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癫痫模型非人哺乳动物
    技术领域 本发明涉及癫痫模型非人哺乳动物。更具体而言、 本发明涉及具有同源于与人常 染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的基因的基因异常、 自然发症癫痫发作的癫痫模型非人 哺乳动物。 另外， 本发明涉及使基因重组个体识别容易地可能的突变基因、 其构建方法及其 识别方法。
     背景技术 癫痫是约 2％日本国民患病的比较多的神经疾病， 其分子生物学成因长期不明。 其 原因是因为癫痫是多种多样的疾病的总称。 但是， 最近以家族性癫痫为中心， 略得知了其遗 传异常。
     其中的常染色体显性夜发性额叶癫痫是家族性癫痫之一， 以夜间的癫痫发作为特 征， 作为其原因基因异常， 报告了神经元乙酰胆碱受体的 α4 且 β2 亚基的基因的 CHRNA4 且 CHRNB2 的基因的突变 ( 非专利文献 1)。作为 CHRNA4 的基因异常， 有 S284L、 S280F 及 291-292insL 的 3 种被报告 ( 非专利文献 2、 3、 4、 5)。另外， 作为 CHRNB2 的基因异常， 有
     V287L、 V287M 及 I312M 的 3 种的基因异常被报告 ( 非专利文献 6、 7、 8)。
     作为用于癫痫的诊断法或处理方法的开发及发展的手段， 使用了所谓 “癫痫模型 动物” 。以往的癫痫模型动物是电刺激或使用戊四唑等的痉挛诱发物的 “痉挛模型动物” 。 另外， 也公开了通过导入糖链抗体基因引起癫痫样痉挛的转基因非人哺乳动物 ( 专利文献 1)。 另外， 也制备了响应于体位转换呈现出强直间代痉挛或癫痫症状的， 从染色体上缺损了 μ3B 基因功能的非人动物 ( 专利文献 2)。但是， 这些以往的模型动物虽然可作为痉挛发作 的模型动物， 但不可作为分子生物学水平的人癫痫的真模型动物。
     发明人发现， 人染色体显性夜发性额叶癫痫为神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因的第 284 位的 Ser 被置换为 Leu( 非专利文献 9)。
     由此， 本发明人制备了通过基因重组导入了大鼠神经元乙酰胆碱受体基因 CHRNA4 的基因突变的基因重组癫痫模型动物 ( 专利文献 3)。
     但是， 由于以往技术在制备所述基因重组模型动物中， 发生同源重组的概率不高， 有必要筛选大量重组体。 另外， 重组体的筛选中有必要对其基因的一部分进行测序， 为此要 耗费相当的时间和费用。 因此， 要是能开发出不进行基因测序而判别重组体的方法， 就能节 约大幅的时间和费用， 也期待所述重组体的判别方法的开发。
     非专利文献 1 ： Hirose， S.， et al.， Neurology 53 ： 1749-1753， 1999
     非专利文献 2 ： Steinlein， O.K.， et al.A missense mutation in theneuronal nicotinic acetylcholine receptor alpha 4 subunit is associatedwith autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Nat Genet11， 201-203(1995).
     非专利文献 3 ： Hirose， S.， et al.A novel mutation of CHRNA4responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Neurology 53 ， 1749-1753(1999).非专利文献 4 ： Steinlein， O.K.， et al.Independent occurrence ofthe CHRNA4 Ser248Phe mutation in a Norwegian family withnocturnal frontal lobe epilepsy. Epilepsia 41， 529-535(2000).
     非专利文献 5 ： Steinlein， O.K.， et al.An insertion mutation of theCHRNA4 gene in a family with autosomal dominant noctu rnal frontallobe epilepsy.Hum Mol Genet 6， 943-947(1997).
     非专利文献 6 ： De Fusco， M.， et al.The nicotinic receptor b2subunit is mutant in nocturnal frontal lobe epilepsy.Nat Genet 26， 275-276(2000).
     非专利文献 7 ： Phillips， H.A.， et al.CHRNB2 is the secondacetylcholine receptor subunit associated with autosomal dominantnocturnal frontal lobe epilepsy.Am J Hum Genet 68， 225-231(2001).
     非专利文献 8 ： Bertrand， D.， et al.The CHRNB2 mutation I312Mis associated with epilepsy and distinct memory deficits.Neurobiol Dis20， 799-804(2005).
     非专利文献 9 ： Hirose， S.， et al.A novel mutation of CHRNA4responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Neurology 53 ， 1749-1753(1999).
     专利文献 1 ： 特开 2006-141217 号公报 专利文献 2 ： 专利第 3853136 号公报 专利文献 3 ： 特开 2005-245361 号公报发明内容 发明拟解决的技术课题
     为响应上述愿望， 本发明人经锐意研究的结果发现， 将与人 CHRNA4 或 CHRNB2 的基 因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中、 且向 所述突变 cDNA 的部分碱基序列导入改造成具有与其碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序 列的碱基序列的探针而制备出的非人哺乳动物可作为癫痫的模型动物， 同时， 如此制备出 的非人哺乳动物不仅可容易识别所述重组个体， 还由于由重组基因表达的 mRNA 与其自身 的同源基因的 mRNA 有区别而可容易检测。而且， 本发明人在将与人 CHRNA4 或 CHRNB2 的基 因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中时， 通 过加工突变位点和所述突变而使出现限制性内切酶切割位点来导入突变， 发现可容易识别 重组个体， 从而完成本发明。
     因此， 本发明是与人癫痫的基因异常具有相同基因异常的大鼠等的癫痫模型非人 哺乳动物， 旨在提供向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受 体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的非人哺乳动物的 DNA 中导入了作为 基因异常的基因突变， 且具有可通过导入特定探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳 动物及其制备方法。
     另外， 本发明旨在提供将上述基因突变导入 cDNA， 同时将所述 cDNA 的部分碱基序 列用具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针置换而得 到的突变基因及其制备方法。
     本发明的优选实施方式旨在提供将上述基因突变导入 cDNA 的新出现限制性内切 酶切割位点的突变基因及其突变方法。
     而且， 本发明旨在提供通过施用针对上述限制性内切酶切割位点的限制性内切酶 或制备上述探针时使用的限制性内切酶而可容易识别重组体个体的重组体识别方法。
     解决课题的技术方案
     为达成这些目的， 本发明提供制备成具有向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相 关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的非人 动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 中分别导入与基因异常相关联的基因突变， 同时， 向所述 基因的部分碱基序列导入改造成具有与所述部分碱基序列不同， 但编码相同的氨基酸序列 的碱基序列的探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳动物。
     另外， 本发明的优选实施方式提供由于所述突变而使出现限制性内切酶切割位点 的癫痫模型非人哺乳动物。
     本发明还旨在提供上述癫痫模型非人哺乳动物的制备方法， 包括 ： 向与人常染色 体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元乙酰胆碱受体基因的 α4 亚基 CHRNA4 或 β2 亚基 CHRNB2 的非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中导入与基因异常相关联的基因 突变， 同时， 将所述 cDNA 的部分碱基序列用具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同 的氨基酸序列的碱基序列的探针置换而制备突变基因， 将所述突变基因移入表达载体， 将 用限制性内切酶切断而分离的分离 DNA 注入受精卵而得到受精卵， 通过将所述受精卵移植 给受胚雌性动物来制备重组体。 另外， 本发明提供、 向基因的碱基序列中导入了一个或多个突变， 同时所述基因的 cDNA 的部分碱基序列被具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同的氨基酸序列的碱基 序列的探针置换的突变基因及其制备方法。 本发明的优选实施方式提供伴随所述突变而出 现限制性内切酶切割位点的突变基因及其制备方法。
     而且， 本发明提供利用上述探针或上述限制性内切酶位点的限制性内切酶识别上 述癫痫模型非人哺乳动物中是否存在作为上述突变基因的外来基因与宿主动物自身基因 之间的同源重组的重组体识别方法。
     发明效果
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物不是利用外部刺激或痉挛诱发物强制性地诱导 痉挛发作的所谓 “痉挛模型动物” ， 而是具有可作为自然诱发癫痫发作的癫痫的真模型动物 的巨大效果。
     即， 本发明的癫痫模型非人哺乳动物由于与人癫痫基因异常具有相同基因异常， 具有可作为自然诱发与人的痉挛发作同样的癫痫发作的癫痫的真模型动物的巨大效果。
     另外， 本发明的癫痫模型非人哺乳动物具有如下效果 ： 通过使用导入由于所述突 变而出现的限制性内切酶切割位点的限制性内切酶或突变基因的探针的限制性内切酶， 可 无需对重组体测序而容易地识别重组个体， 同时， 还由于由重组基因表达的 mRNA 与大鼠等 的其自身的 Chrna4 或 Chrnb2 的 mRNA 有区别而可通过 PCR 法或原位杂交法等容易地检测。
     附图说明
     【图 1】 图 1 是示 CHRNA4 的 Sma I/Bpu1102I 位点中的酶切位点的图。(A) 示野生型 CHRNA4 的酶切位点， (B) 是示探针的酶切位点的图。
     【图 2】 图 2 是示实施例 1 中构建的表达载体的示意图。
     【图 3】 图 3 是示 SnaB I/NaeI 位点中 PDGF 启动子和大鼠 Chrna4 的构成的示意图。
     【图 4】 图 4 是示 CHRNB2 的 Hinc II/Sma I 位点中酶切位点的图。(A) 示野生型 CHRNB2 的酶切位点， (B) 是示探针的酶切位点的图。
     【图 5】 图 5 是示实施例 4 中构建的表达载体的示意图。
     【图 6】 图 6 是示 SnaB I/Dra III 位点中 PDGF 启动子和大鼠 Chrnb2 的构成的示 意图。
     【图 7】 图 7 是示测定转基因大鼠 (Chrnb2V287L) 的脑波 (EEG) 的结果的图。
     【图 8】 图 8 是图 6 的记号 A 部分的放大图。
     【图 9】 图 9 是图 6 的记号 B 部分的放大图。
     实施方式
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物是具有将与作为家族性癫痫之一的以夜间的癫 痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的基因突变进行基因重组， 所述基因的部分 碱基序列被导入具有虽碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针的突变基 因， 缺失或缺损了神经元烟碱乙酰胆碱受体的 α4 亚基 CHRNA4 基因或 β2 亚基 CHRNB2 基 因的功能的基因重组癫痫模型非人哺乳动物。
     其中， 用语 “非人哺乳动物” 是指小鼠、 大鼠、 兔、 狗、 猫、 猪、 马、 牛等的人以外的哺 乳动物， 以常年用于抗癫痫药的开发的观点来看优选大鼠。另外， 在本说明书中， 为使说明 简洁， 以大鼠为例进行说明， 但不特别限定于大鼠。
     目前， 具有基因异常的疾病模型动物一般可通过所述技术领域惯用的重组动物制 备法来制备。在本发明中， 可通过所述技术领域以往使用的重组动物制备法来制备对于作 为家族性癫痫之一的以夜间的癫痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫的癫痫 模型动物。
     为此， 首先， 将与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱 受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的同源基因通过 PCR 克隆等的常规 方法从大鼠等分离。其中， 大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列信息以 L31620 人 CHRNA4cDNA 的 碱 基 序 列 信 息 的 NM_000744(NCBI) 登 录， 而 大 鼠 Chrnb2 的 cDNA 的 碱 基 序 列 信 息 以 NM_019297(NCBI) 登录。
     大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (Chrna4) 基因的 cDNA( 野生型 ) 的碱 基序列如下所示。其中， 下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外， 对应的氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 30 所示。(SEQ ID NO ： 1)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体 β2 亚基 (Chrnb2) 基因的 cDNA( 野生型 ) 的碱 基序列如下所示。其中， 下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外， 对应的氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 31 所示。
     (SEQ ID NO ： 2)
     ATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTG GGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTAC TAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGA TCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAAT ATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTA CGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGA GTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTAC GACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGA CATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCA TTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTC TTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCT GCTCATCTCCAAGATTGTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGC TAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCC CCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACG TCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGG CTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGA CCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGT TCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACT GCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     可通过已知的突变法向如此得到的 cDNA 克隆中导入突变。可在本发明中使用的 突变法优选使用所述技术领域以往广泛使用的位点特异性突变法等的以往方法。 此位点特 异性突变法可位点特异性地向 cDNA 中的任意位点导入任意突变。对于可向所述 cDNA 的 位点位点特异性地导入的突变物特别限制， 也可为所述突变缺失、 缺损、 置换或添加等的改 变。
     因此， 在本发明中， 可利用位点特异性突变法向分离大鼠 Chrna4 或 Chrnb2 中导入 所定的突变， 其结果， 导入了突变的大鼠的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 带有编码具有与人常 染色体显性夜发性额叶癫痫的发作相关联的功能的蛋白质的碱基序列。
     其中， 本说明书中使用的 “同源基因” 或与此相关的用语是遗传学用语， 是指基因 的碱基序列中具有与被认为祖先相同的异种动物的基因类似的碱基序列， 所编码的蛋白也 具有类似功能的基因。 在本发明中， 可如下修饰大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体亚基基因的 cDNA。
     具体而言， 以大鼠的 cDNA 克隆为模板， 基于既有的大鼠 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 序列设计、 制备 2 种引物 ( 例如， 具有下示碱基序列的正向引物和反向引物 )。
     基于大鼠 Chrna4 的 cDNA 序列制备的正向引物 (40 聚体 )(SEQID NO ： 3) 和反向引 物 (38 聚体 )(SEQ ID NO ： 4) 具有如下碱基序列。
     SEQ ID NO ： 3：
     AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG
     SEQ ID NO ： 4：
     AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA
     基于大鼠 Chrnb2 的 cDNA 序列制备的正向引物 (41 聚体 )(SEQID NO ： 5) 和反向引 物 (40 聚体 )(SEQ ID NO ： 6) 具有如下碱基序列。
     SEQ ID NO ： 5：
     AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT
     SEQ ID NO ： 6：
     ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA
     用这些引物进行 PCR， 将得到的 PCR 产物亚克隆于合适的载体中。 对得到的克隆测 序， 确定 Chrna4 及 Chrnb2 的 cDNA 的碱基序列。
     接着， 向如上所述得到的 cDNA 克隆的任意位点导入突变。突变法已知各种方法， 它们均可适用于本发明。特别是， 可通过使用位点特异性突变法等的突变法向任意位点导 入任意突变。
     如上所述， 作为 CHRNA4 基因的基因异常， 报告有 S280F、 S284L 且 291-292insL。 另 外， 作为 CHRNB2 基因的基因突变， 报告有 V287L、 V287M 及 I312M。
     由此， 在本发明中， 可通过上述突变法， 对如上所述通过 PCR 克隆分离的大鼠 Chrna4( 野生型 )(SEQ ID NO ： 1) 及大鼠 Chrnb2( 野生型 )(SEQ ID NO ： 2)， 导入相当于例如，
     CHRNA4 基因的基因异常 (S280F、 S284L、 或 291-292insL) 或者 CHRNB2 的基因突变 (V287L 或 V287M) 的物种特异性同源基因的突变。
     即， 突变可使用合适的正义引物和反义引物、 通过市售的试剂盒将所定的突变导 入所定的突变位点。可用于此突变的正义引物和反义引物一般为 20 聚体～ 40 聚体、 优选 为 25 聚体～ 35 聚体。此时， 为使限制性内切酶切割位点新出现于突变位点， 可加工引物、 突变位点等来导入突变。
     具体而言， 当向例如， 野生型大鼠 Chrna4 导入 S282F( 在人中为 S280F) 的突变时， 可使用下示的正义引物 (29 聚体 ) 和反义引物 (29 聚体 )， 将 cDNA 的碱基序列第 845 位的 C 突变为 T(c.845C ＞ T)， 再将第 846 位的 G 突变为 C(c.846G ＞ C)。由于此突变， 与 CHRNA4 的第 p.282 位同源的氨基酸残基 Ser 被置换为 Phe。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 7) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 8) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 7： CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC
     SEQ ID NO ： 8： GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG
     通过上述突变生成的突变大鼠 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 9) ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGT TACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGCT CATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGC GCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTC CTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCA GTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTA CCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTG GACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGC CGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCC CGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGC ATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCC GCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATG TGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTC CTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGC CCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCC CAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGAC TTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGG GGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCA TCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACC AGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATG CAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCC TGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTC TCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCT
     TCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 当向野生型大鼠 Chrna4 导入 S286L( 在人中为 S284L) 的突变时， 可使用下 示的正义引物 (29 聚体 ) 和反义引物 (29 聚体 )， 将 cDNA 的碱基序列第 856 位的 T 突变为 C(c.856T ＞ C)， 再将第 857 位的 C 突变为 T(c.857C ＞ T)。由于此突变， 与 CHRNA4 的第 p.286 位同源的氨基酸残基 Ser 被置换为 Leu。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 10) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 11) 的碱基序列如 下。
     SEQ ID NO ： 10 ： CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG
     SEQ ID NO ： 11 ：
     CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 12)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 通过在野生型大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列第 878 位和第 879 位之间插入 GCT(c.878-879insGCT)， 使用下示正义引物 (30 聚体 ) 和反义引物 (30 聚体 )， 与 CHRNA4 的第 p.293 位 ( 在人中为第 291 位 ) 同源的氨基酸残基 Leu 和与 CHRNA4 的第 p.294 位 ( 在 人中为第 292 位 ) 同源的氨基酸残基 Ile 之间被插入 Leu。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 13) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 14) 的碱基序列如 下。
     SEQ ID NO ： 13 ：
     GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC
     SEQ ID NO ： 14 ：
     GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 15)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     与上述 c.878-879insGCT 的情况同样， 通过在野生型大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基 序列第 879 位和第 880 位之间插入 TTA(c.879-880insTTA)， 与 CHRNA4 的第 p.293 位 ( 在人 中为第 291 位 ) 同源的氨基酸残基 Leu 和与 CHRNA4 的第 p.294 位 ( 在人中为第 292 位 ) 同源的氨基酸残基 Ile 之间被插入 Leu。(SEQ ID NO ： 16)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCTTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 通过向例如， 野生型大鼠 Chrnb2 导入 V287L 的突变， 在大鼠同源基因 Chrnb2 的 cDNA 中， 使用含 SEQ ID NO ： 16 所示的碱基序列的正向引物及含 SEQ ID NO ： 17 所示的碱 基序列的反向引物， 第 c.856 位的 G 被置换为 C(c.856G ＞ C)， 与人的神经元乙酰胆碱受体 β2 亚基 CHRNB2 同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被置换为氨基酸残基 Leu。
     可使用的正义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 17) 及反义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 18) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 17 ：
     CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC
     SEQ ID NO ： 18 ：
     GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 19)
     GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTAC TAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCA GATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGA CAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGG CATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCAT CTACAAGAGTGCATG CAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCA TGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGG GGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATG ACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCC ATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGT GTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTA CCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCAC ACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCG CTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAG GTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAG CCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTT CATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCG ACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAG AACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     同样， 通过向野生型大鼠 Chrnb2 导入 V287M 的突变， 在大鼠同源基因 Chrnb2 的 cDNA 中， 使用含 SEQ ID NO ： 20 所示的碱基序列的正向引物及含 SEQ ID NO ： 21 所示的碱基 序列的反向引物， 第 c.856 位的 G 被置换为 A(c.856G ＞ A)， 与人的神经元乙酰胆碱受体 β2 亚基 CHRNB2 同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被置换为氨基酸残基 Met。
     可使用的正义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 20) 及反义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 21) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 20 ：
     CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC
     SEQ ID NO ： 21 ：
     GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 22)
     TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGG GAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACT AACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGAT CATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATA TGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTAC GAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAG TGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACG ACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCAT TCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCT TCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTG CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCT AGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCC CCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGT CAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGC TGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAG CCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGAC CACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTT CCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTG CCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     在本发明中， 通过将如上所述导入突变的突变种类加工成对应于位于所述突变位 点的密码子的碱基序列， 从而可使所述突变位点出现新酶位点。
     例如， 就 Chrna4 而言， 通过导入 879-880insTTA 的突变， 出现由限制性内切酶 Tru9I(MseI) 的切割位点 (T ↓ TAA)。另外， 就 Chrnb2 而言， 通过导入 V287L 或 V287M， 出现 由限制性内切酶 HinfIf 的切割位点 (G ↓ ANTG)。其中， 箭标 ( ↓ ) 示切割处。但是， 限制 性内切酶的种类或切割位点等不限于此、 可通过改变突变来适宜选择。
     在本发明中， 向上述 cDNA 导入含所定碱基序列的核苷酸作为探针。导入的探针是 加工成与原碱基序列相比碱基序列完全或几乎完全不同， 但原氨基酸序列相同的核苷酸， 其碱基数一般为约 30bp ～ 200bp、 优选为约 50bp ～ 150bp、 更优选为约 60bp ～ 120bp。这 样的核苷酸可通过 DNA 合成法等的所述技术领域惯用的常规方法来制备。
     具体而言， 例如， 对于 Chrna4 基因的突变 cDNA 而言， 可以具有下示碱基序列 (118bp) 的核苷酸作为探针制备成碱基序列虽与所述 cDNA 的第 c.104 位～第 c.221 位的碱 基序列不同， 但氨基酸序列相同。
     (SEQ ID NO ： 23)
     GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGG CTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
     同样， 例如， 对于 Chrnb2 的突变 cDNA 而言， 可以具有下示碱基序列 (62bp) 的核苷 酸作为探针制备成碱基序列虽与 cDNA 的第 c.1171 位～第 c.1232 位的碱基序列不同， 但氨 基酸序列相同。
     (SEQ ID NO ： 24)
     AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
     接着， 将如上所述制备出的核苷酸探针杂交后， 通过常规方法使用限制性内切酶 位点导入探针。例如， 可通过所述技术领域惯用的探针导入法将 SEQ ID NO ： 22 所示的探 针插入具有上述碱基序列的 Chrna4 的突变 cDNA 的所定位点、 pCRII-TOPO 载体等的适当的 载体的 Sma I 和 Bpu1102I( 别名 Esp I 或 Cel II) 位点。另外， 例如， 可通过所述技术领域 惯用的探针导入法， 将 SEQ ID NO ： 22 所示的探针插入具有上述碱基序列的 Chrnb2 的突变 cDNA 的所定位点、 pCRII-TOPO 载体等的适当的载体的限制性内切酶位点的 Hinc I 和 SmaI。各步骤进行测序， 确定碱基序列。
     大鼠 Chrana4 的突变 cDNA(S282F)( 其中， 在人中为 S280F。 ) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探针导入突变基因 cDNA(S282FPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 25) 如下所示。 其中， 由于 c.845C ＞ T 和 c.846G ＞ C 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 844 位～第 846 位 的 TCG 被突变为 TTC， 且探针部分如下划线所示， 其碱基数为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。
     (SEQ ID NO ： 25)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGG CTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrna4 的突变 cDNA(S286L)( 其中， 在人中为 S284L。) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探针导入突变基因 cDNA(S284LPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 26) 如下所示。 其中， 由于 c.856T ＞ C 和 c.857C ＞ T 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 856 位～第 858 位的 TCT 被突变为 CTT， 且探针部分如下划线所示， 碱基数为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。
     (SEQ ID NO ： 26)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrana4 的突变 cDNA(879-880insL) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探 针导入突变基因 cDNA(S282FPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 27) 如下所示。 其中， 由于 c.845C ＞ T 和 c.846G ＞ C 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 844 位～第 846 位的 TCG 被突变为 TTC， 且探针部分如下划线所示， 为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。但是， 在人中为 S280F。
     (SEQ ID NO ： 27)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGG CTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrnb2 的突变 cDNA 中导入了 SEQ ID NO ： 24 所示的探针的探针导入突变基 因 cDNA(V286L) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 28) 如下所示。
     (SEQ ID NO ： 28)
     GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGG AACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTA ACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATC ATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATAT GAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACG AAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGT GCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGA CCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACA TCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATT CGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTT CTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGC TCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTA GTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCC CTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTC AGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCT GACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGC TGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACC ACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTC CTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGC CACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     大鼠 Chrnb2 的突变 cDNA 中导入了 SEQ ID NO ： 24 所示的探针的探针导入突变基 因 cDNA(V286M) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 29) 如下所示。(SEQ ID NO ： 29)
     TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGG GAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACT AACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGAT CATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATA TGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTAC GAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAG TGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACG ACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGAC ATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCAT TCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCT TCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTG CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCT AGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCC CCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGT CAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGC TGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCG CTGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGAC CACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTT CCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTG CCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     使用如上所述制备的导入大鼠上述突变和探针的大鼠 Chrna4 或 Chrb2 的 cDNA， 本 发明的癫痫非人哺乳动物其本身可根据公知的非人哺乳动物制备方法， 通过常规方法来制 备。所述非人哺乳动物的制备方法可例举 ： 将目的基因导入动物个体的转基因动物的制备 方法、 重组了靶基因和目的导入基因的基因置换动物的制备方法、 使用改变了目的基因的 细胞的核的克隆个体的制备方法等。
     本发明中， 以将作为目的基因的上述突变基因的 cDNA 导入例如大鼠等的动物个 体的受精卵的转基因动物的制备方法为例进行说明。
     首先， 制备具有编码与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰 胆碱受体的 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的同源基因中具有所述突变 的突变基因的 DNA 的表达载体。
     即， 分离含非人哺乳动物的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (Chrna4) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 基因的 DNA， 可通过向此 DNA 片段中插入外源基因等来构建表达载体。 作 为所述外源基因， 优选为标记基因， 特别优选为新霉素抗性基因等的抗生素抗性基因。 插入 抗生素抗性基因时， 可通过只在含抗生素的培养基中培养来筛选发生同源重组的细胞株。 另外， 为进行更有效的筛选， 也可在表达载体结合胸苷激酶基因等。由此， 可排除发生非同 源重组的细胞株。另外， 在表达载体结合白喉毒素 A 片段 (DT-A) 基因等， 则可排除发生非 同源重组的细胞株。作为表达载体， 使用例如， pCI-neo、 pMCIneo、 pXT1、 pSG5、 peDNA3.neo、 pLITMUS28、 pcDNAIamp、 pcDNA3 等。上述 DNA 优选为， 将所述 DNA 被连接到适当的启动子下游的表达载体作为导入基 因导入到非人哺乳动物的 DNA。此外， 作为启动子， 只要是可在导入编码上述受体亚基的 DNA 的非人哺乳动物的细胞内开始转录的启动子， 则可使用任何启动子， 可例举源于例如， 猴肾病毒 40、 多瘤病毒、 腺病毒 2、 人巨细胞病毒、 反转录病毒等的病毒的基因等的启动子。
