ORF7 缺陷型水痘病毒株、 含有该毒株的疫苗及其应用 技术领域 本发明涉及病毒学和生物药学领域。 具体而言， 本发明提供了缺陷型水痘病毒株、 含有该毒株的疫苗及其应用， 为水痘 - 带状疱疹病毒的治疗和预防提供良好的候选疫苗药 物。
技术背景
水痘 - 带状疱疹病毒 (Varicella zoster virus ： VZV， 简称 “水痘病毒” 或 “VZV” ) 是严格种属特异性的病毒， 是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。美国专利 3985615 中 公开了 P-Oka 株通过豚鼠胚胎组织 (GPEC) 多次传代， 产生减毒的 V-Oka 病毒， 制备预防水 痘的 V-Oka 活疫苗。 美国专利 4000256 中叙述了用人胚成纤维细胞 WI-38 株传代培养 VZV 病 毒 10-80 次生产 VZV 减毒疫苗。迄今为止， 只有 P-Oka 株经细胞传代获得的 “水痘病毒减毒 冈株” ( 特公昭 53-41202 号公报 ) ； Lancet 2 ： 1288-1290， 1974) 为 WHO 批准的唯一用于预防 水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株， 该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用 [Requirement for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984 ： WHOTechnical Report Series， No.725， pp.102-104， 1985]。
水痘病毒减毒冈株鉴定的专利 CN1163604C， 从分子水平上揭示该毒株是由多个不 同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中， 源于 V-Oka 疫苗接种者产生 V-Oka 株的带 状疱疹已有报道。故该减毒株的潜在危害性还是存在的， 但是， 现在还没有其它抗 VZV 的疫 苗株上市。 该病毒具有严格种属特异性， 人是其唯一的自然宿主， 病毒基因的功能研究难度 较大 ； 再者该病毒对细胞具有强烈的依赖性， 获得可用于转化的 VZV 病毒 DNA 非常困难， 故 该病毒的研究进展较为缓慢。
随着分子遗传学研究的飞速发展， 基因操作手段的不断革新， 基 因插入或删除成 为发现新基因或研究基因功能的重要手段， 突破了 VZV 基因研究的瓶颈。1993 年 Jeffrey I. 等在 “Generation ofvaricella-zoster virus(VZV)and viral mutants from cosmid DNA s ： VZV thymidylate synthetase is not essential for replication invitro” 一文中通过科斯质粒 (Cosmid) 实现对腺苷合成酶基因的操作， 揭示将终止密码子引入腺 苷合成酶基因导致该酶不表达， 但不影响病毒生长速率和对阿昔洛韦的敏感性。这项研 究开创了体外 VZV 基因操作方法， 为基因功能研究奠定了基础。2000 年 George W 等在 “OpenReading Frame S/L of Varicella-Zoster Virus Encodes aCytoplasmic Protein Expressed in Infected Cells” 一文中描述了通过基因部分结构删除的方法发现了 VZV 新基因， 即 ORF S/L。随着细菌人工染色体 (BAC) 在研究中的应用， 组织培养技术的进 步， 异种生物间器官移植屏障的突破 ( 联合免疫缺陷型小鼠的开发 )， 拓宽了种属特异 的 VZV 基因功能研究的空间， 可以在体外或动物体内进行 VZV 基因功能研究。2004 年 Kazuhiro N. 等在 “Cloning of thevaricella-zoster virus genome as aninfectious bacterialartificial chromosome in Escherichia coli” 一文中揭示被克隆到 BAC 载体 上的 VZV Oka 株全基因组， 可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖， BAC 可被一同转化到人胚肺细胞中的 Cre 酶精确切除， 产生的重组 VZV 病毒具有 p-Oka 同样结构， 完全具有亲本病 毒的特性。BAC 的应用为 VZV 的功能研究带来了极大便利， 加速了 VZV 基因功能研究进程。 2007 年 Zhang Z. 等利用 BAC 载体和基因同源重组技术揭示多个基因的体内外功能。 发明内容
本申请人以含 P-Oka 全基因组的 BAC(VZV-BAC) 为基础， 通过基因重组手段， 获得 ORF7 缺失的病毒株 VZV-7D， 保藏号为 ： CGMCC3207， 保藏日期为 2009 年 7 月 28 日， 保藏单位 名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏单位地址为北京市 朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所 ( 邮编 100101)， 该保藏的病毒株 VZV-7D 的分类命 名为水痘病毒。体内外证实该病毒株不感染皮肤和感觉神经节， 故不存在再活化产生带状 疱疹的潜在危害 ； 该毒株可在 MRC-5、 Mewo 细胞上生长， 且同 P-Oka 株生长一致 ； 该毒株保 留了 P-Oka 株的所有糖蛋白， 其免疫原性理应同 P-Oka 株的免疫力相同 ； 该毒株是通过 Kanr 筛选到的单一克隆株， 不存于混合型 V-Oka 株的潜在危害 ； 由于整个 ORF7 删除， VZV-7D 株 不可能产生回复突变， 因而， 以 VZV-7D 株制备减毒活疫苗更为安全和有效。 而且， VZV-7D 至 少可以克隆 10kb 的外源基因而不影响其本身生长和增殖， 故可以用作外源基因表达载体， 制备用于诊断、 预防和治疗的生物制品。 申请人如下进行了 P-Oka 株 ORF7 缺失株 (VZV-7D) 的制备。因为水痘 - 带状疱疹 病毒 (VZV) 的 ORF7 位于病毒基因组的 8607-9386bp 之间， 编码一个 29kDa 的蛋白， 可能位 于皮层结构中， 它的功能仍不清楚。 VZV ORF7 蛋白与单纯疱疹病毒 (HSV) 中的 UL51 为同源 蛋白。HSV UL51 基因编码一个磷酸化蛋白， 分子量约为 27， 29 和 30kDa， 在感染后期表达， 与病毒出细胞体有关 (Daikoku， Ikenoya et al， 1998)。一项研究报告指出 HSV UL51 蛋白 定位于感染细胞的高尔基体标志蛋白上， UL51 蛋白通过 N- 端第 9 位的半胱氨酸铆钉到高 尔基体上 (Nozawa， Daikoku， et al， 2003)。UL-51 无效突变揭示其在 HSV 复制循环中的作 用。最近的研究显示突变株病斑较小， 最大滴度比野生株降了 100 倍。电子显微镜显示核 衣壳的形成不受 UL51 删除影响， 但是， 病毒出核周质腔受到严重影响， 这现象揭示 UL51 蛋 白涉及到 HSV 病毒颗粒的成熟和出核 (Nozawa， Kawaguchi et al.2005)。通过伪狂犬病毒 (PrV)UL51 缺失突变揭示此基因表达产物也具有相似的功能。 一步生长曲线揭示 PrV-De lt aUL51F 不仅滴度稍有下降， 而且病斑减小明显， 只有野生株大小的 30％。细胞质内的衣壳 大量存在， 病毒无包被或处于包被不同阶段， 所以， 研究结果推断 UL51 蛋白参与病毒的外 出， 对病毒复制不是必需的 (Klupp， Granzow et al.2005)。
