抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂 【技术领域】
本发明属于生物技术领域， 更具体地， 本发明涉及抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂。 背景技术 肿瘤转移是肿瘤病人致死的一个重要的原因。肿瘤转移要经历一个复杂的过程 ： 首先原发肿瘤细胞侵入相邻组织并进入淋巴管或血管， 即进入血管内渗 (Intravasation) ； 然后通过血管迁移到远端毛细管中 ； 转移出血管， 即外渗 (Extravasation)， 最终经过增殖 从微小转移 (Micrometastases) 变为肉眼可见的转移瘤。目前已鉴定了一些与肿瘤转移相 关的因子， 如生长因子、 细胞因子、 趋化因子、 血管形成因子前体、 胞外基质重塑分子和某些 转录因子。但到目前为止， 对肿瘤转移的分子机制和细胞机制的了解还很有限。
肿瘤细胞侵袭和迁移的一个重要过程是细胞迁移能力的变化， 该过程包含肌 动 蛋 白 细 胞 骨 架 的 动 态 重 塑， 其 中 各 种 肌 动 蛋 白 结 合 蛋 白 (ABPs) 起 着 重 要 的 作 用。
Profilin-1( 简写为 Pfn1， 肌动蛋白抑制蛋白 ) 就是其中的一员， 它是一种广泛存在的球形 肌动蛋白结合蛋白。近些年来的研究表明 Pfn1 参与了哺乳动物细胞的迁移过程。Pfn 家族 蛋白大小约为 14-17kDa， 广泛存在于脊椎动物、 无脊椎动物、 原生生物、 真菌、 植物及某些病 毒中。 大多数真核生物含有多种 Pfn 基因， 而且通过选择性剪切可以产生多种异构体。 到目 前为止鉴定出了四种不同的 Pfn 基因 ： Pfn1、 Pfn2( 主要存在于神经细胞中， 存在两种剪切 异构体 )、 Pfn3( 特异性存在于肾脏和睾丸中 ) 和 Pfn4( 特异性存在于睾丸中 )。生化分析 表明 Pfn 家族蛋白能和众多的配体结合， 如肌动蛋白， 肌动蛋白相关蛋白 (Arp)2， 管蛋白结 合蛋白 Gephyrin， 二磷酸磷脂酰肌醇 (PIP2) 以及一些含多聚脯氨酸的蛋白质。 正因为能与 多种配体结合， Pfn1 能参与多种细胞活动， 如细胞增殖、 迁移、 细胞内吞、 mRNA 剪切以及基 因转录。 最初显示 Pfn 在细胞迁移中发挥功能的证据来源于阿米巴变形虫 (Dictyostelium amebae) 中的研究。Pfn I 和 Pfn II 缺陷的阿米巴虫突变体表现出运动障碍和细胞浆移动 缺陷。在 chickadee( 一种 Pfn 同源基因 ) 突变的果蝇 (Drosophila) 中也发现类似的发育 缺陷。在细胞迁移过程中首先会有一基于肌动蛋白的突触伸出过程， 许多病理模型的研究 也表明 Pfn1 在这一过程中发挥作用。最近在人血管内皮细胞中的证据直接表明了 Pfn1 在 细胞迁移过程中的起促进作用。然而另外一些研究表明 Pfn1 在癌细胞转移中起负调控作 用， 如在人类乳腺癌组织和细胞系、 胰腺癌和肝癌中发现 Pfn1 表达水平显著降低。在乳腺 癌细胞 CAL51 中过表达 Pfn1 能阻止该细胞在裸鼠皮下成瘤。此外， 在高转移性乳腺癌细胞 系 BT474 中过表达 Pfn1 也能减弱其迁移能力， 而通过 RNAi 技术沉默 Pfn1 基因表达能增强 乳腺癌细胞 MDA-MB-231 的迁移能力和侵袭能力。从这一点上 Pfn1 被认为是抑癌蛋白质。 因此， 目前认为 Pfn1 在细胞迁移中的作用比较复杂， 具体起什么作用因细胞种类而异。
近 些 年 来， 越来越多的证据表明在肿瘤的形成过程中有一类被称之为 microRNA(miRNA) 的小分子调控 RNA 起着重要的作用。成熟的 miRNA 是体内自然产生的一 种单链 RNA 分子， 长约 21-24 个核苷酸。在哺乳动物中， 成熟的 miRNA 能进入一种 RISC 复合体 ( 即 RNA 诱导的沉默复合体 ) 中， 引导该复合体与特异的靶 mRNA 结合从而阻滞以该 mRNA 为模板的蛋白质翻译过程或是促使 mRNA 降解。越来越多的证据表明 miRNA 能调控众 多的细胞活动， 如分化、 代谢、 增殖以及凋亡。目前， 一些能有着致癌或抑癌功能的 miRNA 已 被鉴定出来， 然而关于 miRNA 在肿瘤转移过程中的作用的研究刚刚起步。近来已鉴定了一 些和肿瘤迁移相关的 miRNA， 如 miR-10b、 miR-373、 miR-520c 和 miR-21 能促进肿瘤迁移， 而 let-7、 miR-335 和 miR-126 能抑制肿瘤转移。MiRNA 是通过抑制一些与细胞迁移、 侵袭和增 殖相关的靶基因而调节肿瘤转移。例如， miR-10b 的一个已鉴定的靶基因是 HOXD10， 该基因 编码的一个转录抑制子能抑制一些在细胞迁移和侵袭中发挥作用的蛋白质的表达， 如小 G 蛋白质 RhoC。在 MCF-7 乳腺癌细胞中， miR-373 诱发的转移是通过直接抑制 CD44( 已知在 结肠癌和前列腺癌中能抑制转移 ) 而实现的。
目前通过 miRNA 芯片检测的技术已发现 miR-320 在许多的人类肿瘤中异常表达， 如结肠癌、 视网膜细胞瘤、 胆管癌、 乳腺癌、 前列腺癌和恶性转化的支气管上皮细胞。此外， 在人类的其它一些疾病中也发现了 miR-320 的异常表达， 如神经退行性病变和镰刀形红细 胞贫血病。然而， 目前本领域对于 miR-320 在肿瘤发生、 迁移、 侵袭中的作用还没有报道。 发明内容 本发明的目的在于提供癌细胞迁移性和侵袭性相关的靶点， 以及抑制癌细胞迁移 和侵袭的方法和试剂。
在本发明的第一方面， 提供一种 miR-320a 的抑制剂的用途， 用于制备抑制肿瘤细 胞的组合物。
在一个优选例中， 所述的肿瘤细胞是表达 Pfn1 蛋白的细胞 ； 更佳的， 所述的肿瘤 细胞是 Pfn1 蛋白表达后迁移性和 / 或侵袭性降低的细胞。
在另一优选例中， 所述的肿瘤细胞是乳腺癌细胞或肺癌细胞。
在另一优选例中， 所述的组合物还用于提高肿瘤细胞中 Pfn1 的表达水平。
在另一优选例中， 所述的肿瘤细胞是 ( 高 ) 表达 miR-320a 的肿瘤细胞。
在另一优选例中， 所述的 miR-320a 的抑制剂是 miR-320a 的反义核苷酸。
在另一优选例中， miR-320a 的反义核苷酸选自 ：
(a) 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示的反义核苷酸 ； 或者
(b) 序列与 SEQ ID NO ： 1 所示的序列具有 80％以上的相同性、 且具有 (a) 指定的 反义核苷酸功能的反义核苷酸 ； 或者
(c) 序列与 SEQ ID NO ： 1 所示的序列在严格条件下杂交、 且具有 (a) 指定的反义 核苷酸功能的反义核苷酸。
在另一优选例中， 所述的反义核苷酸是包括但不限于甲氧基化修饰、 锁核酸修饰、 肽核酸修饰、 硫代修饰以及磷酸骨架由磷脂连接代替的反义核苷酸。
更优选地， 所述的反义核苷酸是甲氧基化修饰的反义核苷酸， 即核糖骨架 2 位羟 基上的氢用甲基取代。
在另一优选例中， 所述的抑制肿瘤细胞包括 ： 抑制肿瘤细胞的迁移和 / 或侵袭。
在本发明的另一方面， 提供一种 Pfn1 抑制剂的用途， 用于制备抑制肿瘤细胞的组 合物。
在一个优选例中， 所述的肿瘤细胞是表达 Pfn1 蛋白的细胞 ； 更佳的， 所述的肿瘤 细胞是 Pfn1 蛋白表达被抑制后迁移性和 / 或侵袭性降低的细胞。
在另一优选例中， 所述的肿瘤细胞是前列腺癌细胞或肝癌细胞。
在另一优选例中， 所述的 Pfn1 的抑制剂选自 ：
(i) 序列如 SEQ ID NO ： 2 所示的 miRNA(miR-320a) ； 或者
(ii) 序列与 SEQ ID NO ： 2 所示的序列具有 80％以上的相同性、 且具有 (i) 指定的 miRNA 功能的 miRNA ； 或者
(iii) 序列与 SEQ ID NO ： 2 所示的序列在严格条件下杂交、 且具有 (i) 指定的 miRNA 功能的 miRNA。
在另一优选例中， 所述的抑制肿瘤细胞包括 ： 抑制肿瘤细胞的迁移和 / 或侵袭。
在另一方面， 本发明还提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法， 所述方法包 括：
(1) 在 测 试 组 中， 向 表 达 miR-320a 的 体 系 中 添 加 待 筛 选 的 候 选 物， 并检测 miR-320a 的表达或活性 ； 并且， 在对照组中， 在不添加所述候选物的、 表达 miR-320a 的体系 中， 检测 miR-320a 的表达或活性 ； (2) 将步骤 (1) 测试组中 miR-320a 的表达或活性与对照组中 miR-320a 的表达或 活性进行比较，
