) 溶液 1.0mL， 在 4000rpm 下离心 20 分钟， 取上清液 2.0ml 于另一支试管中， 加入 1.0％ (w/w) 硫代巴比妥酸 (TBA) 溶液 1.0ml， 混匀后置沸水浴反应 15 分钟， 冷却后稀 释 5 倍， 在 532nm 波长处测吸光度值。酶解液对羟自由基的清除效果用清除率 (SA/％ ) 表 示， 按下式计算 ：
清除率 SA(％ ) ＝ [(Ac-As)/(Ac-A0)]×100％ 式中 ： Ac 为不加清除剂的吸光度， As 为加入供试品后的吸光度， A0 为空白的吸光度。 2.4DPPH 自由基清除能力测定
取供试品溶液 1ml 分别加入到干净的 10ml 具塞试管中， 每管中再加入 0.6mmol/L DPPH 甲醇溶液 0.5ml， 然后以甲醇补充体积至 5ml， 30 分钟室温避光反应后于 517nm 处测定 吸光值 A， 空白组以等体积甲醇溶液代替 DPPH 溶液， 对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液， 并以等体积蒸馏水和甲醇混合液空白调零。按下式计算 ：
清除率 SA(％ ) ＝ [1-(Ai-Aj)/A0]×100％
式中 ： A0 为对照组吸光度， Ai 为样品组吸光度， Aj 为空白组吸光度。
2.5 超氧阴离子自由基清除能力测定
采用邻苯三酚自氧化法进行测定。量取 50mmol/L、 pH ＝ 8.20 的 Tris-HCl 缓冲液 4.7ml， 加入 0.1ml 的供试品溶液， 置于 25℃水浴保温 20 分钟， 然后加入 25℃预温的 3mmol/ L 的邻苯三酚溶液 ( 用 10mmol/LHCl 配制 )0.2ml， 迅速摇匀后倒入比色皿中， 在 319nm 下每 隔 1 分钟测定吸光值一次， 共反应 9 分钟， 用 10mmol/L HCl 溶液为空白调零， 对照组以等体 积去离子水代替供试样品。作吸光度随时间变化曲线的回归方程， 其斜率为邻苯三酚的自 -2 氧化速率 V， 按下式计算样品对 O 的清除率。
清除率 SA(％ ) ＝ [1-V1/V0]×100％
式中 ： V1 为样品组的吸光度随时间的变化率， V0 为空白对照组组吸光度随时间的 变化率。
3、 结果与讨论
10101979652 A CN 101979657
说明书n ＝ 3)9/9 页3.1 具体实验结果如表 4 所示 ： 表 4 四角蛤蜊蛋白多肽的抗氧化能力 ( 浓度 100μg/ml，由表 4 实验结果表明， 本发明提供的方法制备得到的四角蛤蜊蛋白多肽具有很好 清除 DPPH 自由基、 羟自由基及超氧阴离子自由基的能力， 且具有较强的还原能力。因此， 本 发明提供的四角蛤蜊蛋白多肽有望开发成为新一代的抗氧化抗衰老的药品或者保健食品， 可用于防治老化以及老化相关的疾病如癌症、 心血管和自身免疫性等疾病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。