本发明以来自斯坦福大学医学院 Dr.Ann Arvin 实验室的 P-Oka 临床分离株为材 料， 以 VZV-BAC(P-Oka) 为框架， 应用细菌同源重组原理产生重组克隆。 全长 ORF7 被 Kanr 基 因取代而产生 7D-VZVBAC。7D-VZVBAC 与含 Cre 酶的重组质粒一同电转 MRC-5 细胞， 产生无 ORF7 的水痘病毒 (VZV-7D) 克隆株。
VZV ORF7 删除突变体构建基于 luc VZV BAC(Zhang et al.2007)。操 作过程见 图 1。A. 大肠杆菌 DY380 株提供高效同源重组系统， 所需同源序列短至 40bp。同源重组酶 受温度控制， 32℃抑制 /42℃激活。B. 删除 ORF7， 设计的两条引物包含 20bp 的卡那霉素抗 性基因同源核苷酸序列和 ORF7 删除区起始或终止密码子相连的 40bp 同源序列。
上游引物 (F) ：
GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CGC TCT TGTTGG CTA GTG CGT A(SEQ ID NO ： 1)，
下游引物 (R) ：
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAGTGT TAC AAC CAA(SEQ ID NO ： 2)。
卡 那 霉 素 抗 性 基 因 从 质 粒 pGEM-or iV/kan1 上 扩 增 (Netterwald， Yang etal.2005)， PCR 产物用 DpnI 酶进行消化， 用 Qiagen 凝胶提取试剂盒进行回收。C. 以 1.6ky， 250μF 的 BioRad Gene Pulser II 电转仪将大约 200ng 的 PCR 产物转进载有 VZVLuc BAC 的 DY380 菌体中。D. 利用重组酶 42 ℃激活 /32 ℃抑制的特性， 完成 Kanr 基因与 ORF7 的同源重组， ORF7 被 Kanr 基因取代， 在 32℃下从含有 30μg/ml 卡那霉素的琼脂板上选择 单克隆的重组子， 从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株 (ORF7 缺失 )VZV-BAC 的 DNA。E. 所 得病毒基因组完整性由 HindIII 酶切检验， 重组 DNA 经 PCR 检验。F.7D-BACDNA 在 DY380 中增殖并被纯化提取。G. 所得的 7D-BACDNA 单独电转染至 (Marchini， Liu et al.2001) MRC-5 细胞， 产生 7D-BAC， BAC 上带的 GFP 可以用于病毒在细胞中生长增殖研究或与 Cre 表 达载体一同电转染至 (Marchini， Liu et al.2001)MRC-5 细胞， BAC 被 Cre 酶从其两端的 loxP 酶切位点完全切除， 产生 VZV-7D 病毒。VZV-7D 在 Mewo 细胞或 MRC-5 细胞中的生长 特性同 P-Oka 一致， 也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性， 但是， 缺失突变的 VZV-7D 不感染皮肤、 神经瘤细胞和感觉神经节， 这为疫苗的开发带来了希望。 含有荧光素酶基因的 VZV-7D(VZV-7DLuc) 按照 Zhang 等 (Journal of Virology， Sept， 2007， p， 9024-9033) 描述 的方法进行构建。VZV-7DLuc 可用于体内 VZV-7D 功能研究的监测。目前尚无任何 VZV-7D 的 学术报道。据此完成了本发明。 附图说明
图1： 水痘 ORF-7 缺陷型 (7D) 病毒制备。 图2： ORF7 缺失的 VZV 病毒鉴定。 图 3、 水痘 ORF-7 回复突变 (VZV-7R) 病毒制备。 图 4、 VZV-7D 在人体 MeWo 细胞中生长曲线。 图 5、 7D 在人胸腺组织培养 (TOC) 系统中的生长曲线分析。 图 6、 VZV-7D 在人皮肤组织培养 (SOC) 系统中的生长曲线分析。 图 7、 VZV-7D 的背根神经节培养。 图 8、 BAC-VZV 构建及 Mewo 细胞中培养。具体实施方案
实施例 1 ： VZV-7D 的鉴定
VZV-7D 感染长成单层的 MRC-5 细胞， 用含 2％牛血清的 MEM 培养基培养， 约 80％ 细胞病变发生时， 弃培养基， 收获病变细胞， 提取 DNA， 以 P-Oka 为对照进行试验。PCR 扩增 ORF-10 和 ORF-7 基因， 用 HindIII 消化 VZV-7D 和 P-Oka 株的 DNA。PCR 产物和 HindIII 消 化产物用 0.5 ％的琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳产物见图 2。VZV-7D 对 ORF-10 的 PCR 产物 同 P-Oka 一致， 但在 ORF-7 上没有条带， 证实 ORF-7 缺失。HindIII 对病毒的酶切图谱上，VZV-7D 和 P-Oka 间看不出差别
实施例 2 ： VZV-7D 的回复突变体 (VZV-7R) 制备
ORF7 缺失正确与否不仅可以用 HindIII 酶切鉴定， 而且可以通过基因的同源重 组获得完整的 VZV 加以验证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的 VZV， 见图 3。利 用 Invitrogen 的高保真 Taq DNA 聚合酶试剂盒 PCR 扩增 ORF7 片段， 并将其克隆到质粒 pGEM-lox-zeo 的 NotI 和 BglII 位 点 之 间， 从 而 形 成 pGEM-zeo-ORF7 质 粒。 该 克 隆 片 段 通过测序分析鉴定正确， 且通过 PCR 扩增没有错误密码子被引入 ORF7 编码框中。之后以 pGEM-zeo-ORF7 质粒为模板用下述引物 PCR 扩增 zeoR-ORF7 编码框。
正向引物 ：
GAT TTA TCCATA GTTCAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG(SEQ ID NO ： 3) ；
反向引物 ：
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCATAA CTT CGT(SEQ IDNO ： 4)，
得到的 PCR 产物是两端各含一段 40bp 大小与水痘病毒基因组同源的基因， 与 kanR 编码框顺序相连， 位于 ORF7 缺失的位点。将得到的这段嵌合 PCR 产物按上文提到 的 方 法 电 转 化 到 携 带 有 ORF7D BAC 的 DY380 菌 体 中。 重 组 体 要 通 过 含 有 50μg/ml 的 zeocin(Invitrogen) 和 12.5μg/ml 的氯霉素的琼脂平板 32℃培养筛选。正确的 VZV 克隆 通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、 潮霉素抗性、 zeoc in 抗性、 卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性。 这些克隆进一步被酶切消化和 PCR 分 析确证正确。鉴定正确的克隆 ( 即携带有 ORF7 缺失或者 1uc VZV BAC 拯救子的大肠杆菌 DY 380) 接种于含 12.5μg/ml 的氯霉素的 500mlLB 培养基中 32℃培养 20 小时。VZVBAC 的 DNA 通过 BAC DNA 大量提取试剂盒 (BD Biosciences， Palo Alto， CA) 分离得到， 并且利用 转染试剂 FuGene6(Roche， Indi anapolis， IN) 按照使用说明转染到 MRC-5 细胞。6 孔板中 的一孔 (35-mm) 在转染时 DNA 与转染试剂的使用比例为 1.5μg ： 6μl。一般情况转染后 3 天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除 BAC 载体 ( 两侧有 loxP 酶切位点 )， 可 将 Cre 表达载体与 VZV BAC DNA 一起共转染 (Marchini， Liu et al.2001)MRC-5 细胞， 利用 Cre 酶的特性而精确切除 BAC， 产生完整的 VZV。
