CD146作为预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物靶点的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310295008.0 (22)申请日 2013.07.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104288764 A (43)申请公布日 2015.01.21 (73)专利权人 中国科学院生物物理研究所 地址 100101 北京市朝阳区大屯路15号 (72)发明人 阎锡蕴 王平 罗永挺 段红霞 冯静 杨东玲 宋丽娜 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (51)Int.Cl. A61K 39/395(2006.01)。

2、 A61K 48/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 27/02(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (56)对比文件 G Furstenberger et alReal-time PCR of CD146 mRNA in peripheral blood enables the relative quantification of circulating endothelial cells and is an indicator of angiogenesis. British Journal o。

3、f Cancer .2005,第93卷793-798. 吴国荣等.外周血CD146在诊断2型糖尿病患 者微血管病变中的临床应用. 中华老年心脑血 管病杂志 .2009,第11卷(第1期),摘要. 吴国荣等.外周血CD146在诊断2型糖尿病患 者微血管病变中的临床应用. 中华老年心脑血 管病杂志 .2009,第11卷(第1期),摘要. Zhaoqing Wang and Xiyun Yan.CD146, a multi-functional molecule beyond adhesion. Cancer Letters .2013,第330卷(第 2期),摘要. 审查员 马艳林 (54)发明名。

4、称 CD146作为预防和/或治疗缺血性眼部疾病 的药物靶点的应用 (57)摘要 本发明公开了CD146的一种新用途。 该新用 途是CD146作为治疗缺血性眼部疾病的药物靶点 的应用。 本发明首次提出CD146是缺血性眼部疾 病的药物靶点。 实验证明， CD146在患有缺血性眼 部疾病小鼠的视网膜中过度表达； 而CD146被特 异性敲除后能够显著抑制发病小鼠视网膜血管 的迂曲、 扩张和渗漏， 进而减轻疾病的严重程度。 抗CD146的抗体AA98及抑制其表达的microRNA miR-329也能有效预防和治疗缺血性眼部疾病。 AA98或miR-329能够减轻发病鼠的视网膜血管迂 曲扩张、 渗漏以及。

5、血管呈簇状异常生长的严重程 度,使视网膜形态与结构正常化， 从而缓解眼底 出血、 视力模糊和视野缺失等临床症状， 并抑制 疾病的发生发展。 这些结果表明CD146是缺血性 眼部疾病的重要治疗靶点， 对今后的该类疾病的 药物开发和预防治疗具有重要意义。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 104288764 B 2017.04.05 CN 104288764 B 1.蛋白CD146作为靶点在开发或筛选或制备用于预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药 物中的应用； 所述缺血性眼部疾病为早产儿视网膜病变、 年龄相关性黄斑病变或新生血管 性青光眼。 2.蛋白CD146作为靶点在制备用于预。

6、防和/或治疗缺血性眼部疾病的筛药模型中的应 用； 所述缺血性眼部疾病为早产儿视网膜病变、 年龄相关性黄斑病变或新生血管性青光眼。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于： 所述缺血性眼部疾病为缺血性眼底病 变。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述缺血性眼底病变为视网膜病变或脉络 膜病变。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述视网膜病变为视网膜血管新生或视网 膜血管迂曲扩张或视网膜血管渗漏或视网膜出血。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述脉络膜病变为脉络膜血管新生或脉络 膜血管迂曲扩张或脉络膜血管渗漏或脉络膜出血。 权 利 要 求 书 1/1。

7、 页 2 CN 104288764 B 2 CD146作为预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物靶点的应用 技术领域 0001 本发明涉及CD146作为预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物靶点的应用。 背景技术 0002 缺血可引起多种代谢物质的缺乏， 但最为紧急、 损害最重的病变是由缺氧所致。 在 绝大多数情况下， 缺血性病变的核心为缺氧性损害。 大量研究报道， 视网膜和脉络膜缺血、 缺氧是缺血性眼部疾病的重要驱动因素， 是导致视力下降和丧失的重要原因(1,2)。 常见的 该类眼部疾病包括早产儿视网膜病变 （retinopathy of prematurity,ROP） 、 年龄相关性黄 斑病变 。

