一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体及其用 途 技术领域 本发明涉及一种重组载体， 特别涉及一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重 组载体及其用途。
背景技术 肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一， 人类全身肿瘤中 90 ％以上常见的恶性肿 瘤都是实体瘤 ； 随着环境污染的加剧， 其发病率逐年上升。实体瘤的传统治疗方法以手术、 化疗及放疗为主， 但肿瘤的转移率和治疗后的复发率都较高， 生存率仍不理想。因此， 结合 最新的肿瘤生理学和医学分子生物学研究成果， 进一步研究开发新型高效的实体瘤治疗方 法， 具有重要的社会经济意义。
利用自杀基因治疗实体瘤是近年来肿瘤基因治疗的研究热点。 所谓自杀基因治疗 肿瘤就是用基因工程技术将特定的外源基因导入肿瘤宿主细胞或肿瘤组织中， 该外源基因 表达的蛋白质能够将无毒的前体药物分解成对肿瘤细胞有毒性的药物成分， 直接杀死肿瘤 细胞， 从而达到治疗肿瘤的目的。 然而， 目前基因治疗面临的关键问题是如何解决载体的安 全性和靶向性问题， 选择一个高效、 安全、 特异性强的载体， 是实现目的基因在肿瘤细胞中 特异表达的前提。
I 型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (herpes simplex virus-1 thymidinekinase， HSV-TK)/ 丙氧鸟苷 (ganciclovir， GCV) 是目前研究最早最彻底的， 广泛用于肿瘤基因治疗 的自杀基因系统之一。 目前研究认为该自杀基因治疗肿瘤的机制有两个 ： 一是自杀效应， 即 HSV-TK 编码由 376 个氨基酸组成的胸甘激酶， 导入肿瘤细胞后， 这种胸苷激酶将无毒的丙 氧鸟苷 (GCV) 磷酸化成单磷酸丙氧鸟苷， 再进一步磷酸化为三磷酸丙氧鸟苷后， 掺合到新 合成的肿瘤细胞 DNA 链中， 使 DNA 链断裂且抑制 DNA 聚合酶活性， 从而干扰 DNA 合成导致肿 瘤细胞死亡。 另外一种是 TK-GCV 系统引发的 “旁观者效应” ， 所谓 “旁观者效应” 即是转导的 肿瘤细胞被敏感药物杀死的同时， 周围未被转导的肿瘤细胞也被杀死的现象。HSV-TK/GCV 系统通过这种独特的自杀效应或 “旁观者效应” 能选择性地杀死肿瘤细胞， 保护正常组织细 胞， 从而避免传统的化疗等治疗方法对人体带来的伤害。自 1986 年 Moolten 首先报道腺病 毒介导的 HSV-TK 基因可使肿瘤获得对某些药物的敏感性以来， 国内外学者陆续将腺病毒 介导的 HSV-TK 基因应用于肝癌、 胃癌、 舌癌、 前列腺癌、 黑色素瘤等实体瘤的基因治疗的实 验研究， 并取得了可喜进展。然而， 寻找安全有效的 tk 基因表达载体仍然是困扰 HSV-TK 基 因治疗的一大难题。
肿瘤基因治疗的载体系统主要有病毒载体和非病毒载体 ( 脂质体等 ) 两大类。由 于病毒载体本身有很多局限性， 如病毒滴度低、 生产成本高、 靶向性差 ； 同时， 对某些静止期 细胞无感染性 ( 腺病毒载体 )、 宿主范围有限、 插入宿主基因组可能引起突变及病毒本身缺 乏安全性等缺点， 因而不能满足临床应用需要， 使得该项技术还处在摸索阶段。 脂质体等非 病毒载体， 普遍存在基因转染效率低、 缺乏肿瘤特异靶向性等缺点。因而寻找一种高效、 特
异、 安全的载体系统成为近年来研究的热点。
研究表明， 厌氧细菌具有良好的肿瘤靶向定植性， 许多抗肿瘤研究已经尝试以厌 氧菌作为转移载体携带各种抑瘤基因到肿瘤组织处进行肿瘤基因治疗。 厌氧菌载体的应用 解决了传统基因治疗载体 ( 病毒载体或非病毒载体 ) 靶向性不强的问题， 避免载体在到达 肿瘤细胞的过程中所要面临的生理和免疫上的多重障碍， 提高了治疗基因在体内的表达水 平。目前， 广泛研究的厌氧菌包括梭状芽孢杆菌属、 沙门氏菌属和双歧杆菌属等。沙门氏菌 是革兰氏阴性菌， 菌体含有内毒素， 安全性要比双歧杆菌差。
双歧杆菌 (bifidobacterium) 属于革兰氏阳性菌， 严格厌氧菌， 不产生外毒素， 不 含有内毒素， 本身无致病性 ； 该菌是人体中的重要益生菌， 在健康人肠道内定植且占有一定 数量优势细菌， 广泛用于各种奶制品发酵， 其非致病性在许多国家已经得以接受， 美国食品 与药物管理局 (FDA) 将该菌的安全级别定为最高级 --A 级。Li 等将转人内皮抑素的双歧 杆菌经尾静脉注射荷瘤小鼠， 发现抑瘤效果比天然双歧杆菌更好。2008 年 Do Kyung Lee 等人用实验证实人源双歧杆菌能显著提高人的自身免疫并且抑制结肠癌细胞株的生长， 并 诱导肿瘤细胞凋亡。这些研究提示 ： 双歧杆菌可以作为肿瘤基因治疗靶向载体系统。已有 研究证明在实体瘤中存在一些低氧区域 ( 尤其是瘤体的中央区 )， 而这些低氧区域适合厌 氧菌的存活。Vaupel 等研究了肿瘤组织中的氧分压， 发现恶性实体瘤中心区域氧分压低至 2.5mmHg 以下， 远低于正常组织的 24-66mmHg， 这表明恶性实体瘤中心区域较正常组织更适 合双歧杆菌的生存。申请者在前期研究中连续 4 天将 1ml 浓度为 2.0×10 4/ml 的人双歧杆 菌活菌通过耳静脉注入健康家兔 (2.0Kg)， 血培养法结果证明 ： 双歧杆菌入血后， 不会在血 液中大量繁殖和生存， 不会出现高热和休克等菌血症表现 ； 实验组家兔脾、 肾、 骨骼肌、 心肌 和癌旁肝组织经病理学检测未见明显异常。 这些研究均表明双歧杆菌作为肿瘤基因治疗靶 向载体系统具有较高的安全性。
作为肿瘤基因肿瘤载体系统， 双歧杆菌的优越性在于 ： 第一、 作为一种胞外菌， 双 歧杆菌自身的繁殖不依赖于肿瘤细胞活动周期， 也不借助宿主细胞的各种因子启动和调控 目的基因的表达， 无组织特异性限制， 对复制和静息的肿瘤细胞均有作用。第二、 双歧杆菌 的基因组和外源基因都不可能插入宿主基因组， 不会引发宿主基因突变的风险。 第三、 双歧 杆菌对实体瘤的趋化性是针对中心的厌氧区的氧分压， 不对肿瘤的部位和性质， 具有广泛 的实用性， 不需要对肿瘤特异基因的鉴定和了解， 而且该细菌具备不依赖宿主生命周期的 独立繁殖能力， 理论上讲， 只要有一个细菌能够顺利到达肿瘤的厌氧坏死区， 就能够繁殖出 成千上万个细菌， 在局部形成高活性区， 有可能改变现有载体系统转导效率低的状况， 这表 明双歧杆菌作为载体系统具有较高转导效率。综上所述， 双歧杆菌作为肿瘤基因治疗的载 体系统具有较高的特异性、 高效性和安全性， 有可能克服以往肿瘤基因治疗中缺乏肿瘤组 织靶向性、 安全性和转导效率低等 “瓶颈” 。
就目前国内外发表的以双歧杆菌为表达载体进行肿瘤基因治疗的文献而言， 其表达系统大体上有三类 ： 一种是以 pGEX-5X-1 为主 ； 另一种是以 pBV220 为主 ； 第三 类是主要以研究者自己分离和构建的载体系统为主， 如 Kano 等改造的来源于 pTB6 的 pAV001-HU-eCD-M968 等。 他们的共同特点是大多采用了氨苄青霉素为筛选基因， 因此， 其临 床应用的安全风险非常大， 本发明针对上述表达载体的优缺点， 研发出一套安全高效的靶 向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 经专利查新证实， 国内目前关于人用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的专利未见公布。
发明内容 本发明的目的就是针对现有技术的不足， 提供一种靶向治疗实体瘤的 双歧杆菌 pBES-tk 重组载体及其用途。本发明同时提供了一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的构建方法。
为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ：
一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 其特征在于 ： 采用序列表中 的 SEQ ID № ： 1 做为表达载体， 即双歧杆菌 - 大肠杆菌穿梭表达载体 pBES ； 所述靶向治疗 实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体具有序列表中的 SEQ ID № ： 2 所表示的 tk 基因序列， 该基因为发挥治疗效应目的基因。
该靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体在肿瘤组织中能够表达 HSV-1 的 tk 基因编码的胸甘激酶 (TK)， 该 TK 将无毒的前体药物丙氧鸟苷 (GCV) 磷酸化， 成为三磷酸 丙氧鸟苷后， 掺合到新合成的肿瘤细胞 DNA 链中， 使 DNA 链 - 断裂且抑制 DNA 聚合酶活性， 从而干扰 DNA 合成导致肿瘤细胞死亡。同时， 双歧杆菌 pBES-tk 重组载体表达的 TK 系统引 发的 “旁观者效应” ， 所谓 “旁观者效应” 即周围未被 TK 直接作用的肿瘤细胞也由于双歧杆 菌 pBES-tk 重组载体表达的 TK 引发的 Caspase3 表达增加而被杀死的生物学现象。 HSV-TK/ GCV 系统通过这种独特的直接作用或 “旁观者效应” 能选择性地杀死肿瘤细胞达到治疗实体 瘤的目的。
一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的用途， 其特征在于 ： 用于靶 向治疗实体瘤。
本发明所述的一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 通过借助恶性 实体瘤中心区域的低氧分压特点 ( 氧分压比正常组织低 10 到 40 倍 ) 和双歧杆菌的专性厌 氧生活特性， 使得该重组载体经过静脉或局部注射后， 只有到达实体瘤中心的厌氧区域的 双歧杆菌才能生存， 这样， 双歧杆菌 pBES-tk 重组载体表达的 TK 被局限在实体瘤中。散布 正常组织中双歧杆菌 pBES-tk 重组载体由于高氧分压而不能存活， 即使 GCV 存在于正常组 织， 也由于缺乏 TK 而不会对正常组织细胞产生伤害， 从而使本发明所述的一种靶向治疗实 体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体达到对实体瘤的靶向性和对正常组织的无害性。
上述靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的构建方法， 其特征在于包括 以下步骤 ：
第一步， 先用化学合成方法合成 GenBank 号为 AB032875 的 HSV-1 tk 基因， 其序列 特征为 SEQ ID № ： 2； 在其 5- 端添加 BamHI 酶切位点， 3’ 端添加 SalI 酶切位点， 然后将合 成的 tk 基因片段克隆到 pGH 克隆载体中， 测序检测正确后备用， 命名为 pGH-tk ；
第二步， 将 pGH-tk 和 pBES 质粒分别转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养 10 小时后纯化 质粒， 将纯化的 pGH-tk 和 pBES 质粒分别用 BamHI 和 SalI 双酶切， 电泳分离后用凝胶纯化 试剂盒 ( 北京鼎国生物生产 ) 分离纯化 tk 基因片段和载体 pBES 片段， 用连接试剂盒 ( 大 连宝生物生产 ) 在 25℃连接 30min， 转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养过夜后挑取阳性克隆， 扩 大培养后纯化质粒， PCR 和酶切鉴定正确后， 命名为 pBES-tk， -80℃保存备用， 其序列特征 为 SEQ ID № ： 3；
第三步， a) 将双歧杆菌培养至对数生长期即 OD600 为 0.6-0.7 时， 经去离子水配制 的灭菌 10％甘油洗涤处理后， 以双歧杆菌为受体菌， 用电转化法将纯化的 pBES-tk 质粒载体转化到受体菌中 ； 转化条件为 ： 15KV、 200Ω、 25μF ； 所述的双歧杆菌为受体菌， 由中国典 型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 CCTCC No ： M203050 的两歧双歧杆菌 SHQ006 ；
b) 再 将 转 化 处 理 后 的 双 歧 杆 菌 先 在 无 抗 菌 素 的 MRS 液 体 培 养 基 中 复 苏 60-120min， 然后在含 50μg/ml 卡那霉素的 MRS 固体培养基上培养， 选择抗性菌落， 从而获 得转 tk 基因的双歧杆菌， PCR 和 SDS-PAGE 鉴定后的阳性克隆即为双歧杆菌 pBES-tk 重组 载体的种子菌。
c) 将上述经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后， 涂布于含卡那霉素的抗性 MRS 培养基上厌氧培养 48 小时， 然后挑取单一的抗性菌落于抗性 MRS 液体培养基中增菌培养， 经 PCR 证实 tk 阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于含卡那霉素的抗性 MRS 培养基平板 上厌氧培养 48 小时 ； 然后再挑取单一菌落于含卡那霉素的液体培养基中培养， 如此反复接 种培养至继代培养不低于 15 代时， 经 PCR 检测证实 tk 基因仍然阳性的克隆， 可以作为种子 菌用于大规模液体接种扩增培养， 培养物经离心浓缩和洗涤纯化， 进一步制备成转 tk 基因 的双歧杆菌 -tk 重组载体实体瘤治疗的制剂。
该实体瘤治疗系统的优点是经静脉注射或肿瘤局部注射后， 双歧杆菌通过血液 循环进入实体瘤组织， 在实体瘤中心的低氧区， 双歧杆菌存活下来并快速繁殖， 将 TK 蛋白 直接表达在肿瘤中心区域， 并将随后注射的 GCV 分解为对肿瘤细胞有毒性的三磷酸丙氧鸟 苷。由于三磷酸丙氧鸟苷只产生在有 TK 存在的肿瘤组织的中心区， 它能够被肿瘤组织及时 和有效地吸收， 有利于增加药物的生物利用效率， 减少对周围正常组织的毒副作用。同时， 双歧杆菌的大量繁殖， 也能够激活肌体的非特异性免疫， 有利于增强对肿瘤的抗性。 一旦肿 瘤组织被消灭殆尽， 该区域的低氧厌氧条件也被破坏， 双歧杆菌的生存环境亦不复存在， 进 入正常组织的双歧杆菌处于高氧分压环境， 不能繁殖， 肌体会自动清除这些完成使命的双 歧杆菌， 不会造成后遗症和副作用。
该靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的发酵生产成本十分低廉， 得到 的发酵液活菌数量大、 菌体活性高， 经过纯化精制后将纯化的菌体冷冻干燥后在安碚中真 空包装， 可以随时使用。
本发明一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的有益效果是， 运用基 因工程方法将 tk 基因连接到发明人拥有的双歧杆菌 - 大肠杆菌穿梭表达载体 pBES 中， 通 过质粒转化方法把 tk 基因导入到人体生菌 - 双歧杆菌中制成双歧杆菌 (Bifidobacterium sp.) 为表达载体的 tk 重组载体肿瘤基因治疗系统， 即双歧杆菌 pBES-tk 重组载体靶向治疗 实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体。 附图说明 图 1 是本发明的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的结构示意图 ； 其 中， (1)tk 是四环素 tet0 启动子驱动的 HSV-1 的 tk 基因序列区 ；
图 2 是本发明中用 MNU 诱导后的小鼠膀胱癌 ；
图 3 是本发明中小鼠膀胱癌经靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk/GCV 重组载体 ( 简称双歧杆菌 pBES-tk/GCV， 下同 ) 治疗后的 TUNEL 法原位检测图， 结果发现， 各组均出现 不同程度的肿瘤细胞核呈棕褐色染色 ( 见图 A、 B、 C)。 各组的凋亡指数值分别为生理盐水组 A(14.33±5.29％ )、 空质粒双歧杆菌组 B(15.50±4.34％ ) 和重组质粒双歧杆菌 pBES-tk/
GCV 治疗组 C(29.44±6.64％ )。 重组质粒双歧杆菌 pBES-tk/GCV 治疗组的凋亡指数值明显 高于生理盐水组和空质粒双歧杆菌组 (P ＜ 0.05)， 表明凋亡细胞明显增加。说明该系统治 疗小鼠膀胱癌是有效的 ；
图 4 是 CaSki 细胞移植到裸鼠皮下的成瘤图 ；
图 5 是本发明靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗裸鼠实体瘤模型 后的效果检测示意图。 具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明， 但并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。
实施例 1