如果测试组中 miR-320a 的表达或活性在统计学上低于 ( 优选显著低于， 较佳的低 20％或更低 ； 更佳的低 40％或更低 ； 进一步更佳的低 60％或更低 ) 对照组， 就表明该候选 物是抑制肿瘤的潜在物质。
在另一方面， 本发明还提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法， 所述方法包 括：
(a) 在测试组中， 向包含 miR-320a 和 Pfn1 mRNA 的体系中添加待筛选的候选物， 并检测 miR-320 与 Pfn1 mRNA 的结合情况 ； 并且， 在对照组中， 在不添加所述候选物的、 包含 miR-320a 和 Pfn1 的体系中， 检测 miR-320 与 Pfn1mRNA 的结合情况 ；
(b) 将步骤 (a) 测试组中 miR-320 与 Pfn1 mRNA 的结合情况与对照组中 miR-320 与 Pfn1 mRNA 的结合情况进行比较，
如果测试组中 miR-320 与 Pfn1 mRNA 的结合在统计学上低于 ( 优选显著低于， 较 佳的低 20％或更低 ； 更佳的低 40％或更低 ； 进一步更佳的低 60％或更低 ) 对照组， 就表明 该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。
在一个优选例中， 所述的体系是肿瘤细胞体系。
在另一优选例中， 所述的方法还包括 ： 对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验 和 / 或动物试验， 以进一步选择和确定对于抑制肿瘤有用的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
附图说明
图 1、 在 Pfn1mRNA 的 3’ UTR 的第 20-41 位核苷酸是 miR-320a 的靶位点。
(a) 预测到的 miR-320a 的靶位点的位置。miR-320a 的 5’ 的第 2-8 位核苷酸配对的区域 ( 即种子区域 ) 以粗体字母表示， 非配对的核苷酸分列在上下行。
(b) 九种不同物种中 ( 从上到下依次为 ： 人、 大鼠、 小鼠、 恒河猴、 黑猩猩、 果蝇、 线 虫、 马和狗 ) 的 miR-320a 的种子配对区的序列比较。
图 2、 在不同肿瘤细胞系中的 MiR-320a 和 Pfn1 的蛋白质表达呈负相关性。
(a)Western blot 检测不同细胞中的 Pfn1 蛋白质。
(b)Western blot 电泳图的灰度扫描定量 (FUJIFILM-Multi Gauge V3.0)。以 Pfn1/β-Actin 的比值做柱形图。
(c) 以实时定量 RT-PCR 法 (qRT-PCR) 测定 Pfn1 的 mRNA 在各种细胞中的相对表达 水平。
(d) 以实时定量 RT-PCR 法测定 miR-320a 在各种细胞中的相对表达水平。
图 3、 Pfn 1 的 3’ UTR 是 miR-320a 的有效作用靶位。
(a) 插入了 Pfn1-3’ UTR 的报告基因示意图。Wt ： 含有野生型的 Pfn1 3’ UTR ； Mut ： 种子区有 3 个核苷酸突变 ( 以斜体并带下划线的字母标出 ) 的 Pfn13’ UTR。
(b) 荧光素酶报告基因的表达分析。20ng 的 Wt 或 Mut 报告基因载体转染 1×105 的 293T 细胞， 同时转染 50nM 的 control-miR、 或 miR-320a、 或再同时转染 50nM 的对照反义 核酸 (control anti-miR) 或是 miR-320a 的反义核酸 (anti-miR-320a)， 均为瞬时转染。 24 小时后用 Dual luciferaseassay system(Promega) 检测荧光素酶活性。柱形图表示的值 代表 3 组独立实验的平均值 ±SE。Wt UTR ： 含有野生型 Pfn1-3’ -UTR 的报告基因质粒 ； Mut UTR ： 含有突变型 Pfn1-3’ -UTR 的报告基因质粒。 miR-n.c. 表示用作负对照的 control-miR。 (c)Flag 标记的 Pfn1 蛋白编码区 (ORF) 和野生型 (Wt) 或突变的 (Mut) 的 3’ UTR 5 插入 pCDNA3.1 载体。10ng 的上述载体转染 1×10 的 293T 细胞， 同时转染不同剂量的 control-miR 或 miR-320a， 均为瞬时转染。48 小时后用 westernblot 检测外源表达的 Pfn1 蛋白质的水平。pcDNA3.1-Pfn1/wt ： 含有野生型 Pfn1-3’ -UTR 的 Pfn1 mRNA 的蛋白编码区 质粒。miR-n.c. 表示用作负对照的 control-miR。
(d)100nM 的 con-miR 或 miR-320a 或其反义核酸瞬时转染 DU-145、 PC-3、 Hela 和 95D 细胞， 48 小时后用 western blot 检测内源表达的 Pfn1 蛋白质的水平。miR-n.c. 表示 用作负对照的 control-miR。
图 4、 MiR-320a 能正向调控乳腺癌细胞的迁移性和侵袭性。
(a)qRT-PCR 检 测 miR-320a 稳 定 转 染 的 MCF-7 细 胞 能 高 水 平 表 达 miR-320a， con-miR 稳转细胞作为对照。
(b)Western blot 检测稳定转染 miR-320a 或 con-miR 的 MCF-7 细胞以及瞬时转染 100nM miR-320a 反义核酸或对照反义核酸的 MDA-MB-231 细胞的 Pfn1 蛋白质表达量。
(c-f) 伤 口 愈 合 实 验 测 定 瞬 时 转 染 anti-miR-320a 或 anti-con-miR 的 MDA-MB-231 细胞的迁移性 (c， d) 和稳定转染 miR-320a 或 con-miR 的 MCF-7 细胞的迁移性 (e， f)。细胞图片 (c、 e： 标尺 200μm)， 柱形图 (d， f) 表示 3 组独立实验的平均值 ±SE。
(g-j)Transwell 迁 移 实 验 测 定 瞬 时 转 染 anti-miR-320a 或 anti-con-miR 的 MDA-MB-231 细胞的迁移性 (g， h) 和稳定转染 miR-320a 或 con-miR 的 MCF-7 细胞的迁移性 (i， j)。细胞图片 (g、 i： 标尺 200μm)， 柱形图 (h， j) 表示 3 组独立实验的平均值 ±SE。
(k-n)Transwell 侵 袭 实 验 测 定 瞬 时 转 染 anti-miR-320a 或 anti-con-miR 的
MDA-MB-231 细胞的侵袭性 (k， l) 和稳定转染 miR-320a 或 con-miR 的 MCF-7 细胞的侵袭性 (m， n)。细胞图片 (k、 m： 标尺 200μm)。柱形图 (l， n) 表示 3 组独立实验的平均值 ±SE。
图 5、 MiR-320a 对 MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭的影响部分是由下调 Pfn1 介导的。 100nM 的 anti-miR-320a 或 anti-con-miR 转染 MDA-MB-231 细胞， 或再同时转染 100nM 的对 照组 siRNA(si-con) 或 Pfn1 特异性 siRNA(si-Pfn1)， 均为瞬时转染。用 western blot 检 测 Pfn1 的表达量 (a)， 用 Transwell 实验测定细胞迁移性和侵袭性 (b)。柱形图表示三组 的独立实验的平均值 ±SE。
图 6、 伤口愈合实验测定瞬时转染 anti-miR-320a 或 anti-con-miR 的 95D 细胞的 迁移性 (a) 和瞬时转染 miR-320a 或 con-miR 的 DU145 细胞的迁移性 (b)。细胞图片 ( 标尺 200μm)。 具体实施方式
本发明人经过深入的研究， 首次揭示了 miR-320a 与肿瘤细胞的迁移与侵袭的相 关性， 其能够调控 ( 促进 ) 肿瘤细胞的迁移与侵袭。所述的肿瘤细胞特别是表达 Pfn1 蛋白 的细胞， 更特别是 Pfn1 蛋白表达后迁移性和 / 或侵袭性降低的细胞。本发明为肿瘤的防治 提供了新的靶点。 miR-320a 及其用途