水痘 ORF-7 回复突变病毒具有同 P-Oka 病毒相同的生长和增殖特性。说明 ORF-7 的功能可以通过回复突变手段得到恢复。
实施例 3 ： VZV-7D 病毒的 Mewo 细胞培养
六孔板中长成单层的 Mewo 细胞分别用 VZV-7D、 VZV-7R 和 P-Oka 株感染， 以未感染 的 Mewo 细胞作对照， Mewo 细胞在 37℃下用含 2％牛血清的 MEM 培养基培养。感染 24 小时 后， D-luciferin 加到培养的细胞孔中， 终浓度为 150μg/ml， 37℃培养 10 分钟， 不同孔的 生物荧光用体内成像系统 IVIS(50Series ； Xenogen Corporation， Alameda， CA) 同时测量 光子数， 每天测量 3 孔感染细胞， 测量后， 细胞用病毒培养液取代 D-luciferin 物质继续培 养。 病毒荧光量每 24 小时测量一次， 连续测量 7 天。用 3 孔测量的数据均值对时间绘制 生长曲线。结果见图 4。
人 MeWo 细胞不被感染或者被水痘 - 带状疱疹病毒野生株 (1ucVZV) 或者 7D 突变株或者 7D 回复株 (1uc 7R) 感染、 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数， 用3孔 测量的均值对时间绘制生长曲线， 图中标出 3 孔测量数据的误差线。本试验表明 VZV-7D 和 VZV-7R 和野生株一样都可以在 MeWo 细胞中正常生长。
实施例 4、 7D 病毒在人胸腺组织的培养
人胸腺 - 肝脏联合移植体异体移植到雄性的 CB-17SCID/beige 鼠内。人胸腺 - 肝 脏联合移植体构建和使用按 Jennifer F.M(Journal of Virology， Sept.1995， p.5236 5242) 描述的方法进行。移植 3 月后， 人胸腺 - 肝脏移植体经外科手术暴露后， 直接注射 3 3 2×10 至 4×10 PFU 的 Mewo 培养的含有荧光素酶的 VZV-7D 和 P-Oka， 10-20μl 细胞悬液， 每种病毒感染 3 只小鼠， 以未感染鼠为对照， 感染后每天测量荧光量。腹腔注射 250μl 荧 光素酶底物， 即 D-luciferin10 分钟后， 用生物荧光体内成像系统 IVIS 在移植区按实施例 3 的方法测量荧光量， 每种病毒测量 3 只小鼠。结果见图 5。
培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受 VZV 野生株或者 VZV-7D 株感染， 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数。用 3 只鼠测量的光子数均值对时间绘制生长曲 线。图中显示 3 只测量数据的误差线。本试验表明 7D 缺陷株像野生株一样能在胸腺组织 (T- 细胞 ) 中生长。 实施例 5 ： 7D 病毒的皮肤培养
人胚胎皮肤完整结构按 Jennifer F.M(Journal of Virology， Sept.1995， p.5236 5242) 描述的方法， 异体移植到联合免疫缺陷 (SC ID) 小鼠皮下。移植 4 周后， 三种含荧光 素酶的 VZV-7D、 VZV-7R 和 P-Oka 株感染皮肤， 每种病毒感染 3 只小鼠， 以未感染鼠为对照， 感染后每天测量荧光量。 腹腔注射 250μl 荧光素酶底物， 即 D-luciferin10 分钟后， 用生物 荧光体内成像系统 IVIS 在移植区按实施例 3 的方法测量荧光量， 每种病毒测量 3 只小鼠。 结果见图 6。
培养的人皮肤组织被病毒野生株或者 7D 缺失株或者 7D 回复突变株感染、 以不被 感染的鼠为对照， 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数， 用 3 只测量的光子均值 对时间绘制生长曲线。图中标出 3 只测量数据的误差线。实验证实 VZV-7D 在皮肤中有严 重生长缺陷， 这种功能缺陷在 VZV-7D 株回复突变后可以被恢复。
实施例 6 ： VZV-7D 病毒的背根神经节培养
用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠 20 周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节 (DRG)， 分离的背根神经节用含 1％青霉素 / 链霉素的冰浴 1XPBS 瞬时洗涤， 然后转到冰浴 的培养基 (DEM， 含 15％热灭活的胎牛血清和 1％青霉素 / 链霉素 )， 将每个背根神经节单独 放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上， 加 0.5ml 培养基， 培养 5 天， 其间换培养基一次。六孔 细胞板中制备 50％ Mewo 细胞培养物， 用于滴度检测和生长曲线分析。第 6 天收获 P-Oka， VZV-7D 和 VZV-7R 新近感染的 Mewo 细胞， 于培养基悬浮至 1ml。每个背根神经节单独饲养 在六孔板中胶原包被的盖玻片上。10μl 悬液用于病毒滴度检测， 2μl 用于 Mewo 细胞感染 的生长曲线。其余细胞悬液用力通过 27 针管 20 次， 细胞碎片通过 4000rpm 离心 10min 沉 淀。上清均分， 用于感染背根神经节， -120μl/ 样品， 另外， 2 滴 (20μl) 细胞悬液用于感染 另一个背根神经节， 37℃ 5％ CO2 下培养 3 小时后， 背根神经节用 1×PBS 洗涤， 再补加新鲜 培养基。每 24 小时检测一次荧光素酶活性。样品用含 150μg/ml 的 D-luciferin 37℃培 养 10 分钟后， 用 IVIS 仪器和软件分析光子数。检测结果见图 7， 结果表明 VZV-7D 在 Mewo
上生长正常， 而在背根神经节中几乎不生长。
VZV-7D 不感染背根神经节细胞， 这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。
实施例 7 ： VZV-7D 病毒可作为外源基因的表达载体
技术背景
水痘 - 带状疱疹病毒 (Varicella zoster virus ： VZV， 简称 “水痘病毒” 或 “VZV” ) 是严格种属特异性的病毒， 是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。美国专利 3985615 中 公开了 P-Oka 株通过豚鼠胚胎组织 (GPEC) 多次传代， 产生减毒的 V-Oka 病毒， 制备预防水 痘的 V-Oka 活疫苗。 美国专利 4000256 中叙述了用人胚成纤维细胞 WI-38 株传代培养 VZV 病 毒 10-80 次生产 VZV 减毒疫苗。迄今为止， 只有 P-Oka 株经细胞传代获得的 “水痘病毒减毒 冈株” ( 特公昭 53-41202 号公报 ) ； Lancet 2 ： 1288-1290， 1974) 为 WHO 批准的唯一用于预防 水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株， 该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用 [Requirement for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984 ： WHOTechnical Report Series， No.725， pp.102-104， 1985]。