8、（age-related macular degeneration,AMD） 、 糖尿病视网膜病变 （diabetic retinopathy,DR） 、 新生血管性青光眼 （neovascular glaucoma,NVG） 等。 上述疾病在全球发 病率呈上升趋势， 是儿童、 成年人和老年人各年龄段致盲的首要原因(3-6)。 0003 氧诱导的视网膜病变小鼠和大鼠模型 （OIR） 是经典的缺血性眼部疾病的动物模 型。 OIR模型诱导过程中， 鼠眼睛组织内的缺血缺氧导致眼底血管异常成簇状生长， 血管迂 曲、 扩张和渗漏。 这些缺血性眼部病变会导致眼底出血、 视力模糊和视野缺失等临床症状。 （2。

9、， 7） 0004 CD146是一种细胞粘附分子， CD146是I型膜蛋白， 属于免疫球蛋白超家族。 0005 1.Dorrell M,Uusitalo-Jarvinen H,Aguilar E,Friedlander M.2007.Ocular neovascularization:basic mechanisms and therapeutic advances .Surv Ophthalmol52Suppl1:S3-19. 0006 2.Sapieha P,Joyal JS,Rivera JC,Kermorvant-Duchemin E,Sennlaub F,Hardy P,Lachap。

10、elle P,Chemtob S.2010.Retinopathy of prematurity:understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life.J Clin Invest120:3022- 3032. 0007 3.Gilbert C.2008.Retinopathy of prematurity:a global perspective of the epidemics,population of babies at risk and implications for control.Early Hum。

11、 Dev84:77-82. 0008 4.Xu J,Wei WB,Yuan MX,Yuan SY,Wan G,Zheng YY,Li YB,Wang S,Xu L,Fu HJ, Zhu LX,Pu XL,Zhang JD,Du XP,Li YL,Ji Y,Gu XN,Li Y,Pan SF,Cui XL,Bai W,Chen YJ,Wang ZM,Zhu QS,Gao Y,Liu de Y,Ji YT,Yang Z,Jonas JB.2012.Prevalence and risk factors for diabetic retinopathy:the Beijing Communities。

12、 Diabetes Study6.Retina32:322-329. 0009 5 .Cheung CM ,Tai ES ,Kawasaki R ,Tay WT ,Lee JL ,Hamzah H ,Wong TY.2012.Prevalence of and risk factors for age-related macular degeneration in a multiethnic Asian cohort.Arch Ophthalmol130:480-486. 0010 6.Olmos LC,Lee RK.2011.Medical and surgical treatment of。

13、 neovascular glaucoma.Int Ophthalmol Clin51:27-36. 说 明 书 1/6 页 3 CN 104288764 B 3 0011 7.Grossniklaus HE,Kang SJ,Berglin L.2010.Animal models of choroidal and retinal neovascularization.Prog Retin Eye Res29:500-519. 发明内容 0012 本发明的目的是提供一种CD146作为靶点在制备预防和/或治疗缺血性眼部疾病 的药物中的应用。 0013 上述应用中， 所述缺血性眼部疾病可为早产儿视。

14、网膜病变、 糖尿病视网膜病变、 年 龄相关性黄斑病变或新生血管性青光眼。 0014 上述应用中， 所述缺血性眼部疾病可为缺血性眼底病变。 0015 上述应用中， 所述缺血性眼底病变可为视网膜病变或脉络膜病变。 0016 上述应用中， 所述视网膜病变可为视网膜血管迂曲扩张或视网膜血管渗漏或视网 膜出血。 0017 上述应用中， 所述视网膜病变可为视网膜血管新生或视网膜血管从视网膜迁移到 玻璃体腔。 0018 上述应用中， 所述脉络膜病变可为脉络膜血管迂曲扩张或脉络膜血管渗漏或脉络 膜出血。 0019 上述应用中， 所述脉络膜病变可为脉络膜血管新生。 0020 本发明首次提出CD146是缺血性眼部。

15、疾病的药物靶点。 实验证明， CD146在患有缺 血性眼部疾病小鼠的视网膜中过度表达； 而CD146被特异性敲除后能够显著抑制发病小鼠 视网膜血管的迂曲、 扩张和渗漏， 进而减轻疾病的严重程度。 抗CD146的抗体AA98及抑制其 表达的microRNA miR-329也能有效预防和治疗缺血性眼部疾病。 AA98或miR-329能够减轻 发病鼠的视网膜血管迂曲扩张、 渗漏以及血管呈簇状异常生长的严重程度,使视网膜形态 与结构正常化， 从而缓解眼底出血、 视力模糊和视野缺失等临床症状， 并抑制疾病的发生发 展。 这些结果表明CD146是缺血性眼部疾病的重要治疗靶点， 对今后的该类疾病的药物开发 。