miR-320a 为一种本领域已知的 microRNA(miRNA) 小分子， 其对于调控 RNA 是有用 的。然而， 对于 miR-320a 结合的靶点和其与肿瘤的迁移性和 / 或侵袭性之间的关系目前并 不清楚。
miR-320a 具有如 SEQ ID NO ： 2 所示的序列。其可以被分离自细胞， 或者可通过 人工合成的方式获得。在得知了 miR-320a 的序列后， 本领域人员可以方便地制备获得 miR-320a。
基于本发明人的新发现， 提供了一种 miR-320a 的用途， 用于制备抑制 Pfn1 蛋白表 达的组合物。在本领域中， Pfn1 蛋白在肿瘤细胞中的作用已经有所揭示， 在一些肿瘤细胞 ( 如乳腺癌细胞、 胰腺癌细胞 ) 中， Pfn1 蛋白的高表达抑制的肿瘤细胞的迁移和侵袭 ； 而本 发明人发现， 在另一些肿瘤细胞 ( 如前列腺癌细胞 ) 中， Pfn1 蛋白的高表达促进的肿瘤细 胞的迁移和侵袭。因此很显然， miR-320a 可通过抑制 Pfn1 蛋白的表达而调控这些肿瘤细 胞的迁移和侵袭。
Pfn1
Profilin-1( 简写为 Pfn1) 属于 Profilin 家族的成员， 广泛存在于脊椎动物、 无脊 椎动物、 原生生物、 真菌、 植物及某些病毒中。已有研究表明 Pfn1 参与了哺乳动物细胞的迁 移过程。
Pfn1 蛋白的序列可以与 GenBank 登录号 NP 005013 所示的序列基本上相同， 其编 码分子可以与 GenBank 登录号 NM 005022 所示的序列基本上相同。 Pfn1 蛋白或基因可以被 分离自细胞， 或者可通过人工合成的方式获得。在得知了 Pfn1 蛋白或编码基因的序列后， 本领域人员可以方便地制备获得 Pfn1 蛋白或基因。
miR-320a 抑制剂及其用途
本发明人从鉴定 miR-320a 的靶基因入手， 通过一种基于免疫共沉淀的方法纯化
出 RISC 复合体从而进一步鉴定出 miR-320a 的一个靶基因为 Pfn1 基因。根据这一发现， 本 发明人以乳腺癌细胞为模型进一步研究了 miR-320 对肿瘤细胞迁移和侵袭的调控作用。结 果表明 miR-320a 能促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭， 这种作用部分是通过 miR-320a 直接抑 制 Pfn1 而实现的。因此， miR-320a 可以作为肿瘤治疗的靶点。
更具体地， 本发明人的研究表明在 Pfn1mRNA 的 3’ -UTR( 即 3’ 端非翻译区 ) 的第 20 至第 41 个核苷酸区域为 miR-320a 的识别靶位点， 该靶位点在多个物种的 Pfn1 mRNA 中 保守存在。将 Pfn1 的 3’ UTR 克隆到荧光素酶报告基因的 3’ 非翻译区后与 miR-320a 共 转染入 293T 细胞中， 24 小时后检测发现 miR-320a 能显著抑制报告基因的表达。在一些 肿瘤细胞系中过表达 miR-320a 后发现细胞内源的 Pfn1 蛋白水平被下调。而在乳腺癌细 胞 MDA-MB-231( 本身高表达内源的 miR-320a) 转染 miR-320a 的反义核酸抑制其功能时 Pfn1 蛋白水平被上调。上述结果充分证明了 Pfn1 是 miR-320a 的靶基因。已有研究表明 Pfn1 能对乳腺癌细胞的侵袭性起负调控作用， 因此本发明人接着研究了 miR-320a 和乳腺 癌细胞侵袭性的关系。MCF-7 本身内源表达的 miR-320a 很少， 过表达 miR-320a 后， 其迁移 性和侵袭性都得到增强。而在本身高表达 miR-320a 的 MDA-MB-231 细胞中转入其反义核 酸后， 不仅 Pfn1 的蛋白表达上调， 该细胞的迁移性和侵袭性都被减弱 ； 但当再转入 Pfn1 的 特异性 siRNA 将 Pfn1 的水平回复到原先的水平后， 该细胞的迁移性和侵袭性也都部分回 复。上述结果表明， miR-320a 能促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力， 而且该作用部分是由 于 miR-320a 能靶向调控 Pfn1 蛋白的表达。
基于本发明人的上述新发现， 本发明提供了一种 miR-320a 的抑制剂的用途， 用于 制备抑制肿瘤细胞的组合物。所述的抑制肿瘤细胞更特别地是指抑制肿瘤细胞的迁移和 / 或侵袭。所述的肿瘤细胞是表达 Pfn1 蛋白的细胞， 更特别是指 Pfn1 蛋白表达后迁移性和 / 或侵袭性降低的细胞。优选地， 所述的肿瘤细胞是乳腺癌细胞。
如本文所用， 所述的 miR-320a 抑制剂包括了拮抗剂、 下调剂、 阻滞剂、 阻断剂等。 任何可下调 miR-320a 的表达、 加速 miR-320a 降解、 下调 miR-320a 的活性、 阻止 miR-320a 与靶分子结合的物质， 均可作为 miR-320a 的抑制剂， 用于通过抑制 miR-320a 来抑制肿瘤细 胞的迁移和侵袭。
在得知了 miR-320a 对于肿瘤细胞迁移和侵袭的调控作用后， 本领域人员可以方 便地得知 miR-320a 抑制剂可以通过抑制 miR-320a 来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此， 任何 miR-320a 的抑制剂都可用于本发明。根据 miR-320a 的特性， 本领域人员可以获得多 种 miR-320a 的抑制剂。
作为本发明的优选方式， 所述的 miR-320a 的抑制剂是 miR-320a 的反义核苷酸。
如 本 文 所 用， “反 义 核 苷 酸”又 称 为 “反 义 核 酸”或 “反 义 寡 核 苷 酸 (AS-ONs， antisense-oligonucleotides)” 或 “反义药物” ， 是指长度约为 15-24 个碱基的 DNA 分子、 RNA 分子它们的经修饰的形式或它们的类似物， 可与 mRNA 互补。 从理论上来讲， 根据反义技 术获得的反义分子可用于治疗任何由基因表达或者基因缺失引起的疾病， 比如病毒感染、 癌症和炎症。
本领域人员均了解， 根据本发明提供的反义核苷酸， 可以进行适当的变化并保留 其活性， 这些变化形式均可用于本发明。任何可起到抑制或沉默 miR-320a 的作用的反义核 苷酸都是可用于本发明的， 其类型不限于 DNA 或是 RNA。例如， 所述的 miR-320a 的反义核苷酸具有与 SEQ ID NO ： 1 所示的序列在严格条件下杂交的序列 ； 或者所述的 miR-320a 的 反义核苷酸与 SEQ ID NO ： 1 所示的序列具有 80％以上的相同性， 较佳地具有 85％以上的相 同性， 更佳地具有 90％以上的相同性， 最佳地具有 95％以上的相同性， 如具有 96％、 97％、 98％或 99％以上的相同性 ； 或者所述的 miR-320a 的反义核苷酸是 SEQ ID NO ： 1 所示序列 的片段。它们均具有 SEQ ID NO ： 1 所示序列的反义核苷酸相同的功能。
现有技术中已经指出了一些反义核苷酸的变化形式是可取的， 它们也可以针对相 应的靶序列发挥抑制作用。 如 Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucleo tides(2294-2304 Nucleic Acids Research， 2006， Vol.34， No.8) 文献中提到， 在反义核酸 的两个末端截短 1 个碱基是可以保留其活性的。又如 Designand delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in culturedDrosophila and human cells(NATURE PROTOCOLS ； VOL.3 NO.10 ； 2008 ； 1537-1549) 文献综述了多个研究， 认为一 般而言， 在反义核酸的两边延长一些碱基是可以的。而在反义核酸和 miRNA 间亲和性很高 ( 如锁核酸修饰 ) 时， 反义核酸可以被截短到约 2/3 长度。
如本文所用， 所述的 “严格条件” 是指 ： (1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交 和洗脱， 如 0.2×SSC， 0.1 ％ SDS， 60 ℃ ； 或 (2) 杂交时加有变性剂， 如 50 ％ (v/v) 甲酰胺， 0.1％小牛血清 /0.1％ Ficoll， 42℃等 ； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 90％以 上， 更好是 95％以上时才发生杂交。 并且， 可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO ： 1所 示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
