技术领域
本发明涉及一种吡啶类化合物的新用途，具体涉及一种吡啶类化合物在制备治疗分枝杆菌感染性疾病的药物中的用途。
背景技术
布鲁利坏死分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)可以引起严重的皮肤溃疡、坏死，甚至是失明和死亡，多被称为布鲁利坏死(Buruli Ulcer)，目前已经在非洲、澳大利亚、东南亚以及南美洲、日本等多个区域发现该疾病。对于该疾病的治疗手段主要是通过外科手术切除病患组织后再进行植皮，然而其治愈率仅16％到28％之间，必须要辅以药物治疗。世界卫生组织对该疾病的推荐的治疗药物是利福平和链霉素联合治疗8周左右进行辅助治疗。该疗法就是基于之前的小鼠模型中的实验结果。其他的疗法(目前还没有进入临床，主要是2016年才完成动物实验)主要是使用克拉霉素、贝达喹啉替代链霉素和利福平(或者同类药物利福喷丁)联合使用也需要治疗8周左右。
手术治疗该疾病的成本较高，并且治愈率也较低，必须要辅助药物治疗。世卫组织推荐的标准药物疗法中，链霉素需要长周期地每天注射给药，对病人不方便，给药途径因设备消毒不彻底感染风险高，病人依从性差。另外利福平和链霉素的毒副作用都较大，长期给药，患者依从性较差。现有可供选择的药物较少，均需要联合使用利福霉素类的药物，因此如果患者对该类药物耐药，所有疗法的治疗效果都会显著降低，并且利福平一类的药物会显著降低其他疾病治疗药物的药效，如艾滋病药物克力芝，两者一起使用会导致克力芝的抗病毒无效。克拉霉素联合利福平的长期治疗效果较差，仍然需要后期再使用链霉素和利福平进行巩固治疗。新抗结核药物贝达喹啉的毒副作用较大，FDA已经添加黑框限制使用，往往只有在其他药物无效的情况下，才建议用于耐药结核病人的治疗，尚未推荐治疗布鲁利坏死。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供吡啶类化合物在制备治疗分枝杆菌感染性疾病的药物中的用途，所述吡啶类化合物具有如下结构通式：
式中，R1代表5-Me、4-Me、6-Me、7-Me、5-OMe、5-Cl、5-Et、5-i-Pr或5-t-Butyl；
R2代表Me；
R3代表CF3、式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)或式(f)：
优选地，所述吡啶类化合物具有如下结构式：
优选地，所述分枝杆菌为布鲁利坏死分枝杆菌。
优选地，所述分枝杆菌为海分枝杆菌或麻风分枝杆菌。
优选地，所述药物为口服剂型或外用剂型。
优选地，所述口服剂型包括片剂、胶囊、颗粒和口服液；所述外用剂型包括药膏、凝胶、创可贴和药贴。
本发明的另一目的，在于提供一种治疗分枝杆菌感染性疾病的药物，所述药物包含吡啶类化合物以及药物学可接受的载体，所述吡啶类化合物具有如下结构通式：
式中，R1代表5-Me、4-Me、6-Me、7-Me、5-OMe、5-Cl、5-Et、5-i-Pr或5-t-Butyl；
R2代表Me；
R3代表CF3、式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)或式(f)：
优选地，所述吡啶类化合物具有如下结构式：
本发明中式(Ⅲ)所示的化合物简称为COMX；式(Ⅳ)所示的化合物简称为Q203。
优选地，所述分枝杆菌感染性疾病为布鲁利坏死病、海分枝杆菌感染性疾病或麻风病。
优选地，所述药物为口服剂型或外用剂型。
更优选地，所述口服剂型包括片剂、胶囊、颗粒和口服液；所述外用剂型包括药膏、凝胶、创可贴和药贴。
本发明所述吡啶类化合物包括吡唑并吡啶类化合物和咪唑并吡啶类化合物；所述吡唑并吡啶类化合物结构通式如式(Ⅰ)所示，所述咪唑并吡啶类化合物结构通式如式(Ⅱ)所示。
研究表明，吡唑并吡啶类和咪唑并吡啶类化合物起治疗作用的核心部位结构相似，且具有上述结构通式的吡唑并吡啶类化合物和咪唑并吡啶类化合物起治疗作用的核心部位为通式中的结构。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本申请发明人首次发吡唑并吡啶类化合物和咪唑并吡啶类化合物可有效治疗分枝杆菌感染性疾病，尤其是由布鲁利坏死分枝杆菌、海分枝杆菌和麻风分枝杆菌感染引起的疾病，且具有使用方便、见效快、使用剂量低和毒副作用低等优点。
附图说明
图1为COMX和Q203在体外对布鲁利坏死分枝杆菌发光值的动态抑制图。
图2为COMX治疗后，感染自发光布鲁利坏死分枝杆菌小鼠的足部发光值动态变化结果图。
图3为COMX治疗后，感染自发光布鲁利坏死分枝杆菌小鼠的足部组织发光检测结果图。
图4为COMX治疗第7天(治疗5天，隔一天后)感染自发光布鲁利坏死分枝杆菌小鼠足部的照片。