一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 其特征在于 ： 采用序列表中 的 SEQ ID No ： 1 做为表达载体， 即双歧杆菌 - 大肠杆菌穿梭表达载体 pBES ； 所述靶向治疗 实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体具有序列表中的 SEQ ID № ： 2 所表示的 tk 基因序列， 该基因为发挥治疗效应目的基因。 靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的构建方法 ：
第一步， 先用化学合成方法合成 GenBank 号为 AB032875 的 HSV-1tk 基因， 其序列 特征为 SEQ ID № ： 2； 在其 5- 端添加 BamHI 酶切位点， 3’ 端添加 SalI 酶切位点， 然后将合 成的 tk 基因片段克隆到 pGH 克隆载体中， 测序检测正确后备用， 命名为 pGH-tk ；
第二步， 将 pGH-tk 和 pBES 质粒分别转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养 10 小时后纯化 质粒， 将纯化的 pGH-tk 和 pBES 质粒分别用 BamHI 和 SalI 双酶切， 电泳分离后用凝胶纯化 试剂盒 ( 北京鼎国生物生产 ) 分离纯化 tk 基因片段和载体 pBES 片段， 用连接试剂盒 ( 大 连宝生物生产 ) 在 25℃连接 30min， 转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养过夜后挑取阳性克隆， 扩 大培养后纯化质粒， PCR 和酶切鉴定正确后， 命名为 pBES-tk， -80℃保存备用， 其序列特征 为 SEQ ID № ： 3；
第三步， a) 将双歧杆菌培养至对数生长期即 OD600 为 0.6-0.7 时， 经去离子水配制 的灭菌 10％甘油洗涤处理后， 以双歧杆菌为受体菌， 用电转化法将纯化的 pBES-tk 质粒载 体转化到受体菌中 ； 转化条件为 ： 15KV、 200Q、 25μF ； 所述的双歧杆菌为受体菌， 由中国典 型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 CCTCC No ： M203050 的两歧双歧杆菌 SHQ006 ；
b) 再 将 转 化 处 理 后 的 双 歧 杆 菌 先 在 无 抗 菌 素 的 MRS 液 体 培 养 基 中 复 苏 60-120min， 然后在含 50μg/ml 卡那霉素的 MRS 固体培养基上培养， 选择抗性菌落， 从而获 得转 tk 基因的双歧杆菌， PCR 和 SDS-PAGE 鉴定后的阳性克隆即为靶向治疗实体瘤的双歧 杆菌 pBES-tk 重组载体的种子菌。至此， 靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体构 建成功， 结果见说明书附图 1。
实施例 2
靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的用途是通过静脉或局部注射的 方式进行肿瘤的基因治疗， 因此， 其安全性是首先要考虑的重要问题之一， 经动物在体试 验证明， 本发明所使用的表达载体 pBES-tk 的宿主菌双歧杆菌的特征在于 ： 所述的双歧杆 菌 - 重组载体 pBES-tk 用于肿瘤的基因治疗是以双歧杆菌为受体菌进行静脉注射的方式给
药， 经动物在体试验证明， 该双歧杆菌 ( 受体菌 ) 经静脉进入动物体内后， 对受药动物是没 有任何病理伤害的， 因此， 该系统经静脉注射使用是安全的。
以家兔为动物模型， 在家兔静脉注射本发明所述的双歧杆菌进行安全性试验的实 施例说明如下 ：
a) 从重庆医科大学实验动物中心领取体重为 2Kg 的健康雄性家兔 6 只。
b) 将双歧杆菌培养 12 小时使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBSbuffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×104cell/ml。
c) 将 2.0ml 浓度 1.0×104cell/ml 的双歧杆菌 ( 没有进行外源性内毒素检测和 处理 ) 经耳静脉注射到上述 a) 所述的家兔体内， 3 日内观察实验兔与对照之间的体征差异 ( 如活动能力、 取食能力、 是否有震颤、 竖毛、 粪便拉稀等 )， 和存活情况， 3 日内共进行 3 次注 射。结果发现， 注射后 5 小时内实验兔没有发现活动能力和取食能力的变化， 也没有震颤、 竖毛和粪便拉稀等其他体征差异和变化， 更没有死亡个体。
d) 将上述 c) 中所取的血样进行血象分析， 主要测量红、 白细胞和血小板的变化。 经统计学分析发现， 除了白细胞数量在初次注射后有较明显的升高外， 红细胞和血小板未 见有统计学意义的变化， 第 3 次注射后， 白细胞数量恢复到初次注射前的基本状态， 不再有 明显的升高现象。 e) 将第 3 次注射后的动物 8 小时后麻醉处死， 取心脏、 肝脏、 脾脏、 肾脏进行病理学 检测， 同时以正常家兔的上述组织做对照。 结果发现， 该受体菌进入动物体内后对心脏等主 要的脏器无病理损害。
实施例 3
用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗原位实体瘤 ( 膀胱癌 ) 的方 法如下 ：
a) 在重庆医科大学动物试验中心购买 SD(Sprague-Dawley) 大鼠 30 只 ( 雌性 )， 经 MNU 诱导成瘤后待用 (9 周 )， 结果见说明书附图 2。
b) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实体 瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 培养过夜， 使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBS buffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×1010cell/ ml。
c) 将上述 a) 中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为 A、 B、 C 3 组， 每组 9 只， 其中 A 组每 8 只经尾静脉注射 1ml 浓度 4.0×10 cell/ml 的双歧杆菌 -tk 工程菌 ； B 组注射同样浓度的双 歧杆菌空白对照 ( 只转化 pBES 空质粒 ) ； C 组注射同样体积的 PBS， 逐日观察动物的体征， 并 称量体重， 记录食量。 注射双歧杆菌 -tk 工程菌后的第二天开始经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 随后按照 ABC 组分组分别注射双歧杆菌 -tk 工程菌及其相应的对照物， 每周注射一次， 连续 注射 4 周 ； 次日对上述大鼠经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 每天一次， 注射 4 周。结果证明， 靶 向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗的 A 组动物， 发现肿瘤体积明显缩小， 重量 减轻 ； 进一步通过免疫组织化学方法检测发现双歧杆菌介导的 HSV-TK/GCV 治疗荷瘤大鼠 膀胱癌后激活型的 Caspase3 表达增加， 通过 TUNEL 方法证实治疗后肿瘤切片中凋亡细胞明 显增加， 说明该系统对原发性实体瘤的治疗有效。结果见说明书附图 3。
实施例 4
用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗转移实体瘤 ( 宫颈癌 Caski 细胞转移 ) 的方法如下 ：
a) 在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠 10 只 ( 雌雄不限 )， 经尾静脉注射 1ml 6 浓度 1.0×10 cell/ml 的人 CaSki 细胞， 20 天后随机检测肿瘤形成情况， 结果见说明书附图 4。
b) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实体 瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 培养过夜， 使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBS buffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×104cell/ml。
c) 将上述 a) 中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为 A、 B、 C 3 组， 每组 3 只， 其中 A 组每 4 只经尾静脉注射 1ml 浓度 1.0×10 cell/ml 的双歧杆菌 -tk 工程菌 ； B 组注射同样浓度的双 歧杆菌空白对照 ( 只转化 pBES 空质粒 ) ； C 组注射同样体积的 PBS， 逐日观察动物的体征， 并 称量体重， 记录食量。 注射双歧杆菌 -tk 工程菌后的第二天开始经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 随后按照 ABC 组分组分别注射双歧杆菌 -tk 工程菌及其相应的对照物， 每周注射一次， 连续 注射 4 周 ； 次日对上述大鼠经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 每天一次， 注射 4 周。结果证明， 靶 向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗的 A 组动物， 发现肿瘤体积明显缩小， 重量 减轻， 说明该系统对移植瘤 ( 或转移瘤 ) 的治疗同样有效， 结果见说明书附图 5。
实施例 5
用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体局部注射治疗转移实体瘤 ( 宫颈 癌 Caski 细胞转移 ) 的方法如下 ：
a) 在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠 10 只 ( 雌雄不限 )， 经尾静脉注射 1ml 6 浓度 1.0×10 cell/ml 的人 CaSki 细胞， 20 天后随机检测肿瘤形成情况， 结果见说明书附图 4。
b) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实体 瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 培养过夜， 使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBS buffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×104cell/ml。
c) 将上述 a) 中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为 A、 B、 C 3 组， 每组 3 只， 其中 A 组每 4 只经肿瘤组织内部局部注射 1ml 浓度 1.0×10 cell/ml 的双歧杆菌 -tk 工程菌 ； B 组局部注 射同样浓度的双歧杆菌空白对照 ( 只转化 pBES 空质粒 ) ； C 组局部注射同样体积的 PBS， 逐 日观察动物的体征， 并称量体重， 记录食量。注射双歧杆菌 -tk 工程菌后的第二天开始经腹 腔注射 GCV(50mg/Kg)， 随后按照 ABC 组分组分别局部注射双歧杆菌 -tk 工程菌及其相应的 对照物， 每周注射一次， 连续局部注射 4 周 ； 次日对上述大鼠经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 每 天一次， 注射 4 周。结果证明， 靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体经局部注射治 疗的 A 组动物， 发现肿瘤体积明显缩小， 重量减轻， 说明该重组载体经肿瘤组织局部注射对 移植瘤 ( 或转移瘤 ) 的治疗与静脉注射治疗的效果一样。
实施例 6
所述的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 可以制备成真空安碚包装 的常温保存和注射使用的针剂， 其特征在于按以下步骤构建 ：
a) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化后的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实 体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 先在含 50μg/ml 卡那霉素的 MRS 液体培养基中复苏，然后在该固体培养基上培养， 选择抗性菌落， 从而获得靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， PCR 和 SDS-PAGE 鉴定后的阳性克隆用 20％的脱脂牛奶冷冻真空干燥后保藏， 即 为靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的种子菌。
b) 将上述 a) 中所述的经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后， 涂布于含卡那霉 素的抗性 MRS 培养基上厌氧培养 48 小时， 然后挑取单一的抗性菌落于抗性 MRS 液体培养基 中增菌培养， 经 PCR 证实 tk 阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于含卡那霉素的抗性 MRS 培养基平板上厌氧培养 48 小时 ； 然后再挑取单一菌落于含卡那霉素的液体培养基中培养， 如此反复接种培养至继代培养不低于 15 代时， 经 PCR 检测证实 tk 仍然阳性的克隆， 可以作 为种子菌用于大规模液体接种扩增培养。
c) 将作为种子菌的双歧杆菌 -tk 接种在含卡那霉素的抗性 MRS 液体培养中， 在接 种后第 4、 8、 10 小时分别取样， 培养物经离心浓缩后， 进一步经 SDS-PAGE 检测 TK 蛋白的表 达情况， 确证重组载体是能够表达 TK 的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体。
d) 将培养过夜的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ( 双歧杆菌 -tk 工程菌 ) 经过含有 0.01％半胱氨酸盐酸的 PBS 洗涤菌体 5-7 次， 完全除去培养基所含有的 10 蛋白质等杂质， 最后用 10％的甘油液调整菌液浓度为 1×10 cell/ml， 然后按照每安碚分 装 2ml 含有 10％甘油的菌液， 冷冻真空干燥后常温保存， 即为靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的针剂。 虽然结合了附图描述了本发明的实施方式， 但本领域的普通技术人员可以在所附 权利要求的范围内作出各种变形或修改。本行业的技术人员应该了解， 本发明不受上述实 施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神 和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进都落入要求保护的本发 明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
背景技术 肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一， 人类全身肿瘤中 90 ％以上常见的恶性肿 瘤都是实体瘤 ； 随着环境污染的加剧， 其发病率逐年上升。实体瘤的传统治疗方法以手术、 化疗及放疗为主， 但肿瘤的转移率和治疗后的复发率都较高， 生存率仍不理想。因此， 结合 最新的肿瘤生理学和医学分子生物学研究成果， 进一步研究开发新型高效的实体瘤治疗方 法， 具有重要的社会经济意义。
利用自杀基因治疗实体瘤是近年来肿瘤基因治疗的研究热点。 所谓自杀基因治疗 肿瘤就是用基因工程技术将特定的外源基因导入肿瘤宿主细胞或肿瘤组织中， 该外源基因 表达的蛋白质能够将无毒的前体药物分解成对肿瘤细胞有毒性的药物成分， 直接杀死肿瘤 细胞， 从而达到治疗肿瘤的目的。 然而， 目前基因治疗面临的关键问题是如何解决载体的安 全性和靶向性问题， 选择一个高效、 安全、 特异性强的载体， 是实现目的基因在肿瘤细胞中 特异表达的前提。