作为本发明的更优选的方式， 所述的 miR-320a 的反义核苷酸具有 SEQ IDNO ： 1所 示的序列。
在本发明中， 所述的 “反义核苷酸” 还包括经修饰的反义核苷酸， 所述的修饰基本 不改变反义核苷酸的活性， 更佳地， 所述修饰可提高反义核苷酸的活性、 稳定性或治疗效 果。对反义核苷酸的修饰包括但不限于 ： 甲氧基化修饰、 锁核酸修饰、 肽核酸修饰、 硫代修 饰、 磷酸骨架由磷脂连接骨架代替， 这些修饰均是本领域技术人员易于实现的。优选地， 所 述的修饰为甲氧基化修饰， 即： 在核糖骨架的 2 位羟基上的氢被甲基取代。
Pfn1 抑制剂及其用途
本发明人意外地发现， Pfn1 在一些细胞中表达或活性的下调 ( 例如以 miR-320a 下 调其表达 ) 可以抑制肿瘤细胞的迁移或侵袭。所述的细胞是 Pfn1 蛋白表达被抑制后迁移 性和 / 或侵袭性降低的细胞， 如前列腺癌细胞。
因此， 本发明还提供了 Pfn1 抑制剂的用途， 用于制备抑制肿瘤细胞的组合物。
如本文所用， 所述的 Pfn1 的抑制剂包括了拮抗剂、 下调剂、 阻滞剂、 阻断剂等。任 何可降低 Pfn1 蛋白的活性、 降低 Pfn1 蛋白的稳定性、 抑制 Pfn1 蛋白的表达、 减少 Pfn1 蛋白 有效作用时间、 抑制 Pfn1 蛋白的分泌、 或抑制 Pfn1 的转录和翻译的物质均可用于本发明， 作为可用于抑制肿瘤细胞的有效物质。所述的 Pfn1 的抑制剂也可以是经过修饰的形式。
在 Pfn1 蛋白或核酸序列已知的情况下， 本领域人员能够根据一般的手段来获得 Pfn1 的抑制剂。所述的抑制剂例如包括但不限于 ： 特异性结合 Pfn1 蛋白的抗体或配体 ； 特 异性干扰 Pfn1 表达的小干扰分子， 如 siRNA 分子、 miRNA 分子等。
作为本发明的优选方式， 所述的 Pfn1 的抑制剂是 miR-320a ； 或是序列与 miR-320a 的序列具有 80％以上的相同性 ( 较佳地具有 85％以上的相同性， 更佳地具有 90％以上的相同性， 最佳地具有 95％以上的相同性， 如具有 96％、 97％、 98％或 99％以上的相同性 ) 的 miRNA ； 或是序列与 miR-320a 序列在严格条件下杂交的 miRNA ； 它们均具有 miR-320a 相同 的功能。
筛选方法
在得知了所述的 miR-320a 对于调控肿瘤细胞的迁移和 / 或侵袭的用途后， 可以基 于该特征来筛选调节 miR-320a 的表达或活性， 进而调节肿瘤细胞的迁移和 / 或侵袭的物 质； 或者， 可以筛选调节 miR-320a 的表达或活性， 进而调节 Pfn1 的表达或活性， 最终调节肿 瘤细胞的迁移和 / 或侵袭的物质。
因此， 本发明提供一种筛选可用于抑制肿瘤 ( 特别是抑制肿瘤细胞的迁移和 / 或 侵袭 ) 的潜在物质的方法， 所述的方法包括 ： 将候选物质与表达 miR-320a 的体系接触 ； 和 检测候选物质对 miR-320a 的影响 ； 若所述候选物质可降低 miR-320a 的表达或活性， 就表明 该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。 在本发明的优选方式中， 在进行筛选时， 为了更易于观察 到 miR-320a 的表达或活性的改变， 还可设置对照组， 所述的对照组可以是不添加所述候选 物质的表达 miR-320a 的体系。
本发明还提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法， 所述方法包括 ： 将候选物质 与包含 miR-320a 和 Pfn1 mRNA 的体系接触， 并检测 miR-320 与 Pfn1mRNA 的结合情况 ； 如 果 miR-320 与 Pfn1 mRNA 的结合在统计学上低于对照组， 就表明该候选物是抑制肿瘤的潜 在物质。在本发明的优选方式中， 在进行筛选时， 为了更易于观察到 miR-320 与 Pfn1 mRNA 的结合的改变， 还可设置对照组， 所述的对照组可以是不添加所述候选物质的包含 miR-320 与 Pfn1mRNA 的体系。 所述的体系包括 ( 但不限于 ) ： 溶液体系、 亚细胞体系、 细胞体系、 组织体系、 器官 体系、 或动物体系。优选地， 所述的体系是肿瘤细胞体系。
作为本发明的优选方式， 所述的方法还包括 ： 对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和 / 或动物试验， 以进一步选择和确定对于抑制肿瘤真正有用的物质。
另一方面， 本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于抑制肿瘤的潜在物 质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库， 以便于人们最终可以从中筛选出真正有用 的物质。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物， 所述的药物组合物含有有效量的所述的反义核 苷酸， 以及药学上可接受的载体。
所述 “药学上可接受的” 的成分是适用于人和 / 或动物而无过度不良副反应 ( 如 毒性、 刺激和变态反应 ) 的， 即有合理的效益 / 风险比的物质。
所述 “有效量” 是指可对人和 / 或动物产生功能或活性的且可被人和 / 或动物所 接受的量。
所述 “药学上可接受的载体” 指用于治疗剂给药的载体， 包括各种赋形剂和稀释 剂。该术语指这样一些药剂载体 ： 它们本身并不是必要的活性成分， 且施用后没有过分的 毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington’ s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.， N.J.1991) 中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在 组合物中药学上可接受的载体可含有液体， 如水、 盐水、 甘油和乙醇。 另外， 这些载体中还可
能存在辅助性的物质， 如填充剂、 润滑剂、 助流剂、 润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲物质等。
本发明的反义核苷酸的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而 变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定 ( 例如通过 临床试验 )。所述的因素包括但不限于 ： 反义核苷酸的药代动力学参数例如生物利用率、 代谢、 半衰期等 ； 患者所要治疗的疾病、 患者的体重、 患者的免疫状况、 给药的途径等。通 常， 当本发明的反义核苷酸每天以约 0.001-100mg/kg( 优选的为 0.01-20mg/kg) 动物体 重的剂量给予时， 能得到令人满意的效果， 较佳地每天以 2-4 次分开的剂量给予， 或以缓 释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言， 每天的总剂量约为 0.005-100mg， 较佳地约为 0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如， 由治疗状况的迫切要求， 可每 天给予若干次分开的剂量， 或将剂量按比例地减少。
任何适用的给药途径都是可以的， 包括但不限于 ： 口服、 静脉内注射、 皮下注射、 肌 肉给予、 局部给予、 植入、 缓释给予、 肿瘤内给予等 ； 优选的， 所述给药方式是非肠道给予的。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室指南 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和 份数按重量计算。 除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I、 材料和方法
