技术领域
本发明属于生物医药研究领域，具体涉及IDNK抑制剂在制备肝癌治疗药物中的用途。
背景技术
目前，手术切除是肝癌主要的治疗手段，但是，肝癌病人的术后复发率高，预后差， 据统计约80％的肝癌患者死于复发转移，且大部分肝癌患者在确诊时已经发生远端器官转 移。目前针对肝癌患者复发转移的早期诊断及治疗均缺乏有效手段，其根本原因在于对肝癌 复发转移的机理尚不明确。
肿瘤转移机制的研究一直是肿瘤学研究中的前沿领域。大量研究证实，肿瘤的转移并 非随机，而是具有选择性、器官嗜性。Paget等提出的著名“种子与土壤”假说：“种子” 播散本身是随机行为，但特定的组织或器官的微环境适合某些“种子”的存活和生长，为其 提供生存和发展的“土壤”，由此使“种子”的转移表现出组织和器官特异性。当前研究者 多关注肿瘤的本身，而对肿瘤的土壤及微环境关注较少。其实在肝癌靶向转移的过程中，特 定的“土壤”当前被认为在肝癌转移过程中发挥了重要的作用。因此寻肿瘤的找特定土壤、 新微环境迫在眉睫。
IDNK基因编码一种葡糖酸激酶，是一种需Mg2+的典型的磷酸转移酶，这种激酶参与 了d-葡糖酸酯降解过程(PMID:23067238)，该蛋白在肾脏，肝脏，小肠，十二指肠等器官 有较高的表达(PMID 24309898)。并且该基因位于急性髓性白血病del(9q)的基因缺失 区。目前发现IDNK基因编码的激酶代谢葡糖酸的特点与在原核生物中的作用类似，推测该 蛋白可能行使了人体内的葡糖酸分解代谢的作用。但是目前未有针对IDNK在细胞中的作用 功能的研究。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供IDNK抑制剂在制备肝 癌治疗药物中的用途。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了IDNK抑制剂用于制备肝癌治疗药物的用途。
进一步地，所述肝癌治疗药物至少具有以下功用之一：
抑制肝癌细胞增殖、降低肝癌细胞活力、升高G1期肝癌细胞以及G2/M期肝癌细胞比 例、降低S期肝癌细胞比例、导致肝癌细胞发生G1期阻滞以及G2/M期阻滞、促进肝癌细 胞凋亡、抑制肝癌肿瘤生长。
进一步地，所述IDNK抑制剂是指对IDNK具有抑制效果的分子。
对于IDNK具有抑制效果包括但不限于：抑制IDNK活性，或者抑制IDNK基因转录或 表达。
所述IDNK抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的，所述IDNK抑制剂可以为siRNA或shRNA。
所述肝癌治疗药物必然包括IDNK抑制剂，并以IDNK抑制剂作为前述功用的有效成 分。
所述肝癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为IDNK抑制剂，亦可包含其他 可起到类似功用的分子。
亦即，IDNK抑制剂为所述肝癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述肝癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述肝癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各 种物质形式。
所述肝癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第二方面，提供了一种治疗肝癌的方法，为向对象施用IDNK抑制剂。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的肝癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动 物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、 猿或人。所述肝癌细胞可以为离体肝癌。
所述对象可以是罹患肝癌的患者或者期待治疗的肝癌的个体。或者所述对象为肝癌患 者或者期待治疗肝癌的个体的肝癌细胞。
所述IDNK抑制剂可以在接受肝癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第三方面，提供一种肝癌治疗药物，包括有效剂量的IDNK抑制剂。
进一步地，所述肝癌治疗药物，包括有效剂量的IDNK抑制剂及药用载体。
所述肝癌治疗药物必然包括IDNK抑制剂，并以IDNK抑制剂作为前述功用的有效成 分。
所述肝癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为IDNK抑制剂，亦可包含其他 可起到类似功用的分子。
亦即，IDNK抑制剂为所述肝癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述肝癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述肝癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种 物质形式。
所述肝癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第四方面，提供一种肝癌联合治疗药物组合，包括有效量的IDNK抑制剂和至 少一种其他肝癌治疗药物。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将IDNK抑制剂和其他肝癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不 同，给药途径亦可相同或不同。
当其他肝癌治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他肝癌治疗药物为化学药 物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各 化学药物的已知给药途径给药。
