技术领域：
本发明涉及一种基因工程药物，特别是涉及含有人重组纤溶酶原K5片 段用于治疗与新生血管生成相关的疾病的药物。
背景技术：
血管新生是一个复杂的生理和病理过程的结果或因素，除正常的生理条 件(如伤口愈合，怀孕和发育)条件下可发生，在病理条件下，如由糖尿病 引起的视网膜充血和肿瘤发生都与新生血管的生成有关。尤其是视网膜神经 血管形成，新血管从先存在的毛细血管异常形成，是许多眼病的特有的病理 现象。如糖尿病视网膜病、镰状细胞视网膜病、视网膜血管阻塞和视网膜早 熟(ROP)。肿瘤，脑缺血和慢性炎症也可以导致新生血管的生成，从而加重 这些病情。医学研究证明实体瘤的血管生成能力特别旺盛，因而与正常机体 争夺营养。如能抑制新生血管的生成，就能有效的抑制肿瘤生长，并导致肿 瘤死亡。血管生成因子抑制剂是近几年来发现的基因，该基因的蛋白产物能 够抑制新生血管的形成，其中包括Angiostatin(纤维蛋白溶酶原)。目前认为 Angiostatin是由纤维酶原经过特定的蛋白酶水解而成。Angiostatin包括四个 kringle结构(包括三个二硫键的环结构)，其中单独的kringle 1，2，3也具有 抗血管生成的作用。由于Angiostatin分子较大，不适于作为药物。
近年来的研究显示，纤溶酶原(Plasminogen)内部的K5区(kringle5，以下 简称为K5，存在于Plasminogen，但不属于Angiostatin)对内皮细胞的增殖和 迁移比Angiostatin有更强的抑制作用。(Ji，W.R.，Barrientos，L.G.，Trail，P.A.， 1998，BBRC 247，414-419 Cao，Y.，Chen，A.，Llinas，M.，1997，J.Biol.Chem. 272，22924-22928)。
K5是一种血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)蛋白水解的片段(Cao，Y.，Ji，R. W.，Davidson，D.，Folkman，J.，1 996，J.Biol.Chem.271：29461)，是纤维酶原中 第5个kringle区。每个kringle由80个氨基酸组成(Castellino FJ，McCance SG：The kringle domains of human plasminogen.Ciba Foundation Symposium 212：46-65，1997)。已经证明，K5抑制内皮细胞增殖；而且，其抑制活性高于 angiostatin(即kringle 1-4)(Cao，Y.，Ji，R.W.，Davidson，D.，Folkman，J.，1996， J.Biol.Chem.271：29461、Cao，Y.，Chen，A.，Llinas，M.，1997，J.Biol.Chem.272， 22924-22928、O’Reilly，M.S.，Holmgren，L.，Shing，Y.，Folkman，J.，1994，Cell. 79：315)。另外，K5也抑制内皮细胞迁移这一血管生成的重要步骤(Ji，W.R.， Barrientos，L.G.，Trail，P.A.，1998，BBRC 247，414-419、Lu H，Dhanabal M， Volk R，Waterman MJF，Ramchandran R，Knebelmann B，Segal M，Sukhatme VP： Kringle 5 causes cell cycle arrest and apoptosis of endothelial cells.Biochem Biophy Res Comm 285：668-673，1999)。K5对内皮细胞的的作用是通过诱导细 胞周期循环抑制和细胞凋亡而起作用的，并且针对于内皮细胞的增殖。由于 其具有的高效、细胞类型的选择性，以及较短的氨基酸序列，K5被认为是 治疗新生血管疾病的有效物质。
但用Plasminogen K5作为药物，用于治疗与新生血管生成相关的肿瘤、 视网膜疾病尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的是研制一种含有Plasminogen K5片段的药物，用于治疗与 新生血管生成相关的肿瘤和视网膜疾病。
本发明发现了重组K5在体内和体外对视网膜以及肿瘤新血管形成具有 明显抑制作用。
本发明的技术方案是：
1.K5的获得
1)构建人重组K5表达系统
利用RT-PCR技术，从人的肝脏RNA中扩增出K5cDNA，将该PCR产 物克隆到pET22载体中的Eco RI和HindIII的位点上，形成了6X组氨酸和 K5的融合基因序列。表达载体构建的正确性通过测序确认。