水痘病毒减毒冈株鉴定的专利 CN1163604C， 从分子水平上揭示该毒株是由多个不 同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中， 源于 V-Oka 疫苗接种者产生 V-Oka 株的带 状疱疹已有报道。故该减毒株的潜在危害性还是存在的， 但是， 现在还没有其它抗 VZV 的疫 苗株上市。 该病毒具有严格种属特异性， 人是其唯一的自然宿主， 病毒基因的功能研究难度 较大 ； 再者该病毒对细胞具有强烈的依赖性， 获得可用于转化的 VZV 病毒 DNA 非常困难， 故 该病毒的研究进展较为缓慢。
随着分子遗传学研究的飞速发展， 基因操作手段的不断革新， 基 因插入或删除成 为发现新基因或研究基因功能的重要手段， 突破了 VZV 基因研究的瓶颈。1993 年 Jeffrey I. 等在 “Generation ofvaricella-zoster virus(VZV)and viral mutants from cosmid DNA s ： VZV thymidylate synthetase is not essential for replication invitro” 一文中通过科斯质粒 (Cosmid) 实现对腺苷合成酶基因的操作， 揭示将终止密码子引入腺 苷合成酶基因导致该酶不表达， 但不影响病毒生长速率和对阿昔洛韦的敏感性。这项研 究开创了体外 VZV 基因操作方法， 为基因功能研究奠定了基础。2000 年 George W 等在 “OpenReading Frame S/L of Varicella-Zoster Virus Encodes aCytoplasmic Protein Expressed in Infected Cells” 一文中描述了通过基因部分结构删除的方法发现了 VZV 新基因， 即 ORF S/L。随着细菌人工染色体 (BAC) 在研究中的应用， 组织培养技术的进 步， 异种生物间器官移植屏障的突破 ( 联合免疫缺陷型小鼠的开发 )， 拓宽了种属特异 的 VZV 基因功能研究的空间， 可以在体外或动物体内进行 VZV 基因功能研究。2004 年 Kazuhiro N. 等在 “Cloning of thevaricella-zoster virus genome as aninfectious bacterialartificial chromosome in Escherichia coli” 一文中揭示被克隆到 BAC 载体 上的 VZV Oka 株全基因组， 可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖， BAC 可被一同转化到人胚肺细胞中的 Cre 酶精确切除， 产生的重组 VZV 病毒具有 p-Oka 同样结构， 完全具有亲本病 毒的特性。BAC 的应用为 VZV 的功能研究带来了极大便利， 加速了 VZV 基因功能研究进程。 2007 年 Zhang Z. 等利用 BAC 载体和基因同源重组技术揭示多个基因的体内外功能。 发明内容
本申请人以含 P-Oka 全基因组的 BAC(VZV-BAC) 为基础， 通过基因重组手段， 获得 ORF7 缺失的病毒株 VZV-7D， 保藏号为 ： CGMCC3207， 保藏日期为 2009 年 7 月 28 日， 保藏单位 名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏单位地址为北京市 朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所 ( 邮编 100101)， 该保藏的病毒株 VZV-7D 的分类命 名为水痘病毒。体内外证实该病毒株不感染皮肤和感觉神经节， 故不存在再活化产生带状 疱疹的潜在危害 ； 该毒株可在 MRC-5、 Mewo 细胞上生长， 且同 P-Oka 株生长一致 ； 该毒株保 留了 P-Oka 株的所有糖蛋白， 其免疫原性理应同 P-Oka 株的免疫力相同 ； 该毒株是通过 Kanr 筛选到的单一克隆株， 不存于混合型 V-Oka 株的潜在危害 ； 由于整个 ORF7 删除， VZV-7D 株 不可能产生回复突变， 因而， 以 VZV-7D 株制备减毒活疫苗更为安全和有效。 而且， VZV-7D 至 少可以克隆 10kb 的外源基因而不影响其本身生长和增殖， 故可以用作外源基因表达载体， 制备用于诊断、 预防和治疗的生物制品。 申请人如下进行了 P-Oka 株 ORF7 缺失株 (VZV-7D) 的制备。因为水痘 - 带状疱疹 病毒 (VZV) 的 ORF7 位于病毒基因组的 8607-9386bp 之间， 编码一个 29kDa 的蛋白， 可能位 于皮层结构中， 它的功能仍不清楚。 VZV ORF7 蛋白与单纯疱疹病毒 (HSV) 中的 UL51 为同源 蛋白。HSV UL51 基因编码一个磷酸化蛋白， 分子量约为 27， 29 和 30kDa， 在感染后期表达， 与病毒出细胞体有关 (Daikoku， Ikenoya et al， 1998)。一项研究报告指出 HSV UL51 蛋白 定位于感染细胞的高尔基体标志蛋白上， UL51 蛋白通过 N- 端第 9 位的半胱氨酸铆钉到高 尔基体上 (Nozawa， Daikoku， et al， 2003)。UL-51 无效突变揭示其在 HSV 复制循环中的作 用。最近的研究显示突变株病斑较小， 最大滴度比野生株降了 100 倍。电子显微镜显示核 衣壳的形成不受 UL51 删除影响， 但是， 病毒出核周质腔受到严重影响， 这现象揭示 UL51 蛋 白涉及到 HSV 病毒颗粒的成熟和出核 (Nozawa， Kawaguchi et al.2005)。通过伪狂犬病毒 (PrV)UL51 缺失突变揭示此基因表达产物也具有相似的功能。 一步生长曲线揭示 PrV-De lt aUL51F 不仅滴度稍有下降， 而且病斑减小明显， 只有野生株大小的 30％。细胞质内的衣壳 大量存在， 病毒无包被或处于包被不同阶段， 所以， 研究结果推断 UL51 蛋白参与病毒的外 出， 对病毒复制不是必需的 (Klupp， Granzow et al.2005)。
本发明以来自斯坦福大学医学院 Dr.Ann Arvin 实验室的 P-Oka 临床分离株为材 料， 以 VZV-BAC(P-Oka) 为框架， 应用细菌同源重组原理产生重组克隆。 全长 ORF7 被 Kanr 基 因取代而产生 7D-VZVBAC。7D-VZVBAC 与含 Cre 酶的重组质粒一同电转 MRC-5 细胞， 产生无 ORF7 的水痘病毒 (VZV-7D) 克隆株。
VZV ORF7 删除突变体构建基于 luc VZV BAC(Zhang et al.2007)。操 作过程见 图 1。A. 大肠杆菌 DY380 株提供高效同源重组系统， 所需同源序列短至 40bp。同源重组酶 受温度控制， 32℃抑制 /42℃激活。B. 删除 ORF7， 设计的两条引物包含 20bp 的卡那霉素抗 性基因同源核苷酸序列和 ORF7 删除区起始或终止密码子相连的 40bp 同源序列。
上游引物 (F) ：
本发明以来自斯坦福大学医学院 Dr.Ann Arvin 实验室的 P-Oka 临床分离株为材 料， 以 VZV-BAC(P-Oka) 为框架， 应用细菌同源重组原理产生重组克隆。 全长 ORF7 被 Kanr 基 因取代而产生 7D-VZVBAC。7D-VZVBAC 与含 Cre 酶的重组质粒一同电转 MRC-5 细胞， 产生无 ORF7 的水痘病毒 (VZV-7D) 克隆株。
