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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610128964.3 (22)申请日 2016.03.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105769901 A (43)申请公布日 2016.07.20 (73)专利权人 甘肃东方天润玫瑰科技发展有限 公司 地址 730000 甘肃省兰州市城关区中山路 201号恒基大厦4楼 (72)发明人 不公告发明人 (51)Int.Cl. A61K 31/715(2006.01) A61P 25/16(2006.01) (56)对比文件 叶琳琳等.抗氧化剂依达拉奉。
2、联合葛根素用 于帕金森病治疗的临床观察. 现代生物医学进 展 .2014,第14卷(第32期),第6311-6314页. 白伟芳.玫瑰花多糖的提取及其功效研究. 中国优秀硕士学位论文全文数据库， 工程科技I 辑 .2011, (第5期),第43-44、 10-17页. 审查员 陈蕾 (54)发明名称 玫瑰花多糖在制备治疗帕金森综合征的药 物中的应用 (57)摘要 本发明属于生物医药领域， 提供一种玫瑰花 多糖的新应用， 具体涉及玫瑰花多糖在制备治疗 帕金森综合征的药物中的应用。 本发明采用水提 醇沉法提取玫瑰花多糖， 该玫瑰花多糖可显著抑 制-突触核蛋白的表达， 对秀丽隐杆线虫帕金 森综合征病。
3、理模型具有显著的治疗作用， 提示玫 瑰花多糖具有治疗帕金森综合征的潜力， 可在制 备治疗帕金森综合征的药物中应用， 亦可在制备 预防和辅助治疗帕金森综合征的保健品中应用。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105769901 B 2018.06.29 CN 105769901 B 1.玫瑰花多糖作为唯一活性成分在制备治疗帕金森综合征的药物中的应用。 2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述玫瑰花多糖作为药效成分的药物制剂为 注射剂、 颗粒剂、 粉剂、 丸剂、 口服液、 片剂。 3.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述玫瑰花多糖的制备方法如下： 称取玫瑰花， 按1： 2。
4、0-30质量份数加蒸馏水， 浸泡20min， 加热煮沸并保持30min， 10000rpm离心10min， 取上清液， 重复三次， 合并上清液， 加入5倍体积的无水乙醇于室温沉 淀12h， 10000rpm离心5min， 收集沉淀， 待溶剂挥干， 收集固体， 得粗多糖； 粗多糖脱蛋白： 将粗多糖加蒸馏水溶解后配置为100mg/ml的水溶液， 加入1/5体积5: 1v/v的氯仿： 正丁醇， 剧烈振荡， 4000rpm离心20min， 弃沉淀， 重复多次直至离心后溶剂界面 无沉淀； 粗多糖脱色素： 取脱蛋白后的粗多糖， 加入10倍体积的65的乙醇， 55水浴提取5h， 4000rpm离心5min，。
5、 弃上清； 粗多糖脱酚： 取脱色素后的粗多糖， 加入等体积的丙酮溶液， 充 分振摇， 4000rpm离心20min， 收取沉淀， 即得所述玫瑰花多糖。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105769901 B 2 玫瑰花多糖在制备治疗帕金森综合征的药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 提供一种玫瑰花多糖的新应用， 具体涉及玫瑰花多糖 在制备治疗帕金森综合征的药物中的应用。 背景技术 0002 帕金森综合征(Parkinson s disease,PD)是第二大神经退行性疾病， 表现为运动 能力和认识功能下降。 运动能力上表现为肌肉僵硬、 运动迟缓和震颤； 行为和认。
6、知能力上表 现为痴呆、 抑郁、 焦虑和睡眠紊乱。 这一疾病的发病率在大于60岁的人群中迅速增加。 病患 生活质量随疾病发展不断下降， 直至负累家庭， 给社会和家庭带来沉重的负担。 0003 帕金森综合征的主要病理特征为 -突触核蛋白在脑组织中聚积形成路易小体 (Lewy bodies)和中脑黑核中多巴胺能神经元选择性缺失。 到目前为止， 尚无有效的治疗方 法。 0004 采用帕金森哺乳动物病理模型用于筛选抗帕金森药物周期长、 成本高。 采用秀丽 隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans)可使筛选周期从月为单位下降至以天为单位。 秀丽 隐杆线虫是一个非常有用的多功能药物筛选和药物。