图5为Q203治疗后，感染自发光布鲁利坏死分枝杆菌小鼠的足部发光值动态变化结果图。
图6为COMX和Q203治疗4周后(治疗4周，间隔4周后)感染麻风分枝杆菌小鼠足部组织，通过RT-PCR检测计算的相对菌载量。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例研究本发明所述吡唑并吡啶类化合物和咪唑并吡啶类化合物在体外抑制布鲁利坏死分枝杆菌的作用。
(一)实验分组
Solvent组：给等体积的药物溶剂，作为对照；
吡唑并吡啶类化合物组：以式(Ⅰ)所示的骨架，各个化合物的R1、R2和R3的结构如表1所示：
表1 吡唑并吡啶类化合物结构式
化合物编号 R1 R2 R3 1 5-Me Me CF3 2 5-Me Me 式(a) 3 5-Me Me 式(b) 4 5-Me Me 式(c) 5 5-Me Me 式(d) 6 5-Me Me 式(e) 7 5-Me Me 式(f) 8 4-Me Me 式(f) 9 6-Me Me 式(f) 10 7-Me Me 式(f) 11 5-OMe Me 式(f) 12 5-Cl Me 式(f) 13 5-Et Me 式(f) 14 5-i-Pr Me 式(f) 15 5-t-Butyl Me 式(f)
咪唑并吡啶类化合物组：以式(Ⅱ)所示的骨架，各个化合物的R1、R2和R3的结构如表2所示：
表2 咪唑并吡啶类化合物结构式
上述所用吡唑并吡啶类和咪唑并吡啶类化合物溶解于DMSO中待用。
(二)实验步骤
1、自发光布鲁利坏死分枝杆菌的培养
将自发光布鲁利坏死分枝杆菌接入7H11固体培养基，30℃培养58天；从平板上挑取单菌落使用发光检测仪检测相对光单位(RLU)，将确认发光的单菌落接入50mL的7H9液体培养基培养7天左右，用无菌生理盐水重悬后，用300目的细胞筛网过滤，滤后接近形成单个存在的菌悬液，用于检测实验。
2、加药共孵育连续检测
取96孔板，在左边第一竖排中加入已准备好的化合物，使用移液枪将药物与菌液吹打混匀之后，再在使用排枪从左到右，进行2倍梯度稀释。检测药物杀菌或抑菌效果：孵育至第5天后，将96孔板放入酶标仪后，检测各组发光值。
(三)实验结果
化合物对细菌的生长抑制率＝1-(加药组检测值/溶剂对照组的发光值)％
最低抑菌浓度为化合物抑制率高于90％时的最低浓度。
吡唑并吡啶类化合物组和咪唑并吡啶类化合物组最低抑菌浓度检测结果如表3所示：
表3 实验结果
由上述结果可知，吡唑并吡啶和咪唑并吡啶类系列化合物对布鲁利坏死分枝杆菌均具有较好的抑制活性。其中编号11的吡唑并吡啶化合物(即COMX)和编号27的咪唑并吡啶类化合物(即Q203)的抑菌活性最佳。
实施例2
本实施例研究COMX和Q203在体外抑制布鲁利坏死分枝杆菌的作用。
(一)实验分组
Solvent组：给等体积的药物溶剂，作为对照；
COMX组：浓度为1μg/mL、0.2μg/mL、0.04μg/mL、0.008μg/mL、0.0016μg/mL、0.00032μg/mL；
Q203组：浓度为4μg/mL、0.8μg/mL、0.16μg/mL、0.03μg/mL、0.005μg/mL；0.001μg/mL
上述所用COMX和Q203溶解于DMSO中待用。
(二)实验步骤
1、自发光布鲁利坏死分枝杆菌的培养，实验步骤同实施例1。
2、加药共孵育连续检测
向每个EP管中分别加入198μL菌液和2μL药物已准备好的药物，同时，使用移液枪将吹打药物与菌液混匀。检测药物杀菌或抑菌效果：将EP管放入发光检测仪后，按检测键，记录每个EP管的RLUs，记第一次检测为day 0。然后每隔1天检测一次，直至检测到第5天。
(三)实验结果
从给药开始时，定时检测不同组的相对发光值，每个时间点相对发光值越小，说明药物抑菌效果越明显，反之亦然。
检测结果如图1所示，结果表明：COMX组和Q203均可以显著抑制布鲁利坏死分枝杆菌，两者的最低抑菌浓度为0.001μg/mL左右，抑菌活性非常好。
实施例3
本实施例研究COMX和Q203在小鼠体内对布鲁利坏死分枝杆菌的抑制作用。
(一)动物分组及给药
选择6周左右的Balb/C鼠，往小鼠后脚部注射感染自发光布鲁利坏死分枝杆菌，感染10天后开始给药治疗，给药分组如下，每组10只小鼠：
untreated组：感染后给等体积的去离子水，作为阴性对照；
uninfected组：未感染细菌组，作为检测的发光的背景基线；
利福平+链霉素组：灌胃给利福平10mg/kg和皮下注射给链霉素150mg/kg；
COMX组：COMX灌胃给药量分别为50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg、6.25mg/kg、3.2mg/kg、1.6mg/kg、0.8mg/kg、0.4mg/kg；