VZV ORF7 删除突变体构建基于 luc VZV BAC(Zhang et al.2007)。操 作过程见 图 1。A. 大肠杆菌 DY380 株提供高效同源重组系统， 所需同源序列短至 40bp。同源重组酶 受温度控制， 32℃抑制 /42℃激活。B. 删除 ORF7， 设计的两条引物包含 20bp 的卡那霉素抗 性基因同源核苷酸序列和 ORF7 删除区起始或终止密码子相连的 40bp 同源序列。
上游引物 (F) ：
GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CGC TCT TGTTGG CTA GTG CGT A(SEQ ID NO ： 1)，
下游引物 (R) ：
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAGTGT TAC AAC CAA(SEQ ID NO ： 2)。
卡 那 霉 素 抗 性 基 因 从 质 粒 pGEM-or iV/kan1 上 扩 增 (Netterwald， Yang etal.2005)， PCR 产物用 DpnI 酶进行消化， 用 Qiagen 凝胶提取试剂盒进行回收。C. 以 1.6ky， 250μF 的 BioRad Gene Pulser II 电转仪将大约 200ng 的 PCR 产物转进载有 VZVLuc BAC 的 DY380 菌体中。D. 利用重组酶 42 ℃激活 /32 ℃抑制的特性， 完成 Kanr 基因与 ORF7 的同源重组， ORF7 被 Kanr 基因取代， 在 32℃下从含有 30μg/ml 卡那霉素的琼脂板上选择 单克隆的重组子， 从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株 (ORF7 缺失 )VZV-BAC 的 DNA。E. 所 得病毒基因组完整性由 HindIII 酶切检验， 重组 DNA 经 PCR 检验。F.7D-BACDNA 在 DY380 中增殖并被纯化提取。G. 所得的 7D-BACDNA 单独电转染至 (Marchini， Liu et al.2001) MRC-5 细胞， 产生 7D-BAC， BAC 上带的 GFP 可以用于病毒在细胞中生长增殖研究或与 Cre 表 达载体一同电转染至 (Marchini， Liu et al.2001)MRC-5 细胞， BAC 被 Cre 酶从其两端的 loxP 酶切位点完全切除， 产生 VZV-7D 病毒。VZV-7D 在 Mewo 细胞或 MRC-5 细胞中的生长 特性同 P-Oka 一致， 也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性， 但是， 缺失突变的 VZV-7D 不感染皮肤、 神经瘤细胞和感觉神经节， 这为疫苗的开发带来了希望。 含有荧光素酶基因的 VZV-7D(VZV-7DLuc) 按照 Zhang 等 (Journal of Virology， Sept， 2007， p， 9024-9033) 描述 的方法进行构建。VZV-7DLuc 可用于体内 VZV-7D 功能研究的监测。目前尚无任何 VZV-7D 的 学术报道。据此完成了本发明。 附图说明
图1： 水痘 ORF-7 缺陷型 (7D) 病毒制备。 图2： ORF7 缺失的 VZV 病毒鉴定。 图 3、 水痘 ORF-7 回复突变 (VZV-7R) 病毒制备。 图 4、 VZV-7D 在人体 MeWo 细胞中生长曲线。 图 5、 7D 在人胸腺组织培养 (TOC) 系统中的生长曲线分析。 图 6、 VZV-7D 在人皮肤组织培养 (SOC) 系统中的生长曲线分析。 图 7、 VZV-7D 的背根神经节培养。 图 8、 BAC-VZV 构建及 Mewo 细胞中培养。具体实施方案
实施例 1 ： VZV-7D 的鉴定
VZV-7D 感染长成单层的 MRC-5 细胞， 用含 2％牛血清的 MEM 培养基培养， 约 80％ 细胞病变发生时， 弃培养基， 收获病变细胞， 提取 DNA， 以 P-Oka 为对照进行试验。PCR 扩增 ORF-10 和 ORF-7 基因， 用 HindIII 消化 VZV-7D 和 P-Oka 株的 DNA。PCR 产物和 HindIII 消 化产物用 0.5 ％的琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳产物见图 2。VZV-7D 对 ORF-10 的 PCR 产物 同 P-Oka 一致， 但在 ORF-7 上没有条带， 证实 ORF-7 缺失。HindIII 对病毒的酶切图谱上，VZV-7D 和 P-Oka 间看不出差别
实施例 2 ： VZV-7D 的回复突变体 (VZV-7R) 制备
ORF7 缺失正确与否不仅可以用 HindIII 酶切鉴定， 而且可以通过基因的同源重 组获得完整的 VZV 加以验证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的 VZV， 见图 3。利 用 Invitrogen 的高保真 Taq DNA 聚合酶试剂盒 PCR 扩增 ORF7 片段， 并将其克隆到质粒 pGEM-lox-zeo 的 NotI 和 BglII 位 点 之 间， 从 而 形 成 pGEM-zeo-ORF7 质 粒。 该 克 隆 片 段 通过测序分析鉴定正确， 且通过 PCR 扩增没有错误密码子被引入 ORF7 编码框中。之后以 pGEM-zeo-ORF7 质粒为模板用下述引物 PCR 扩增 zeoR-ORF7 编码框。
正向引物 ：
GAT TTA TCCATA GTTCAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG(SEQ ID NO ： 3) ；
反向引物 ：
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCATAA CTT CGT(SEQ IDNO ： 4)，
得到的 PCR 产物是两端各含一段 40bp 大小与水痘病毒基因组同源的基因， 与 kanR 编码框顺序相连， 位于 ORF7 缺失的位点。将得到的这段嵌合 PCR 产物按上文提到 的 方 法 电 转 化 到 携 带 有 ORF7D BAC 的 DY380 菌 体 中。 重 组 体 要 通 过 含 有 50μg/ml 的 zeocin(Invitrogen) 和 12.5μg/ml 的氯霉素的琼脂平板 32℃培养筛选。正确的 VZV 克隆 通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、 潮霉素抗性、 zeoc in 抗性、 卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性。 这些克隆进一步被酶切消化和 PCR 分 析确证正确。鉴定正确的克隆 ( 即携带有 ORF7 缺失或者 1uc VZV BAC 拯救子的大肠杆菌 DY 380) 接种于含 12.5μg/ml 的氯霉素的 500mlLB 培养基中 32℃培养 20 小时。VZVBAC 的 DNA 通过 BAC DNA 大量提取试剂盒 (BD Biosciences， Palo Alto， CA) 分离得到， 并且利用 转染试剂 FuGene6(Roche， Indi anapolis， IN) 按照使用说明转染到 MRC-5 细胞。6 孔板中 的一孔 (35-mm) 在转染时 DNA 与转染试剂的使用比例为 1.5μg ： 6μl。一般情况转染后 3 天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除 BAC 载体 ( 两侧有 loxP 酶切位点 )， 可 将 Cre 表达载体与 VZV BAC DNA 一起共转染 (Marchini， Liu et al.2001)MRC-5 细胞， 利用 Cre 酶的特性而精确切除 BAC， 产生完整的 VZV。