I 型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (herpes simplex virus-1 thymidinekinase， HSV-TK)/ 丙氧鸟苷 (ganciclovir， GCV) 是目前研究最早最彻底的， 广泛用于肿瘤基因治疗 的自杀基因系统之一。 目前研究认为该自杀基因治疗肿瘤的机制有两个 ： 一是自杀效应， 即 HSV-TK 编码由 376 个氨基酸组成的胸甘激酶， 导入肿瘤细胞后， 这种胸苷激酶将无毒的丙 氧鸟苷 (GCV) 磷酸化成单磷酸丙氧鸟苷， 再进一步磷酸化为三磷酸丙氧鸟苷后， 掺合到新 合成的肿瘤细胞 DNA 链中， 使 DNA 链断裂且抑制 DNA 聚合酶活性， 从而干扰 DNA 合成导致肿 瘤细胞死亡。 另外一种是 TK-GCV 系统引发的 “旁观者效应” ， 所谓 “旁观者效应” 即是转导的 肿瘤细胞被敏感药物杀死的同时， 周围未被转导的肿瘤细胞也被杀死的现象。HSV-TK/GCV 系统通过这种独特的自杀效应或 “旁观者效应” 能选择性地杀死肿瘤细胞， 保护正常组织细 胞， 从而避免传统的化疗等治疗方法对人体带来的伤害。自 1986 年 Moolten 首先报道腺病 毒介导的 HSV-TK 基因可使肿瘤获得对某些药物的敏感性以来， 国内外学者陆续将腺病毒 介导的 HSV-TK 基因应用于肝癌、 胃癌、 舌癌、 前列腺癌、 黑色素瘤等实体瘤的基因治疗的实 验研究， 并取得了可喜进展。然而， 寻找安全有效的 tk 基因表达载体仍然是困扰 HSV-TK 基 因治疗的一大难题。
肿瘤基因治疗的载体系统主要有病毒载体和非病毒载体 ( 脂质体等 ) 两大类。由 于病毒载体本身有很多局限性， 如病毒滴度低、 生产成本高、 靶向性差 ； 同时， 对某些静止期 细胞无感染性 ( 腺病毒载体 )、 宿主范围有限、 插入宿主基因组可能引起突变及病毒本身缺 乏安全性等缺点， 因而不能满足临床应用需要， 使得该项技术还处在摸索阶段。 脂质体等非 病毒载体， 普遍存在基因转染效率低、 缺乏肿瘤特异靶向性等缺点。因而寻找一种高效、 特
利用自杀基因治疗实体瘤是近年来肿瘤基因治疗的研究热点。 所谓自杀基因治疗 肿瘤就是用基因工程技术将特定的外源基因导入肿瘤宿主细胞或肿瘤组织中， 该外源基因 表达的蛋白质能够将无毒的前体药物分解成对肿瘤细胞有毒性的药物成分， 直接杀死肿瘤 细胞， 从而达到治疗肿瘤的目的。 然而， 目前基因治疗面临的关键问题是如何解决载体的安 全性和靶向性问题， 选择一个高效、 安全、 特异性强的载体， 是实现目的基因在肿瘤细胞中 特异表达的前提。
I 型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (herpes simplex virus-1 thymidinekinase， HSV-TK)/ 丙氧鸟苷 (ganciclovir， GCV) 是目前研究最早最彻底的， 广泛用于肿瘤基因治疗 的自杀基因系统之一。 目前研究认为该自杀基因治疗肿瘤的机制有两个 ： 一是自杀效应， 即 HSV-TK 编码由 376 个氨基酸组成的胸甘激酶， 导入肿瘤细胞后， 这种胸苷激酶将无毒的丙 氧鸟苷 (GCV) 磷酸化成单磷酸丙氧鸟苷， 再进一步磷酸化为三磷酸丙氧鸟苷后， 掺合到新 合成的肿瘤细胞 DNA 链中， 使 DNA 链断裂且抑制 DNA 聚合酶活性， 从而干扰 DNA 合成导致肿 瘤细胞死亡。 另外一种是 TK-GCV 系统引发的 “旁观者效应” ， 所谓 “旁观者效应” 即是转导的 肿瘤细胞被敏感药物杀死的同时， 周围未被转导的肿瘤细胞也被杀死的现象。HSV-TK/GCV 系统通过这种独特的自杀效应或 “旁观者效应” 能选择性地杀死肿瘤细胞， 保护正常组织细 胞， 从而避免传统的化疗等治疗方法对人体带来的伤害。自 1986 年 Moolten 首先报道腺病 毒介导的 HSV-TK 基因可使肿瘤获得对某些药物的敏感性以来， 国内外学者陆续将腺病毒 介导的 HSV-TK 基因应用于肝癌、 胃癌、 舌癌、 前列腺癌、 黑色素瘤等实体瘤的基因治疗的实 验研究， 并取得了可喜进展。然而， 寻找安全有效的 tk 基因表达载体仍然是困扰 HSV-TK 基 因治疗的一大难题。
肿瘤基因治疗的载体系统主要有病毒载体和非病毒载体 ( 脂质体等 ) 两大类。由 于病毒载体本身有很多局限性， 如病毒滴度低、 生产成本高、 靶向性差 ； 同时， 对某些静止期 细胞无感染性 ( 腺病毒载体 )、 宿主范围有限、 插入宿主基因组可能引起突变及病毒本身缺 乏安全性等缺点， 因而不能满足临床应用需要， 使得该项技术还处在摸索阶段。 脂质体等非 病毒载体， 普遍存在基因转染效率低、 缺乏肿瘤特异靶向性等缺点。因而寻找一种高效、 特
异、 安全的载体系统成为近年来研究的热点。
研究表明， 厌氧细菌具有良好的肿瘤靶向定植性， 许多抗肿瘤研究已经尝试以厌 氧菌作为转移载体携带各种抑瘤基因到肿瘤组织处进行肿瘤基因治疗。 厌氧菌载体的应用 解决了传统基因治疗载体 ( 病毒载体或非病毒载体 ) 靶向性不强的问题， 避免载体在到达 肿瘤细胞的过程中所要面临的生理和免疫上的多重障碍， 提高了治疗基因在体内的表达水 平。目前， 广泛研究的厌氧菌包括梭状芽孢杆菌属、 沙门氏菌属和双歧杆菌属等。沙门氏菌 是革兰氏阴性菌， 菌体含有内毒素， 安全性要比双歧杆菌差。
双歧杆菌 (bifidobacterium) 属于革兰氏阳性菌， 严格厌氧菌， 不产生外毒素， 不 含有内毒素， 本身无致病性 ； 该菌是人体中的重要益生菌， 在健康人肠道内定植且占有一定 数量优势细菌， 广泛用于各种奶制品发酵， 其非致病性在许多国家已经得以接受， 美国食品 与药物管理局 (FDA) 将该菌的安全级别定为最高级 --A 级。Li 等将转人内皮抑素的双歧 杆菌经尾静脉注射荷瘤小鼠， 发现抑瘤效果比天然双歧杆菌更好。2008 年 Do Kyung Lee 等人用实验证实人源双歧杆菌能显著提高人的自身免疫并且抑制结肠癌细胞株的生长， 并 诱导肿瘤细胞凋亡。这些研究提示 ： 双歧杆菌可以作为肿瘤基因治疗靶向载体系统。已有 研究证明在实体瘤中存在一些低氧区域 ( 尤其是瘤体的中央区 )， 而这些低氧区域适合厌 氧菌的存活。Vaupel 等研究了肿瘤组织中的氧分压， 发现恶性实体瘤中心区域氧分压低至 2.5mmHg 以下， 远低于正常组织的 24-66mmHg， 这表明恶性实体瘤中心区域较正常组织更适 合双歧杆菌的生存。申请者在前期研究中连续 4 天将 1ml 浓度为 2.0×10 4/ml 的人双歧杆 菌活菌通过耳静脉注入健康家兔 (2.0Kg)， 血培养法结果证明 ： 双歧杆菌入血后， 不会在血 液中大量繁殖和生存， 不会出现高热和休克等菌血症表现 ； 实验组家兔脾、 肾、 骨骼肌、 心肌 和癌旁肝组织经病理学检测未见明显异常。 这些研究均表明双歧杆菌作为肿瘤基因治疗靶 向载体系统具有较高的安全性。
作为肿瘤基因肿瘤载体系统， 双歧杆菌的优越性在于 ： 第一、 作为一种胞外菌， 双 歧杆菌自身的繁殖不依赖于肿瘤细胞活动周期， 也不借助宿主细胞的各种因子启动和调控 目的基因的表达， 无组织特异性限制， 对复制和静息的肿瘤细胞均有作用。第二、 双歧杆菌 的基因组和外源基因都不可能插入宿主基因组， 不会引发宿主基因突变的风险。 第三、 双歧 杆菌对实体瘤的趋化性是针对中心的厌氧区的氧分压， 不对肿瘤的部位和性质， 具有广泛 的实用性， 不需要对肿瘤特异基因的鉴定和了解， 而且该细菌具备不依赖宿主生命周期的 独立繁殖能力， 理论上讲， 只要有一个细菌能够顺利到达肿瘤的厌氧坏死区， 就能够繁殖出 成千上万个细菌， 在局部形成高活性区， 有可能改变现有载体系统转导效率低的状况， 这表 明双歧杆菌作为载体系统具有较高转导效率。综上所述， 双歧杆菌作为肿瘤基因治疗的载 体系统具有较高的特异性、 高效性和安全性， 有可能克服以往肿瘤基因治疗中缺乏肿瘤组 织靶向性、 安全性和转导效率低等 “瓶颈” 。
就目前国内外发表的以双歧杆菌为表达载体进行肿瘤基因治疗的文献而言， 其表达系统大体上有三类 ： 一种是以 pGEX-5X-1 为主 ； 另一种是以 pBV220 为主 ； 第三 类是主要以研究者自己分离和构建的载体系统为主， 如 Kano 等改造的来源于 pTB6 的 pAV001-HU-eCD-M968 等。 他们的共同特点是大多采用了氨苄青霉素为筛选基因， 因此， 其临 床应用的安全风险非常大， 本发明针对上述表达载体的优缺点， 研发出一套安全高效的靶 向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 经专利查新证实， 国内目前关于人用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的专利未见公布。