2)人重组K5的表达和纯化
将上述载体转化E.coli菌株BL-21/DE3，该菌株表达的人重组K5主要在 原生质膜(preplasmic)间隙。重组蛋白的表达是通过IPTG的诱导。用溶菌酶 和离心的方法回收原生质膜间隙的蛋白。将由此得到的蛋白进行分离纯化。 得到的人重组K5蛋白用SDS-PAGE方法和Western印迹法进行确认。
2.药效学实验
用本发明的药物进行了如下生物学实验：
1)重组K5对人眼视网膜毛细管内皮细胞(HRCEC)生长抑制实验
结果显示：HRCEC在低氧(1％O2)条件下比在正常氧条件下数量明显 增多(p＜0.05，n＝4)，其半数抑制浓度EC50在正常氧和低氧条件下分别是70nM 和600nM。
2)K5的细胞型特异性抑制：
结果显示：K5对原发周膜细胞(Pericyte)或E1A-NR3细胞(从大鼠视 网膜神经元衍生的一种无限增殖化细胞系)无抑制作用(p＞0.05，n＝4)。证明 K5的抑制作用仅针对于神经内皮细胞。
3)K5预防大鼠视网膜神经血管形成体内实验
结果显示：K5处理过的动物眼比对照组视网膜神经血管前体细胞明显减 少(K5实验组33.3±2.7nuclei/section；PBS对照组66.1±5.9，P＜0.01，n＝8)。 证明注射K5可预防视网膜神经血管的发展。并提示K5的抑制作用取决于浓 度。
4)K5抑制视网膜神经血管生长的体内实验
在视网膜神经血管新生后，用K5处理的眼睛，其视网膜神经血管生长的 平均数仅有轻微增长，(注射前74.6±12.4nuclei/section，注射后80.3±22.5 P＝0.4，n＝8)。相反用PBS的对照组视网膜神经血管生长的平均数增长了1倍 (注射前74.6±12.4nuclei/section，注射后145.5±24.1 nuclei/section P＜0.01， n＝8)。然而，K5并不减少血管细胞前体的数量。该结果提示，K5一次注射 后可抑制神经血管的生长，而不影响血管内皮细胞前体。
5)K5的安全性实验
眼部注射K5后无明显的组织学改变或炎症细胞渗透发生。此外，正常的 视网膜内血管在注射后无可检测到的改变。该发现提示：K5在所用浓度下不 会引起视网膜或正常血管毒性。
6)K5的抗肿瘤作用
用人重组K5蛋白分别对视网膜充血的大鼠和产生肿瘤的裸鼠进行治疗试 验。对视网膜充血的大鼠，带有肿瘤的裸鼠，用K5进行肿瘤的原位注射，4 周后，取下肿瘤，进行肿块大小分析和形态学上的分析。实验表明，K5能 明显地抑制肿瘤的生长。
本发明的优点和效果
1)本发明所用的人K5的基因产物是人体内源性蛋白。利用细菌发酵生 产人K5基因产物，属于生物高科技，污染小，产率高，成本低。
2)人重组K5多肽为16kD，比其它天然人蛋白类的血管生长因子抑制剂 的分子量都小，更适宜作为药物分子。
3)本发明的药物在体外体内均可有效抑制血管细胞生长，且该种抑制是 特异性的，不对非血管细胞产生抑制。即对非血管细胞不产生毒害与损伤。
具体实施方式：
实施例1 K5的制备
1.构建人重组K5表达系统
利用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)技术，从人的肝脏RNA中扩 增出K5cDNA，将该PCR产物克隆到pET22载体(美国Novagen公司产品) 中的Eco RI和Hind III的位点上，形成了6X组氨酸和K5的融合基因序列。 表达载体构建的正确性通过测序确认。
2.人重组K5的表达和纯化
将上述载体转化E.coli菌株BL-21/DE3(美国Novagen公司产品)。该菌 株表达的人重组K5主要在原生质膜(preplasmic)间隙。重组蛋白的表达是通 过IPTG的诱导。用溶菌酶和离心的方法回收原生质膜间隙的蛋白。将由此 得到的蛋白过His-Bind柱(美国Novagen公司产品)进行分离纯化。纯化后得 到的人重组K5蛋白用SDS-PAGE方法和Western印迹法进行确认。
实施例2 K5对人视网膜细胞生长抑制实验
1.实验材料
视网膜细胞来源：从美国南卡Lion眼库协会(theSouth Carolina Lion′s Eye Bank Association)获得志愿者人眼。
2.实验方法
A.人眼视网膜毛细管内皮细胞(HRCEC)和周膜细胞(Pericyte)的分 离与培养：