     另外， 在本发明中使用的表达载体优选为， 在编码非人动物的神经元烟碱乙酰胆 碱受体的 α4 亚基 (Chrna2) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 的突变基因的 DNA 的下游具有 mRNA 的 3’ 末端的多聚腺苷酸化中必要的多聚腺苷酸化信号的表达载体。作为多聚腺苷酸化信 号， 可例举例如， 源于上述病毒等的各基因所含的 SV40 的后期基因或初期基因等的多聚腺 苷酸化信号等。 此外， 在表达载体中， 为了更高表达目的基因， 也可将各基因的剪接信号、 增 强子区域、 内含子的一部分连接到启动子区域的 5’ 上游、 启动子区域和翻译区域间、 或者翻 译区域的 3’ 下游。
     在本发明中， 例如， 使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 将导入上述突变和探针的 大鼠突变 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 移入表达载体中后， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 切 割。例如， 将大鼠突变 Chrna4 的 cDNA 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载 体中时， 可使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 移入， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 切割， 另外， 移入大鼠 Chrb2 的 cDNA 时， 可使用限制性内切酶位点 XhoI 和 SalI 移入， 用限制性内 切酶 SnaBI 和 DraIII 切割。由此， 可将含 PDGF 启动子、 大鼠突变 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 及 polyA 部分的片段作为 DNA 构建物从凝胶切出分离、 纯化。 在本发明中， 例如， 可通过将如上所述分离、 纯化的 DNA 构建物等导入非人哺乳动 物的分化全能性细胞来制备非人哺乳动物。作为可使用的分化全能性细胞， 可使用例如， 受精卵、 初期胚、 胚胎干细胞等。待导入 DNA 构建物的受精卵可通过将例如， 性腺刺激激素 (PMS) 等的排卵诱发剂施用于腹腔内， 诱发雌性动物的超数排卵而回收可导入 DNA 构建物 的受精卵， 摘出与通过输精管结扎等而去势的雄性小鼠交配的假孕雌性动物的输卵管， 在 显微镜下采集来得到。
     接着， 向得到的受精卵中导入 DNA 构建物。已知作为将构建物导入受精卵的手段 的各种方法， 但在考虑转基因动物个体的制备效率或往下一代的导入基因的传递效率时， 优选微注射法。将如此注入了突变基因的受精卵移植到代孕母亲的输卵管中， 使发育成个 体， 从身体的一部分 ( 例如， 尾部尖端等 ) 的体细胞提取 DNA， 通过 DNA 印迹或 PCR 法确定导 入的基因的存在。 可通过筛选如此体细胞的基因组中整合了导入基因的个体来制备目的转 基因动物。
     将如上所述确定存在导入基因的个体 ( 杂合子 ) 作为原代 (Founder ： F0)， 则导入 基因传递到 50％其子代 (F1)。接着， 通过交配此 F1 个体的雌雄， 可制备 2 倍体染色体的两 方具有导入基因的个体 (F2)。
     对此， 本发明中用于癫痫模型非人哺乳动物的制备的转基因方法是， 向正常状 态的内源性基因 (Chrna4 基因或 Chrnb2 基因 ) 染色体 DNA 的任意位置新导入编码突变 型 Chrna4 或 Chrnb2 的突变基因。为此， 本发明的癫痫模型动物中， 分别同时产生正常的 Chrna4 或 Chrnb2， 和突变型 Chrna4 或 Chrnb2。神经元烟碱乙酰胆碱受体是发挥离子通道 (α 亚基 2 个、 β 亚基 3 个 ) 功能的蛋白质， 这样的离子通道只要任意亚基突变， 则通道功 能改变。 因此， 如本发明所述， 认为同时表达正常亚基和突变亚基对于表现人型癫痫发作的
     模型动物合适。
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物， 如后述实施例所示， 具有如同人染色体显性夜 发性额叶癫痫， 在睡眠中自然发症癫痫发作的优异的特性。
     其中， 目的基因整合到全部细胞的染色体上的个体的选择通常如下进行 ： 从构成 个体的血液组织、 上皮组织等的组织的一部分制备 DNA， 对 DNA 进行测序， 以 DNA 水平确定存 在导入基因。但是， 如此测序 DNA 来选择所述重组个体需要费时费力且费成本的复杂操作。
     即， 制备具有基因异常的疾病模型动物时， 有必要正确判别同源重组体。 以往的疾 病模型动物的制备法中， 为了判别重组体， 有必要对所述个体的基因的一部分进行测序， 且 需要表达所述导入基因的 mRNA。 但是， 通过 RT-PCR 或原位杂交等表达所述导入基因的 mRNA 并不容易。
     由此， 在本发明中， 通过如上所述对突变基因进行突变， 同时将所述突变基因的一 部分用探针置换来进行操作， 以使可容易地进行重组体的识别。 另外， 由于上述突变而出现 新限制性内切酶切割位点时， 也可容易地进行重组体的识别。其中， 此方法应理解为， 不仅 限于下示说明的具体实施方式， 与基因突变或限制性内切酶等的种类无关， 适用于全部突 变。另外， 在本发明中， 对位点特异性地导入所述 cDNA 克隆的位点的突变的种类无特别限 定。
     即， 本发明中， 为了可容易地进行所述重组个体的选择， 如上所述， 向编码非人动 物的神经元烟碱乙酰胆碱受体的 α4 亚基 (Chrna4) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 基因 DNA 导 入例如， S280L、 S284L、 S291-292L、 V287L、 V287M 等的突变， 而使出现新的限制性内切酶切割 位点。通过如此使出现新的限制性内切酶切割位点， 可在制备重组体时， 容易识别重组体。
     在本发明中， 将制备出的突变 cDNA 的一部分的碱基序列用含碱基序列与所述碱 基序列基本上完全不同， 但氨基酸序列相同的碱基序列的探针置换， 再导入与原碱基序列 相同的位点， 通过使用所述导入的探针的限制性内切酶， 不仅可容易识别重组个体， 还由于 由重组基因表达的 mRNA 与大鼠自身的 Chrna4mRNA 或 Chrnb2mRNA 有区别， 可通过 RT-PCR 或原位杂交等容易地检测。
     另外， 例如， 通过向神经元乙酰胆碱受体基因的 α4 亚基 CHRNB2 的同源基因 Chrnb2 导入突变 (c.856G ＞ C) 或 (c.856G ＞ A)， 出现限制性内切酶切割位点 Hinf If， 可 通过使用限制性内切酶 Hinf If 的 PCR-RFLP( 限制性内切酶片段长度多态性 ) 法等判别含 此切割位点的区域。即， 不发生目的同源重组的个体由于不具有 Hinf If 位点， 不发生由限 制性内切酶 Hinf If 的切割， 与此相比， 发生目的同源重组的个体则由于具有 Hinf If 位 点， 可由限制性内切酶 Hinf If 切割。因此， 在本发明中， 通过使神经元乙酰胆碱受体基因 的 α4 亚基 CHRNA4 的同源基因 Chrna4 或 β4 亚基 CHRNB2 的同源基因 Chrnb2 突变而出现 限制性内切酶切割位点， 可容易地识别重组体。
     其中， 其中使用的 PCR-RFLP 法， 由于其本身是公知手法， 通过此方法， 将对象位点 用 PCR 扩增， 将扩增产物用所定限制性内切酶、 例如， True9I 或 Hinf If 等的限制性内切酶 消化， 用电泳等检查消化后的 DNA 片段的大小， 研究所述限制性内切酶的切割位点的存在 与否。
     以下， 通过实施例更详细说明本发明， 本发明不限于下述实施例， 且下述实施例仅 为旨在具体说明本发明的例示记载， 应理解为不旨在以任何方式限定本发明的记载。实施例 实施例 1 ：
     首 先，以 大 鼠 脑 QUICK-Clone cDNA(CLONTECH ； MountainView， CA) 作 为 模 板， 用 基 于 既 有 的 大 鼠 Chrna4 的 cDNA 序 列 设 计 的 2 个 引 物， 即， 正 向 引 物 (BN- 大 鼠 CHRNA4cDNA-F) ：
     AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG(40 聚体 )(SEQ ID NO ： 3) 和
     反向引物 ( 大鼠 CHRNA4cDNA-BX-R) ：
     AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA(38 聚体 )(SEQ ID NO ： 4)
     进行了 PCR。将得到的 PCR 产物纯化， 亚克隆到 pCRII-TOPO 载体 (Invitorogen ； Carlsbad， CA) 中。将得到的克隆测序， 确定 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列。其中， 大鼠碱基 序列信息以登录号 L31620(NCBI) 被登录。
     向得到的克隆使用 QuikChange 位点特异性诱变试剂盒 (STRATAGENE ； La Jolla， CA) 进行突变。 首先， 使用 r845T846C-sen ： CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC(29 聚体 )(SEQ ID NO ： 7) 和 r845T846C-ant ： GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG(29 聚体 )(SEQ IDNO ： 8) 将 cDNA 碱基序列第 845 位的 C 突变为 T， 又将第 846 位的 G 突变为 C。得到的突变 cDNA 的碱 基序列如 SEQ ID NO ： 9 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.282 位 的氨基酸残基 Ser 被突变为氨基酸残基 Phe。
     向如此制备出的突变的 cDNA 的 c.104 ～ c.221， 制备具有含编码与此位点相同的 氨基酸序列， 但碱基序列与原碱基序列完全不同的下示碱基序列的 118bp 的核苷酸的探针 (SEQ ID NO ： 23) 而导入所述位点。
     (SEQ ID NO ： 23)
     GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGG CTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
     对如上所述导入探针的突变 cDNA 杂交后， 将待插入 pCRII-TOPO 载体的 Chrna4 的 cDNA， 使用限制性内切酶位点的 SmaI 和 Bpu1102I 进行插入。各步骤中进行测序， 确定碱基 序列。
     而且， 将具有所述突变 (S286L) 的大鼠 Chrna4 的 cDNA 使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载体中后， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 进行切割。将具有 PDGF 启动子和大鼠 Chrna4 的 cDNA 及 polyA 部分的片段 由凝胶切出分离、 纯化。此经分离、 纯化的 DNA 显微注入到受精卵， 将状态良好的 200 个以 上的卵移植到受胚雌性动物的输卵管中， 通过自然分娩的方法制备出重组体。
     实施例 2 ：
     如同实施例 1， 使用 r856C857T-sen ： CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG(29 聚体 ) (SEQ IDNO ： 10) 和 r856C857T-ant ： CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG(29 聚体 )(SEQ IDNO ： 11) 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 T 突变为 C， 将第 857 位的 C 突变为 T。 得到的突变 cDNA 的 碱基序列如 SEQ ID NO ： 12 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Ser 被突变为氨基酸残基 Leu。
     向如此制备出的突变的 cDNA 的 c.104 ～ c.221， 如同实施例 1， 制备含 SEQ ID NO ：
     23 所示的 118bp 的核苷酸的探针而导入。
     使用如上所述导入探针的突变 cDNA， 如同实施例 1 制备出重组体。
     实施例 3 ：
     如同实施例 1， 使用正义引物 rCHRNA-878insGCT-sen ： GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCAC CGAGATC(30 聚体 )(SEQ IDNO ： 13) 和反义引物 rCHRNA-878insGCT-ant ： GATCTCGGTGATGAGC AGCAGCAGGAAGAC(30 聚体 )(SEQ IDNO ： 14) 在 cDNA 碱基序列第 878 位和第 879 位之间插入 GCT。得到的突变 cDNA 的碱基序列如 SEQ ID NO ： 15 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.293 位的氨基酸残基 Leu 和第 p.294 位的氨基酸残基 Ile 之间被插入 氨基酸残基 Leu。
     使用如此制备出的突变的 cDNA， 如同实施例 1 制备出重组体。
     实施例 4 ：
     向通过 PCR 克隆分离的大鼠 Chrnb2， 通过突变法， 导入 c.856G ＞ C 和 c.856G ＞ A 的突变。即， 以大鼠脑 QUICK-ClonecDNA(CLONTECH Mountain View， CA) 作为模板， 由基于 既有的大鼠 Chrnb2 的 cDNA 序列设计的 2 个引物 (BN- 大鼠 CHRNB2cDNA-F ： AGATCTCGCGACA TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT(41 聚体 )(SEQ ID NO ： 5) 和大鼠 CHRNB2cDNA-CB-R ： ATCG ATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA(40 聚体 )(SEQ ID NO ： 6) 进行 PCR。生成得到的 PCR 产物， 并亚克隆到 pCRII-TOPO 载体 (Invitorogen Carlsbad， CA) 中。对得到的克隆进 行测序， 确定 Chrnb2 的 cDNA 的碱基序列。 此大鼠碱基序列信息以登录号 NM_019297(NCBI) 被登录。
     使用 QuikChange 位点特异性诱变试剂盒 (STRATAGENE、 LaJolla， CA) 向得到的克 隆中导入突变。首先， 使用大鼠 CHRNB2m286V/M-F ： CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC(30 聚体 )(SEQ ID NO ： 17) 和大鼠 CHRNB2m286V/M-R ： GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG(30 聚 体 )(SEQ IDNO ： 18)， 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 G 突变为 C。由此， 与人的神经元乙酰胆 碱受体 β2 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被突变为氨基酸残基 Leu( 作为 β 是 遵从了特许厅的在线申请规则 )。
     此突变中， 由 c.856G ＞ C 的导入， 限制性内切酶切割位点出现 HinfIf， 认为制备重 组体时， 可容易地识别重组体。
     向制备出的突变的 cDNA 的 c.1171 ～ c.1232 导入了编码与此位点相同的氨基酸 序列， 但碱基序列与所述碱基序列完全不同的探针 (SEQID NO ： 24)。
     (SEQ ID NO ： 24)
     AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
     其中， 制备此 62bp 的核苷酸， 杂交后， 将待插入 pCRII-TOPO 载体中的 Chrnb2 的 cDNA 使用限制性内切酶位点的 Hinc II 和 Sma I 进行插入。各步骤中进行测序， 确定碱基 序列。
     而且， 将具有所述突变和探针的大鼠 Chrnb2 的 2 种 cDNA， 使用限制性内切酶位点 Xho I 和 Sal I 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载体中后， 用限制性内切 酶 SnaBI 和 DraIII 切割。将具有 PDGF 启动子和大鼠 Chrnb2 的 cDNA 及 polyA 部分的片段 由凝胶切出分离、 纯化。将此分离出的 DNA 显微注入受精卵， 将状态良好的 200 个以上的卵 移植到受胚雌性动物的输卵管中， 通过自然分娩方法制备出重组体。实施例 5 ：
     如同实施例 4， 使用大鼠 CHRNB2m286V/L-F ： CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC(3 0 聚体 )(SEQ IDNO ： 20) 和大鼠 CHRNB2m286V/L-R ： GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG(30 聚体 )(SEQID NO ： 21) 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 G 突变为 A。由此， 与人的神经元乙酰 胆碱受体 β2 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被突变为氨基酸残基 Met。使用如 此得到的突变 cDNA， 如同实施例 4 制备出重组体。
     实施例 6 ：
     癫痫模型大鼠的脑波 (electroencephalogram ： EEG) 测定
     对 8 ～ 10 周龄的转基因大鼠 (Chrnb2V287L) 进行脑波 (EEG) 测定。将大鼠用戊 巴比妥钠 ( 大日本住友制药株式会社 ) 麻醉， 固定于脑定位固定装置 (SR-5、 成重 )， 电极 安装于大鼠的头盖骨的前卤点至动脉 ： 2.5mm， 侧部 ： 1.5mm 和动脉 ： -2.5mm， 侧部 ： 2.5mm， 将无关电极安装于大鼠鼻骨附近的骨的厚部分， 用牙科用粘固剂固定。将脑波测定用的涂 覆特氟隆 ( 注册商标 ) 的不锈钢电极安装于左右大脑半球的额叶 ( 距前卤点 A ＝ 3.mm、 L ＝ 0.8mm)， 用牙科用粘固剂固定。将无关电极埋入小脑位点的上部。脑波 (EEG) 则使用 VideoOption(KISSEI COMTEC)， 将大鼠放入箱子内数天， 在自由运动条件下进行测定， 脑波 解析使用 SleepSign(KISSEI COMTEC) 进行。
     脑波测定结果示于图 5。图中、 将异常脑波部分以记号 A 及记号 B 显示， 以记号 A 显示的异常脑波部分的放大图示于图 6， 而将以记号 B 显示的异常脑波部分示于图 7。此结 果证实， 本发明的大鼠可作为癫痫模型大鼠而被利用。
     工业实用性
     背景技术 癫痫是约 2％日本国民患病的比较多的神经疾病， 其分子生物学成因长期不明。 其 原因是因为癫痫是多种多样的疾病的总称。 但是， 最近以家族性癫痫为中心， 略得知了其遗 传异常。
     其中的常染色体显性夜发性额叶癫痫是家族性癫痫之一， 以夜间的癫痫发作为特 征， 作为其原因基因异常， 报告了神经元乙酰胆碱受体的 α4 且 β2 亚基的基因的 CHRNA4 且 CHRNB2 的基因的突变 ( 非专利文献 1)。作为 CHRNA4 的基因异常， 有 S284L、 S280F 及 291-292insL 的 3 种被报告 ( 非专利文献 2、 3、 4、 5)。另外， 作为 CHRNB2 的基因异常， 有
     其中的常染色体显性夜发性额叶癫痫是家族性癫痫之一， 以夜间的癫痫发作为特 征， 作为其原因基因异常， 报告了神经元乙酰胆碱受体的 α4 且 β2 亚基的基因的 CHRNA4 且 CHRNB2 的基因的突变 ( 非专利文献 1)。作为 CHRNA4 的基因异常， 有 S284L、 S280F 及 291-292insL 的 3 种被报告 ( 非专利文献 2、 3、 4、 5)。另外， 作为 CHRNB2 的基因异常， 有
    V287L、 V287M 及 I312M 的 3 种的基因异常被报告 ( 非专利文献 6、 7、 8)。
     作为用于癫痫的诊断法或处理方法的开发及发展的手段， 使用了所谓 “癫痫模型 动物” 。以往的癫痫模型动物是电刺激或使用戊四唑等的痉挛诱发物的 “痉挛模型动物” 。 另外， 也公开了通过导入糖链抗体基因引起癫痫样痉挛的转基因非人哺乳动物 ( 专利文献 1)。 另外， 也制备了响应于体位转换呈现出强直间代痉挛或癫痫症状的， 从染色体上缺损了 μ3B 基因功能的非人动物 ( 专利文献 2)。但是， 这些以往的模型动物虽然可作为痉挛发作 的模型动物， 但不可作为分子生物学水平的人癫痫的真模型动物。
     发明人发现， 人染色体显性夜发性额叶癫痫为神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因的第 284 位的 Ser 被置换为 Leu( 非专利文献 9)。
     由此， 本发明人制备了通过基因重组导入了大鼠神经元乙酰胆碱受体基因 CHRNA4 的基因突变的基因重组癫痫模型动物 ( 专利文献 3)。
     但是， 由于以往技术在制备所述基因重组模型动物中， 发生同源重组的概率不高， 有必要筛选大量重组体。 另外， 重组体的筛选中有必要对其基因的一部分进行测序， 为此要 耗费相当的时间和费用。 因此， 要是能开发出不进行基因测序而判别重组体的方法， 就能节 约大幅的时间和费用， 也期待所述重组体的判别方法的开发。
     非专利文献 1 ： Hirose， S.， et al.， Neurology 53 ： 1749-1753， 1999
     非专利文献 2 ： Steinlein， O.K.， et al.A missense mutation in theneuronal nicotinic acetylcholine receptor alpha 4 subunit is associatedwith autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Nat Genet11， 201-203(1995).
     非专利文献 3 ： Hirose， S.， et al.A novel mutation of CHRNA4responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Neurology 53 ， 1749-1753(1999).非专利文献 4 ： Steinlein， O.K.， et al.Independent occurrence ofthe CHRNA4 Ser248Phe mutation in a Norwegian family withnocturnal frontal lobe epilepsy. Epilepsia 41， 529-535(2000).
     非专利文献 5 ： Steinlein， O.K.， et al.An insertion mutation of theCHRNA4 gene in a family with autosomal dominant noctu rnal frontallobe epilepsy.Hum Mol Genet 6， 943-947(1997).
     非专利文献 6 ： De Fusco， M.， et al.The nicotinic receptor b2subunit is mutant in nocturnal frontal lobe epilepsy.Nat Genet 26， 275-276(2000).
     非专利文献 7 ： Phillips， H.A.， et al.CHRNB2 is the secondacetylcholine receptor subunit associated with autosomal dominantnocturnal frontal lobe epilepsy.Am J Hum Genet 68， 225-231(2001).
     非专利文献 8 ： Bertrand， D.， et al.The CHRNB2 mutation I312Mis associated with epilepsy and distinct memory deficits.Neurobiol Dis20， 799-804(2005).
     非专利文献 9 ： Hirose， S.， et al.A novel mutation of CHRNA4responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Neurology 53 ， 1749-1753(1999).