二)将IDNK抑制剂和其他肝癌治疗药物配置成复方制剂，在将IDNK抑制剂和其他肝 癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明的第五方面，提供一种治疗肝癌的方法，为向对象施用有效量的IDNK抑制剂 以及向对象施用有效量的其他肝癌治疗药物和/或向对象实施其他肝癌治疗手段。
可以同步地或顺序地给予有效量的IDNK抑制剂和至少一种有效量的其他肝癌治疗药 物。
基于IDNK为本发明首次发现的肝癌治疗靶点，在与IDNK抑制剂以外的其他肝癌治疗 药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于肝癌的治疗作用。
其他的肝癌治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
所述IDNK抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他肝癌治疗药物可以是 胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。
本发明的第六方面，提供IDNK抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的 用途：抑制肝癌细胞增殖、降低肝癌细胞活力、升高G1期肝癌细胞以及G2/M期肝癌细胞 比例、降低S期肝癌细胞比例、导致肝癌细胞发生G1期阻滞以及G2/M期阻滞、促进肝癌 细胞凋亡、抑制肝癌肿瘤生长。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究，首次研究发现抑制IDNK表达，可显著影响肝癌细胞 BEL-7404细胞的增殖，影响细胞周期的分布，并促进细胞的凋亡。表明该基因可能是一个 促进肝癌发生发展的一个关键功能基因，可能作为一个肝癌的潜在治疗靶点。
附图说明
图1：慢病毒感染BEL-7404细胞荧光图片，上部图片为感染shCtrl慢病毒组，下部 为感染shIDNK干扰慢病毒组，左侧为明场照片，右侧为荧光照片。
图2A：shIDNK敲减效率检测，shIDNK慢病毒显著抑制BEL-7404细胞中IDNK基 因在mRNA水平的表达量，柱状结果以平均值±SD显示，**表示p<0.01。
图2B：shIDNK敲减效率检测，Western Blot图示，干扰靶点对IDNK的外源表达在 蛋白水平有敲减作用。
图3A：Celigo细胞计数法验证IDNK基因对细胞增殖影响，Celigo连续5天记录细胞 图片。
图3B：Celigo细胞计数法验证IDNK基因对细胞增殖影响，shRNA慢病毒感染 BEL-7404细胞，shIDNK组与shCtrl对照组细胞数目随时间变化的曲线。
图3C：Celigo细胞计数法验证IDNK基因对细胞增殖影响，shRNA慢病毒感染 BEL-7404细胞，shIDNK组与shCtrl对照组细胞数量的变化倍数随时间变化的对比。
图4A：MTT法检测IDNK基因对细胞增殖活力的影响，shRNA慢病毒感染BEL-7404 细胞，培养5天后，经MTT处理4小时，shIDNK组与shCtrl对照组在酶标仪对波长490nm 的光的吸收率随时间变化的对比。OD490在这里反映了具有活力的细胞的数量。
图4B：MTT法检测IDNK基因对细胞增殖活力的影响，shRNA慢病毒感染BEL-7404 细胞，培养5天后，经MTT处理4小时，shIDNK组与shCtrl对照组在酶标仪对波长490nm 的光的吸收率变化倍数随时间变化的对比。OD490在这里反映了具有活力的细胞的数量。
图5A：流式细胞周期检测shIDNK对BEL-7404细胞细胞周期的影响，为细胞周期结 果示意图。
图5B：流式细胞周期检测shIDNK对BEL-7404细胞细胞周期的影响，柱状结果以细胞百 分比平均值±SD显示，**表示p<0.01。
图6A：Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shIDNK对BEL-7404细胞凋亡的影响，为 流式细胞凋亡示意图。
图6B：Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shIDNK对BEL-7404细胞凋亡的影响，柱 状结果以细胞百分比平均值±SD显示，**表示p<0.01。
具体实施方式
本发明的发明人研究发现，设计针对IDNK基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒， 对IDNK基因进行敲减后，会显著影响肝癌细胞BEL-7404细胞的增殖，影响细胞周期的分 布，并促进细胞的凋亡。表明该基因可能是一个促进肝癌发生发展的一个关键功能基因， 可能作为一个肝癌的潜在治疗靶点。
IDNK
为一种葡糖酸激酶，是一种需Mg2+的典型的磷酸转移酶，这种激酶参与了d-葡糖酸酯 降解过程(PMID:23067238)，该蛋白在肾脏，肝脏，小肠，十二指肠等器官有较高的表 达(PMID 24309898)。
IDNK抑制剂
指对于IDNK具有抑制效果的分子。对于IDNK具有抑制效果包括但不限于：抑制IDNK 活性，或者抑制IDNK基因转录或表达。所述IDNK抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、 抗体、小分子化合物。
抑制IDNK活性是指使IDNK活力下降。优选地，相比抑制前，IDNK活力下降至 少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，更佳的降低 至少80％，最佳的降低至少90％。
抑制IDNK基因转录或表达是指：使IDNK的基因不转录，或降低IDNK的基因的转 录活性，或者使IDNK的基因不表达，或降低IDNK的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对IDNK的基因转录或表达进行调节，如基因敲 除、同源重组，干扰RNA等。