从人眼中分离出视网膜毛细管内皮细胞(HRCEC)掺入用荧光探针标记 乙酰化低密度脂蛋白(DiI 1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，MA)，确定培养物中第二 代内皮细胞的纯度。周膜细胞(Pericyte)的分离按文献(Grant MB，Guay，C： Plasminogen activator production by human retinal endothelial cells of non-diabetic and diabetic origin.Invest Ophthalmol Vis Sci 32：53-64，1991)方法 进行。
B.活细胞计数：
将处于第二和第六代的上述细胞接种在覆盖有明胶/纤连蛋白的12孔培 养板中，每孔的细胞接种密度为0.8×104，在含15％的FBS的培养基中培养 24小时后，改换为含5％FBS和1ng/ml bEGF的培养基，在改换的培养基中 加入不同浓度的K5，每种浓度设4个重复。然后，细胞在正常氧浓度和低氧 浓度(1％O2)的条件下分别培养72小时。通过胰蛋白酶化法，从培养板中 取出细胞，重悬浮于生长介质(growth media)中，用0.4％台盼蓝(trypan blue) 染色，然后在光学显微镜下进行活细胞计数。用Student′s test分析平均细胞 数，以确定K5对细胞生长的抑制和抑制的特异性。
3.实验结果：
重组K5在正常氧和低氧条件下对HRCEC的体外抑制实验
用浓度为20、40、80、160nM的重组K5处理HRCEC，在正常氧和低 氧条件下分别培养72小时，然后进行细胞计数。当浓度在20nM时，在正常 氧和低氧条件下K5就可明显降低细胞数量(p＜0.01 n＝4)。半数抑制浓度EC50在正常氧和低氧条件下分别是70nM和600nM。
结论：HRCEC在低氧(1％O2)条件下比在正常氧条件下数量明显增多 (p＜0.05，n＝4)。
实施例3 K5的细胞型特异性抑制
实验条件同实施例2，结果显示K5不显示任何有意义的对原发周膜细胞 (Pericyte)或E1A-NR3细胞(从大鼠视网膜神经元衍生的一种无限增殖化 细胞系)的抑制作用(p＞0.05，n＝4)。K5的浓度从20-320nM均可观察到此。 提示：K5的抑制作用仅针对于神经内皮细胞。
实施例4动物体内视网膜神经血管形成的诱导
1.实验动物：从位于Indianapolis的Harlan购得Spragre Dawley和Brown Norway大鼠。
2.实验方法：
视网膜神经血管形成的诱导和数量确定按文献(Smith LE，et al： Oxygen-induced retinopathy in the muse.Invest Ophthalmol Vis Sci 35：101-111.1994、Smith LEH et al：Essential role of growth hormone in ischemia-induced retinal neovascularization.Science 276：1706-1709，1997)的方 法进行，稍有改动。将8只白化病的Spragre Dawley和Brown Norway新生 大鼠随机分组。出生后7日的大鼠暴露于低氧环境下(75％O2)5天，然后 在正常氧条件下饲养7天，以诱导视网膜神经血管形成。
3.视网膜神经血管形成的检验
蛋白印迹法分析：将视网膜切片，然后进行超声降解匀化。用BioRad蛋 白试验测定上清液的蛋白浓度。50微克可溶蛋白经SDS-PAGE(15％聚丙 烯酰胺凝胶)电泳，并电转移至Hybond ECL硝化纤维滤膜(Amersham International plc)。然后用5％BLOTTO在TBST缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.6， 137mMNaCl，0.1％Tween 20)溶液在室温下振摇1小时，以阻断该膜。加入 兔抗-VEGF抗体(Santa Cruz，CA)至该BLOTTO中，浓度为1∶4000，与该 膜在4℃培养振摇过夜。室温下将该膜用TBST冲洗三次，每次20分钟。用 辣根过氧化酶(Amersham International plc)标记的驴抗兔抗体用BLOTTO溶 液称释至1∶4000，在室温下与该膜温育2小时。将该膜用TBST冲洗三次， 用ECL检测盒(Amersham International plc)将该膜显色成带，然后用Kodak X-Omat胶片曝光。同样的膜用特异于b-肌动蛋白的抗体进行带状化和再次 蛋白印迹。
蛋白印迹法分析证实经氧诱导的Brown Norway大鼠视网膜病变中， Brown Norway大鼠前视网膜血管生成细胞的生成数量较Spragre Dawley大鼠 更多，因此随后的实验均采用Brown Norway大鼠。氧诱导的Brown Norway 大鼠视网膜病变：在所有实验大鼠中可观察到明显的视网膜神经血管形成、 微动脉瘤、非灌注区和出血现象。