发明内容 本发明的目的就是针对现有技术的不足， 提供一种靶向治疗实体瘤的 双歧杆菌 pBES-tk 重组载体及其用途。本发明同时提供了一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的构建方法。
为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ：
一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 其特征在于 ： 采用序列表中 的 SEQ ID № ： 1 做为表达载体， 即双歧杆菌 - 大肠杆菌穿梭表达载体 pBES ； 所述靶向治疗 实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体具有序列表中的 SEQ ID № ： 2 所表示的 tk 基因序列， 该基因为发挥治疗效应目的基因。
该靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体在肿瘤组织中能够表达 HSV-1 的 tk 基因编码的胸甘激酶 (TK)， 该 TK 将无毒的前体药物丙氧鸟苷 (GCV) 磷酸化， 成为三磷酸 丙氧鸟苷后， 掺合到新合成的肿瘤细胞 DNA 链中， 使 DNA 链 - 断裂且抑制 DNA 聚合酶活性， 从而干扰 DNA 合成导致肿瘤细胞死亡。同时， 双歧杆菌 pBES-tk 重组载体表达的 TK 系统引 发的 “旁观者效应” ， 所谓 “旁观者效应” 即周围未被 TK 直接作用的肿瘤细胞也由于双歧杆 菌 pBES-tk 重组载体表达的 TK 引发的 Caspase3 表达增加而被杀死的生物学现象。 HSV-TK/ GCV 系统通过这种独特的直接作用或 “旁观者效应” 能选择性地杀死肿瘤细胞达到治疗实体 瘤的目的。
一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的用途， 其特征在于 ： 用于靶 向治疗实体瘤。
本发明所述的一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 通过借助恶性 实体瘤中心区域的低氧分压特点 ( 氧分压比正常组织低 10 到 40 倍 ) 和双歧杆菌的专性厌 氧生活特性， 使得该重组载体经过静脉或局部注射后， 只有到达实体瘤中心的厌氧区域的 双歧杆菌才能生存， 这样， 双歧杆菌 pBES-tk 重组载体表达的 TK 被局限在实体瘤中。散布 正常组织中双歧杆菌 pBES-tk 重组载体由于高氧分压而不能存活， 即使 GCV 存在于正常组 织， 也由于缺乏 TK 而不会对正常组织细胞产生伤害， 从而使本发明所述的一种靶向治疗实 体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体达到对实体瘤的靶向性和对正常组织的无害性。
上述靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的构建方法， 其特征在于包括 以下步骤 ：
第一步， 先用化学合成方法合成 GenBank 号为 AB032875 的 HSV-1 tk 基因， 其序列 特征为 SEQ ID № ： 2； 在其 5- 端添加 BamHI 酶切位点， 3’ 端添加 SalI 酶切位点， 然后将合 成的 tk 基因片段克隆到 pGH 克隆载体中， 测序检测正确后备用， 命名为 pGH-tk ；
第二步， 将 pGH-tk 和 pBES 质粒分别转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养 10 小时后纯化 质粒， 将纯化的 pGH-tk 和 pBES 质粒分别用 BamHI 和 SalI 双酶切， 电泳分离后用凝胶纯化 试剂盒 ( 北京鼎国生物生产 ) 分离纯化 tk 基因片段和载体 pBES 片段， 用连接试剂盒 ( 大 连宝生物生产 ) 在 25℃连接 30min， 转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养过夜后挑取阳性克隆， 扩 大培养后纯化质粒， PCR 和酶切鉴定正确后， 命名为 pBES-tk， -80℃保存备用， 其序列特征 为 SEQ ID № ： 3；
第三步， a) 将双歧杆菌培养至对数生长期即 OD600 为 0.6-0.7 时， 经去离子水配制 的灭菌 10％甘油洗涤处理后， 以双歧杆菌为受体菌， 用电转化法将纯化的 pBES-tk 质粒载体转化到受体菌中 ； 转化条件为 ： 15KV、 200Ω、 25μF ； 所述的双歧杆菌为受体菌， 由中国典 型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 CCTCC No ： M203050 的两歧双歧杆菌 SHQ006 ；
b) 再 将 转 化 处 理 后 的 双 歧 杆 菌 先 在 无 抗 菌 素 的 MRS 液 体 培 养 基 中 复 苏 60-120min， 然后在含 50μg/ml 卡那霉素的 MRS 固体培养基上培养， 选择抗性菌落， 从而获 得转 tk 基因的双歧杆菌， PCR 和 SDS-PAGE 鉴定后的阳性克隆即为双歧杆菌 pBES-tk 重组 载体的种子菌。
c) 将上述经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后， 涂布于含卡那霉素的抗性 MRS 培养基上厌氧培养 48 小时， 然后挑取单一的抗性菌落于抗性 MRS 液体培养基中增菌培养， 经 PCR 证实 tk 阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于含卡那霉素的抗性 MRS 培养基平板 上厌氧培养 48 小时 ； 然后再挑取单一菌落于含卡那霉素的液体培养基中培养， 如此反复接 种培养至继代培养不低于 15 代时， 经 PCR 检测证实 tk 基因仍然阳性的克隆， 可以作为种子 菌用于大规模液体接种扩增培养， 培养物经离心浓缩和洗涤纯化， 进一步制备成转 tk 基因 的双歧杆菌 -tk 重组载体实体瘤治疗的制剂。
该实体瘤治疗系统的优点是经静脉注射或肿瘤局部注射后， 双歧杆菌通过血液 循环进入实体瘤组织， 在实体瘤中心的低氧区， 双歧杆菌存活下来并快速繁殖， 将 TK 蛋白 直接表达在肿瘤中心区域， 并将随后注射的 GCV 分解为对肿瘤细胞有毒性的三磷酸丙氧鸟 苷。由于三磷酸丙氧鸟苷只产生在有 TK 存在的肿瘤组织的中心区， 它能够被肿瘤组织及时 和有效地吸收， 有利于增加药物的生物利用效率， 减少对周围正常组织的毒副作用。同时， 双歧杆菌的大量繁殖， 也能够激活肌体的非特异性免疫， 有利于增强对肿瘤的抗性。 一旦肿 瘤组织被消灭殆尽， 该区域的低氧厌氧条件也被破坏， 双歧杆菌的生存环境亦不复存在， 进 入正常组织的双歧杆菌处于高氧分压环境， 不能繁殖， 肌体会自动清除这些完成使命的双 歧杆菌， 不会造成后遗症和副作用。
该靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的发酵生产成本十分低廉， 得到 的发酵液活菌数量大、 菌体活性高， 经过纯化精制后将纯化的菌体冷冻干燥后在安碚中真 空包装， 可以随时使用。
本发明一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的有益效果是， 运用基 因工程方法将 tk 基因连接到发明人拥有的双歧杆菌 - 大肠杆菌穿梭表达载体 pBES 中， 通 过质粒转化方法把 tk 基因导入到人体生菌 - 双歧杆菌中制成双歧杆菌 (Bifidobacterium sp.) 为表达载体的 tk 重组载体肿瘤基因治疗系统， 即双歧杆菌 pBES-tk 重组载体靶向治疗 实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体。 附图说明 图 1 是本发明的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的结构示意图 ； 其 中， (1)tk 是四环素 tet0 启动子驱动的 HSV-1 的 tk 基因序列区 ；
图 2 是本发明中用 MNU 诱导后的小鼠膀胱癌 ；