IDNK的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，IDNK基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％， 再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地IDNK基因 完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
IDNK抑制剂制备肝癌治疗药物
以IDNK抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备肝癌治疗药物。通常，药物 中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅 料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不 利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与IDNK抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常 情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具 体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生 物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固 体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、 玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸； 乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧 化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配 方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气 味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、 胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹 配。
联合治疗药物组合和施用方法
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将IDNK抑制剂和其他肝癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或 不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先 后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。
二)将IDNK抑制剂和其他肝癌治疗药物配置成复方制剂，在将IDNK抑制剂和其他 肝癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。
小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、 抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。
可以同步地或顺序地给予有效量的IDNK抑制剂和至少一种有效量的其他肝癌治疗药 物。
使用时，可将有效量的IDNK抑制剂和有效量的其他肝癌治疗药物同时使用，也可将 有效量的IDNK抑制剂和有效量的其他肝癌治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用 药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特 定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施 方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通 常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域 常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
一、实验方法：
1、IDNK基因干扰慢病毒制备
针对IDNK基因，设计了特异性靶点干扰序列，也就是靶点序列为 AAACAGAACTAAGCATAAA，SEQ ID NO.1)，并以TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO.2)为阴性对照序列，根据靶点序列设计shRNA干扰序列，分别构建至hU6-MCS-CMV-EGFP质粒载体中，与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体质粒，共转染293T 细胞，在转染后48-72h获得未纯化的细胞上清，并对上清进行纯化浓缩获得高滴度的慢病 毒。具体地，针对IDNK基因的shRNA的序列为CCGGCCAAACAGAACTAAGCATAAA CTCGAGTTTATGCTTAGTTCTGTTTGGTTTTT(SEQ ID NO.3，记为shIDNK)。针对IDNK 基因的siRNA的序列为AAACAGAACUAAGCAUAAA，SEQ ID NO.4)。阴性对照shRNA 记为shCtrl。
2、RT-PCR检测目的基因敲减效率
针对IDNK基因进行引物设计。抽提对照组shCtrl以及shIDNK干扰慢病毒感染组 细胞，分别抽提RNA，反转录获得cDNA，以GAPDH为内参，通过RT-PCR检测IDNK 的mRNA表达情况。
3、Western Blot外源验证靶点有效性
将构建含有融合FLAG标签的IDNK表达克隆质粒和针对IDKN干扰靶点的RNAi 病毒载体质粒，共转染至293T细胞中，48h后，收集蛋白并定量，运用flag抗体进行 Western Blot检测蛋白敲减效率。