材料， 抗体和细胞
培 养 基 DMEM 和 胎 牛 血 清 购 自 Invitrogen/Gibco(Karlsruhe， Germany)。24 孔 Transwell 小室和基质胶包被的小室 (8μm 孔径 ) 购自 BD Biosciences(Bedford， MA， USA)。 对照的 miRNA(control-miR， Ambion 货号 ： AM17110)、 miR320a( 序列为 5’ -AAAAGCUGGGUUG AGAGGGCGA-3’ (SEQ ID NO ： 2))、 对照的 2’ 甲氧基化修饰的反义核酸 (control-anti-miR 或 anti-control-miR， Ambion 货 号 ： AM17010)、 miR-320a 的 甲 氧 基 化 修 饰 的 反 义 核 酸 (anti-miR-320a， 序列为 5’ -UCGCCCUCUCAACCCAGCUUUU-3’ (SEQ ID NO ： 1)， 修饰位点为核 糖的 2 位羟基 )、 对照 siRNA(si-con 或 control-siRNA， Ambion 货号 ： 4390843) 和 Pfn1 特 异的 siRNA(si-Pfn1， Ambion 货号 ： AM16810， SiRNA ID ： S10375) 购自 Ambion(Austin， TX， USA)。
用于稳定转染 MCF-7 细胞的过表达 miR-320 的慢病毒载体构建所用引物 ：
Lmi320a+(SEQ ID NO ： 7) ：
GATCCGCTTCGCTCCCCTCCGCCTTCTCTTCCCGGTTCTTCCCGGAGTCGG ；
Lmi320a-(SEQ ID NO ： 8) ：
GGGAAGAACCGGGAAGAGAAGGCGGAGGGGAGCGAAGCG ；
Lmi320b+(SEQ ID NO ： 9) ：
GAAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGAAAAAGGATGAGGTTTTTTC ；
Lmi320b-(SEQ ID NO ： 10) ：
TCGAGAAAAAACCTCATCCTTTTTCGCCCTCTCAACCCAGCTTTTCCCGACTCC ；
Lmi-con-a+(SEQ ID NO ： 11) ：
GATCCGCTTCGCTCCCCTCCGGCGTCTCTTGCGTGGTCTTCCCGGAGTCGG ；
Lmi-con-a-(SEQ ID NO ： 12) ：
GGGAAGACCACGCAAGAGACGCCGGAGGGGGCGAAGCG ；
Lmi-con-b+(SEQ ID NO ： 13) ：
GAACACCACGCTTGAGACGCCGAAAAAGGATGAGGTTTTTTC ；
Lmi-con-b-(SEQ ID NO ： 14) ：
TCGAGAAAAAACCTCATCCTTTTTCGGCGTCTCAAGCGTGGTGTTCCCGACTCC。
Pfn1 的抗体购自 Abcam， β-actin 的抗体和 Flag 的抗体购自 Sigma， GAPDH 的抗 体购自康成生物公司。细胞系 293， 293T， Hela， HFL1， HL-7702， BEL-7404， 肝癌细胞株 LO2， 肝癌细胞株 HepG2， 肺癌细胞株 A549， 肺癌细胞株 95-D， 乳腺癌细胞株 MCF-7， 乳腺癌细胞株 MDA-MB-231， 乳腺癌细胞株 MDA-MB-435S， 前列腺癌细胞株 DU-145 和前列腺癌细胞株 PC-3 均购自中国科学院上海生命科学院生化细胞所细胞库。
3’ -UTR- 荧光素酶报告质粒及 pLenti 慢病毒稳定表达质粒的构建和报告基因表 达检测方法
Pfn1 全 长 的 3’ -UTR 通 过 PCR 扩 增 得 到 ： 以 MCF-7 细 胞 的 cDNA 为 模 板 ( 用 Trizol 试剂抽提 MCF-7 细胞的总 RNA。用 oligo dT( 即连续 20 个 dT 核苷酸 ) 作反转 录 引 物， 用 SuperScript III(Invitrogen) 按 其 说 明 书 进 行 反 转 录 合 成 出 cDNA)， 引物 为： 上 游 引 物 5’ -TCACATATGTCTGTCCCTTCCCCTTCACCGCTCC-3’ (SEQ ID NO ： 3)， 下游引 物 5’ -TCACATATGAACAAAAGTTT TCCAACCACACACG-3’ (SEQ ID NO ： 4)， 扩增产物克隆到 pGL3(Promega， Madison， WI， USA) 的 Xba I 位点， 构建野生型 Pfn1-3’ -UTR 的报告基因质粒。 miR-320a 结合位点突变的 Pfn1-3’ -UTR 用 Quick change-mutagenesis kit(Stratagene， Heidelberg， Germany) 试剂盒产生， 突变所用的引物为 5’ -CTTCCCCTTCACCGCTCCCCACTGATC TGCACCCCTTTCCTCCCCATAC-3’ (SEQ ID NO ： 15) ； 5’ -GTATGGGGAGGAAAGGGGTGCAGATCAGTGGGGA GCGGTGAAGGGGAAG-3’ (SEQ ID NO ： 16)。
扩增 Pfn1 的 Pfn1 mRNA 的蛋白编码区 (ORF) 加上 3’ -UTR 所用引物 ： 5’ -CCTGCT AGCATGGACTACAAAGACGATGACGATAAAATGGCCGGGTGGAACGCCTAC-3’ (SEQ ID NO ： 17) 和 SEQ ID NO ： 4， 扩增产物克隆到 pcDNA3.1(Invitrogen) 的 Nhe I 和 Xba I 位点， 获得携带 Pfn1 mRNA 的蛋白编码区加上 3’ UTR 区的 pCDNA3.1 载体。
用于稳定转染的 pLenti-320a 及 pLenti-control 质粒的构建 ： 分别把 Lmi320 和 Lmi-con 中 a+ 和 a-， b+ 和 b- 退火形成双链。退火后， a 片段和 b 片段之间有互补的粘性 位点， a 片段的另一端有 BamH I 粘性位点， b 片段另一端有 Xho I 粘性位点。把 pLenti 空 载体 ( 参见 Ge 等的文献 ： PCAF Acetylates β-Catenin andImproves Its Stability.Mol Biol Cell.2009 January 1 ； 20(1) ： 419-427) 用 BamH I 和 Xho I 酶切后， 分别将 Lmi320 的 a， b 片段和 Lmi-con 的 a， b 片段和载体连接， 转化后， 鉴定正确的克隆。
报告基因表达检测方法 ： 将 含 有 野 生 型 或 突 变 型 Pfn1-3’ -UTR 的 报 告 基 因 质 粒 (20ng) 与 转 染 内 参 质 粒 pRL-SV40(20ng)(Promega) 以 及 miRNA 或 反 义 核 酸 用 脂 质 体 Lipofectamine 2000(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 瞬 时 共 转 染 入 293T 细 胞(2-5×105)。24 小时后用 Dual luciferaseassay system(Promega) 检测荧光素酶活性。
细胞瞬时转染和筛选稳定转染的细胞
瞬时转染的前一天把细胞用胰酶消化分散后， 按 1×105 个细胞 / 孔接种于 12 孔 板。单独转染合成的小 RNA 分子或反义核酸分子、 共转染质粒和合成的小 RNA 分子或反义 核酸分子均按 Lipofectamine 2000 的说明书进行。转染 24 小时后， 进行迁移性、 侵袭性实 验分析。转染 48 小时后， 收获细胞， 进行 WesternBlot 分析。
稳定转染细胞的筛选 ： 转染前一天将细胞按 2×106 个细胞 / 皿接种于 10cm 细胞 培养皿。转染含 miR-320a 或对照 miRNA 的 pLenti 载体过程按 Lipofectamine 2000 的说 明书进行。转染 24 小时后， 用流式细胞仪筛选出 GFP 阳性的细胞。筛选出的 GFP 阳性细胞 再次接种于 10cm 细胞培养皿。等细胞长满时， 再次用流式细胞仪筛选出 GFP 阳性的细胞。 之后再重复一次培养 / 筛选。三次富集所得的细胞即为用作实验的稳定转染细胞。