水痘 ORF-7 回复突变病毒具有同 P-Oka 病毒相同的生长和增殖特性。说明 ORF-7 的功能可以通过回复突变手段得到恢复。
实施例 3 ： VZV-7D 病毒的 Mewo 细胞培养
六孔板中长成单层的 Mewo 细胞分别用 VZV-7D、 VZV-7R 和 P-Oka 株感染， 以未感染 的 Mewo 细胞作对照， Mewo 细胞在 37℃下用含 2％牛血清的 MEM 培养基培养。感染 24 小时 后， D-luciferin 加到培养的细胞孔中， 终浓度为 150μg/ml， 37℃培养 10 分钟， 不同孔的 生物荧光用体内成像系统 IVIS(50Series ； Xenogen Corporation， Alameda， CA) 同时测量 光子数， 每天测量 3 孔感染细胞， 测量后， 细胞用病毒培养液取代 D-luciferin 物质继续培 养。 病毒荧光量每 24 小时测量一次， 连续测量 7 天。用 3 孔测量的数据均值对时间绘制 生长曲线。结果见图 4。
人 MeWo 细胞不被感染或者被水痘 - 带状疱疹病毒野生株 (1ucVZV) 或者 7D 突变株或者 7D 回复株 (1uc 7R) 感染、 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数， 用3孔 测量的均值对时间绘制生长曲线， 图中标出 3 孔测量数据的误差线。本试验表明 VZV-7D 和 VZV-7R 和野生株一样都可以在 MeWo 细胞中正常生长。
实施例 4、 7D 病毒在人胸腺组织的培养
人胸腺 - 肝脏联合移植体异体移植到雄性的 CB-17SCID/beige 鼠内。人胸腺 - 肝 脏联合移植体构建和使用按 Jennifer F.M(Journal of Virology， Sept.1995， p.5236 5242) 描述的方法进行。移植 3 月后， 人胸腺 - 肝脏移植体经外科手术暴露后， 直接注射 3 3 2×10 至 4×10 PFU 的 Mewo 培养的含有荧光素酶的 VZV-7D 和 P-Oka， 10-20μl 细胞悬液， 每种病毒感染 3 只小鼠， 以未感染鼠为对照， 感染后每天测量荧光量。腹腔注射 250μl 荧 光素酶底物， 即 D-luciferin10 分钟后， 用生物荧光体内成像系统 IVIS 在移植区按实施例 3 的方法测量荧光量， 每种病毒测量 3 只小鼠。结果见图 5。
培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受 VZV 野生株或者 VZV-7D 株感染， 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数。用 3 只鼠测量的光子数均值对时间绘制生长曲 线。图中显示 3 只测量数据的误差线。本试验表明 7D 缺陷株像野生株一样能在胸腺组织 (T- 细胞 ) 中生长。 实施例 5 ： 7D 病毒的皮肤培养
人胚胎皮肤完整结构按 Jennifer F.M(Journal of Virology， Sept.1995， p.5236 5242) 描述的方法， 异体移植到联合免疫缺陷 (SC ID) 小鼠皮下。移植 4 周后， 三种含荧光 素酶的 VZV-7D、 VZV-7R 和 P-Oka 株感染皮肤， 每种病毒感染 3 只小鼠， 以未感染鼠为对照， 感染后每天测量荧光量。 腹腔注射 250μl 荧光素酶底物， 即 D-luciferin10 分钟后， 用生物 荧光体内成像系统 IVIS 在移植区按实施例 3 的方法测量荧光量， 每种病毒测量 3 只小鼠。 结果见图 6。
培养的人皮肤组织被病毒野生株或者 7D 缺失株或者 7D 回复突变株感染、 以不被 感染的鼠为对照， 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数， 用 3 只测量的光子均值 对时间绘制生长曲线。图中标出 3 只测量数据的误差线。实验证实 VZV-7D 在皮肤中有严 重生长缺陷， 这种功能缺陷在 VZV-7D 株回复突变后可以被恢复。
实施例 6 ： VZV-7D 病毒的背根神经节培养
用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠 20 周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节 (DRG)， 分离的背根神经节用含 1％青霉素 / 链霉素的冰浴 1XPBS 瞬时洗涤， 然后转到冰浴 的培养基 (DEM， 含 15％热灭活的胎牛血清和 1％青霉素 / 链霉素 )， 将每个背根神经节单独 放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上， 加 0.5ml 培养基， 培养 5 天， 其间换培养基一次。六孔 细胞板中制备 50％ Mewo 细胞培养物， 用于滴度检测和生长曲线分析。第 6 天收获 P-Oka， VZV-7D 和 VZV-7R 新近感染的 Mewo 细胞， 于培养基悬浮至 1ml。每个背根神经节单独饲养 在六孔板中胶原包被的盖玻片上。10μl 悬液用于病毒滴度检测， 2μl 用于 Mewo 细胞感染 的生长曲线。其余细胞悬液用力通过 27 针管 20 次， 细胞碎片通过 4000rpm 离心 10min 沉 淀。上清均分， 用于感染背根神经节， -120μl/ 样品， 另外， 2 滴 (20μl) 细胞悬液用于感染 另一个背根神经节， 37℃ 5％ CO2 下培养 3 小时后， 背根神经节用 1×PBS 洗涤， 再补加新鲜 培养基。每 24 小时检测一次荧光素酶活性。样品用含 150μg/ml 的 D-luciferin 37℃培 养 10 分钟后， 用 IVIS 仪器和软件分析光子数。检测结果见图 7， 结果表明 VZV-7D 在 Mewo
上生长正常， 而在背根神经节中几乎不生长。
VZV-7D 不感染背根神经节细胞， 这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。
实施例 7 ： VZV-7D 病毒可作为外源基因的表达载体
细菌人工染色体载体 (BAC)PUSF-6， 含有原核生物的 Ori、 repE、 parA、 pa rB 基因， r Cam 基因， gfp 基因， 两个 500bp 分别与 ORF60 和 ORF61 同源的 VZV 片段 a 和 b， 图 A 灰框， 还有两个 loxP 位点 ( 图 A 白框 )， 全长约为 10kb。用 BamHI 消化 BAC pUSF-6， 产生用于重 组的线性片段。P-Oka 遗传物质由 125kb 个核苷酸组成， 包括 UL、 US 和末端及中间重复序 列。由 P-Oka 全基因组构建的 4 个具 有重叠区段的科斯质粒， pvFsp73、 pvSpe14、 pvPme19、 pvSpe23。pUSF-6 电转至含 pvSpe23 的 DY380 菌体， 通过同源重组插入 pvSpe23 的 ORF60 和 ORF61 之间， 形成 pvSpe23-pUSF-6， 提取 pvSpe23-pUSF-6 的 VZV-BAC DNA 与其它 3 个科斯 质粒的 VZV 片段共转染 Mewo 细胞， 同源重组产生 VZV-BAC。重组 VZV-BAC 病毒在 Mewo 细胞 中复制， 产生绿色荧光斑点。见图 8C， 其生长繁殖速度同 p-Oka 一致， 见图 8D。BAC 的插入 没有影响病毒本身的生长特应， 而且 BAC 上载的 GFP 可以表达。故 VZV-7D 可以作为其他生 物遗传物质的表达载体。8CN 101967466 A
下游引物 (R) ：
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAGTGT TAC AAC CAA(SEQ ID NO ： 2)。