7、作用机制的研究平台。 它廉价、 易培养； 世代周期短、 后代数目多， 同时可获得大量背景一致的个体， 保证实验重复性和采用大样本 量进行实验， 从而排除个体差异的影响； 与高等生物在基因和分子通路方面高度保守 (Kaletta and Hengartner， 2006)。 它作为一个从细胞体外水平药物初筛到小鼠体内水平 药物复筛的一个桥梁， 越来越受到药学家的青睐。 美国devGen公司利用人源化线虫筛选的 抗心律不齐药物已被FDA批准进入临床研究。 0005 将人源 -突触核蛋白与YFP黄色荧光蛋白融合被插入线虫肌肉特异性启动子之 下， 因此人类 -突触核蛋白便可在线虫肌肉组织特异性表达。 。
8、由于线虫通体透明， 利用荧光 显微镜可清晰地观察到黄色荧光， 荧光越强， 人源 -突触核蛋白表达越高。 对PD有治疗作用 的药物可显著抑制 -突触核蛋白表达产生的荧光， 待检药物抑制荧光能力越强， 抗PD活性 就越好(Fu et al.,2014)。 0006 玫瑰花具有多种药学活性包括催眠、 止痛、 抗惊厥、 止咳和扩张支气管， 促进肠蠕 动和通便， 对心血管系统也有一定的作用。 此外， 玫瑰花的药学活性还包括抗菌、 抗HIV、 抗 糖尿病， 抗辐射、 抗炎、 抗肿瘤等。 从玫瑰花中提取的活性成分是玫瑰花药学活性的基础， 这 些活性成分多涉及玫瑰花精油、 甲醇、 乙醇、 氯仿等提取物， 以及。
9、从中分离的玫瑰花黄酮、 多 酚， 花色素等。 在对玫瑰花活性成分功效学研究中， 大多数集中在对于玫瑰花精油药学作用 的研究， 其次是玫瑰花黄酮， 而鲜有涉及对于玫瑰花多糖的研究(Boskabady et al., 2011)。 现有技术中公开了采用水提醇沉方法获得的玫瑰花粗多糖具有抗肿瘤作用， 300mg/ Kg/d给药10天， 对S180荷瘤小鼠实体瘤的抑制率可达61.27(白伟芳， 2010)。 但是， 对于玫 瑰花多糖是否具有抗PD作用尚未可知。 0007 基于上述研究现状， 本发明公开了一种玫瑰花多糖的新应用， 所述玫瑰花多糖可 显著抑制 -突触核蛋白的表达， 对秀丽隐杆线虫帕金森综合。
10、征病理模型具有显著的治疗作 说 明 书 1/5 页 3 CN 105769901 B 3 用， 提示玫瑰花多糖具有治疗帕金森综合征的潜力， 可在制备治疗帕金森综合征的药物中 的应用， 亦可在制备预防和辅助治疗帕金森综合征的保健品中应用。 0008 参考文献 0009 Boskabady M.H.,Shafei M.N.,Saberi Z.,Amini S.Pharmacological Effects of Rosa Damascena.Iranian Journal of Basic Medical Sciences 2011,14,295-307. 0010 Fu R .H .,Harn 。
11、H .J .,Liu S .P .,Chen C .S .,Chang W .L .,et al .n- Butylidenephthalide protects against dopaminergic neuron degeneration and a- Synuclein accumulation in Caenorhabditis elegans models of Parkinson s disease.PLoS ONE 2014,9(1):e85305.doi:10.1371/journal.pone.0085305. 0011 Kaletta T,Hengartner MO.Fi。
12、nding function in novel targets:C.elegans as a model organism.Nat Rev Drug Discov 2006,5:387e398. 0012 Ma ,L .,Qin ,C .,Wang ,M .,Gan ,D .,Cao ,L .,Ye ,H .,et al .Preparation , preliminarycharacterization and inhibitory effect on human colon cancer HT- 29cells of anacidic polysaccharide fraction fro。
13、m Stachys floridana Schuttl.ex Benth.Food and Chemical Toxicology 2013,60: 269276. 0013 白伟芳.玫瑰花多糖的提取及其功效研究.山东轻工业学院,2010. 0014 姜琼， 谢妤.苯酚硫酸法测定多糖方法的改进.江苏农业科学2013,41(12):316- 318. 发明内容 0015 本发明的目的是提供一种玫瑰花多糖的应用。 0016 具体涉及玫瑰花多糖在制备治疗帕金森综合征的药物中的应用。 0017 所述玫瑰花多糖作为药效成分的药物制剂为注射剂、 散剂、 颗粒剂、 粉剂、 丸剂、 口 服液、 片剂等任一剂型。