细胞裂解制备蛋白样品及 Western Blot 分析
细 胞 用 磷 酸 缓 冲 液 (PBS) 洗 涤 后， 裂 解 于 Laemmli Sample Buffer(BIO-RAD， Hercules， CA， USA)。蛋白质浓度用 RC DC Protein Assay kit(BIO-RAD) 测定。约取 40μg 总蛋白于 15％ SDS-PAGE 进行电泳并电转印到 PVDF 膜上。用相应抗体对膜进行杂交， 最后 用化学发光法 (SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate， Thermo， Rockford， USA) 检测杂交信号。
RNA 抽提， 反转录反应以及实时定量 PCR
用 Trizol 试剂 (Invitrogen) 抽提细胞的总 RNA。以总 RNA 为模板用 NCodemiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 和 SuperScript III CellDirect cDNASynthesis Kit(Invitrogen) 合成出相应的 cDNA。实时定量 PCR 在 AppliedBiosystems 7500 Fast Real Time PCR system 仪 器上进 行， miR-320a 定 量时所 用上 游 引物为 miR-320a 特异 性引物 ( 即 miR-320a 的对应 DNA 序列 )， 下游引物为试剂盒中的通用引物， 所用试剂为 SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal(Invitrogen)。检测 Pfn1 表达的引物用 Primer premier v5.0 软件设计， 序列为 ： 5’ -GCCATCGTGGGCTACAAGG-3’ ( 上游引物， SEQ ID NO ： 5) 和 5’ -CCATCAGCAGGACTAGCGTCTT-3’ ( 下游引物， SEQ ID NO ： 6)。PCR 反应程序为 ： 95℃预变 性 4min， 然后是 45 步循环反应 ： 95℃变性 3sec.， 60℃退火并延伸 40sec.。最后， miR-320a -ΔΔCt 和 Pfn1 的定量按照 2 法计算， 分别以 U6 snRNA 和 GAPDH 为内参。
细胞迁移性和侵袭性检测
伤 口 愈 合 实 验 参 照 文 献 Ding Z 等， Silencing profilin-1 inhibits endothelialcell proliferation， migration and cord morphogenesis.Journal of cell science2006 ； 119(Pt 19) ： 4127-37 中所述。测定 3-4 个不同视野下的伤口宽度。伤口闭 合的定量是测量伤口宽度的变化数值， 一般每孔细胞测 3 个视野， 取平均值。
Transwell 细 胞 迁 移 实 验 参 见 文 献 Roy P， Jacobson K.Overexpression ofprofilin reduces the migration of invasive breast cancer cells.Cell motility and thecytoskeleton 2004 ； 57(2) ： 84-95 中所述。简而言之， 待细胞生长至 75-80％汇合 度时， 换无血清培养基继续培养， 血清饥饿 24 小时。胰酶消化下来后， 用 PBS 洗涤 3 次， 重 4 悬于无血清培养基中， 取 5×10 个细胞加入 Transwell 的上室中， 下室加入完全培养基 ( 含 10％胎牛血清 )。 培养 12 小时后， 用棉签擦去上室底膜上方的细胞， 而穿到膜下方的细胞则固定后用结晶紫染色， 并于显微镜下拍照， 取 3 个不同视野用 FUJIFILM Colony V1.1 软件 对细胞计数。用包被了基质胶的小室按照同样的方法进行细胞侵袭实验。
统计分析方法
数据的统计作图用软件 Sigma Plot 10.0 进行。数据表示为平均值 ±SE。组间差 异用 Student’ s t-test 分析， P ＜ 0.05 时为显著差异。
II、 实施例
实施例 1、 Pfn13’ UTR 含有保守的 miR-320a 的靶位点
为了研究 miR-320a 在肿瘤发生过程中的作用， 本发明人首先用最近报道的一种 生化方法 ( 参见 Karginov FV et al.A biochemical approach to identifyingmicroRNA targets.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 2007 ； 104(49) ： 19291-6) 鉴定了 miR-320a 的靶基因， 该方法的主要原理是用抗 RISC 核心组分 Ago2 的抗体免疫共沉淀出 RISC 中的 miRNA 和其靶基因 mRNA， 然后鉴定出相 应的 miRNA 的靶基因的种类。结果， 本发明人鉴定到 Pfn1 是 miR-320a 的候选靶基因。
然 后，本 发 明 人 用 miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、 TargetScan(http://www.targetscan.org/) 和 PicTar(http://www.pictar.org/) 等 miRNA 靶基因预测软件也预测到 Pfn1 是 miR-320a 的靶基因。 进一步分析发现， 在 Pfn1 mRNA(NM_005022) 的 3’ UTR 区第 20-41 个核苷酸存在 一个靶位点， 如图 1a， 通过 mFold 软件 (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/) 分析可得 Pfn1 3’ UTR 和 miR-320a 结合自由能为 -17.6kcal/mol， 这符合 miRNA 与靶基因结合的原则。而 且， 该靶位点的序列， 特别是种子区 ( 即与 miRNA 5’ 端 2-8 位核苷酸配对的区域 ) 在 9 种 物种中保守存在， 如图 1b。
实施例 2、 Pfn1 蛋白表达量和 miR-320a 表达量呈负相关性
首先， 本发明人检测了在一些细胞系中 miR-320a 与 Pfn1 表达量的关系， 如图 2a-d。在肺癌细胞系 A549 和 95-D 中， 95-D 细胞中的 Pfn1 mRNA 表达水平比 A549 高 5 倍， 而 95-D 细胞中 Pfn1 蛋白水平比 A549 低， 这表明在 95-D 中 Pfn1 的蛋白翻译过程可能受 阻。与此相比较， 95-D 细胞中 miR-320a 表达水平比 A549 细胞高 6 倍。在前列腺细胞 PC-3 和 DU-145 中也观察到类似的结果。总而言之， 在检测的这些细胞中都能观察到 Pfn1 的蛋 白表达水平与 miR-320a 的表达水平呈负相关性。
上述这些结果提示， miR-320a 在转录后翻译水平对 Pfn1 的蛋白表达起负调控作 用。
实施例 3、 MiR-320a 能作用于 Pfn1 mRNA 的 3’ UTR， 抑制 Pfn1 的表达
为了进一步证实 miR-320a 能直接靶向调控 Pfn1， 本发明人接着检测了 miR-320a 是否能结合到 Pfn1 mRNA 的 3’ UTR 并阻止蛋白质翻译。为此本发明人构建了如下的报告基 因载体 ： 将人的 Pfn1 全长的 3’ UTR 克隆到荧光素酶报告基因的 3’ UTR 区 (Wt UTR， 图 3a)， 同时还构建了一个对照载体， 即在 miR-320a 的靶位点的种子区有 3 个核苷酸突变的载体 (Mut UTR， 图 3a) 以去除 miR-320a 与该位点的结合。
将上述载体与 miR-320a 或对照 miRNA 共转染 293T 细胞， 或在此基础上再转染 miR-320a 的 反 义 核 酸 (anti-miR-320a) 或 对 照 的 反 义 核 酸 (Controlanti-miR) 以 抑 制 miR-320a 的功能， 均为瞬时转染。结果如图 3b 所示， 与对照的 miRNA 相比， miR-320a 能显
著降低报告基因的表达， 而 3’ UTR 带有突变的报告基因的表达几乎不受 miR-320a 的影响。 当用反义核酸抑制了 miR-320a 的功能后， 报告基因的表达得到恢复。 这些数据表明在 293T 细胞中 Pfn1 的 3’ UTR 区含有 miR-320a 的有效的作用靶点。