    
    
    专利文献 1 ： 特开 2006-141217 号公报 专利文献 2 ： 专利第 3853136 号公报 专利文献 3 ： 特开 2005-245361 号公报发明内容 发明拟解决的技术课题
     为响应上述愿望， 本发明人经锐意研究的结果发现， 将与人 CHRNA4 或 CHRNB2 的基 因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中、 且向 所述突变 cDNA 的部分碱基序列导入改造成具有与其碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序 列的碱基序列的探针而制备出的非人哺乳动物可作为癫痫的模型动物， 同时， 如此制备出 的非人哺乳动物不仅可容易识别所述重组个体， 还由于由重组基因表达的 mRNA 与其自身 的同源基因的 mRNA 有区别而可容易检测。而且， 本发明人在将与人 CHRNA4 或 CHRNB2 的基 因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中时， 通 过加工突变位点和所述突变而使出现限制性内切酶切割位点来导入突变， 发现可容易识别 重组个体， 从而完成本发明。
     因此， 本发明是与人癫痫的基因异常具有相同基因异常的大鼠等的癫痫模型非人 哺乳动物， 旨在提供向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受 体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的非人哺乳动物的 DNA 中导入了作为 基因异常的基因突变， 且具有可通过导入特定探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳 动物及其制备方法。
     另外， 本发明旨在提供将上述基因突变导入 cDNA， 同时将所述 cDNA 的部分碱基序 列用具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针置换而得 到的突变基因及其制备方法。
     本发明的优选实施方式旨在提供将上述基因突变导入 cDNA 的新出现限制性内切 酶切割位点的突变基因及其突变方法。
     而且， 本发明旨在提供通过施用针对上述限制性内切酶切割位点的限制性内切酶 或制备上述探针时使用的限制性内切酶而可容易识别重组体个体的重组体识别方法。
     解决课题的技术方案
     为达成这些目的， 本发明提供制备成具有向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相 关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的非人 动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 中分别导入与基因异常相关联的基因突变， 同时， 向所述 基因的部分碱基序列导入改造成具有与所述部分碱基序列不同， 但编码相同的氨基酸序列 的碱基序列的探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳动物。
     另外， 本发明的优选实施方式提供由于所述突变而使出现限制性内切酶切割位点 的癫痫模型非人哺乳动物。
     本发明还旨在提供上述癫痫模型非人哺乳动物的制备方法， 包括 ： 向与人常染色 体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元乙酰胆碱受体基因的 α4 亚基 CHRNA4 或 β2 亚基 CHRNB2 的非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中导入与基因异常相关联的基因 突变， 同时， 将所述 cDNA 的部分碱基序列用具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同 的氨基酸序列的碱基序列的探针置换而制备突变基因， 将所述突变基因移入表达载体， 将 用限制性内切酶切断而分离的分离 DNA 注入受精卵而得到受精卵， 通过将所述受精卵移植 给受胚雌性动物来制备重组体。 另外， 本发明提供、 向基因的碱基序列中导入了一个或多个突变， 同时所述基因的 cDNA 的部分碱基序列被具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同的氨基酸序列的碱基 序列的探针置换的突变基因及其制备方法。 本发明的优选实施方式提供伴随所述突变而出 现限制性内切酶切割位点的突变基因及其制备方法。
     而且， 本发明提供利用上述探针或上述限制性内切酶位点的限制性内切酶识别上 述癫痫模型非人哺乳动物中是否存在作为上述突变基因的外来基因与宿主动物自身基因 之间的同源重组的重组体识别方法。
     发明效果
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物不是利用外部刺激或痉挛诱发物强制性地诱导 痉挛发作的所谓 “痉挛模型动物” ， 而是具有可作为自然诱发癫痫发作的癫痫的真模型动物 的巨大效果。
     即， 本发明的癫痫模型非人哺乳动物由于与人癫痫基因异常具有相同基因异常， 具有可作为自然诱发与人的痉挛发作同样的癫痫发作的癫痫的真模型动物的巨大效果。
     另外， 本发明的癫痫模型非人哺乳动物具有如下效果 ： 通过使用导入由于所述突 变而出现的限制性内切酶切割位点的限制性内切酶或突变基因的探针的限制性内切酶， 可 无需对重组体测序而容易地识别重组个体， 同时， 还由于由重组基因表达的 mRNA 与大鼠等 的其自身的 Chrna4 或 Chrnb2 的 mRNA 有区别而可通过 PCR 法或原位杂交法等容易地检测。
    附图说明
     【图 1】 图 1 是示 CHRNA4 的 Sma I/Bpu1102I 位点中的酶切位点的图。(A) 示野生型 CHRNA4 的酶切位点， (B) 是示探针的酶切位点的图。
     【图 2】 图 2 是示实施例 1 中构建的表达载体的示意图。
     【图 3】 图 3 是示 SnaB I/NaeI 位点中 PDGF 启动子和大鼠 Chrna4 的构成的示意图。
     【图 4】 图 4 是示 CHRNB2 的 Hinc II/Sma I 位点中酶切位点的图。(A) 示野生型 CHRNB2 的酶切位点， (B) 是示探针的酶切位点的图。
     【图 5】 图 5 是示实施例 4 中构建的表达载体的示意图。
     【图 6】 图 6 是示 SnaB I/Dra III 位点中 PDGF 启动子和大鼠 Chrnb2 的构成的示 意图。
     【图 7】 图 7 是示测定转基因大鼠 (Chrnb2V287L) 的脑波 (EEG) 的结果的图。
     【图 8】 图 8 是图 6 的记号 A 部分的放大图。
     【图 9】 图 9 是图 6 的记号 B 部分的放大图。
     实施方式
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物是具有将与作为家族性癫痫之一的以夜间的癫 痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的基因突变进行基因重组， 所述基因的部分 碱基序列被导入具有虽碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针的突变基 因， 缺失或缺损了神经元烟碱乙酰胆碱受体的 α4 亚基 CHRNA4 基因或 β2 亚基 CHRNB2 基 因的功能的基因重组癫痫模型非人哺乳动物。
     其中， 用语 “非人哺乳动物” 是指小鼠、 大鼠、 兔、 狗、 猫、 猪、 马、 牛等的人以外的哺 乳动物， 以常年用于抗癫痫药的开发的观点来看优选大鼠。另外， 在本说明书中， 为使说明 简洁， 以大鼠为例进行说明， 但不特别限定于大鼠。
     目前， 具有基因异常的疾病模型动物一般可通过所述技术领域惯用的重组动物制 备法来制备。在本发明中， 可通过所述技术领域以往使用的重组动物制备法来制备对于作 为家族性癫痫之一的以夜间的癫痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫的癫痫 模型动物。
     为此， 首先， 将与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱 受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的同源基因通过 PCR 克隆等的常规 方法从大鼠等分离。其中， 大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列信息以 L31620 人 CHRNA4cDNA 的 碱 基 序 列 信 息 的 NM_000744(NCBI) 登 录， 而 大 鼠 Chrnb2 的 cDNA 的 碱 基 序 列 信 息 以 NM_019297(NCBI) 登录。
     大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (Chrna4) 基因的 cDNA( 野生型 ) 的碱 基序列如下所示。其中， 下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外， 对应的氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 30 所示。(SEQ ID NO ： 1)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体 β2 亚基 (Chrnb2) 基因的 cDNA( 野生型 ) 的碱 基序列如下所示。其中， 下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外， 对应的氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 31 所示。
     (SEQ ID NO ： 2)
     ATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTG GGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTAC TAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGA TCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAAT ATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTA CGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGA GTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTAC GACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGA CATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCA TTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTC TTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCT GCTCATCTCCAAGATTGTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGC TAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCC CCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACG TCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGG CTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGA CCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGT TCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACT GCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     可通过已知的突变法向如此得到的 cDNA 克隆中导入突变。可在本发明中使用的 突变法优选使用所述技术领域以往广泛使用的位点特异性突变法等的以往方法。 此位点特 异性突变法可位点特异性地向 cDNA 中的任意位点导入任意突变。对于可向所述 cDNA 的 位点位点特异性地导入的突变物特别限制， 也可为所述突变缺失、 缺损、 置换或添加等的改 变。
     因此， 在本发明中， 可利用位点特异性突变法向分离大鼠 Chrna4 或 Chrnb2 中导入 所定的突变， 其结果， 导入了突变的大鼠的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 带有编码具有与人常 染色体显性夜发性额叶癫痫的发作相关联的功能的蛋白质的碱基序列。
     其中， 本说明书中使用的 “同源基因” 或与此相关的用语是遗传学用语， 是指基因 的碱基序列中具有与被认为祖先相同的异种动物的基因类似的碱基序列， 所编码的蛋白也 具有类似功能的基因。 在本发明中， 可如下修饰大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体亚基基因的 cDNA。
     具体而言， 以大鼠的 cDNA 克隆为模板， 基于既有的大鼠 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 序列设计、 制备 2 种引物 ( 例如， 具有下示碱基序列的正向引物和反向引物 )。
     基于大鼠 Chrna4 的 cDNA 序列制备的正向引物 (40 聚体 )(SEQID NO ： 3) 和反向引 物 (38 聚体 )(SEQ ID NO ： 4) 具有如下碱基序列。
     SEQ ID NO ： 3：
     AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG
     SEQ ID NO ： 4：
     AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA
     基于大鼠 Chrnb2 的 cDNA 序列制备的正向引物 (41 聚体 )(SEQID NO ： 5) 和反向引 物 (40 聚体 )(SEQ ID NO ： 6) 具有如下碱基序列。
     SEQ ID NO ： 5：
     AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT
     SEQ ID NO ： 6：
     ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA
     用这些引物进行 PCR， 将得到的 PCR 产物亚克隆于合适的载体中。 对得到的克隆测 序， 确定 Chrna4 及 Chrnb2 的 cDNA 的碱基序列。
     接着， 向如上所述得到的 cDNA 克隆的任意位点导入突变。突变法已知各种方法， 它们均可适用于本发明。特别是， 可通过使用位点特异性突变法等的突变法向任意位点导 入任意突变。
     如上所述， 作为 CHRNA4 基因的基因异常， 报告有 S280F、 S284L 且 291-292insL。 另 外， 作为 CHRNB2 基因的基因突变， 报告有 V287L、 V287M 及 I312M。
     由此， 在本发明中， 可通过上述突变法， 对如上所述通过 PCR 克隆分离的大鼠 Chrna4( 野生型 )(SEQ ID NO ： 1) 及大鼠 Chrnb2( 野生型 )(SEQ ID NO ： 2)， 导入相当于例如，
     CHRNA4 基因的基因异常 (S280F、 S284L、 或 291-292insL) 或者 CHRNB2 的基因突变 (V287L 或 V287M) 的物种特异性同源基因的突变。
     即， 突变可使用合适的正义引物和反义引物、 通过市售的试剂盒将所定的突变导 入所定的突变位点。可用于此突变的正义引物和反义引物一般为 20 聚体～ 40 聚体、 优选 为 25 聚体～ 35 聚体。此时， 为使限制性内切酶切割位点新出现于突变位点， 可加工引物、 突变位点等来导入突变。
     具体而言， 当向例如， 野生型大鼠 Chrna4 导入 S282F( 在人中为 S280F) 的突变时， 可使用下示的正义引物 (29 聚体 ) 和反义引物 (29 聚体 )， 将 cDNA 的碱基序列第 845 位的 C 突变为 T(c.845C ＞ T)， 再将第 846 位的 G 突变为 C(c.846G ＞ C)。由于此突变， 与 CHRNA4 的第 p.282 位同源的氨基酸残基 Ser 被置换为 Phe。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 7) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 8) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 7： CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC
     SEQ ID NO ： 8： GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG
     通过上述突变生成的突变大鼠 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 9) ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGT TACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGCT CATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGC GCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTC CTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCA GTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTA CCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTG GACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGC CGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCC CGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGC ATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCC GCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATG TGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTC CTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGC CCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCC CAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGAC TTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGG GGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCA TCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACC AGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATG CAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCC TGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTC TCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCT
     TCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 当向野生型大鼠 Chrna4 导入 S286L( 在人中为 S284L) 的突变时， 可使用下 示的正义引物 (29 聚体 ) 和反义引物 (29 聚体 )， 将 cDNA 的碱基序列第 856 位的 T 突变为 C(c.856T ＞ C)， 再将第 857 位的 C 突变为 T(c.857C ＞ T)。由于此突变， 与 CHRNA4 的第 p.286 位同源的氨基酸残基 Ser 被置换为 Leu。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 10) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 11) 的碱基序列如 下。
     SEQ ID NO ： 10 ： CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG
     SEQ ID NO ： 11 ：
     CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 12)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 通过在野生型大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列第 878 位和第 879 位之间插入 GCT(c.878-879insGCT)， 使用下示正义引物 (30 聚体 ) 和反义引物 (30 聚体 )， 与 CHRNA4 的第 p.293 位 ( 在人中为第 291 位 ) 同源的氨基酸残基 Leu 和与 CHRNA4 的第 p.294 位 ( 在 人中为第 292 位 ) 同源的氨基酸残基 Ile 之间被插入 Leu。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 13) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 14) 的碱基序列如 下。
     SEQ ID NO ： 13 ：
     GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC
     SEQ ID NO ： 14 ：
     GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 15)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     与上述 c.878-879insGCT 的情况同样， 通过在野生型大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基 序列第 879 位和第 880 位之间插入 TTA(c.879-880insTTA)， 与 CHRNA4 的第 p.293 位 ( 在人 中为第 291 位 ) 同源的氨基酸残基 Leu 和与 CHRNA4 的第 p.294 位 ( 在人中为第 292 位 ) 同源的氨基酸残基 Ile 之间被插入 Leu。(SEQ ID NO ： 16)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCTTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 通过向例如， 野生型大鼠 Chrnb2 导入 V287L 的突变， 在大鼠同源基因 Chrnb2 的 cDNA 中， 使用含 SEQ ID NO ： 16 所示的碱基序列的正向引物及含 SEQ ID NO ： 17 所示的碱 基序列的反向引物， 第 c.856 位的 G 被置换为 C(c.856G ＞ C)， 与人的神经元乙酰胆碱受体 β2 亚基 CHRNB2 同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被置换为氨基酸残基 Leu。
     可使用的正义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 17) 及反义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 18) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 17 ：
     CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC
     SEQ ID NO ： 18 ：
     GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 19)
     GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTAC TAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCA GATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGA CAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGG CATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCAT CTACAAGAGTGCATG CAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCA TGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGG GGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATG ACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCC ATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGT GTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTA CCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCAC ACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCG CTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAG GTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAG CCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTT CATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCG ACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAG AACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     同样， 通过向野生型大鼠 Chrnb2 导入 V287M 的突变， 在大鼠同源基因 Chrnb2 的 cDNA 中， 使用含 SEQ ID NO ： 20 所示的碱基序列的正向引物及含 SEQ ID NO ： 21 所示的碱基 序列的反向引物， 第 c.856 位的 G 被置换为 A(c.856G ＞ A)， 与人的神经元乙酰胆碱受体 β2 亚基 CHRNB2 同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被置换为氨基酸残基 Met。