14、， 这是本领域技术人员可以理解的。 0018 所述玫瑰花多糖亦可在制备预防和辅助治疗帕金森综合征的保健品中应用。 0019 所述玫瑰花多糖作为有效成分的保健品剂型为散剂、 颗粒剂、 粉剂、 丸剂、 口服液、 片剂等任一剂型， 这是本领域技术人员可以理解的。 0020 本发明所述玫瑰花多糖的制备方法如下： 0021 水提醇沉法制备玫瑰花多糖： 称取玫瑰花， 按1： 20-30质量份数加蒸馏水， 浸泡 20min， 加热煮沸并保持30min， 10000rpm离心10min， 取上清液， 重复三次， 合并上清液， 加入 5倍体积的无水乙醇于室温沉淀12h， 10000rpm离心5min， 收集沉淀。
15、， 待溶剂挥干， 收集固体， 得粗多糖； 0022 粗多糖脱蛋白： 将粗多糖加蒸馏水溶解后配置为100mg/ml的水溶液， 加入1/5体积 5:1v/v的氯仿： 正丁醇， 剧烈振荡， 4000rpm离心20min， 弃沉淀， 重复多次直至离心后溶剂界 面无沉淀； 0023 粗多糖脱色素： 取脱蛋白后的粗多糖， 加入10倍体积的65的乙醇， 55水浴提取 5h， 4000rpm 离心5min， 弃上清； 0024 粗多糖脱酚： 取脱色素后的粗多糖， 加入等体积的丙酮溶液， 充分振摇， 4000rpm离 心20min， 收取沉淀， 即得所述玫瑰花多糖。 其中， 所述丙酮为无水丙酮。 说 明 书 2。
16、/5 页 4 CN 105769901 B 4 0025 采用苯酚-浓硫酸法检测玫瑰花多糖含量， 具体方法参见姜琼和谢妤(2013)， 略改 动。 简单地说， 取所述玫瑰花多糖， 用蒸馏水溶解成15mg/ml的玫瑰花多糖水溶液， 100倍稀 释。 之后按照样品、 5 苯酚溶液、 浓硫酸为2： 1： 5的比例添加试剂， 混匀5min后， 沸水浴加 热15min， 冷却。 处理好的待检样品在490nm处测量吸光度值。 标准曲线采用葡萄糖为标准品 绘制， 经检测， 所述玫瑰花多糖中多糖含量为85.4。 0026 本发明的有益效果： 0027 本发明以秀丽隐杆线虫PD病理模型进行实验， 结果表明： 玫。
17、瑰花多糖可显著抑制 -突触核蛋白的表达， 对秀丽隐杆线虫PD病理模型具有显著的治疗作用， 提示玫瑰花多糖 具有治疗帕金森综合征的潜力， 可在制备治疗帕金森综合征的药物中的应用， 亦可在制备 预防和辅助治疗帕金森综合征的保健品中应用。 0028 下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案， 但本发明的保护范围不 局限于以下所述。 附图说明 0029 图1本发明所述玫瑰花多糖对秀丽隐杆线虫PD病理模型的治疗作用 0030 Control-空白对照组。 具体实施方式 0031 实施例1本发明所述玫瑰花多糖的制备 0032 称取玫瑰花， 按1： 20-30质量份数加蒸馏水， 浸泡20min， 加。
18、热煮沸并保持30min， 10000rpm 离心10min， 取上清液， 重复三次， 合并上清液， 加入5倍体积的无水乙醇于室温沉 淀12h， 10000rpm 离心5min， 收集沉淀， 待溶剂挥干， 收集固体， 得粗多糖； 0033 粗多糖脱蛋白： 将粗多糖加蒸馏水溶解后配置为100mg/ml的水溶液， 加入1/5体积 5:1v/v的氯仿： 正丁醇， 剧烈振荡， 4000rpm离心20min， 弃沉淀， 重复多次直至离心后溶剂界 面无沉淀； 0034 粗多糖脱色素： 取脱蛋白后的粗多糖， 加入10倍体积的65的乙醇， 55水浴提取 5h， 4000rpm 离心5min， 弃上清； 0035。
19、 粗多糖脱酚： 取脱色素后的粗多糖， 加入等体积的丙酮溶液， 充分振摇， 4000rpm离 心20min， 收取沉淀， 即得所述玫瑰花多糖， 经检测， 所述玫瑰花多糖中多糖含量为85.4。 0036 实施例2本发明所述玫瑰花多糖对秀丽隐杆线虫PD病理模型的治疗作用 0037 1.生物材料 0038 (1)秀丽隐杆线虫OW13购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)； 为转基因品 系， 该种系的人源 -突触核蛋白与YFP黄色荧光蛋白融合， 被插入到肌肉特异性启动子之 下， 因此该株系线虫肌肉组织特异性表达人类 -突触核蛋白， 以荧光显微镜观察， 荧光越 强， -。
20、突触核蛋白表达越高。 对 PD有治疗作用的药物可显著抑制 -突触核蛋白表达产生的 荧光， 待检药物抑制荧光能力越强， 抗 PD活性就越好。 本实施例采用秀丽线虫OW13株系作 为筛选抗PD药物的病理模型。 0039 (2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)， 购自Caenorhabditis Genetics Center (CGC)， 作为秀丽隐杆线虫的食物。 说 明 书 3/5 页 5 CN 105769901 B 5 0040 2.试剂 0041 (1)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作(以1升为例)： 0042 成分 含量 NaCl 3.00g。