考虑到靶基因 mRNA 的高级结构可能会影响 miRNA 的结合， 本发明人接着又将 Pfn1 mRNA 的蛋白编码区加上 3’ UTR 区一起克隆到了 pCDNA3.1 载体 ( 购自 Invitrogen 公司 ) 里， 同样构建了一份 miR-320a 靶位点种子区带有突变的质粒作为对照。将不同浓度的上述 质粒瞬时转染 293T 细胞， 结果如图 3c 所示， miR-320a 能剂量依赖性的特异下调人为构建 的野生型 Pfn1 的表达， 而带有突变位点的 Pfn1 则不受 miR-320 的影响。这些结果进一步 证明在 293T 细胞中， miR-320a 能调控 Pfn1 的表达。
为了研究 miR-320a 能否调控内源的 Pfn1 蛋白的表达， 本发明人将人工合成的 miR-320a 瞬时转染不同的肿瘤细胞系中。结果如图 3d 所示， 转染 miR-320a48 小时后， DU-145、 PC-3 和 Hela 细胞中的内源 Pfn1 蛋白被显著下调。
综上所述， miR-320 能于转录后水平通过与 Pfn1 mRNA 3’ UTR 的结合而下调其表 达。
实施例 4、 MiR-320a 能促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭 最近有研究表明 Pfn1 能负调控乳腺肿瘤细胞的侵袭性， 在结肠癌中 miR-320 与肿 瘤转移性复发相关。这些研究结果促使本发明人推测 miR-320a 可能调控肿瘤细胞的侵袭 性， 因此本发明人接着在两株乳腺癌细胞 MCF-7 和 MDA-MB-231 中检验该假设。MCF-7 是公 认的迁移性和转移性很低的细胞， 而 MDA-MB-231 是具有转移性的乳腺癌细胞。结果见图 2d， 表明了 miR-320a 在 MDA-MB-231 中表达远高于 MCF-7。因此， 本发明人在 MCF-7 中过表 达 miR-320a， 然后再检测细胞迁移性和侵袭性的变化。为此， 用病毒载体表达 miR-320a 的 前体， 即 pre-miR-320a， 然后转染 MCF-7 细胞筛选出稳定转染细胞株， 如图 4a 所示， 稳转的 MCF-7 细胞中高表达 miR-320a， 而 Pfn1 蛋白的水平受到下调 ( 图 4b)。
随后， 本发明人首先用伤口愈合实验检测了细胞迁移性的变化。在 MCF-7 细胞中， 过表达 miR-320a 能导致细胞迁移性上升 40％ ( 图 4e， 4f)。Transwell 细胞迁移测试和基 质胶侵袭实验也表明过表达 miR-320a 后 MCF-7 细胞的迁移性增加 60％ ( 图 4i 和 4j)， 侵 袭性约增强 3-4 倍 ( 图 4m 和 4n)。这些结果表明， miR-320a 能增强肿瘤细胞的迁移性和侵 袭性。
实施例 5、 MiR-320a 的反义核苷酸提高 Pfn1 表达， 抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭
MDA-MB-231 是具有转移性的乳腺癌细胞， 在 MDA-MB-231 中用 miR-320a 的反义 核酸 (anti-miR-320a) 抑制 miR-320a 的功能， 然后再检测细胞迁移性和侵袭性的变化。 miR-320a 的反义核酸瞬时转染 MDA-MB-231， 结果 Pfn1 蛋白水平上调 ( 图 4b)。随后， 本 发明人首先用伤口愈合实验检测了细胞迁移性的变化。转染 miR-320a 的反义核酸后， MDA-MB-231 细胞的迁移性下降 60％ ( 图 4c， 4d)。Transwell 细胞迁移测试和基质胶侵袭 实验也表明， 抑制 miR-320a 活性后 MDA-MB-231 细胞的迁移性减弱 40％ ( 图 4g 和 4h)， 侵 袭性则被减弱 60％ ( 图 4k 和 41)。这些结果表明， miR-320a 反义核酸能抑制肿瘤细胞的 迁移性和侵袭性。
实施例 6、 MiR-320a 对乳腺癌细胞的迁移和侵袭的作用是通过调控 Pfn1 蛋白表达 而实现的
为了验证 miR-320a 对乳腺癌细胞迁移性和侵袭性的影响是否是通过 Pfn1 来介 导的， 本发明人又采用了 Pfn1 特异性的 siRNA(si-Pfn1) 来抵消由 miR-320a 反义核酸在 MDA-MB-231 细胞中引起的 Pfn1 蛋白质表达的上升作用， 然后检测该细胞的迁移性和侵袭 性是否能恢复到原来的水平。结果如图 5a 所示， 如前所述 miR-320a 反义核酸能引起 Pfn1 蛋白质水平的上升， 但当加入 Pfn1 特异的 siRNA(si-Pfn1) 后， Pfn1 蛋白质被重新降回到原 来的水平。而此时， MDA-MB-231 细胞的迁移性和侵袭性被部分的恢复 ( 图 5b)， 非特异性的 对照 siRNA(control-siRNA， si-con) 则没有这种作用。 这些数据表明 Pfn1 介导了 miR-320a 对乳腺癌细胞的迁移性和侵袭性的调控作用。
实施例 7、 MiR-320a 的反义核苷酸提高 Pfn1 表达， 抑制肺癌细胞的迁移
95D 是高迁移的肺癌细胞株， 本发明人将 miR-320a 的反义核酸瞬时转染 95D 肺癌 细胞， 结果如图 3d 所示， 转染 miR-320a 的反义核酸后， 95D 细胞的 Pfn1 蛋白水平上调。
用伤口愈合实验检测细胞迁移性的变化， 将 miR-320a 的反义核酸以及对照分别 瞬时转染 95D 高迁移的肺癌细胞株， 结果如图 6a 所示， miR-320a 的反义核酸可以明显抑制 肺癌细胞的迁移性。
实施例 8、 过表达 MiR-320a 能抑制前列腺癌细胞 Pfn1 的表达， 并抑制前列腺癌细 胞的迁移
DU-145 是高迁移前列腺癌细胞株， 本发明人将人工合成的 miR-320a 瞬时转染 DU-145 前列腺癌细胞， 结果如图 3d 所示， 转染 miR-320a 48 小时后， DU-145 细胞中的内源 Pfn1 蛋白被显著下调。
用 伤 口 愈 合 实 验 检 测 细 胞 迁 移 性 的 变 化， 将 miR-320a 及 对 照 分 别 瞬 时 转 染 DU-145 细胞， 结果如图 6b 所示， 过表达 miR-320a 可以明显抑制前列腺癌细胞的迁移性。
实施例 9、 筛选方法
方法 1 ：
设置 ： 测试组 ： 乳腺癌细胞 MDA-MB-231( 其中高表达 miR-320a)， 并给予候选物质 ； 对照组 ： 乳腺癌细胞 MDA-MB-231( 其中高表达 miR-320a)， 不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组中 miR-320a 的表达情况， 并进行比较。如果测试组中 miR-320a 的表达在统计学上低于 ( 如低 50％或更低 ) 对照组， 就表明该候选物是抑制肿瘤 的潜在物质。
将 miR-320a 的反义核苷酸 miR-320a 和对照 control-anti-miR 分别作为候选物 质， 加入到乳腺癌细胞 MDA-MB-231 培养物中， 观察胞内 miR-320a 的表达情况， 结果发现 miR-320a 可有效地降低 miR-320a 的表达， 而 control-anti-miR 不能有效地降低 miR-320a 的表达。
方法 2 ：
如前所述构建报告基因载体， 其中将人的 Pfn1 全长的 3’ UTR 克隆到荧光素酶报 告基因的 3’ UTR 区。将上述载体与 miR-320a 共转染 293T 细胞， 获得包含 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的细胞。
设置 ： 测试组 ： 上述包含 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的细胞， 并给予候选物质 ； 对照 组： 上述包含 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的细胞， 不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组中 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的结合情况， 并进行比较。如果测试组中 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的结合在统计学上低于 ( 如低 50％或更低 ) 对照 组， 就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。