     可使用的正义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 20) 及反义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 21) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 20 ：
     CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC
     SEQ ID NO ： 21 ：
     GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 22)
     TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGG GAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACT AACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGAT CATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATA TGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTAC GAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAG TGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACG ACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCAT TCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCT TCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTG CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCT AGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCC CCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGT CAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGC TGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAG CCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGAC CACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTT CCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTG CCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     在本发明中， 通过将如上所述导入突变的突变种类加工成对应于位于所述突变位 点的密码子的碱基序列， 从而可使所述突变位点出现新酶位点。
     例如， 就 Chrna4 而言， 通过导入 879-880insTTA 的突变， 出现由限制性内切酶 Tru9I(MseI) 的切割位点 (T ↓ TAA)。另外， 就 Chrnb2 而言， 通过导入 V287L 或 V287M， 出现 由限制性内切酶 HinfIf 的切割位点 (G ↓ ANTG)。其中， 箭标 ( ↓ ) 示切割处。但是， 限制 性内切酶的种类或切割位点等不限于此、 可通过改变突变来适宜选择。
     在本发明中， 向上述 cDNA 导入含所定碱基序列的核苷酸作为探针。导入的探针是 加工成与原碱基序列相比碱基序列完全或几乎完全不同， 但原氨基酸序列相同的核苷酸， 其碱基数一般为约 30bp ～ 200bp、 优选为约 50bp ～ 150bp、 更优选为约 60bp ～ 120bp。这 样的核苷酸可通过 DNA 合成法等的所述技术领域惯用的常规方法来制备。
     具体而言， 例如， 对于 Chrna4 基因的突变 cDNA 而言， 可以具有下示碱基序列 (118bp) 的核苷酸作为探针制备成碱基序列虽与所述 cDNA 的第 c.104 位～第 c.221 位的碱 基序列不同， 但氨基酸序列相同。
     (SEQ ID NO ： 23)
     GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGG CTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
     同样， 例如， 对于 Chrnb2 的突变 cDNA 而言， 可以具有下示碱基序列 (62bp) 的核苷 酸作为探针制备成碱基序列虽与 cDNA 的第 c.1171 位～第 c.1232 位的碱基序列不同， 但氨 基酸序列相同。
     (SEQ ID NO ： 24)
     AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
     接着， 将如上所述制备出的核苷酸探针杂交后， 通过常规方法使用限制性内切酶 位点导入探针。例如， 可通过所述技术领域惯用的探针导入法将 SEQ ID NO ： 22 所示的探 针插入具有上述碱基序列的 Chrna4 的突变 cDNA 的所定位点、 pCRII-TOPO 载体等的适当的 载体的 Sma I 和 Bpu1102I( 别名 Esp I 或 Cel II) 位点。另外， 例如， 可通过所述技术领域 惯用的探针导入法， 将 SEQ ID NO ： 22 所示的探针插入具有上述碱基序列的 Chrnb2 的突变 cDNA 的所定位点、 pCRII-TOPO 载体等的适当的载体的限制性内切酶位点的 Hinc I 和 SmaI。各步骤进行测序， 确定碱基序列。
     大鼠 Chrana4 的突变 cDNA(S282F)( 其中， 在人中为 S280F。 ) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探针导入突变基因 cDNA(S282FPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 25) 如下所示。 其中， 由于 c.845C ＞ T 和 c.846G ＞ C 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 844 位～第 846 位 的 TCG 被突变为 TTC， 且探针部分如下划线所示， 其碱基数为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。
     (SEQ ID NO ： 25)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGG CTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrna4 的突变 cDNA(S286L)( 其中， 在人中为 S284L。) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探针导入突变基因 cDNA(S284LPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 26) 如下所示。 其中， 由于 c.856T ＞ C 和 c.857C ＞ T 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 856 位～第 858 位的 TCT 被突变为 CTT， 且探针部分如下划线所示， 碱基数为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。
     (SEQ ID NO ： 26)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrana4 的突变 cDNA(879-880insL) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探 针导入突变基因 cDNA(S282FPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 27) 如下所示。 其中， 由于 c.845C ＞ T 和 c.846G ＞ C 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 844 位～第 846 位的 TCG 被突变为 TTC， 且探针部分如下划线所示， 为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。但是， 在人中为 S280F。
     (SEQ ID NO ： 27)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGG CTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrnb2 的突变 cDNA 中导入了 SEQ ID NO ： 24 所示的探针的探针导入突变基 因 cDNA(V286L) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 28) 如下所示。
     (SEQ ID NO ： 28)
     GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGG AACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTA ACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATC ATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATAT GAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACG AAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGT GCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGA CCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACA TCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATT CGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTT CTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGC TCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTA GTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCC CTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTC AGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCT GACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGC TGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACC ACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTC CTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGC CACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     大鼠 Chrnb2 的突变 cDNA 中导入了 SEQ ID NO ： 24 所示的探针的探针导入突变基 因 cDNA(V286M) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 29) 如下所示。(SEQ ID NO ： 29)
     TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGG GAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACT AACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGAT CATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATA TGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTAC GAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAG TGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACG ACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGAC ATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCAT TCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCT TCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTG CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCT AGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCC CCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGT CAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGC TGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCG CTGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGAC CACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTT CCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTG CCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     使用如上所述制备的导入大鼠上述突变和探针的大鼠 Chrna4 或 Chrb2 的 cDNA， 本 发明的癫痫非人哺乳动物其本身可根据公知的非人哺乳动物制备方法， 通过常规方法来制 备。所述非人哺乳动物的制备方法可例举 ： 将目的基因导入动物个体的转基因动物的制备 方法、 重组了靶基因和目的导入基因的基因置换动物的制备方法、 使用改变了目的基因的 细胞的核的克隆个体的制备方法等。
     本发明中， 以将作为目的基因的上述突变基因的 cDNA 导入例如大鼠等的动物个 体的受精卵的转基因动物的制备方法为例进行说明。
     首先， 制备具有编码与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰 胆碱受体的 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的同源基因中具有所述突变 的突变基因的 DNA 的表达载体。
     即， 分离含非人哺乳动物的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (Chrna4) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 基因的 DNA， 可通过向此 DNA 片段中插入外源基因等来构建表达载体。 作 为所述外源基因， 优选为标记基因， 特别优选为新霉素抗性基因等的抗生素抗性基因。 插入 抗生素抗性基因时， 可通过只在含抗生素的培养基中培养来筛选发生同源重组的细胞株。 另外， 为进行更有效的筛选， 也可在表达载体结合胸苷激酶基因等。由此， 可排除发生非同 源重组的细胞株。另外， 在表达载体结合白喉毒素 A 片段 (DT-A) 基因等， 则可排除发生非 同源重组的细胞株。作为表达载体， 使用例如， pCI-neo、 pMCIneo、 pXT1、 pSG5、 peDNA3.neo、 pLITMUS28、 pcDNAIamp、 pcDNA3 等。上述 DNA 优选为， 将所述 DNA 被连接到适当的启动子下游的表达载体作为导入基 因导入到非人哺乳动物的 DNA。此外， 作为启动子， 只要是可在导入编码上述受体亚基的 DNA 的非人哺乳动物的细胞内开始转录的启动子， 则可使用任何启动子， 可例举源于例如， 猴肾病毒 40、 多瘤病毒、 腺病毒 2、 人巨细胞病毒、 反转录病毒等的病毒的基因等的启动子。
     另外， 在本发明中使用的表达载体优选为， 在编码非人动物的神经元烟碱乙酰胆 碱受体的 α4 亚基 (Chrna2) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 的突变基因的 DNA 的下游具有 mRNA 的 3’ 末端的多聚腺苷酸化中必要的多聚腺苷酸化信号的表达载体。作为多聚腺苷酸化信 号， 可例举例如， 源于上述病毒等的各基因所含的 SV40 的后期基因或初期基因等的多聚腺 苷酸化信号等。 此外， 在表达载体中， 为了更高表达目的基因， 也可将各基因的剪接信号、 增 强子区域、 内含子的一部分连接到启动子区域的 5’ 上游、 启动子区域和翻译区域间、 或者翻 译区域的 3’ 下游。
     在本发明中， 例如， 使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 将导入上述突变和探针的 大鼠突变 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 移入表达载体中后， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 切 割。例如， 将大鼠突变 Chrna4 的 cDNA 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载 体中时， 可使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 移入， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 切割， 另外， 移入大鼠 Chrb2 的 cDNA 时， 可使用限制性内切酶位点 XhoI 和 SalI 移入， 用限制性内 切酶 SnaBI 和 DraIII 切割。由此， 可将含 PDGF 启动子、 大鼠突变 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 及 polyA 部分的片段作为 DNA 构建物从凝胶切出分离、 纯化。 在本发明中， 例如， 可通过将如上所述分离、 纯化的 DNA 构建物等导入非人哺乳动 物的分化全能性细胞来制备非人哺乳动物。作为可使用的分化全能性细胞， 可使用例如， 受精卵、 初期胚、 胚胎干细胞等。待导入 DNA 构建物的受精卵可通过将例如， 性腺刺激激素 (PMS) 等的排卵诱发剂施用于腹腔内， 诱发雌性动物的超数排卵而回收可导入 DNA 构建物 的受精卵， 摘出与通过输精管结扎等而去势的雄性小鼠交配的假孕雌性动物的输卵管， 在 显微镜下采集来得到。
     接着， 向得到的受精卵中导入 DNA 构建物。已知作为将构建物导入受精卵的手段 的各种方法， 但在考虑转基因动物个体的制备效率或往下一代的导入基因的传递效率时， 优选微注射法。将如此注入了突变基因的受精卵移植到代孕母亲的输卵管中， 使发育成个 体， 从身体的一部分 ( 例如， 尾部尖端等 ) 的体细胞提取 DNA， 通过 DNA 印迹或 PCR 法确定导 入的基因的存在。 可通过筛选如此体细胞的基因组中整合了导入基因的个体来制备目的转 基因动物。
     将如上所述确定存在导入基因的个体 ( 杂合子 ) 作为原代 (Founder ： F0)， 则导入 基因传递到 50％其子代 (F1)。接着， 通过交配此 F1 个体的雌雄， 可制备 2 倍体染色体的两 方具有导入基因的个体 (F2)。
     对此， 本发明中用于癫痫模型非人哺乳动物的制备的转基因方法是， 向正常状 态的内源性基因 (Chrna4 基因或 Chrnb2 基因 ) 染色体 DNA 的任意位置新导入编码突变 型 Chrna4 或 Chrnb2 的突变基因。为此， 本发明的癫痫模型动物中， 分别同时产生正常的 Chrna4 或 Chrnb2， 和突变型 Chrna4 或 Chrnb2。神经元烟碱乙酰胆碱受体是发挥离子通道 (α 亚基 2 个、 β 亚基 3 个 ) 功能的蛋白质， 这样的离子通道只要任意亚基突变， 则通道功 能改变。 因此， 如本发明所述， 认为同时表达正常亚基和突变亚基对于表现人型癫痫发作的
     模型动物合适。
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物， 如后述实施例所示， 具有如同人染色体显性夜 发性额叶癫痫， 在睡眠中自然发症癫痫发作的优异的特性。
     其中， 目的基因整合到全部细胞的染色体上的个体的选择通常如下进行 ： 从构成 个体的血液组织、 上皮组织等的组织的一部分制备 DNA， 对 DNA 进行测序， 以 DNA 水平确定存 在导入基因。但是， 如此测序 DNA 来选择所述重组个体需要费时费力且费成本的复杂操作。
     即， 制备具有基因异常的疾病模型动物时， 有必要正确判别同源重组体。 以往的疾 病模型动物的制备法中， 为了判别重组体， 有必要对所述个体的基因的一部分进行测序， 且 需要表达所述导入基因的 mRNA。 但是， 通过 RT-PCR 或原位杂交等表达所述导入基因的 mRNA 并不容易。
     由此， 在本发明中， 通过如上所述对突变基因进行突变， 同时将所述突变基因的一 部分用探针置换来进行操作， 以使可容易地进行重组体的识别。 另外， 由于上述突变而出现 新限制性内切酶切割位点时， 也可容易地进行重组体的识别。其中， 此方法应理解为， 不仅 限于下示说明的具体实施方式， 与基因突变或限制性内切酶等的种类无关， 适用于全部突 变。另外， 在本发明中， 对位点特异性地导入所述 cDNA 克隆的位点的突变的种类无特别限 定。
     即， 本发明中， 为了可容易地进行所述重组个体的选择， 如上所述， 向编码非人动 物的神经元烟碱乙酰胆碱受体的 α4 亚基 (Chrna4) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 基因 DNA 导 入例如， S280L、 S284L、 S291-292L、 V287L、 V287M 等的突变， 而使出现新的限制性内切酶切割 位点。通过如此使出现新的限制性内切酶切割位点， 可在制备重组体时， 容易识别重组体。
     在本发明中， 将制备出的突变 cDNA 的一部分的碱基序列用含碱基序列与所述碱 基序列基本上完全不同， 但氨基酸序列相同的碱基序列的探针置换， 再导入与原碱基序列 相同的位点， 通过使用所述导入的探针的限制性内切酶， 不仅可容易识别重组个体， 还由于 由重组基因表达的 mRNA 与大鼠自身的 Chrna4mRNA 或 Chrnb2mRNA 有区别， 可通过 RT-PCR 或原位杂交等容易地检测。
     另外， 例如， 通过向神经元乙酰胆碱受体基因的 α4 亚基 CHRNB2 的同源基因 Chrnb2 导入突变 (c.856G ＞ C) 或 (c.856G ＞ A)， 出现限制性内切酶切割位点 Hinf If， 可 通过使用限制性内切酶 Hinf If 的 PCR-RFLP( 限制性内切酶片段长度多态性 ) 法等判别含 此切割位点的区域。即， 不发生目的同源重组的个体由于不具有 Hinf If 位点， 不发生由限 制性内切酶 Hinf If 的切割， 与此相比， 发生目的同源重组的个体则由于具有 Hinf If 位 点， 可由限制性内切酶 Hinf If 切割。因此， 在本发明中， 通过使神经元乙酰胆碱受体基因 的 α4 亚基 CHRNA4 的同源基因 Chrna4 或 β4 亚基 CHRNB2 的同源基因 Chrnb2 突变而出现 限制性内切酶切割位点， 可容易地识别重组体。
     其中， 其中使用的 PCR-RFLP 法， 由于其本身是公知手法， 通过此方法， 将对象位点 用 PCR 扩增， 将扩增产物用所定限制性内切酶、 例如， True9I 或 Hinf If 等的限制性内切酶 消化， 用电泳等检查消化后的 DNA 片段的大小， 研究所述限制性内切酶的切割位点的存在 与否。
     以下， 通过实施例更详细说明本发明， 本发明不限于下述实施例， 且下述实施例仅 为旨在具体说明本发明的例示记载， 应理解为不旨在以任何方式限定本发明的记载。实施例 实施例 1 ：
     首 先，以 大 鼠 脑 QUICK-Clone cDNA(CLONTECH ； MountainView， CA) 作 为 模 板， 用 基 于 既 有 的 大 鼠 Chrna4 的 cDNA 序 列 设 计 的 2 个 引 物， 即， 正 向 引 物 (BN- 大 鼠 CHRNA4cDNA-F) ：
     AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG(40 聚体 )(SEQ ID NO ： 3) 和
     反向引物 ( 大鼠 CHRNA4cDNA-BX-R) ：
     AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA(38 聚体 )(SEQ ID NO ： 4)
     进行了 PCR。将得到的 PCR 产物纯化， 亚克隆到 pCRII-TOPO 载体 (Invitorogen ； Carlsbad， CA) 中。将得到的克隆测序， 确定 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列。其中， 大鼠碱基 序列信息以登录号 L31620(NCBI) 被登录。