实施例5 K5预防大鼠视网膜神经血管形成体内实验
实验动物来源及诱导病理模型方法同实施例4。
实验方法：
将人重组K5蛋白溶于PBS，1mg/ml，进行过滤除菌。一部分动物在从低 氧环境转入正常氧环境后立即注射K5，实验证明，此时，尚未发生新神经血 管形成。在正常氧环境下饲养7日后检查视网膜神经。
另一部分动物在从低氧环境转入正常氧环境7日后注射K5，将注射后的 动物在正常氧条件下饲养7天，将实验动物麻醉，用玻璃毛细管针将不同浓 度K5注射到右眼的玻璃体中，左眼作为对照，注射PBS。将注射后的动物 在正常氧条件下饲养7天后杀死鼠，取出眼体，用10％福尔马林固定，做切 片。用苏木精和曙红染色。用250倍光学显微镜对视网膜玻璃体侧的血管细 胞核进行记数，并对每只眼8个矢状切面进行细胞形态学检测。每组动物的 血管细胞核数目进行平均。将该平均数与对照组进行比较，用Student′s test 方法进行分析。
视网膜血管生长情况检验方法：
高分子量荧光素造影术：
按文献(Smith LE，et al：Oxygen-induced retinopathy in the muse.Invest Ophthalmol Vis Sci 35：101-111，1994)方法，将实验动物麻醉并灌注荧光素(经 由心室内注射Sigma生产的50mg/ml，2×106分子量异硫氰酸酯葡聚糖荧光 素fluorescein isothiocyanate-dextran)后，立即处死动物，取出眼体，用4％低 聚甲醛固定10分钟，将视网膜做切片，除去晶状体和玻璃体，在4％低聚甲 醛中培育3小时。将处理后的视网膜平铺在一个明胶覆盖的玻片上。在荧光 显微镜(Axioplan2 Imaging，Zeiss)下检查血管系统。
实验结果：接受了3ul K5(3ug/ul)K5注射的眼，比起用同体积PBS注 射的对照组，显示出神经血管丛减少。K5处理过的眼比对照组视网膜神经血 管前体细胞也明显减少(K5实验组33.3±2.7 nuclei/section；PBS对照组66.1 ±5.9，P＜0.01，n＝8)。
结果表明：一次性注射K5，至少可部分预防在缺血条件下，视网膜神经 血管的发展。而注射同体积浓度仅为0.3ug/ul K5不会产生有意义的神经血 管细胞的减少(65.3±2.0 nuclei/section，P＝0.9，n＝8)，提示K5的抑制作用取 决于浓度。
实施例6 K5抑制视网膜神经血管生长的体内实验
在视网膜神经血管新生后，为确定K5的作用，在转入正常氧条件后7日 将K5注射入大鼠玻璃体中，此时已发生明显的视网膜神经血管新生。然后 在正常氧条件下再饲养7日，让新生视网膜神经血管继续生长，然后计数。 用K5处理的眼睛，视网膜神经血管生长的平均数仅有轻微增长，(注射前 74.6±12.4nuclei/section，注射后80.3±22.5 P＝0.4，n＝8)。相反用PBS的对照 组视网膜神经血管生长的平均数增长了1倍(注射前74.6±12.4nuclei/section， 注射后145.5±24.1nuclei/section P＜0.01，n＝8)。统计学分析表明，经K5处理 过的眼比起用PBS处理过的眼注射7日后神经血管细胞少(P＜0.05，n＝8)。 然而，K5并不减少血管细胞前体的数量。该结果提示，K5一次注射后可抑 制神经血管的生长，而不影响血管内皮细胞前体。
实施例7 K5对视网膜的安全性实验
实验动物同实施例3、4。
为确定毒性和抗原性，在注射K57日后检查了视网膜结构。无明显的组 织学改变或炎症细胞渗透发生。此外，正常的视网膜内血管在注射后无可检 测到的改变。该发现提示：K5在所用浓度下不会引起视网膜或正常血管毒性。
实施例8用K5进行动物体内肿瘤的抑制作用
实验动物：荷瘤裸鼠(接种人肺癌细胞)共30只，分3组，每组10只 鼠。1组：K5肿瘤原位注射组；2组：K5腹腔注射组(阳性对照组)；3组： 生理盐水肿瘤原位注射(空白对照组)。
实验药物：人重组K5蛋白磷酸缓冲液，浓度为3微克/微升
实验方法：给1组荷瘤鼠进行肿瘤的原位注射受试药物3微克/微升/150 克体重；2组进行同样药量的腹腔注射；3组原位注射同体积量的生理盐水。 每周一次注射，4周后，取下肿瘤，进行肿块大小分析和形态学上的分析。
实验结果：原位注射组的肿瘤明显小于腹腔和生理盐水注射组，肿瘤体 积平均小于1/3。结果表明，用K5进行原位注射对肿瘤具明显抑制作用。