图 3 是本发明中小鼠膀胱癌经靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk/GCV 重组载体 ( 简称双歧杆菌 pBES-tk/GCV， 下同 ) 治疗后的 TUNEL 法原位检测图， 结果发现， 各组均出现 不同程度的肿瘤细胞核呈棕褐色染色 ( 见图 A、 B、 C)。 各组的凋亡指数值分别为生理盐水组 A(14.33±5.29％ )、 空质粒双歧杆菌组 B(15.50±4.34％ ) 和重组质粒双歧杆菌 pBES-tk/
GCV 治疗组 C(29.44±6.64％ )。 重组质粒双歧杆菌 pBES-tk/GCV 治疗组的凋亡指数值明显 高于生理盐水组和空质粒双歧杆菌组 (P ＜ 0.05)， 表明凋亡细胞明显增加。说明该系统治 疗小鼠膀胱癌是有效的 ；
图 4 是 CaSki 细胞移植到裸鼠皮下的成瘤图 ；
图 5 是本发明靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗裸鼠实体瘤模型 后的效果检测示意图。 具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明， 但并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。
实施例 1
一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 其特征在于 ： 采用序列表中 的 SEQ ID No ： 1 做为表达载体， 即双歧杆菌 - 大肠杆菌穿梭表达载体 pBES ； 所述靶向治疗 实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体具有序列表中的 SEQ ID № ： 2 所表示的 tk 基因序列， 该基因为发挥治疗效应目的基因。 靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的构建方法 ：
第一步， 先用化学合成方法合成 GenBank 号为 AB032875 的 HSV-1tk 基因， 其序列 特征为 SEQ ID № ： 2； 在其 5- 端添加 BamHI 酶切位点， 3’ 端添加 SalI 酶切位点， 然后将合 成的 tk 基因片段克隆到 pGH 克隆载体中， 测序检测正确后备用， 命名为 pGH-tk ；
第二步， 将 pGH-tk 和 pBES 质粒分别转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养 10 小时后纯化 质粒， 将纯化的 pGH-tk 和 pBES 质粒分别用 BamHI 和 SalI 双酶切， 电泳分离后用凝胶纯化 试剂盒 ( 北京鼎国生物生产 ) 分离纯化 tk 基因片段和载体 pBES 片段， 用连接试剂盒 ( 大 连宝生物生产 ) 在 25℃连接 30min， 转化大肠杆菌 DH5α， 37℃培养过夜后挑取阳性克隆， 扩 大培养后纯化质粒， PCR 和酶切鉴定正确后， 命名为 pBES-tk， -80℃保存备用， 其序列特征 为 SEQ ID № ： 3；
第三步， a) 将双歧杆菌培养至对数生长期即 OD600 为 0.6-0.7 时， 经去离子水配制 的灭菌 10％甘油洗涤处理后， 以双歧杆菌为受体菌， 用电转化法将纯化的 pBES-tk 质粒载 体转化到受体菌中 ； 转化条件为 ： 15KV、 200Q、 25μF ； 所述的双歧杆菌为受体菌， 由中国典 型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 CCTCC No ： M203050 的两歧双歧杆菌 SHQ006 ；
b) 再 将 转 化 处 理 后 的 双 歧 杆 菌 先 在 无 抗 菌 素 的 MRS 液 体 培 养 基 中 复 苏 60-120min， 然后在含 50μg/ml 卡那霉素的 MRS 固体培养基上培养， 选择抗性菌落， 从而获 得转 tk 基因的双歧杆菌， PCR 和 SDS-PAGE 鉴定后的阳性克隆即为靶向治疗实体瘤的双歧 杆菌 pBES-tk 重组载体的种子菌。至此， 靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体构 建成功， 结果见说明书附图 1。
实施例 2
靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的用途是通过静脉或局部注射的 方式进行肿瘤的基因治疗， 因此， 其安全性是首先要考虑的重要问题之一， 经动物在体试 验证明， 本发明所使用的表达载体 pBES-tk 的宿主菌双歧杆菌的特征在于 ： 所述的双歧杆 菌 - 重组载体 pBES-tk 用于肿瘤的基因治疗是以双歧杆菌为受体菌进行静脉注射的方式给
药， 经动物在体试验证明， 该双歧杆菌 ( 受体菌 ) 经静脉进入动物体内后， 对受药动物是没 有任何病理伤害的， 因此， 该系统经静脉注射使用是安全的。
以家兔为动物模型， 在家兔静脉注射本发明所述的双歧杆菌进行安全性试验的实 施例说明如下 ：
a) 从重庆医科大学实验动物中心领取体重为 2Kg 的健康雄性家兔 6 只。
b) 将双歧杆菌培养 12 小时使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBSbuffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×104cell/ml。
c) 将 2.0ml 浓度 1.0×104cell/ml 的双歧杆菌 ( 没有进行外源性内毒素检测和 处理 ) 经耳静脉注射到上述 a) 所述的家兔体内， 3 日内观察实验兔与对照之间的体征差异 ( 如活动能力、 取食能力、 是否有震颤、 竖毛、 粪便拉稀等 )， 和存活情况， 3 日内共进行 3 次注 射。结果发现， 注射后 5 小时内实验兔没有发现活动能力和取食能力的变化， 也没有震颤、 竖毛和粪便拉稀等其他体征差异和变化， 更没有死亡个体。
d) 将上述 c) 中所取的血样进行血象分析， 主要测量红、 白细胞和血小板的变化。 经统计学分析发现， 除了白细胞数量在初次注射后有较明显的升高外， 红细胞和血小板未 见有统计学意义的变化， 第 3 次注射后， 白细胞数量恢复到初次注射前的基本状态， 不再有 明显的升高现象。 e) 将第 3 次注射后的动物 8 小时后麻醉处死， 取心脏、 肝脏、 脾脏、 肾脏进行病理学 检测， 同时以正常家兔的上述组织做对照。 结果发现， 该受体菌进入动物体内后对心脏等主 要的脏器无病理损害。
实施例 3
用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗原位实体瘤 ( 膀胱癌 ) 的方 法如下 ：
a) 在重庆医科大学动物试验中心购买 SD(Sprague-Dawley) 大鼠 30 只 ( 雌性 )， 经 MNU 诱导成瘤后待用 (9 周 )， 结果见说明书附图 2。
b) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实体 瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 培养过夜， 使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBS buffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×1010cell/ ml。
c) 将上述 a) 中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为 A、 B、 C 3 组， 每组 9 只， 其中 A 组每 8 只经尾静脉注射 1ml 浓度 4.0×10 cell/ml 的双歧杆菌 -tk 工程菌 ； B 组注射同样浓度的双 歧杆菌空白对照 ( 只转化 pBES 空质粒 ) ； C 组注射同样体积的 PBS， 逐日观察动物的体征， 并 称量体重， 记录食量。 注射双歧杆菌 -tk 工程菌后的第二天开始经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 随后按照 ABC 组分组分别注射双歧杆菌 -tk 工程菌及其相应的对照物， 每周注射一次， 连续 注射 4 周 ； 次日对上述大鼠经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 每天一次， 注射 4 周。结果证明， 靶 向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗的 A 组动物， 发现肿瘤体积明显缩小， 重量 减轻 ； 进一步通过免疫组织化学方法检测发现双歧杆菌介导的 HSV-TK/GCV 治疗荷瘤大鼠 膀胱癌后激活型的 Caspase3 表达增加， 通过 TUNEL 方法证实治疗后肿瘤切片中凋亡细胞明 显增加， 说明该系统对原发性实体瘤的治疗有效。结果见说明书附图 3。