     向得到的克隆使用 QuikChange 位点特异性诱变试剂盒 (STRATAGENE ； La Jolla， CA) 进行突变。 首先， 使用 r845T846C-sen ： CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC(29 聚体 )(SEQ ID NO ： 7) 和 r845T846C-ant ： GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG(29 聚体 )(SEQ IDNO ： 8) 将 cDNA 碱基序列第 845 位的 C 突变为 T， 又将第 846 位的 G 突变为 C。得到的突变 cDNA 的碱 基序列如 SEQ ID NO ： 9 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.282 位 的氨基酸残基 Ser 被突变为氨基酸残基 Phe。
     向如此制备出的突变的 cDNA 的 c.104 ～ c.221， 制备具有含编码与此位点相同的 氨基酸序列， 但碱基序列与原碱基序列完全不同的下示碱基序列的 118bp 的核苷酸的探针 (SEQ ID NO ： 23) 而导入所述位点。
     (SEQ ID NO ： 23)
     GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGG CTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
     对如上所述导入探针的突变 cDNA 杂交后， 将待插入 pCRII-TOPO 载体的 Chrna4 的 cDNA， 使用限制性内切酶位点的 SmaI 和 Bpu1102I 进行插入。各步骤中进行测序， 确定碱基 序列。
     而且， 将具有所述突变 (S286L) 的大鼠 Chrna4 的 cDNA 使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载体中后， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 进行切割。将具有 PDGF 启动子和大鼠 Chrna4 的 cDNA 及 polyA 部分的片段 由凝胶切出分离、 纯化。此经分离、 纯化的 DNA 显微注入到受精卵， 将状态良好的 200 个以 上的卵移植到受胚雌性动物的输卵管中， 通过自然分娩的方法制备出重组体。
     实施例 2 ：
     如同实施例 1， 使用 r856C857T-sen ： CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG(29 聚体 ) (SEQ IDNO ： 10) 和 r856C857T-ant ： CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG(29 聚体 )(SEQ IDNO ： 11) 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 T 突变为 C， 将第 857 位的 C 突变为 T。 得到的突变 cDNA 的 碱基序列如 SEQ ID NO ： 12 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Ser 被突变为氨基酸残基 Leu。
     向如此制备出的突变的 cDNA 的 c.104 ～ c.221， 如同实施例 1， 制备含 SEQ ID NO ：
     23 所示的 118bp 的核苷酸的探针而导入。
     使用如上所述导入探针的突变 cDNA， 如同实施例 1 制备出重组体。
     实施例 3 ：
     如同实施例 1， 使用正义引物 rCHRNA-878insGCT-sen ： GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCAC CGAGATC(30 聚体 )(SEQ IDNO ： 13) 和反义引物 rCHRNA-878insGCT-ant ： GATCTCGGTGATGAGC AGCAGCAGGAAGAC(30 聚体 )(SEQ IDNO ： 14) 在 cDNA 碱基序列第 878 位和第 879 位之间插入 GCT。得到的突变 cDNA 的碱基序列如 SEQ ID NO ： 15 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.293 位的氨基酸残基 Leu 和第 p.294 位的氨基酸残基 Ile 之间被插入 氨基酸残基 Leu。
     使用如此制备出的突变的 cDNA， 如同实施例 1 制备出重组体。
     实施例 4 ：
     向通过 PCR 克隆分离的大鼠 Chrnb2， 通过突变法， 导入 c.856G ＞ C 和 c.856G ＞ A 的突变。即， 以大鼠脑 QUICK-ClonecDNA(CLONTECH Mountain View， CA) 作为模板， 由基于 既有的大鼠 Chrnb2 的 cDNA 序列设计的 2 个引物 (BN- 大鼠 CHRNB2cDNA-F ： AGATCTCGCGACA TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT(41 聚体 )(SEQ ID NO ： 5) 和大鼠 CHRNB2cDNA-CB-R ： ATCG ATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA(40 聚体 )(SEQ ID NO ： 6) 进行 PCR。生成得到的 PCR 产物， 并亚克隆到 pCRII-TOPO 载体 (Invitorogen Carlsbad， CA) 中。对得到的克隆进 行测序， 确定 Chrnb2 的 cDNA 的碱基序列。 此大鼠碱基序列信息以登录号 NM_019297(NCBI) 被登录。
     使用 QuikChange 位点特异性诱变试剂盒 (STRATAGENE、 LaJolla， CA) 向得到的克 隆中导入突变。首先， 使用大鼠 CHRNB2m286V/M-F ： CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC(30 聚体 )(SEQ ID NO ： 17) 和大鼠 CHRNB2m286V/M-R ： GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG(30 聚 体 )(SEQ IDNO ： 18)， 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 G 突变为 C。由此， 与人的神经元乙酰胆 碱受体 β2 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被突变为氨基酸残基 Leu( 作为 β 是 遵从了特许厅的在线申请规则 )。
     此突变中， 由 c.856G ＞ C 的导入， 限制性内切酶切割位点出现 HinfIf， 认为制备重 组体时， 可容易地识别重组体。
     向制备出的突变的 cDNA 的 c.1171 ～ c.1232 导入了编码与此位点相同的氨基酸 序列， 但碱基序列与所述碱基序列完全不同的探针 (SEQID NO ： 24)。
     (SEQ ID NO ： 24)
     AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
     其中， 制备此 62bp 的核苷酸， 杂交后， 将待插入 pCRII-TOPO 载体中的 Chrnb2 的 cDNA 使用限制性内切酶位点的 Hinc II 和 Sma I 进行插入。各步骤中进行测序， 确定碱基 序列。
     而且， 将具有所述突变和探针的大鼠 Chrnb2 的 2 种 cDNA， 使用限制性内切酶位点 Xho I 和 Sal I 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载体中后， 用限制性内切 酶 SnaBI 和 DraIII 切割。将具有 PDGF 启动子和大鼠 Chrnb2 的 cDNA 及 polyA 部分的片段 由凝胶切出分离、 纯化。将此分离出的 DNA 显微注入受精卵， 将状态良好的 200 个以上的卵 移植到受胚雌性动物的输卵管中， 通过自然分娩方法制备出重组体。实施例 5 ：
     如同实施例 4， 使用大鼠 CHRNB2m286V/L-F ： CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC(3 0 聚体 )(SEQ IDNO ： 20) 和大鼠 CHRNB2m286V/L-R ： GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG(30 聚体 )(SEQID NO ： 21) 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 G 突变为 A。由此， 与人的神经元乙酰 胆碱受体 β2 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被突变为氨基酸残基 Met。使用如 此得到的突变 cDNA， 如同实施例 4 制备出重组体。
     实施例 6 ：
     癫痫模型大鼠的脑波 (electroencephalogram ： EEG) 测定
     对 8 ～ 10 周龄的转基因大鼠 (Chrnb2V287L) 进行脑波 (EEG) 测定。将大鼠用戊 巴比妥钠 ( 大日本住友制药株式会社 ) 麻醉， 固定于脑定位固定装置 (SR-5、 成重 )， 电极 安装于大鼠的头盖骨的前卤点至动脉 ： 2.5mm， 侧部 ： 1.5mm 和动脉 ： -2.5mm， 侧部 ： 2.5mm， 将无关电极安装于大鼠鼻骨附近的骨的厚部分， 用牙科用粘固剂固定。将脑波测定用的涂 覆特氟隆 ( 注册商标 ) 的不锈钢电极安装于左右大脑半球的额叶 ( 距前卤点 A ＝ 3.mm、 L ＝ 0.8mm)， 用牙科用粘固剂固定。将无关电极埋入小脑位点的上部。脑波 (EEG) 则使用 VideoOption(KISSEI COMTEC)， 将大鼠放入箱子内数天， 在自由运动条件下进行测定， 脑波 解析使用 SleepSign(KISSEI COMTEC) 进行。
     脑波测定结果示于图 5。图中、 将异常脑波部分以记号 A 及记号 B 显示， 以记号 A 显示的异常脑波部分的放大图示于图 6， 而将以记号 B 显示的异常脑波部分示于图 7。此结 果证实， 本发明的大鼠可作为癫痫模型大鼠而被利用。
     工业实用性
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物是与人癫痫基因异常具有相同基因异常的癫痫 模型非人哺乳动物， 通过使用此模型动物， 可诱发与人癫痫发作同等的痉挛发作而进行研 究， 可利用于癫痫的治疗药的研究、 开发。26CN 101970657 A
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     非专利文献 5 ： Steinlein， O.K.， et al.An insertion mutation of theCHRNA4 gene in a family with autosomal dominant noctu rnal frontallobe epilepsy.Hum Mol Genet 6， 943-947(1997).
     非专利文献 6 ： De Fusco， M.， et al.The nicotinic receptor b2subunit is mutant in nocturnal frontal lobe epilepsy.Nat Genet 26， 275-276(2000).
     非专利文献 7 ： Phillips， H.A.， et al.CHRNB2 is the secondacetylcholine receptor subunit associated with autosomal dominantnocturnal frontal lobe epilepsy.Am J Hum Genet 68， 225-231(2001).
     非专利文献 8 ： Bertrand， D.， et al.The CHRNB2 mutation I312Mis associated with epilepsy and distinct memory deficits.Neurobiol Dis20， 799-804(2005).
     非专利文献 9 ： Hirose， S.， et al.A novel mutation of CHRNA4responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.Neurology 53 ， 1749-1753(1999).
     专利文献 1 ： 特开 2006-141217 号公报 专利文献 2 ： 专利第 3853136 号公报 专利文献 3 ： 特开 2005-245361 号公报发明内容 发明拟解决的技术课题
     为响应上述愿望， 本发明人经锐意研究的结果发现， 将与人 CHRNA4 或 CHRNB2 的基 因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中、 且向 所述突变 cDNA 的部分碱基序列导入改造成具有与其碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序 列的碱基序列的探针而制备出的非人哺乳动物可作为癫痫的模型动物， 同时， 如此制备出 的非人哺乳动物不仅可容易识别所述重组个体， 还由于由重组基因表达的 mRNA 与其自身 的同源基因的 mRNA 有区别而可容易检测。而且， 本发明人在将与人 CHRNA4 或 CHRNB2 的基 因异常相关联的基因突变分别导入非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中时， 通 过加工突变位点和所述突变而使出现限制性内切酶切割位点来导入突变， 发现可容易识别 重组个体， 从而完成本发明。
     因此， 本发明是与人癫痫的基因异常具有相同基因异常的大鼠等的癫痫模型非人 哺乳动物， 旨在提供向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受 体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的非人哺乳动物的 DNA 中导入了作为 基因异常的基因突变， 且具有可通过导入特定探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳 动物及其制备方法。
     另外， 本发明旨在提供将上述基因突变导入 cDNA， 同时将所述 cDNA 的部分碱基序 列用具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针置换而得 到的突变基因及其制备方法。
     本发明的优选实施方式旨在提供将上述基因突变导入 cDNA 的新出现限制性内切 酶切割位点的突变基因及其突变方法。
     而且， 本发明旨在提供通过施用针对上述限制性内切酶切割位点的限制性内切酶 或制备上述探针时使用的限制性内切酶而可容易识别重组体个体的重组体识别方法。
     解决课题的技术方案
     为达成这些目的， 本发明提供制备成具有向与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相 关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的非人 动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 中分别导入与基因异常相关联的基因突变， 同时， 向所述 基因的部分碱基序列导入改造成具有与所述部分碱基序列不同， 但编码相同的氨基酸序列 的碱基序列的探针而得到的突变基因的癫痫模型非人哺乳动物。
     另外， 本发明的优选实施方式提供由于所述突变而使出现限制性内切酶切割位点 的癫痫模型非人哺乳动物。
     本发明还旨在提供上述癫痫模型非人哺乳动物的制备方法， 包括 ： 向与人常染色 体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元乙酰胆碱受体基因的 α4 亚基 CHRNA4 或 β2 亚基 CHRNB2 的非人动物的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 中导入与基因异常相关联的基因 突变， 同时， 将所述 cDNA 的部分碱基序列用具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同 的氨基酸序列的碱基序列的探针置换而制备突变基因， 将所述突变基因移入表达载体， 将 用限制性内切酶切断而分离的分离 DNA 注入受精卵而得到受精卵， 通过将所述受精卵移植 给受胚雌性动物来制备重组体。 另外， 本发明提供、 向基因的碱基序列中导入了一个或多个突变， 同时所述基因的 cDNA 的部分碱基序列被具有虽与所述部分碱基序列不同， 但编码相同的氨基酸序列的碱基 序列的探针置换的突变基因及其制备方法。 本发明的优选实施方式提供伴随所述突变而出 现限制性内切酶切割位点的突变基因及其制备方法。
     而且， 本发明提供利用上述探针或上述限制性内切酶位点的限制性内切酶识别上 述癫痫模型非人哺乳动物中是否存在作为上述突变基因的外来基因与宿主动物自身基因 之间的同源重组的重组体识别方法。
     发明效果
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物不是利用外部刺激或痉挛诱发物强制性地诱导 痉挛发作的所谓 “痉挛模型动物” ， 而是具有可作为自然诱发癫痫发作的癫痫的真模型动物 的巨大效果。
     即， 本发明的癫痫模型非人哺乳动物由于与人癫痫基因异常具有相同基因异常， 具有可作为自然诱发与人的痉挛发作同样的癫痫发作的癫痫的真模型动物的巨大效果。
     另外， 本发明的癫痫模型非人哺乳动物具有如下效果 ： 通过使用导入由于所述突 变而出现的限制性内切酶切割位点的限制性内切酶或突变基因的探针的限制性内切酶， 可 无需对重组体测序而容易地识别重组个体， 同时， 还由于由重组基因表达的 mRNA 与大鼠等 的其自身的 Chrna4 或 Chrnb2 的 mRNA 有区别而可通过 PCR 法或原位杂交法等容易地检测。
    附图说明
     【图 1】 图 1 是示 CHRNA4 的 Sma I/Bpu1102I 位点中的酶切位点的图。(A) 示野生型 CHRNA4 的酶切位点， (B) 是示探针的酶切位点的图。
     【图 2】 图 2 是示实施例 1 中构建的表达载体的示意图。
     【图 3】 图 3 是示 SnaB I/NaeI 位点中 PDGF 启动子和大鼠 Chrna4 的构成的示意图。
     【图 4】 图 4 是示 CHRNB2 的 Hinc II/Sma I 位点中酶切位点的图。(A) 示野生型 CHRNB2 的酶切位点， (B) 是示探针的酶切位点的图。
     【图 5】 图 5 是示实施例 4 中构建的表达载体的示意图。
     【图 6】 图 6 是示 SnaB I/Dra III 位点中 PDGF 启动子和大鼠 Chrnb2 的构成的示 意图。
     【图 7】 图 7 是示测定转基因大鼠 (Chrnb2V287L) 的脑波 (EEG) 的结果的图。
     【图 8】 图 8 是图 6 的记号 A 部分的放大图。
     【图 9】 图 9 是图 6 的记号 B 部分的放大图。
     实施方式
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物是具有将与作为家族性癫痫之一的以夜间的癫 痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的基因突变进行基因重组， 所述基因的部分 碱基序列被导入具有虽碱基序列不同， 但编码相同氨基酸序列的碱基序列的探针的突变基 因， 缺失或缺损了神经元烟碱乙酰胆碱受体的 α4 亚基 CHRNA4 基因或 β2 亚基 CHRNB2 基 因的功能的基因重组癫痫模型非人哺乳动物。
     其中， 用语 “非人哺乳动物” 是指小鼠、 大鼠、 兔、 狗、 猫、 猪、 马、 牛等的人以外的哺 乳动物， 以常年用于抗癫痫药的开发的观点来看优选大鼠。另外， 在本说明书中， 为使说明 简洁， 以大鼠为例进行说明， 但不特别限定于大鼠。
     目前， 具有基因异常的疾病模型动物一般可通过所述技术领域惯用的重组动物制 备法来制备。在本发明中， 可通过所述技术领域以往使用的重组动物制备法来制备对于作 为家族性癫痫之一的以夜间的癫痫发作为特征的人常染色体显性夜发性额叶癫痫的癫痫 模型动物。
     为此， 首先， 将与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰胆碱 受体 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的同源基因通过 PCR 克隆等的常规 方法从大鼠等分离。其中， 大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列信息以 L31620 人 CHRNA4cDNA 的 碱 基 序 列 信 息 的 NM_000744(NCBI) 登 录， 而 大 鼠 Chrnb2 的 cDNA 的 碱 基 序 列 信 息 以 NM_019297(NCBI) 登录。
     大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (Chrna4) 基因的 cDNA( 野生型 ) 的碱 基序列如下所示。其中， 下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外， 对应的氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 30 所示。(SEQ ID NO ： 1)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体 β2 亚基 (Chrnb2) 基因的 cDNA( 野生型 ) 的碱 基序列如下所示。其中， 下划线部分显示本发明中被探针置换的部分。另外， 对应的氨基酸 序列如 SEQ ID NO ： 31 所示。
     (SEQ ID NO ： 2)
     ATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTG GGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTAC TAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGA TCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAAT ATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTA CGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGA GTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTAC GACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGA CATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCA TTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTC TTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCT GCTCATCTCCAAGATTGTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGC TAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCC CCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACG TCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGG CTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGA CCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGT TCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACT GCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     可通过已知的突变法向如此得到的 cDNA 克隆中导入突变。可在本发明中使用的 突变法优选使用所述技术领域以往广泛使用的位点特异性突变法等的以往方法。 此位点特 异性突变法可位点特异性地向 cDNA 中的任意位点导入任意突变。对于可向所述 cDNA 的 位点位点特异性地导入的突变物特别限制， 也可为所述突变缺失、 缺损、 置换或添加等的改 变。
     因此， 在本发明中， 可利用位点特异性突变法向分离大鼠 Chrna4 或 Chrnb2 中导入 所定的突变， 其结果， 导入了突变的大鼠的同源基因 Chrna4 或 Chrnb2 带有编码具有与人常 染色体显性夜发性额叶癫痫的发作相关联的功能的蛋白质的碱基序列。
     其中， 本说明书中使用的 “同源基因” 或与此相关的用语是遗传学用语， 是指基因 的碱基序列中具有与被认为祖先相同的异种动物的基因类似的碱基序列， 所编码的蛋白也 具有类似功能的基因。 在本发明中， 可如下修饰大鼠的神经元烟碱乙酰胆碱受体亚基基因的 cDNA。
     具体而言， 以大鼠的 cDNA 克隆为模板， 基于既有的大鼠 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 序列设计、 制备 2 种引物 ( 例如， 具有下示碱基序列的正向引物和反向引物 )。
     基于大鼠 Chrna4 的 cDNA 序列制备的正向引物 (40 聚体 )(SEQID NO ： 3) 和反向引 物 (38 聚体 )(SEQ ID NO ： 4) 具有如下碱基序列。
     SEQ ID NO ： 3：
     AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG
     SEQ ID NO ： 4：
     AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA
     基于大鼠 Chrnb2 的 cDNA 序列制备的正向引物 (41 聚体 )(SEQID NO ： 5) 和反向引 物 (40 聚体 )(SEQ ID NO ： 6) 具有如下碱基序列。
     SEQ ID NO ： 5：
     AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT
     SEQ ID NO ： 6：
     ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA
     用这些引物进行 PCR， 将得到的 PCR 产物亚克隆于合适的载体中。 对得到的克隆测 序， 确定 Chrna4 及 Chrnb2 的 cDNA 的碱基序列。
     接着， 向如上所述得到的 cDNA 克隆的任意位点导入突变。突变法已知各种方法， 它们均可适用于本发明。特别是， 可通过使用位点特异性突变法等的突变法向任意位点导 入任意突变。
     如上所述， 作为 CHRNA4 基因的基因异常， 报告有 S280F、 S284L 且 291-292insL。 另 外， 作为 CHRNB2 基因的基因突变， 报告有 V287L、 V287M 及 I312M。
     由此， 在本发明中， 可通过上述突变法， 对如上所述通过 PCR 克隆分离的大鼠 Chrna4( 野生型 )(SEQ ID NO ： 1) 及大鼠 Chrnb2( 野生型 )(SEQ ID NO ： 2)， 导入相当于例如，
     CHRNA4 基因的基因异常 (S280F、 S284L、 或 291-292insL) 或者 CHRNB2 的基因突变 (V287L 或 V287M) 的物种特异性同源基因的突变。
     即， 突变可使用合适的正义引物和反义引物、 通过市售的试剂盒将所定的突变导 入所定的突变位点。可用于此突变的正义引物和反义引物一般为 20 聚体～ 40 聚体、 优选 为 25 聚体～ 35 聚体。此时， 为使限制性内切酶切割位点新出现于突变位点， 可加工引物、 突变位点等来导入突变。
     具体而言， 当向例如， 野生型大鼠 Chrna4 导入 S282F( 在人中为 S280F) 的突变时， 可使用下示的正义引物 (29 聚体 ) 和反义引物 (29 聚体 )， 将 cDNA 的碱基序列第 845 位的 C 突变为 T(c.845C ＞ T)， 再将第 846 位的 G 突变为 C(c.846G ＞ C)。由于此突变， 与 CHRNA4 的第 p.282 位同源的氨基酸残基 Ser 被置换为 Phe。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 7) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 8) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 7： CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC
     SEQ ID NO ： 8： GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG
     通过上述突变生成的突变大鼠 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 9) ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGT TACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGCT CATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGC GCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTC CTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCA GTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTA CCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTG GACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGC CGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCC CGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGC ATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCC GCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATG TGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTC CTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGC CCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCC CAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGAC TTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGG GGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCA TCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACC AGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATG CAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCC TGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTC TCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCT
     TCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 当向野生型大鼠 Chrna4 导入 S286L( 在人中为 S284L) 的突变时， 可使用下 示的正义引物 (29 聚体 ) 和反义引物 (29 聚体 )， 将 cDNA 的碱基序列第 856 位的 T 突变为 C(c.856T ＞ C)， 再将第 857 位的 C 突变为 T(c.857C ＞ T)。由于此突变， 与 CHRNA4 的第 p.286 位同源的氨基酸残基 Ser 被置换为 Leu。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 10) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 11) 的碱基序列如 下。
     SEQ ID NO ： 10 ： CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG
     SEQ ID NO ： 11 ：
     CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 12)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 通过在野生型大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列第 878 位和第 879 位之间插入 GCT(c.878-879insGCT)， 使用下示正义引物 (30 聚体 ) 和反义引物 (30 聚体 )， 与 CHRNA4 的第 p.293 位 ( 在人中为第 291 位 ) 同源的氨基酸残基 Leu 和与 CHRNA4 的第 p.294 位 ( 在 人中为第 292 位 ) 同源的氨基酸残基 Ile 之间被插入 Leu。
     可使用的正义引物 (SEQ ID NO ： 13) 及反义引物 (SEQ ID NO ： 14) 的碱基序列如 下。
     SEQ ID NO ： 13 ：
     GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC
     SEQ ID NO ： 14 ：
     GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 15)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     与上述 c.878-879insGCT 的情况同样， 通过在野生型大鼠 Chrna4 的 cDNA 的碱基 序列第 879 位和第 880 位之间插入 TTA(c.879-880insTTA)， 与 CHRNA4 的第 p.293 位 ( 在人 中为第 291 位 ) 同源的氨基酸残基 Leu 和与 CHRNA4 的第 p.294 位 ( 在人中为第 292 位 ) 同源的氨基酸残基 Ile 之间被插入 Leu。(SEQ ID NO ： 16)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGG TTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCTTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     同样， 通过向例如， 野生型大鼠 Chrnb2 导入 V287L 的突变， 在大鼠同源基因 Chrnb2 的 cDNA 中， 使用含 SEQ ID NO ： 16 所示的碱基序列的正向引物及含 SEQ ID NO ： 17 所示的碱 基序列的反向引物， 第 c.856 位的 G 被置换为 C(c.856G ＞ C)， 与人的神经元乙酰胆碱受体 β2 亚基 CHRNB2 同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被置换为氨基酸残基 Leu。
     可使用的正义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 17) 及反义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 18) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 17 ：
     CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC
     SEQ ID NO ： 18 ：
     GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 19)
     GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTAC TAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCA GATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGA CAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGG CATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCAT CTACAAGAGTGCATG CAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCA TGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGG GGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATG ACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCC ATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGT GTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTA CCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCAC ACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCG CTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAG GTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAG CCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTT CATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCG ACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAG AACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     同样， 通过向野生型大鼠 Chrnb2 导入 V287M 的突变， 在大鼠同源基因 Chrnb2 的 cDNA 中， 使用含 SEQ ID NO ： 20 所示的碱基序列的正向引物及含 SEQ ID NO ： 21 所示的碱基 序列的反向引物， 第 c.856 位的 G 被置换为 A(c.856G ＞ A)， 与人的神经元乙酰胆碱受体 β2 亚基 CHRNB2 同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被置换为氨基酸残基 Met。
     可使用的正义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 20) 及反义引物 (30 聚体 )(SEQ ID NO ： 21) 的碱基序列如下。
     SEQ ID NO ： 20 ：
     CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC
     SEQ ID NO ： 21 ：
     GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG
     通过上述突变生成的突变 cDNA 的碱基序列如下所示。
     (SEQ ID NO ： 22)
     TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGG GAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACT AACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGAT CATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATA TGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTAC GAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAG TGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACG ACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCAT TCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCT TCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTG CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCT AGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCC CCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGT CAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGC TGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAG CCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGAC CACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTT CCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTG CCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     在本发明中， 通过将如上所述导入突变的突变种类加工成对应于位于所述突变位 点的密码子的碱基序列， 从而可使所述突变位点出现新酶位点。
     例如， 就 Chrna4 而言， 通过导入 879-880insTTA 的突变， 出现由限制性内切酶 Tru9I(MseI) 的切割位点 (T ↓ TAA)。另外， 就 Chrnb2 而言， 通过导入 V287L 或 V287M， 出现 由限制性内切酶 HinfIf 的切割位点 (G ↓ ANTG)。其中， 箭标 ( ↓ ) 示切割处。但是， 限制 性内切酶的种类或切割位点等不限于此、 可通过改变突变来适宜选择。
     在本发明中， 向上述 cDNA 导入含所定碱基序列的核苷酸作为探针。导入的探针是 加工成与原碱基序列相比碱基序列完全或几乎完全不同， 但原氨基酸序列相同的核苷酸， 其碱基数一般为约 30bp ～ 200bp、 优选为约 50bp ～ 150bp、 更优选为约 60bp ～ 120bp。这 样的核苷酸可通过 DNA 合成法等的所述技术领域惯用的常规方法来制备。
     具体而言， 例如， 对于 Chrna4 基因的突变 cDNA 而言， 可以具有下示碱基序列 (118bp) 的核苷酸作为探针制备成碱基序列虽与所述 cDNA 的第 c.104 位～第 c.221 位的碱 基序列不同， 但氨基酸序列相同。
     (SEQ ID NO ： 23)
     GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGG CTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
     同样， 例如， 对于 Chrnb2 的突变 cDNA 而言， 可以具有下示碱基序列 (62bp) 的核苷 酸作为探针制备成碱基序列虽与 cDNA 的第 c.1171 位～第 c.1232 位的碱基序列不同， 但氨 基酸序列相同。
     (SEQ ID NO ： 24)
     AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
     接着， 将如上所述制备出的核苷酸探针杂交后， 通过常规方法使用限制性内切酶 位点导入探针。例如， 可通过所述技术领域惯用的探针导入法将 SEQ ID NO ： 22 所示的探 针插入具有上述碱基序列的 Chrna4 的突变 cDNA 的所定位点、 pCRII-TOPO 载体等的适当的 载体的 Sma I 和 Bpu1102I( 别名 Esp I 或 Cel II) 位点。另外， 例如， 可通过所述技术领域 惯用的探针导入法， 将 SEQ ID NO ： 22 所示的探针插入具有上述碱基序列的 Chrnb2 的突变 cDNA 的所定位点、 pCRII-TOPO 载体等的适当的载体的限制性内切酶位点的 Hinc I 和 SmaI。各步骤进行测序， 确定碱基序列。
     大鼠 Chrana4 的突变 cDNA(S282F)( 其中， 在人中为 S280F。 ) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探针导入突变基因 cDNA(S282FPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 25) 如下所示。 其中， 由于 c.845C ＞ T 和 c.846G ＞ C 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 844 位～第 846 位 的 TCG 被突变为 TTC， 且探针部分如下划线所示， 其碱基数为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。
     (SEQ ID NO ： 25)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGG CTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTTCGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrna4 的突变 cDNA(S286L)( 其中， 在人中为 S284L。) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探针导入突变基因 cDNA(S284LPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 26) 如下所示。 其中， 由于 c.856T ＞ C 和 c.857C ＞ T 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 856 位～第 858 位的 TCT 被突变为 CTT， 且探针部分如下划线所示， 碱基数为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。
     (SEQ ID NO ： 26)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTG CATCTCGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCC CGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAAT GTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCT CCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACG CCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCC CCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGA CTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTG GGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGC ATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCAC CAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACAT GCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCC CTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTT CTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCC TTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrana4 的突变 cDNA(879-880insL) 中导入了 SEQ ID NO ： 23 所示的探针的探 针导入突变基因 cDNA(S282FPB) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 27) 如下所示。 其中， 由于 c.845C ＞ T 和 c.846G ＞ C 的突变， 如矩形所框住 ( □ )， 第 844 位～第 846 位的 TCG 被突变为 TTC， 且探针部分如下划线所示， 为 118bp， 位于第 104 位～第 221 位。但是， 在人中为 S280F。
     (SEQ ID NO ： 27)
     ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACC GGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGG CTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCAGC TCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTG CGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGT CCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGC AGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGT ACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACT GGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTG CCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATC CCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTGCTAATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCA TCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTC AATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCG CCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCA ACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCT GCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCC TGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCA GTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGAT GGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCC CACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCA CATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTG CCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGA CTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCT GCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