Q203组：Q203灌胃给药量分别为25mg/kg、6.25mg/kg、1.6mg/kg；
每种药物的灌胃体积为0.2mL/次/只，每天均只给药一次，连续治疗5天。
(二)指标检测
按照设计时间点检测小鼠活体发光值，在第七天麻醉小鼠后颈椎脱臼法处死，取脚部组织研磨，测定组织发光值，发光值越小，说明药物治疗效果越好，反之则差。
(三)实验结果
1、活体小鼠足部的发光值连续检测结果如图2所示，由图2可知，COMX低至0.4mg/kg就已经表现出明显的抗布鲁利坏死分枝杆菌的活性。仅0.8mg/kg的COMX治疗效果优于10mg/kg的利福平和150mg/kg的链霉素联合使用，说明COMX具有很好的的抗布鲁利坏死分枝杆菌活性，并且在体内的起效要比目前常用的药物更快。停药2天后，一线疗法(RIF10+STR150)小鼠活体发光值出现反弹，而COMX在3.1mg/kg以上未出现反弹。
2、感染小鼠的足部组织发光检测结果如图3所示，由图3可知，治疗5天后，标准一线疗法(RIF10+STR150)治疗组仍然可以检测到较高的发光值，而12.5mg/kg以上的COMX治疗组，甚至都已经达到背景值(和未感染组数值一样)，表明COMX可以非常显著地缩短疗程。
3、在第7天(治疗5天，隔一天后)拍摄的小鼠足部的照片，结果由图4所示，由图4可以明显看出，COMX治疗组的足部基本恢复正常(和uninfected组已经基本一致)，说明COMX对布鲁利坏死具有非常好的治疗效果。
4、COMX和Q203对布鲁利坏死分枝杆菌的抑制作用机制类似，Q203在小鼠体内对布鲁利坏死分枝杆菌的抑制作用实验结果见图5，Q203对布鲁利坏死也具有非常好的治疗效果。
实施例4
本实施例研究COMX和Q203在小鼠体内对麻风分枝杆菌的抑制作用。
(一)动物分组及给药
选择雌性C57BL/6鼠，往小鼠脚部注射感染麻风分枝杆菌，感染12周后开始给药治疗，给药分组如下，每组20只小鼠：
untreated组：给等体积的去离子水，作为阴性对照；
利福平组：灌胃给药量为利福平10mg/kg；
COMX组：给药COMX，灌胃给药，剂量为25mg/kg；
Q203组：给药Q203，灌胃给药，剂量为25mg/kg；
每种药物的灌胃量为0.2mL/次/只，每天均只给药一次，连续治疗4周，每周治疗5天。
(二)指标检测
所有组别治疗结束后，等待4周，麻醉颈椎脱臼法处死小鼠，使用剪刀小心取出小鼠感染脚部的软组织，提取组织基因组，纯化后进行荧光定量PCR检测，上游检测引物序列为：5’-GCAGTATCGTGTTAGTGAACAGTGCA-3’，下游检测引物序列为5’-CGCTAGAAGGTTGCCGTATGTGC-3’。以确定含量的麻风分枝杆菌悬液作为标准对照，根据荧光定量PCR结果曲线，换算出各组小鼠的组织中菌量。
(三)实验结果
检测结果如图6所示，吡唑并吡啶类化合物(以COMX为代表)和咪唑并吡啶类化合物(以SQ203为代表)的治疗组的小鼠菌载量低于对照组和10mg/kg的利福平阳性对照组。明COMX和SQ203对布麻风病具有非常好的治疗效果。
实施例5
本实施例研究COMX和Q203在体外对海分枝杆菌的抑制作用。
(一)实验分组
Solvent组：给等体积的药物溶剂，作为对照；
COMX组：浓度为0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mL；
Q203组：浓度为0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mL
上述所用COMX和Q203溶解于DMSO中待用。
(二)实验步骤
1、自发光海分枝杆菌的培养，将自发光海分枝杆菌接入7H11固体培养基，30℃培养7天；从平板上挑取单菌落使用发光检测仪检测相对光单位(RLU)，将确认发光的单菌落接入50mL的7H9液体培养基培养3天左右，用无菌生理盐水重悬后，用300目的细胞筛网过滤，滤后接近形成单个存在的菌悬液，用于检测实验。
2、加药共孵育连续检测
向每个EP管中分别加入198μL菌液和2μL药物已准备好的药物，同时，使用移液枪将吹打药物与菌液混匀。孵育到24小时后，检测药物杀菌或抑菌效果：将EP管放入发光检测仪后，等待1-2秒，等到外界的光淬灭，按检测键，记录每个EP管的RLUs。
(三)实验结果
化合物对细菌的生长抑制率和最低抑菌浓度的计算方法同实施例1。海分枝杆菌和布鲁利坏死分枝杆菌的亲缘性很高，两者的基因组相似率达到了99％。结果表明：COMX组和Q203均可以显著抑制海分枝杆菌，两者的最低抑菌浓度均为0.01μg/mL左右，抑菌活性非常好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。