21、 K2HPO42.34g KH2PO417.23g 蛋白胨 2.50g 琼脂 17.00g 补充H2O至 1000mL 0043 固体NGM培养基配制好后， 121下高压恒温灭菌20min， 在无菌操作台下加入5mg/ ml胆固醇1ml， 1M MgSO4 1ml,1M CaCl2 1ml摇匀， 趁热倒入已灭菌的9cm培养板， 约20ml/ 板。 静置等待培养基凝固， 备用。 0044 (2)M9液配方 0045 成分 含量 Na2HPO46.00g KH2PO43.00g NaCl 5.00g 1M MgSO41.00mL 补充H2O至 1000mL 0046 (3)裂解液的配制： 6.4N。
22、aClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。 0047 3.实施步骤 0048 (1)线虫的培养： 0049 将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上， 然后置于16的培养箱中培养， 当 线虫长到成虫时进行同步化处理。 0050 (2)线虫同步化： 0051 挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基， 用M9液将线虫从培 养基上冲下， 转移到离心管中， 静置使线虫自由沉降至管底， 弃上清。 视线虫量多少向离心 管中加入裂解液， 在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于 1.5ml离心管中， 用M9溶液洗线虫卵三次。 0052 (3)实验组设置 。
23、0053 空白对照组： 无菌水。 0054 玫瑰花多糖组： 0.04mg/ml； 0.2mg/ml； 1mg/ml 0055 配制含有玫瑰花多糖的NGM平板： 0056 将实施例1获得的玫瑰花多糖以无菌水稀释， 得到玫瑰花多糖的无菌水溶液， 将玫 瑰花多糖的无菌水溶液加入NGM培养基中， 使玫瑰花多糖在培养基中的终浓度分别达到 0.04mg/ml， 0.2mg/ml和 1mg/ml， 将NGM倒入各平板， 静置等待培养基凝固。 在培养基上均匀 涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。 空白对照组中， 用等量的无菌水替换玫瑰花多糖的无 说 明 书 4/5 页 6 CN 105769901 B 6 菌。
24、水溶液， 其他步骤不变。 0057 (4)实验步骤 0058 将同步化后分装于离心管， M9缓冲中孵化48小时成为同步化的L1期幼体线虫， 4000rpm,5min 离心除去多余M9， 将线虫转移到涂布有OP50的NGM板中22培养至L3期， 用 M9液冲冼下线虫， 4000rpm,5min离心除去多余M9， 最终将线虫转移到含不同浓度的玫瑰花 多糖的NGM培养皿， 空白对照组为涂布有OP50并加有与玫瑰花多糖组等体积无菌水的NGM培 养皿中。 所有NGM皿中均含有 50 M 5-氟脱氧尿苷(FuDR)， 用以抑制线虫繁殖， 避免产生世 代交叠。 每个培养皿60条线虫， 每个药物浓度三个培养皿。
25、作为平行， 22继续培养72小时。 再用M9将线虫冲冼下来， 4000rpm， 5min离心除去上清(M9培养基)， 加入10mM NaN3麻醉线 虫， 在荧光显微镜下观察， 拍照。 每组随机观察25 条线虫， 所有图片采用Image J软件定量 分析荧光强度。 0059 (5)实验结果 0060 图1的纵坐标表示YFP荧光强度， 由于同 -突触核蛋白融合， 因此代表 -突触核蛋 白在线虫肌肉组织的表达量， 此值越低， 表明玫瑰花多糖抗PD活性越高， 即玫瑰花多糖抗PD 作用越强。 不同字母意味着差异显著p0.05。 0061 实验结果表明， 在本实施例中玫瑰花多糖显著抑制了人源 -突触核蛋白在线虫肌 肉组织的表达， 提示玫瑰花多糖对PD具有显著的治疗作用。 0062 通过以上实施例证明， 玫瑰花多糖对秀丽隐杆线虫帕金森综合征病理模型具有显 著的治疗作用， 提示本发明所述玫瑰花多糖具有治疗帕金森综合征的潜力， 可在制备治疗 帕金森综合征的药物中应用， 亦可在制备预防和辅助治疗帕金森综合征的保健品中应用。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105769901 B 7 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 105769901 B 8 。