实施例 4
用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗转移实体瘤 ( 宫颈癌 Caski 细胞转移 ) 的方法如下 ：
a) 在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠 10 只 ( 雌雄不限 )， 经尾静脉注射 1ml 6 浓度 1.0×10 cell/ml 的人 CaSki 细胞， 20 天后随机检测肿瘤形成情况， 结果见说明书附图 4。
b) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实体 瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 培养过夜， 使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBS buffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×104cell/ml。
c) 将上述 a) 中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为 A、 B、 C 3 组， 每组 3 只， 其中 A 组每 4 只经尾静脉注射 1ml 浓度 1.0×10 cell/ml 的双歧杆菌 -tk 工程菌 ； B 组注射同样浓度的双 歧杆菌空白对照 ( 只转化 pBES 空质粒 ) ； C 组注射同样体积的 PBS， 逐日观察动物的体征， 并 称量体重， 记录食量。 注射双歧杆菌 -tk 工程菌后的第二天开始经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 随后按照 ABC 组分组分别注射双歧杆菌 -tk 工程菌及其相应的对照物， 每周注射一次， 连续 注射 4 周 ； 次日对上述大鼠经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 每天一次， 注射 4 周。结果证明， 靶 向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体治疗的 A 组动物， 发现肿瘤体积明显缩小， 重量 减轻， 说明该系统对移植瘤 ( 或转移瘤 ) 的治疗同样有效， 结果见说明书附图 5。
实施例 5
用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体局部注射治疗转移实体瘤 ( 宫颈 癌 Caski 细胞转移 ) 的方法如下 ：
a) 在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠 10 只 ( 雌雄不限 )， 经尾静脉注射 1ml 6 浓度 1.0×10 cell/ml 的人 CaSki 细胞， 20 天后随机检测肿瘤形成情况， 结果见说明书附图 4。
b) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实体 瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 培养过夜， 使 OD600 为 1.2-1.5 时， 双歧杆菌菌液用 PBS buffer( 含 0.01％的半胱氨酸盐 ) 洗涤 3 次， 最后用 PBS 调整细菌浓度为 1.0×104cell/ml。
c) 将上述 a) 中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为 A、 B、 C 3 组， 每组 3 只， 其中 A 组每 4 只经肿瘤组织内部局部注射 1ml 浓度 1.0×10 cell/ml 的双歧杆菌 -tk 工程菌 ； B 组局部注 射同样浓度的双歧杆菌空白对照 ( 只转化 pBES 空质粒 ) ； C 组局部注射同样体积的 PBS， 逐 日观察动物的体征， 并称量体重， 记录食量。注射双歧杆菌 -tk 工程菌后的第二天开始经腹 腔注射 GCV(50mg/Kg)， 随后按照 ABC 组分组分别局部注射双歧杆菌 -tk 工程菌及其相应的 对照物， 每周注射一次， 连续局部注射 4 周 ； 次日对上述大鼠经腹腔注射 GCV(50mg/Kg)， 每 天一次， 注射 4 周。结果证明， 靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体经局部注射治 疗的 A 组动物， 发现肿瘤体积明显缩小， 重量减轻， 说明该重组载体经肿瘤组织局部注射对 移植瘤 ( 或转移瘤 ) 的治疗与静脉注射治疗的效果一样。
实施例 6
所述的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， 可以制备成真空安碚包装 的常温保存和注射使用的针剂， 其特征在于按以下步骤构建 ：
a) 将双歧杆菌 pBES-tk 重组载体转化后的双歧杆菌 -tk 工程菌 ( 即靶向治疗实 体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ) 先在含 50μg/ml 卡那霉素的 MRS 液体培养基中复苏，然后在该固体培养基上培养， 选择抗性菌落， 从而获得靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体， PCR 和 SDS-PAGE 鉴定后的阳性克隆用 20％的脱脂牛奶冷冻真空干燥后保藏， 即 为靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的种子菌。
b) 将上述 a) 中所述的经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后， 涂布于含卡那霉 素的抗性 MRS 培养基上厌氧培养 48 小时， 然后挑取单一的抗性菌落于抗性 MRS 液体培养基 中增菌培养， 经 PCR 证实 tk 阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于含卡那霉素的抗性 MRS 培养基平板上厌氧培养 48 小时 ； 然后再挑取单一菌落于含卡那霉素的液体培养基中培养， 如此反复接种培养至继代培养不低于 15 代时， 经 PCR 检测证实 tk 仍然阳性的克隆， 可以作 为种子菌用于大规模液体接种扩增培养。
c) 将作为种子菌的双歧杆菌 -tk 接种在含卡那霉素的抗性 MRS 液体培养中， 在接 种后第 4、 8、 10 小时分别取样， 培养物经离心浓缩后， 进一步经 SDS-PAGE 检测 TK 蛋白的表 达情况， 确证重组载体是能够表达 TK 的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体。
d) 将培养过夜的靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体 ( 双歧杆菌 -tk 工程菌 ) 经过含有 0.01％半胱氨酸盐酸的 PBS 洗涤菌体 5-7 次， 完全除去培养基所含有的 10 蛋白质等杂质， 最后用 10％的甘油液调整菌液浓度为 1×10 cell/ml， 然后按照每安碚分 装 2ml 含有 10％甘油的菌液， 冷冻真空干燥后常温保存， 即为靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk 重组载体的针剂。 虽然结合了附图描述了本发明的实施方式， 但本领域的普通技术人员可以在所附 权利要求的范围内作出各种变形或修改。本行业的技术人员应该了解， 本发明不受上述实 施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神 和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进都落入要求保护的本发 明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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