16、和预防治疗具有重要意义。 附图说明 0021 图1为正常小鼠和OIR模型小鼠的视网膜表型， 显示OIR小鼠模型构建成功。 0022 图2为在OIR小鼠的视网膜中， CD146的mRNA表达显著上调。 0023 图3为在OIR小鼠的视网膜中， CD146的蛋白表达显著上调。 0024 图4为CD146基因特异性敲除后能够明显减轻OIR小鼠的发病程度。 0025 图5为miR-329基因治疗显著抑制OIR小鼠视网膜血管的迂曲、 扩张和出血。 0026 图6为miR-329基因治疗能够抑制OIR小鼠视网膜中CD146的过度表达。 0027 图7为抗CD146抗体AA98能够预防OIR小鼠疾病的发生发。

17、展。 0028 图8为抗CD146抗体AA98治疗能够显著减轻OIR小鼠的发病程度。 0029 图9为抗CD146抗体AA98能够特异性识别CD146。 具体实施方式 0030 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 说 明 书 2/6 页 4 CN 104288764 B 4 0031 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0032 下述实施例中进行的视网膜荧光铺片实验均按照如下步骤进行： 1、 将小鼠麻醉， 左心室心脏灌流600 l50mg/ml的FITC荧光标记的dextran， 此时小鼠的全身血管都灌注有 荧光分子。 2、 将小鼠。

18、的眼睛剥离， 4%多聚甲醛固定1小时。 3、 剥离视网膜， 并用剪刀剪成四叶 草状。 用体式荧光显微镜观察并拍照。 0033 实施例1、 CD146在患有缺血性眼部疾病的小鼠视网膜上过度表达 0034 一、 构建OIR小鼠模型 0035 我们以氧诱导的视网膜病变小鼠 （OIR小鼠） 为缺血性眼部疾病的动物模型。 将出 生后第7天的C57BL/6J乳鼠 （P7） 和母鼠放入含75%氧气的高氧培养箱中5天， 在第12天 （P12） 将其从氧箱中取出， 放在正常氧气 （21%氧气） 中饲养， 造成相对低氧的环境。 在第17天 （P17） 的乳鼠即为模型鼠。 0036 将正常鼠 （未经任何诱导的C57。

19、BL/6J小鼠） 和模型鼠进行视网膜荧光铺片实验。 结 果如图1所示。 结果显示， 与正常鼠相比， 模型鼠 （OIR） 的视网膜血管呈现明显的迂曲、 扩张 和渗漏， 并成血管簇状异常生长。 视网膜血管的荧光渗漏点表示视网膜出血严重。 以上视网 膜形态结构的异常表示模型构建成功。 0037 二、 CD146的实时荧光定量PCR 0038 将出生后第17天 （P17） 的模型鼠和正常鼠的视网膜剥离， 利用实时荧光定量PCR对 CD146进行定量分析。 0039 （一） 取P17的模型鼠的两个视网膜为一个样品， 每个样品加入1ml Trizol， 用匀浆 器将视网膜打碎， 室温放置5分钟。 同样取正。

20、常鼠的两个视网膜为一个样品进行上述处理。 0040 （二） 将两个样品分别移入EP管， 每管加入200 l三氯甲烷， 用手上下颠倒EP管使管 中的液体乳化。 0041 （三） 将EP管4， 12000rpm离心15分钟。 0042 （四） 分别将上层透明液体转移至新管， 加入一倍体积的预冷异丙醇混匀， -20静 置2小时。 0043 （五） 4， 12000rpm离心15分钟， 弃上清。 0044 （六） 将沉淀分别用70%乙醇洗一次并再次离心， 得到两种沉淀， 即P17的模型鼠和 正常鼠的视网膜RNA。 将两种沉淀晾干。 0045 （七） 分别加入适量无RNA酶的水溶解RNA。 0046 （。

21、八） 分别取2 g P17的模型鼠和正常鼠的RNA反转录为cDNA。 0047 （九） 利用两种cDNA进行实时荧光定量PCR （方法按照SYBR green PCR master mix 试剂盒的说明书） ， GAPDH作为表达内参。 0048 0049 PCR扩增条件： 95， 5分钟； 9530s， 5530s， 7220s， 40个循环。 0050 （十） 用2- Ct方法进行定量分析。 0051 结果如图2所示。 结果表明， 与正常鼠相比， P17模型鼠的视网膜中CD146的mRNA的 表达明显上调。 说 明 书 3/6 页 5 CN 104288764 B 5 0052 三、 We。