4、Celigo细胞计数法检测细胞生长
对BEL-7404细胞进行慢病毒感染4天后，传代接种于96孔板中，铺板24小时后， 通过celigo仪器读取表达EGFP荧光的细胞并拍照，通过软件处理计算孔板中不同组别 的细胞数目，连续检测5天后，绘制细胞的生长曲线图，分析细胞生长状况。
5、MTT检测细胞活力
对BEL-7404细胞进行慢病毒感染4天后，传代接种于96孔板中，铺板24后，培 养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，4h后加入100μLDMSO溶液，进行酶标 仪检测。
6、PI-FACS流式细胞周期检测
对BEL-7404细胞进行慢病毒感染4天后，传代铺板，待细胞融合度达85％后，消化 收集细胞，进行乙醇固定并洗涤，加入PI染液对细胞进行染色，使用流式细胞仪对细胞进 行检测并运用ModFit软件进行数据分析。
7、Annexin V-APC流式细胞凋亡检测
对BEL-7404细胞进行慢病毒感染4天后，传代铺板，待细胞融合度达85％后，消化 收集细胞，加入Annexin V-APC染色处理，使用流式细胞仪对细胞进行检测，并运用guava ICtrlyte流式细胞仪分析软件进行分析。
二、实验结果
1、IDNK基因干扰慢病毒感染及敲减效率验证
运用构建好的shIDNK干扰慢病毒以及shCtrl对照慢病毒以MOI 20感染BEL-7404细 胞，72小时后在荧光显微镜下观察EGFP荧光并拍照，结果显示细胞感染效率达到80％以 上，细胞状态良好(图1)。
确认感染效果后，通过qPCR实验验证shIDNK慢病毒的干扰效率。qPCR结果显示 shIDNK慢病毒显著抑制了BEL-7404细胞中IDNK基因在mRNA水平的表达量(p<0.05)， 敲减效率达84.5％(图2A)。通过将含有融合FLAG标签的IDNK过表达质粒与shIDNK干 扰质粒共转染293T细胞，Western Blot检测FLAG标签，结果显示干扰靶点对IDNK的外 源表达在蛋白水平有敲减作用，因而是有效靶点(图2B)。
2、IDNK基因干扰抑制BEL-7404细胞增殖
通过celigo细胞计数法对shIDNK干扰组以及shCtrl对照组BEL-7404细胞进行连续5 天的拍照记录，结果显示，IDNK基因干扰可显著影响BEL-7404细胞的生长增殖(图3A)。 shCtrl对照组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天相比与第一天的增殖倍 数分别为1.35±0.02，3.55±0.13,5.66±0.21,8.92±0.26(图3B)，而shIDNK干扰组细胞贴壁 生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天相比与第一天的增殖倍数分别为1.08±0.06， 1.86±0.11,2.15±0.1,2.69±0.21，生长倍数显著被抑制(图3C)。
此外，运用MTT检测方法同样验证了IDNK基因对细胞活力的影响。MTT实验结果显 示，shCtrl对照组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天与第一天相比的细 胞活力倍数分别为1.357±0.0134，1.888±0.0862,2.55±0.031,3.959±0.0119，而shIDNK干扰 组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天与第一天相比的细胞活力倍数分 别为1.182±0.0179，1.552±0.0407,1.924±0.0611,2.267±0.0125，显示shIDNK组细胞增殖明 显减缓(图4)。
3、IDNK基因干扰影响BEL-7404细胞周期再分布
进一步，我们运用流式细胞术检测了IDNK基因干扰对BEL-7404细胞周期的影响。流 式结果显示，shIDNK使G1期细胞以及G2/M期细胞比例显著升高(p<0.01)，S期细胞比 例显著降低(p<0.01)，可能导致细胞的发生G1期阻滞以及G2/M期阻滞(图5A和5B)。
4、IDNK基因干扰促进BEL-7404细胞凋亡
细胞周期阻滞通常伴随着细胞凋亡的发生，因此接下来我们通过流式检测shIDNK对 细胞凋亡的影响。流式检测Annexin V标记的细胞结果显示，shIDNK组的细胞凋亡率显著 增加，由shCtrl对照组的4.24±0.1697％上升至34.03±0.0629％(p<0.01)，表明IDNK基因 干扰显著促进了BEL-7404细胞的凋亡(图6A和6B)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干 改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不 脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修 饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实 施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 无锡市第三人民医院
<120> IDNK抑制剂在制备肝癌治疗药物中的用途
<130> 176434
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaacagaact aagcataaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttctccgaac gtgtcacgt 19
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggccaaac agaactaagc ataaactcga gtttatgctt agttctgttt ggttttt 57
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaacagaacu aagcauaaa 19