     大鼠 Chrnb2 的突变 cDNA 中导入了 SEQ ID NO ： 24 所示的探针的探针导入突变基 因 cDNA(V286L) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 28) 如下所示。
     (SEQ ID NO ： 28)
     GGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGG AACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTA ACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATC ATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATAT GAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACG AAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGT GCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGA CCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACA TCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATT CGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTT CTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGC TCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTA GTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCC CTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTC AGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCT GACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGC TGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACC ACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTC CTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGC CACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     大鼠 Chrnb2 的突变 cDNA 中导入了 SEQ ID NO ： 24 所示的探针的探针导入突变基 因 cDNA(V286M) 的碱基序列 (SEQ ID NO ： 29) 如下所示。(SEQ ID NO ： 29)
     TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGG GAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACT AACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGAT CATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATA TGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTAC GAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAG TGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACG ACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGAC ATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCAT TCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCT TCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTG CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCT AGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCC CCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGT CAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGC TGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCG CTGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGAC CACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTT CCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTG CCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
     使用如上所述制备的导入大鼠上述突变和探针的大鼠 Chrna4 或 Chrb2 的 cDNA， 本 发明的癫痫非人哺乳动物其本身可根据公知的非人哺乳动物制备方法， 通过常规方法来制 备。所述非人哺乳动物的制备方法可例举 ： 将目的基因导入动物个体的转基因动物的制备 方法、 重组了靶基因和目的导入基因的基因置换动物的制备方法、 使用改变了目的基因的 细胞的核的克隆个体的制备方法等。
     本发明中， 以将作为目的基因的上述突变基因的 cDNA 导入例如大鼠等的动物个 体的受精卵的转基因动物的制备方法为例进行说明。
     首先， 制备具有编码与人常染色体显性夜发性额叶癫痫相关联的神经元烟碱乙酰 胆碱受体的 α4 亚基 (CHRNA4) 基因或 β2 亚基 (CHRNB2) 基因的同源基因中具有所述突变 的突变基因的 DNA 的表达载体。
     即， 分离含非人哺乳动物的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基 (Chrna4) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 基因的 DNA， 可通过向此 DNA 片段中插入外源基因等来构建表达载体。 作 为所述外源基因， 优选为标记基因， 特别优选为新霉素抗性基因等的抗生素抗性基因。 插入 抗生素抗性基因时， 可通过只在含抗生素的培养基中培养来筛选发生同源重组的细胞株。 另外， 为进行更有效的筛选， 也可在表达载体结合胸苷激酶基因等。由此， 可排除发生非同 源重组的细胞株。另外， 在表达载体结合白喉毒素 A 片段 (DT-A) 基因等， 则可排除发生非 同源重组的细胞株。作为表达载体， 使用例如， pCI-neo、 pMCIneo、 pXT1、 pSG5、 peDNA3.neo、 pLITMUS28、 pcDNAIamp、 pcDNA3 等。上述 DNA 优选为， 将所述 DNA 被连接到适当的启动子下游的表达载体作为导入基 因导入到非人哺乳动物的 DNA。此外， 作为启动子， 只要是可在导入编码上述受体亚基的 DNA 的非人哺乳动物的细胞内开始转录的启动子， 则可使用任何启动子， 可例举源于例如， 猴肾病毒 40、 多瘤病毒、 腺病毒 2、 人巨细胞病毒、 反转录病毒等的病毒的基因等的启动子。
     另外， 在本发明中使用的表达载体优选为， 在编码非人动物的神经元烟碱乙酰胆 碱受体的 α4 亚基 (Chrna2) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 的突变基因的 DNA 的下游具有 mRNA 的 3’ 末端的多聚腺苷酸化中必要的多聚腺苷酸化信号的表达载体。作为多聚腺苷酸化信 号， 可例举例如， 源于上述病毒等的各基因所含的 SV40 的后期基因或初期基因等的多聚腺 苷酸化信号等。 此外， 在表达载体中， 为了更高表达目的基因， 也可将各基因的剪接信号、 增 强子区域、 内含子的一部分连接到启动子区域的 5’ 上游、 启动子区域和翻译区域间、 或者翻 译区域的 3’ 下游。
     在本发明中， 例如， 使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 将导入上述突变和探针的 大鼠突变 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 移入表达载体中后， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 切 割。例如， 将大鼠突变 Chrna4 的 cDNA 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载 体中时， 可使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 移入， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 切割， 另外， 移入大鼠 Chrb2 的 cDNA 时， 可使用限制性内切酶位点 XhoI 和 SalI 移入， 用限制性内 切酶 SnaBI 和 DraIII 切割。由此， 可将含 PDGF 启动子、 大鼠突变 Chrna4 或 Chrnb2 的 cDNA 及 polyA 部分的片段作为 DNA 构建物从凝胶切出分离、 纯化。 在本发明中， 例如， 可通过将如上所述分离、 纯化的 DNA 构建物等导入非人哺乳动 物的分化全能性细胞来制备非人哺乳动物。作为可使用的分化全能性细胞， 可使用例如， 受精卵、 初期胚、 胚胎干细胞等。待导入 DNA 构建物的受精卵可通过将例如， 性腺刺激激素 (PMS) 等的排卵诱发剂施用于腹腔内， 诱发雌性动物的超数排卵而回收可导入 DNA 构建物 的受精卵， 摘出与通过输精管结扎等而去势的雄性小鼠交配的假孕雌性动物的输卵管， 在 显微镜下采集来得到。
     接着， 向得到的受精卵中导入 DNA 构建物。已知作为将构建物导入受精卵的手段 的各种方法， 但在考虑转基因动物个体的制备效率或往下一代的导入基因的传递效率时， 优选微注射法。将如此注入了突变基因的受精卵移植到代孕母亲的输卵管中， 使发育成个 体， 从身体的一部分 ( 例如， 尾部尖端等 ) 的体细胞提取 DNA， 通过 DNA 印迹或 PCR 法确定导 入的基因的存在。 可通过筛选如此体细胞的基因组中整合了导入基因的个体来制备目的转 基因动物。
     将如上所述确定存在导入基因的个体 ( 杂合子 ) 作为原代 (Founder ： F0)， 则导入 基因传递到 50％其子代 (F1)。接着， 通过交配此 F1 个体的雌雄， 可制备 2 倍体染色体的两 方具有导入基因的个体 (F2)。
     对此， 本发明中用于癫痫模型非人哺乳动物的制备的转基因方法是， 向正常状 态的内源性基因 (Chrna4 基因或 Chrnb2 基因 ) 染色体 DNA 的任意位置新导入编码突变 型 Chrna4 或 Chrnb2 的突变基因。为此， 本发明的癫痫模型动物中， 分别同时产生正常的 Chrna4 或 Chrnb2， 和突变型 Chrna4 或 Chrnb2。神经元烟碱乙酰胆碱受体是发挥离子通道 (α 亚基 2 个、 β 亚基 3 个 ) 功能的蛋白质， 这样的离子通道只要任意亚基突变， 则通道功 能改变。 因此， 如本发明所述， 认为同时表达正常亚基和突变亚基对于表现人型癫痫发作的
     模型动物合适。
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物， 如后述实施例所示， 具有如同人染色体显性夜 发性额叶癫痫， 在睡眠中自然发症癫痫发作的优异的特性。
     其中， 目的基因整合到全部细胞的染色体上的个体的选择通常如下进行 ： 从构成 个体的血液组织、 上皮组织等的组织的一部分制备 DNA， 对 DNA 进行测序， 以 DNA 水平确定存 在导入基因。但是， 如此测序 DNA 来选择所述重组个体需要费时费力且费成本的复杂操作。
     即， 制备具有基因异常的疾病模型动物时， 有必要正确判别同源重组体。 以往的疾 病模型动物的制备法中， 为了判别重组体， 有必要对所述个体的基因的一部分进行测序， 且 需要表达所述导入基因的 mRNA。 但是， 通过 RT-PCR 或原位杂交等表达所述导入基因的 mRNA 并不容易。
     由此， 在本发明中， 通过如上所述对突变基因进行突变， 同时将所述突变基因的一 部分用探针置换来进行操作， 以使可容易地进行重组体的识别。 另外， 由于上述突变而出现 新限制性内切酶切割位点时， 也可容易地进行重组体的识别。其中， 此方法应理解为， 不仅 限于下示说明的具体实施方式， 与基因突变或限制性内切酶等的种类无关， 适用于全部突 变。另外， 在本发明中， 对位点特异性地导入所述 cDNA 克隆的位点的突变的种类无特别限 定。
     即， 本发明中， 为了可容易地进行所述重组个体的选择， 如上所述， 向编码非人动 物的神经元烟碱乙酰胆碱受体的 α4 亚基 (Chrna4) 基因或 β2 亚基 (Chrnb2) 基因 DNA 导 入例如， S280L、 S284L、 S291-292L、 V287L、 V287M 等的突变， 而使出现新的限制性内切酶切割 位点。通过如此使出现新的限制性内切酶切割位点， 可在制备重组体时， 容易识别重组体。
     在本发明中， 将制备出的突变 cDNA 的一部分的碱基序列用含碱基序列与所述碱 基序列基本上完全不同， 但氨基酸序列相同的碱基序列的探针置换， 再导入与原碱基序列 相同的位点， 通过使用所述导入的探针的限制性内切酶， 不仅可容易识别重组个体， 还由于 由重组基因表达的 mRNA 与大鼠自身的 Chrna4mRNA 或 Chrnb2mRNA 有区别， 可通过 RT-PCR 或原位杂交等容易地检测。
     另外， 例如， 通过向神经元乙酰胆碱受体基因的 α4 亚基 CHRNB2 的同源基因 Chrnb2 导入突变 (c.856G ＞ C) 或 (c.856G ＞ A)， 出现限制性内切酶切割位点 Hinf If， 可 通过使用限制性内切酶 Hinf If 的 PCR-RFLP( 限制性内切酶片段长度多态性 ) 法等判别含 此切割位点的区域。即， 不发生目的同源重组的个体由于不具有 Hinf If 位点， 不发生由限 制性内切酶 Hinf If 的切割， 与此相比， 发生目的同源重组的个体则由于具有 Hinf If 位 点， 可由限制性内切酶 Hinf If 切割。因此， 在本发明中， 通过使神经元乙酰胆碱受体基因 的 α4 亚基 CHRNA4 的同源基因 Chrna4 或 β4 亚基 CHRNB2 的同源基因 Chrnb2 突变而出现 限制性内切酶切割位点， 可容易地识别重组体。
     其中， 其中使用的 PCR-RFLP 法， 由于其本身是公知手法， 通过此方法， 将对象位点 用 PCR 扩增， 将扩增产物用所定限制性内切酶、 例如， True9I 或 Hinf If 等的限制性内切酶 消化， 用电泳等检查消化后的 DNA 片段的大小， 研究所述限制性内切酶的切割位点的存在 与否。
     以下， 通过实施例更详细说明本发明， 本发明不限于下述实施例， 且下述实施例仅 为旨在具体说明本发明的例示记载， 应理解为不旨在以任何方式限定本发明的记载。实施例 实施例 1 ：
     首 先，以 大 鼠 脑 QUICK-Clone cDNA(CLONTECH ； MountainView， CA) 作 为 模 板， 用 基 于 既 有 的 大 鼠 Chrna4 的 cDNA 序 列 设 计 的 2 个 引 物， 即， 正 向 引 物 (BN- 大 鼠 CHRNA4cDNA-F) ：
     AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG(40 聚体 )(SEQ ID NO ： 3) 和
     反向引物 ( 大鼠 CHRNA4cDNA-BX-R) ：
     AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA(38 聚体 )(SEQ ID NO ： 4)
     进行了 PCR。将得到的 PCR 产物纯化， 亚克隆到 pCRII-TOPO 载体 (Invitorogen ； Carlsbad， CA) 中。将得到的克隆测序， 确定 Chrna4 的 cDNA 的碱基序列。其中， 大鼠碱基 序列信息以登录号 L31620(NCBI) 被登录。
     向得到的克隆使用 QuikChange 位点特异性诱变试剂盒 (STRATAGENE ； La Jolla， CA) 进行突变。 首先， 使用 r845T846C-sen ： CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC(29 聚体 )(SEQ ID NO ： 7) 和 r845T846C-ant ： GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG(29 聚体 )(SEQ IDNO ： 8) 将 cDNA 碱基序列第 845 位的 C 突变为 T， 又将第 846 位的 G 突变为 C。得到的突变 cDNA 的碱 基序列如 SEQ ID NO ： 9 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.282 位 的氨基酸残基 Ser 被突变为氨基酸残基 Phe。
     向如此制备出的突变的 cDNA 的 c.104 ～ c.221， 制备具有含编码与此位点相同的 氨基酸序列， 但碱基序列与原碱基序列完全不同的下示碱基序列的 118bp 的核苷酸的探针 (SEQ ID NO ： 23) 而导入所述位点。
     (SEQ ID NO ： 23)
     GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGG CTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
     对如上所述导入探针的突变 cDNA 杂交后， 将待插入 pCRII-TOPO 载体的 Chrna4 的 cDNA， 使用限制性内切酶位点的 SmaI 和 Bpu1102I 进行插入。各步骤中进行测序， 确定碱基 序列。
     而且， 将具有所述突变 (S286L) 的大鼠 Chrna4 的 cDNA 使用限制性内切酶位点 XhoI 和 NotI 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载体中后， 用限制性内切酶 SnaBI 和 NaeI 进行切割。将具有 PDGF 启动子和大鼠 Chrna4 的 cDNA 及 polyA 部分的片段 由凝胶切出分离、 纯化。此经分离、 纯化的 DNA 显微注入到受精卵， 将状态良好的 200 个以 上的卵移植到受胚雌性动物的输卵管中， 通过自然分娩的方法制备出重组体。
     实施例 2 ：
     如同实施例 1， 使用 r856C857T-sen ： CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG(29 聚体 ) (SEQ IDNO ： 10) 和 r856C857T-ant ： CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG(29 聚体 )(SEQ IDNO ： 11) 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 T 突变为 C， 将第 857 位的 C 突变为 T。 得到的突变 cDNA 的 碱基序列如 SEQ ID NO ： 12 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Ser 被突变为氨基酸残基 Leu。
     向如此制备出的突变的 cDNA 的 c.104 ～ c.221， 如同实施例 1， 制备含 SEQ ID NO ：
     23 所示的 118bp 的核苷酸的探针而导入。
     使用如上所述导入探针的突变 cDNA， 如同实施例 1 制备出重组体。
     实施例 3 ：
     如同实施例 1， 使用正义引物 rCHRNA-878insGCT-sen ： GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCAC CGAGATC(30 聚体 )(SEQ IDNO ： 13) 和反义引物 rCHRNA-878insGCT-ant ： GATCTCGGTGATGAGC AGCAGCAGGAAGAC(30 聚体 )(SEQ IDNO ： 14) 在 cDNA 碱基序列第 878 位和第 879 位之间插入 GCT。得到的突变 cDNA 的碱基序列如 SEQ ID NO ： 15 所示。由此， 与人神经元乙酰胆碱受体 α4 亚基同源的第 p.293 位的氨基酸残基 Leu 和第 p.294 位的氨基酸残基 Ile 之间被插入 氨基酸残基 Leu。
     使用如此制备出的突变的 cDNA， 如同实施例 1 制备出重组体。
     实施例 4 ：
     向通过 PCR 克隆分离的大鼠 Chrnb2， 通过突变法， 导入 c.856G ＞ C 和 c.856G ＞ A 的突变。即， 以大鼠脑 QUICK-ClonecDNA(CLONTECH Mountain View， CA) 作为模板， 由基于 既有的大鼠 Chrnb2 的 cDNA 序列设计的 2 个引物 (BN- 大鼠 CHRNB2cDNA-F ： AGATCTCGCGACA TGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT(41 聚体 )(SEQ ID NO ： 5) 和大鼠 CHRNB2cDNA-CB-R ： ATCG ATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA(40 聚体 )(SEQ ID NO ： 6) 进行 PCR。生成得到的 PCR 产物， 并亚克隆到 pCRII-TOPO 载体 (Invitorogen Carlsbad， CA) 中。对得到的克隆进 行测序， 确定 Chrnb2 的 cDNA 的碱基序列。 此大鼠碱基序列信息以登录号 NM_019297(NCBI) 被登录。
     使用 QuikChange 位点特异性诱变试剂盒 (STRATAGENE、 LaJolla， CA) 向得到的克 隆中导入突变。首先， 使用大鼠 CHRNB2m286V/M-F ： CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC(30 聚体 )(SEQ ID NO ： 17) 和大鼠 CHRNB2m286V/M-R ： GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG(30 聚 体 )(SEQ IDNO ： 18)， 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 G 突变为 C。由此， 与人的神经元乙酰胆 碱受体 β2 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被突变为氨基酸残基 Leu( 作为 β 是 遵从了特许厅的在线申请规则 )。
     此突变中， 由 c.856G ＞ C 的导入， 限制性内切酶切割位点出现 HinfIf， 认为制备重 组体时， 可容易地识别重组体。
     向制备出的突变的 cDNA 的 c.1171 ～ c.1232 导入了编码与此位点相同的氨基酸 序列， 但碱基序列与所述碱基序列完全不同的探针 (SEQID NO ： 24)。
     (SEQ ID NO ： 24)
     AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
     其中， 制备此 62bp 的核苷酸， 杂交后， 将待插入 pCRII-TOPO 载体中的 Chrnb2 的 cDNA 使用限制性内切酶位点的 Hinc II 和 Sma I 进行插入。各步骤中进行测序， 确定碱基 序列。
     而且， 将具有所述突变和探针的大鼠 Chrnb2 的 2 种 cDNA， 使用限制性内切酶位点 Xho I 和 Sal I 移入具有源于 pCI-neo 载体的 PDGF 启动子的表达载体中后， 用限制性内切 酶 SnaBI 和 DraIII 切割。将具有 PDGF 启动子和大鼠 Chrnb2 的 cDNA 及 polyA 部分的片段 由凝胶切出分离、 纯化。将此分离出的 DNA 显微注入受精卵， 将状态良好的 200 个以上的卵 移植到受胚雌性动物的输卵管中， 通过自然分娩方法制备出重组体。实施例 5 ：
     如同实施例 4， 使用大鼠 CHRNB2m286V/L-F ： CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC(3 0 聚体 )(SEQ IDNO ： 20) 和大鼠 CHRNB2m286V/L-R ： GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG(30 聚体 )(SEQID NO ： 21) 将 cDNA 碱基序列第 856 位的 G 突变为 A。由此， 与人的神经元乙酰 胆碱受体 β2 亚基同源的第 p.286 位的氨基酸残基 Val 被突变为氨基酸残基 Met。使用如 此得到的突变 cDNA， 如同实施例 4 制备出重组体。
     实施例 6 ：
     癫痫模型大鼠的脑波 (electroencephalogram ： EEG) 测定
     对 8 ～ 10 周龄的转基因大鼠 (Chrnb2V287L) 进行脑波 (EEG) 测定。将大鼠用戊 巴比妥钠 ( 大日本住友制药株式会社 ) 麻醉， 固定于脑定位固定装置 (SR-5、 成重 )， 电极 安装于大鼠的头盖骨的前卤点至动脉 ： 2.5mm， 侧部 ： 1.5mm 和动脉 ： -2.5mm， 侧部 ： 2.5mm， 将无关电极安装于大鼠鼻骨附近的骨的厚部分， 用牙科用粘固剂固定。将脑波测定用的涂 覆特氟隆 ( 注册商标 ) 的不锈钢电极安装于左右大脑半球的额叶 ( 距前卤点 A ＝ 3.mm、 L ＝ 0.8mm)， 用牙科用粘固剂固定。将无关电极埋入小脑位点的上部。脑波 (EEG) 则使用 VideoOption(KISSEI COMTEC)， 将大鼠放入箱子内数天， 在自由运动条件下进行测定， 脑波 解析使用 SleepSign(KISSEI COMTEC) 进行。
     脑波测定结果示于图 5。图中、 将异常脑波部分以记号 A 及记号 B 显示， 以记号 A 显示的异常脑波部分的放大图示于图 6， 而将以记号 B 显示的异常脑波部分示于图 7。此结 果证实， 本发明的大鼠可作为癫痫模型大鼠而被利用。
     工业实用性
     本发明的癫痫模型非人哺乳动物是与人癫痫基因异常具有相同基因异常的癫痫 模型非人哺乳动物， 通过使用此模型动物， 可诱发与人癫痫发作同等的痉挛发作而进行研 究， 可利用于癫痫的治疗药的研究、 开发。26CN 101970657 A
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