22、stern-blot检测CD146蛋白表达量。 0053 结果如图3所示， 显示p17模型鼠的视网膜中CD146的蛋白的表达明显上调。 GADPH 为表达内参。 0054 实施例2、 CD146基因特异性敲除抑制缺血性眼部疾病的发生发展 0055 CD146内皮特异性敲除小鼠 （CD146EC-KO） 是将正常C57BL/6J小鼠中的CD146编码基 因敲除得到的小鼠， 该小鼠在 “Duan H,Xing S,Luo Y,Feng L,Gramaglia I,Zhang Y,Lu D,Zeng Q,Fan K,Feng J,Yang D,Qin Z,Couraud PO,Romero IA,W。

23、eksler B,Yan X.2013.Targeting endothelial CD146attenuates neuroinflammation by limiting lymphocyte extravasation to the CNS.Sci Rep3:1687.” 中公开过。 0056 本实施例中的非敲除小鼠 （WT） 为野生型的C57BL/6J小鼠， 记作正常鼠。 0057 一、 将CD146特异性敲除小鼠 （CD146EC-KO） 和非敲除小鼠 （WT） 均构建OIR模型。 0058 方法如实施例1的步骤一。 0059 二、 视网膜荧光铺片实验。 0060 图4所示为正常CD。

24、146EC-KO、 正常WT， OIR-CD146EC-KO和OIR-WT的视网膜表型。 0061 结果表明， 与WT小鼠相比， OIR-WT小鼠的视网膜血管呈现明显的迂曲、 扩张和渗漏 并成血管簇状异常生长， 视网膜出血严重。 与OIR-WT小鼠相比， OIR-CD146EC-KO小鼠视网膜血 管迂曲、 扩张、 渗漏和异常成簇状生长的严重程度明显减轻， 视网膜出血症状也减轻， 呈现 较好的视网膜形态。 0062 上述实验表明， CD146被敲除后能够有效减缓OIR小鼠疾病的严重程度， 揭示CD146 在缺血性眼部疾病视网膜中的过度表达能够促进疾病的发展。 0063 实施例3、 miR-329。

25、能够有效治疗缺血性眼部疾病 0064 一、 构建OIR小鼠疾病模型： 与实施例1中步骤一相同。 0065 二、 miR-329注射后显著减轻了OIR小鼠疾病的严重程度 0066 在乳鼠出生后第12天， 将修饰过的鼠miR-329 （5 g/ul， 1 l） 、 对照miRNA （5 g/ l， 1 l） 或溶剂对照0.9%NaCl （1 l） 的水溶液注射到乳鼠眼睛玻璃体腔内。 在第17天， 对乳鼠视 网膜进行荧光铺片分析。 0067 小鼠miR-329序列： 5 -AACACACCCAGCUAACCUUUUU-3 （SEQ ID No.1） ； 0068 对照miRNA为线虫miR-239b。

26、， 与人、 小鼠、 大鼠的miRNA具有最小同源性。 0069 对照miRNA序列： 5 -UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3 （SEQ ID No.2） ； 0070 以下实验均使用双链的小鼠miR-329和对照miRNA， 并分别对其序列进行如下修 饰： 2 -甲氧基修饰， 硫代硫酸骨架修饰和序列5 端连接胆固醇。 0071 上述修饰过的小鼠miR-329序列和修饰过的对照miRNA序列均购自广州锐博生物 公司。 0072 视网膜荧光铺片结果如图5所示， 结果显示， 与对照miRNA或溶剂对照0.9%NaCl相 比， miR-329注射组小鼠的视网膜呈现较好的结构， 表现为显。

27、著减少的视网膜血管的迂曲、 扩张及视网膜出血点的面积。 这种视网膜形态的正常化， 可以缓解眼底出血、 视力模糊和视 野缺失等临床症状， 减轻疾病的发病程度。 0073 三、 miR-329注射后抑制体内CD146的过度表达 0074 检测视网膜组织中CD146蛋白的相对表达量。 结果如图6所示， 表明miR-329可以显 说 明 书 4/6 页 6 CN 104288764 B 6 著抑制OIR小鼠视网膜中CD146的过度表达。 0075 综合以上结果， 抑制CD146表达的miR-329基因治疗可以显著减轻缺血性眼部疾病 的严重程度， 揭示CD146是该疾病的重要靶点。 0076 实施例4、。