卡 那 霉 素 抗 性 基 因 从 质 粒 pGEM-or iV/kan1 上 扩 增 (Netterwald， Yang etal.2005)， PCR 产物用 DpnI 酶进行消化， 用 Qiagen 凝胶提取试剂盒进行回收。C. 以 1.6ky， 250μF 的 BioRad Gene Pulser II 电转仪将大约 200ng 的 PCR 产物转进载有 VZVLuc BAC 的 DY380 菌体中。D. 利用重组酶 42 ℃激活 /32 ℃抑制的特性， 完成 Kanr 基因与 ORF7 的同源重组， ORF7 被 Kanr 基因取代， 在 32℃下从含有 30μg/ml 卡那霉素的琼脂板上选择 单克隆的重组子， 从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株 (ORF7 缺失 )VZV-BAC 的 DNA。E. 所 得病毒基因组完整性由 HindIII 酶切检验， 重组 DNA 经 PCR 检验。F.7D-BACDNA 在 DY380 中增殖并被纯化提取。G. 所得的 7D-BACDNA 单独电转染至 (Marchini， Liu et al.2001) MRC-5 细胞， 产生 7D-BAC， BAC 上带的 GFP 可以用于病毒在细胞中生长增殖研究或与 Cre 表 达载体一同电转染至 (Marchini， Liu et al.2001)MRC-5 细胞， BAC 被 Cre 酶从其两端的 loxP 酶切位点完全切除， 产生 VZV-7D 病毒。VZV-7D 在 Mewo 细胞或 MRC-5 细胞中的生长 特性同 P-Oka 一致， 也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性， 但是， 缺失突变的 VZV-7D 不感染皮肤、 神经瘤细胞和感觉神经节， 这为疫苗的开发带来了希望。 含有荧光素酶基因的 VZV-7D(VZV-7DLuc) 按照 Zhang 等 (Journal of Virology， Sept， 2007， p， 9024-9033) 描述 的方法进行构建。VZV-7DLuc 可用于体内 VZV-7D 功能研究的监测。目前尚无任何 VZV-7D 的 学术报道。据此完成了本发明。 附图说明
图1： 水痘 ORF-7 缺陷型 (7D) 病毒制备。 图2： ORF7 缺失的 VZV 病毒鉴定。 图 3、 水痘 ORF-7 回复突变 (VZV-7R) 病毒制备。 图 4、 VZV-7D 在人体 MeWo 细胞中生长曲线。 图 5、 7D 在人胸腺组织培养 (TOC) 系统中的生长曲线分析。 图 6、 VZV-7D 在人皮肤组织培养 (SOC) 系统中的生长曲线分析。 图 7、 VZV-7D 的背根神经节培养。 图 8、 BAC-VZV 构建及 Mewo 细胞中培养。具体实施方案
实施例 1 ： VZV-7D 的鉴定
VZV-7D 感染长成单层的 MRC-5 细胞， 用含 2％牛血清的 MEM 培养基培养， 约 80％ 细胞病变发生时， 弃培养基， 收获病变细胞， 提取 DNA， 以 P-Oka 为对照进行试验。PCR 扩增 ORF-10 和 ORF-7 基因， 用 HindIII 消化 VZV-7D 和 P-Oka 株的 DNA。PCR 产物和 HindIII 消 化产物用 0.5 ％的琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳产物见图 2。VZV-7D 对 ORF-10 的 PCR 产物 同 P-Oka 一致， 但在 ORF-7 上没有条带， 证实 ORF-7 缺失。HindIII 对病毒的酶切图谱上，VZV-7D 和 P-Oka 间看不出差别
实施例 2 ： VZV-7D 的回复突变体 (VZV-7R) 制备
ORF7 缺失正确与否不仅可以用 HindIII 酶切鉴定， 而且可以通过基因的同源重 组获得完整的 VZV 加以验证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的 VZV， 见图 3。利 用 Invitrogen 的高保真 Taq DNA 聚合酶试剂盒 PCR 扩增 ORF7 片段， 并将其克隆到质粒 pGEM-lox-zeo 的 NotI 和 BglII 位 点 之 间， 从 而 形 成 pGEM-zeo-ORF7 质 粒。 该 克 隆 片 段 通过测序分析鉴定正确， 且通过 PCR 扩增没有错误密码子被引入 ORF7 编码框中。之后以 pGEM-zeo-ORF7 质粒为模板用下述引物 PCR 扩增 zeoR-ORF7 编码框。
正向引物 ：
GAT TTA TCCATA GTTCAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG(SEQ ID NO ： 3) ；
反向引物 ：
AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCATAA CTT CGT(SEQ IDNO ： 4)，
得到的 PCR 产物是两端各含一段 40bp 大小与水痘病毒基因组同源的基因， 与 kanR 编码框顺序相连， 位于 ORF7 缺失的位点。将得到的这段嵌合 PCR 产物按上文提到 的 方 法 电 转 化 到 携 带 有 ORF7D BAC 的 DY380 菌 体 中。 重 组 体 要 通 过 含 有 50μg/ml 的 zeocin(Invitrogen) 和 12.5μg/ml 的氯霉素的琼脂平板 32℃培养筛选。正确的 VZV 克隆 通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、 潮霉素抗性、 zeoc in 抗性、 卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性。 这些克隆进一步被酶切消化和 PCR 分 析确证正确。鉴定正确的克隆 ( 即携带有 ORF7 缺失或者 1uc VZV BAC 拯救子的大肠杆菌 DY 380) 接种于含 12.5μg/ml 的氯霉素的 500mlLB 培养基中 32℃培养 20 小时。VZVBAC 的 DNA 通过 BAC DNA 大量提取试剂盒 (BD Biosciences， Palo Alto， CA) 分离得到， 并且利用 转染试剂 FuGene6(Roche， Indi anapolis， IN) 按照使用说明转染到 MRC-5 细胞。6 孔板中 的一孔 (35-mm) 在转染时 DNA 与转染试剂的使用比例为 1.5μg ： 6μl。一般情况转染后 3 天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除 BAC 载体 ( 两侧有 loxP 酶切位点 )， 可 将 Cre 表达载体与 VZV BAC DNA 一起共转染 (Marchini， Liu et al.2001)MRC-5 细胞， 利用 Cre 酶的特性而精确切除 BAC， 产生完整的 VZV。
水痘 ORF-7 回复突变病毒具有同 P-Oka 病毒相同的生长和增殖特性。说明 ORF-7 的功能可以通过回复突变手段得到恢复。
实施例 3 ： VZV-7D 病毒的 Mewo 细胞培养
六孔板中长成单层的 Mewo 细胞分别用 VZV-7D、 VZV-7R 和 P-Oka 株感染， 以未感染 的 Mewo 细胞作对照， Mewo 细胞在 37℃下用含 2％牛血清的 MEM 培养基培养。感染 24 小时 后， D-luciferin 加到培养的细胞孔中， 终浓度为 150μg/ml， 37℃培养 10 分钟， 不同孔的 生物荧光用体内成像系统 IVIS(50Series ； Xenogen Corporation， Alameda， CA) 同时测量 光子数， 每天测量 3 孔感染细胞， 测量后， 细胞用病毒培养液取代 D-luciferin 物质继续培 养。 病毒荧光量每 24 小时测量一次， 连续测量 7 天。用 3 孔测量的数据均值对时间绘制 生长曲线。结果见图 4。