将 miR-320a 的反义核苷酸 miR-320a 和对照 control-anti-miR 分别作为候选物 质， 分别加入到上述包含 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的细胞中， 观察胞内 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的结合情况， 结果发现 miR-320a 可有效地减少 miR-320a 以及 Pfn1 mRNA 的结合， 而 control-anti-miR 不能有效地减少 miR-320a 的表达。
讨论
肿瘤转移是肿瘤病人致死的主要原因之一， 然而对其中的分子机制还知之甚少。 已有研究表明一些在原发肿瘤中表达的基因与肿瘤治疗后的转移性复发密切相关。 但是关 于导致这些基因异常表达的调控网络方面的了解还很有限。miRNA 由于能在转录后水平调 控一系列基因的表达， 因此是肿瘤迁移性发生过程中的上游调控因子的理想的候选因子。 目前已经报道了一些 miRNA 在致癌或抑癌方面的功能， 然而关于 miRNA 对肿瘤转移过程中 的作用的研究刚刚起步。本发明关于与肿瘤转移相关的一个蛋白质 Pfn1 是 miR-320a 的一 个靶基因。本发明人的研究表明了 miR-320a 能促进乳腺癌细胞 MDA-MB-231 和 MCF-7 的迁 移性和侵袭性， 而这一作用部分是由于 miR-320a 对 Pfn1 的调控引起的。
作为肌动蛋白结合蛋白质， Profilin 参与了许多肌动蛋白相关的细胞活动， 如运 动、 细胞连接、 细胞浆移动和细胞形态变化和维持。遗传学的研究表明了 Profilin 在正常 细胞的增殖和发育中发挥重要作用。Profilin 基因缺陷会导致单个细胞的生长、 运动和胞 浆移动出现障碍甚至胚胎致死。此外， 近年在乳腺癌中的研究表明 Pfn1 能作为抑癌基因并 能抑制肿瘤细胞的侵袭性。用 siRNA 沉默 Pfn1 能增强乳腺癌细胞 MDA-MB-231 细胞的移动 性和侵袭性。本发明人发现了 Pfn1 的一个内源的调控小分子 RNA， 即 miR-320a。这本身就 提示了 miR-320a 可能调控细胞的迁移和侵袭。本发明人的研究也发现了 miR-320a 在高迁 移性的乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中高表达。随后的研究发现用反义核酸抑制了 miR-320a 功 能后， MDA-MB-231 的迁移和侵袭都被抑制。而相反， 在低迁移乳腺癌细胞 MCF-7 中过表达 miR-320a 能促进该细胞的迁移和侵袭。这与前人关于 Pfn1 抑制乳腺癌细胞侵袭性的研究 结论正好吻合。
总而言之， 本发明人的研究表明， Pfn1 是 miR-320a 的靶基因， 而且， miR-320a 能促 进乳腺癌细胞 MCF-7 和 MDA-MB-231 的迁移性和侵袭性。 在高侵袭的乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中用反义核酸抑制 miR-320a 能有效抑制其迁移性和侵袭性， 这意味着抑制 miR-320a 的活 性这种方法能成为遏制乳腺癌细胞转移的治疗方案。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 抑制癌细胞侵袭性的方法和试剂
<130>093922
<160>1718CN 101987197 A
说3.3明书16/19 页<170>PatentIn version <210>1 <211>22 <212>RNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 寡核苷酸 <400>1 ucgcccucuc aacccagcuu <210>2 <211>22 <212>RNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 寡核苷酸 <400>2 aaaagcuggg uugagagggc <210>3 <211>34 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>3 tcacatatgt ctgtcccttc <210>4 <211>34 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>4 tcacatatga acaaaagttt <210>5 <211>19uu22ga22cccttcaccg ctcc34tccaaccaca cacg34<212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>5 gccatcgtgg gctacaagg <210>6 <211>22 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>6 ccatcagcag gactagcgtc tt <210>7 <211>51 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>7 gatccgcttc gctcccctcc gccttctctt cccggttctt cccggagtcg g <210>8 <211>39 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>8 gggaagaacc gggaagagaa ggcggagggg agcgaagcg <210>9 <211>42 <212>DNA <213> 人工序列 <220>20192251<221>misc_feature <223> 引物 <400>9 gaaaagctgg gttgagaggg <210>10 <211>54 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>10 tcgagaaaaa acctcatcct <210>11 <211>51 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>11 gatccgcttc gctcccctcc <210>12 <211>38 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>12 gggaagacca cgcaagagac <210>13 <211>42 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>13cgaaaaagga tgaggttttt tc42ttttcgccct ctcaacccag cttttcccga ctcc54ggcgtctctt gcgtggtctt cccggagtcg g51gccggagggg gcgaagcg38gaacaccacg cttgagacgc cgaaaaagga tgaggttttt tc <210>14 <211>54 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>14 tcgagaaaaa acctcatcct ttttcggcgt ctcaagcgtg gtgttcccga ctcc <210>15 <211>49 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>15 cttccccttc accgctcccc actgatctgc acccctttcc tccccatac <210>16 <211>49 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>16 gtatggggag gaaaggggtg cagatcagtg gggagcggtg aaggggaag <210>17 <211>57 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <221>misc_feature <223> 引物 <400>17 cctgctagca tggactacaa agacgatgac gataaaatgg ccgggtggaa cgcctac4254494957