28、 抗CD146抗体预防和治疗缺血性眼部疾病 0077 本实施例中使用的抗体AA98见专利 “CN1124284C” 。 抗体重链和轻链可变区的序列 分别见专利第2页和第3页。 0078 一、 抗CD146抗体AA98预防OIR大鼠疾病的发生发展 0079 （一） 构建OIR大鼠疾病模型 0080 将出生后第7天的SD大鼠乳鼠 （P7） 和母鼠放入含75%氧气的高氧培养箱中5天， 在 第12天 （P12） 将其从氧箱中取出， 放在正常氧气 （21%） 中饲养， 造成相对低氧的环境， 继续饲 养。 在第18天 （P18） 的乳鼠即为模型鼠。 0081 （二） 玻璃体腔注射 0082 在乳鼠出生后第。

29、7天， 将AA98 （1 g/ l， 1 l） ， 对照mIgG （1 g/ l， 1 l） 分别注射到乳 鼠的左、 右眼睛的玻璃体腔内， 再按照构建OIR大鼠模型的构建方法进行饲养， 即为AA98组 实验鼠和mIgG组实验鼠。 不注射的乳鼠按照OIR大鼠模型的构建方法进行饲养， 即为模型 鼠。 0083 在第18天将AA98组、 mIgG组、 模型鼠和正常鼠， 分别剥离眼球进行实验。 0084 （三） 视网膜荧光铺片实验 0085 实验结果如图7所示。 结果表明， 与正常鼠相比， 模型鼠 （OIR） 的视网膜血管呈现明 显的迂曲、 扩张和渗漏。 视网膜血管的荧光渗漏点表示视网膜出血严重。 以。

30、上视网膜形态结 构的异常表示模型构建成功。 0086 与mIgG组和模型组相比， AA98注射组显著减轻了视网膜血管的迂曲、 扩张和渗漏， 显著减轻了视网膜出血， 使其形态结构正常化。 图7中 、 、 、 展示了不同拍照视野下小 鼠视网膜的表型。 0087 这些结果表明AA98可以有效预防缺血性眼部疾病的发生发展。 0088 二、 抗CD146抗体AA98治疗能够有效减轻OIR大鼠疾病的严重程度。 0089 （一） 构建OIR大鼠模型： 与实验一中相同。 0090 （二） 玻璃体腔注射 0091 在乳鼠出生后第15天， 将1 l1 g/ l的AA98， 对照mIgG （1 g/ l， 1 l）。

31、 分别注射到乳 鼠的左、 右眼睛的玻璃体腔内， 再将注射后的鼠按照OIR大鼠模型的构建方法进行饲养即为 AA98组实验鼠和mIgG组实验鼠。 不注射的乳鼠按照OIR大鼠模型的构建方法进行饲养即为 模型鼠。 0092 在第20天将AA98组、 mIgG组、 模型鼠和正常鼠， 分别剥离眼球进行实验。 0093 （三） 视网膜荧光铺片实验 0094 方法如实施例2的步骤三。 实验结果如图8所示。 0095 结果表明， 与模型组和mIgG组相比， AA98注射后显著减轻了视网膜血管的迂曲和 扩张， 并且减轻了视网膜出血。 这种视网膜形态结构的正常化， 可以缓解眼底出血、 视力模 糊和视野缺失等临床症状。

32、， 减轻疾病的严重程度。 图8中 、 展示了不同拍照视野下小鼠视 网膜的表型。 说 明 书 5/6 页 7 CN 104288764 B 7 0096 这些结果表明AA98可以有效治疗缺血性眼部疾病。 0097 三、 抗CD146抗体AA98特异性识别CD146 0098 用免疫印迹方法检测抗体AA98对鼠内皮瘤细胞系SEND中CD146的识别。 结果如图9 所示， 显示抗体AA98仅能识别CD146， 说明抗体AA98是特异作用于CD146的。 图中， 抗CD146的 抗体AA7为正对照； 二抗交叉为不加一抗， 只加二抗的负对照， 排除了AA98对CD146识别的非 特异性。 0099 综合以上结果， 进一步确定了以CD146作为靶点可以有效预防和治疗缺血性眼部 疾病， CD146是缺血性眼部疾病的一个重要靶点。 说 明 书 6/6 页 8 CN 104288764 B 8 0001 序 列 表 1/1 页 9 CN 104288764 B 9 图1 图2 图3 图4 图5 图6 图7 图8 说 明 书 附 图 1/2 页 10 CN 104288764 B 10 图9 说 明 书 附 图 2/2 页 11 CN 104288764 B 11 。