人 MeWo 细胞不被感染或者被水痘 - 带状疱疹病毒野生株 (1ucVZV) 或者 7D 突变株或者 7D 回复株 (1uc 7R) 感染、 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数， 用3孔 测量的均值对时间绘制生长曲线， 图中标出 3 孔测量数据的误差线。本试验表明 VZV-7D 和 VZV-7R 和野生株一样都可以在 MeWo 细胞中正常生长。
实施例 4、 7D 病毒在人胸腺组织的培养
人胸腺 - 肝脏联合移植体异体移植到雄性的 CB-17SCID/beige 鼠内。人胸腺 - 肝 脏联合移植体构建和使用按 Jennifer F.M(Journal of Virology， Sept.1995， p.5236 5242) 描述的方法进行。移植 3 月后， 人胸腺 - 肝脏移植体经外科手术暴露后， 直接注射 3 3 2×10 至 4×10 PFU 的 Mewo 培养的含有荧光素酶的 VZV-7D 和 P-Oka， 10-20μl 细胞悬液， 每种病毒感染 3 只小鼠， 以未感染鼠为对照， 感染后每天测量荧光量。腹腔注射 250μl 荧 光素酶底物， 即 D-luciferin10 分钟后， 用生物荧光体内成像系统 IVIS 在移植区按实施例 3 的方法测量荧光量， 每种病毒测量 3 只小鼠。结果见图 5。
培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受 VZV 野生株或者 VZV-7D 株感染， 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数。用 3 只鼠测量的光子数均值对时间绘制生长曲 线。图中显示 3 只测量数据的误差线。本试验表明 7D 缺陷株像野生株一样能在胸腺组织 (T- 细胞 ) 中生长。 实施例 5 ： 7D 病毒的皮肤培养
人胚胎皮肤完整结构按 Jennifer F.M(Journal of Virology， Sept.1995， p.5236 5242) 描述的方法， 异体移植到联合免疫缺陷 (SC ID) 小鼠皮下。移植 4 周后， 三种含荧光 素酶的 VZV-7D、 VZV-7R 和 P-Oka 株感染皮肤， 每种病毒感染 3 只小鼠， 以未感染鼠为对照， 感染后每天测量荧光量。 腹腔注射 250μl 荧光素酶底物， 即 D-luciferin10 分钟后， 用生物 荧光体内成像系统 IVIS 在移植区按实施例 3 的方法测量荧光量， 每种病毒测量 3 只小鼠。 结果见图 6。
培养的人皮肤组织被病毒野生株或者 7D 缺失株或者 7D 回复突变株感染、 以不被 感染的鼠为对照， 培养 7 天。感染后每天用 IVIS 系统测量光子数， 用 3 只测量的光子均值 对时间绘制生长曲线。图中标出 3 只测量数据的误差线。实验证实 VZV-7D 在皮肤中有严 重生长缺陷， 这种功能缺陷在 VZV-7D 株回复突变后可以被恢复。
实施例 6 ： VZV-7D 病毒的背根神经节培养
用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠 20 周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节 (DRG)， 分离的背根神经节用含 1％青霉素 / 链霉素的冰浴 1XPBS 瞬时洗涤， 然后转到冰浴 的培养基 (DEM， 含 15％热灭活的胎牛血清和 1％青霉素 / 链霉素 )， 将每个背根神经节单独 放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上， 加 0.5ml 培养基， 培养 5 天， 其间换培养基一次。六孔 细胞板中制备 50％ Mewo 细胞培养物， 用于滴度检测和生长曲线分析。第 6 天收获 P-Oka， VZV-7D 和 VZV-7R 新近感染的 Mewo 细胞， 于培养基悬浮至 1ml。每个背根神经节单独饲养 在六孔板中胶原包被的盖玻片上。10μl 悬液用于病毒滴度检测， 2μl 用于 Mewo 细胞感染 的生长曲线。其余细胞悬液用力通过 27 针管 20 次， 细胞碎片通过 4000rpm 离心 10min 沉 淀。上清均分， 用于感染背根神经节， -120μl/ 样品， 另外， 2 滴 (20μl) 细胞悬液用于感染 另一个背根神经节， 37℃ 5％ CO2 下培养 3 小时后， 背根神经节用 1×PBS 洗涤， 再补加新鲜 培养基。每 24 小时检测一次荧光素酶活性。样品用含 150μg/ml 的 D-luciferin 37℃培 养 10 分钟后， 用 IVIS 仪器和软件分析光子数。检测结果见图 7， 结果表明 VZV-7D 在 Mewo
上生长正常， 而在背根神经节中几乎不生长。
VZV-7D 不感染背根神经节细胞， 这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。
实施例 7 ： VZV-7D 病毒可作为外源基因的表达载体
细菌人工染色体载体 (BAC)PUSF-6， 含有原核生物的 Ori、 repE、 parA、 pa rB 基因， r Cam 基因， gfp 基因， 两个 500bp 分别与 ORF60 和 ORF61 同源的 VZV 片段 a 和 b， 图 A 灰框， 还有两个 loxP 位点 ( 图 A 白框 )， 全长约为 10kb。用 BamHI 消化 BAC pUSF-6， 产生用于重 组的线性片段。P-Oka 遗传物质由 125kb 个核苷酸组成， 包括 UL、 US 和末端及中间重复序 列。由 P-Oka 全基因组构建的 4 个具 有重叠区段的科斯质粒， pvFsp73、 pvSpe14、 pvPme19、 pvSpe23。pUSF-6 电转至含 pvSpe23 的 DY380 菌体， 通过同源重组插入 pvSpe23 的 ORF60 和 ORF61 之间， 形成 pvSpe23-pUSF-6， 提取 pvSpe23-pUSF-6 的 VZV-BAC DNA 与其它 3 个科斯 质粒的 VZV 片段共转染 Mewo 细胞， 同源重组产生 VZV-BAC。重组 VZV-BAC 病毒在 Mewo 细胞 中复制， 产生绿色荧光斑点。见图 8C， 其生长繁殖速度同 p-Oka 一致， 见图 8D。BAC 的插入 没有影响病毒本身的生长特应， 而且 BAC 上载的 GFP 可以表达。故 VZV-7D 可以作为其他生 物遗传物质的表达载体。8CN 101967466 A
序列表1/1 页序列表 <110> 新泽西医学院北京万泰生物药业股份有限公司厦门大学 <120>ORF7 缺陷型水痘病毒株、 含有该毒株的疫苗及其应用 <130>IDC090012 <160>4 <170>PatentIn version 3.2 <210>1 <211>61 <212>DNA <213> 人工序列 <400>1 gatttatcca tagttcaata cgttggaaag ccagtcaatc gctcttgttg gctagtgcgt a <210>2 <211>60 <212>DNA <213> 人工序列 <400>2 aaacatacac cagaaacgtt tttagttttt atttcaatat tctgccagtg ttacaaccaa <210>3 <211>60 <212>DNA <213> 人工序列 <400>3 gatttatcca tagttcaata cgttggaaag ccagtcaatc atgcagacgg tgtgtgccag <210>4 <211>60 <212>DNA <213> 人工序列 <400>4 aaacatacac cagaaacgtt tttagttttt atttcaatat ggatggatcc ataacttcgt60 61606060