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1、(10)授权公告号 CN 103405787 B (45)授权公告日 2014.11.19 CN 103405787 B (21)申请号 201310386678.3 (22)申请日 2013.08.30 A61K 48/00(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 1/00(2006.01) (73)专利权人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市鼓楼区汉口路 22 号 (72)发明人 陈江宁 张峻峰 黄振 石通国 龙珊珊 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 胡锡瑜 (54) 发明名称 一种基于 miR-141 的分子靶向核酸纳米药物。
2、 及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一 种基于 miR-141 的分子靶向核酸纳米药物及其 制备方法和应用。本发明应用 miR-141 首次调 控 CXCL12 作为 IBD 的分子治疗新靶点， 采用 聚乙烯亚胺作为核酸药物的载体制备了过表达 miR-141 的质粒或 miR-141 前体或 miR-141 模拟 物的新型分子靶向核酸纳米药物， 提高了核酸药 物体内的稳定性， 在核酸药物的转染效率和细胞 靶向输送上取得重要突破。该核酸药物通过原位 给药能直接上调小鼠结肠上皮细胞中 miR-141 水 平， 从而抑制免疫细胞的大量浸润， 最终明显缓解 小鼠。
3、肠炎症状， 为 IBD 治疗提供一种全新的治疗 药物。 (51)Int.Cl. 审查员 张林 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 103405787 B CN 103405787 B 1/1 页 2 1. 一种基于 miR-141 和聚乙烯亚胺的分子靶向核酸纳米药物在制备治疗炎症性肠病 药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103405787 B 2 1/5 页 3 一种基于 miR-141 的分子靶向核酸纳米药物及其制备方法 和应用 一、 技术领域 0001 本发明属于生物医药技。
4、术领域， 具体涉及一种基于 miR-141 的分子靶向核酸纳米 药物及其制备方法和应用。 二、 背景技术 0002 炎症性肠炎 （Inflammatory bowel disease,IBD） 是胃肠道一种慢性、 易复发的自 身免疫性疾病。由于 IBD 的病因及发病机制尚未完全研究清楚， 因此治疗药物也缺少特异 性。 现有的针对IBD的治疗药物主要包括三大类 ： 氨基水杨酸类制剂、 糖皮质类激素和免疫 抑制剂， 这些传统药物只能通过非特异性地抑制炎症来缓解肠道炎症反应， 并不能从根本 上来治愈肠道炎症。而 IBD 的反复发作和难以治愈会极大增加结肠癌变可能， 严重威胁患 者生命健康， 因此亟待。
5、需要发展新型的 IBD 治疗药物。 0003 近年来， 微小 RNA 作为一类新的基因表达调控分子家族而受到广泛的关注， 已有 研究发现它们可作为重要的药物作用靶点和潜在的核酸药物应用于肝癌疾病的治疗， 然 而， 微小 RNA 作为 IBD 治疗的分子核酸药物还没有被研制。本发明通过深入研究 IBD 的分 子机制和生物学功能， 发现微小 RNA 与 IBD 的发生和发展也密切相关。进一步研究发现一 种重要的微小 RNA-miR-141 能够直接调控趋化因子 CXCL12 的表达， 影响结肠组织中 免疫细胞的迁移从而调控 IBD 的病程。在此研究基础上， 本发明通过 miR-141 首次调控的 。
6、CXCL12作为IBD的分子治疗新靶点， 制备了基于miR-141的新型分子靶向核酸纳米药物， 为 IBD 治疗提供一种全新的治疗策略。 三、 发明内容 0004 本发明需要解决的问题就是公开了一种有效治疗IBD的基于miR-141的分子靶向 核酸纳米药物及其制备方法。 0005 本发明所述一种基于 miR-141 的核酸纳米药物， 是由基于 miR-141 的核酸药物和 聚乙烯亚胺构成的纳米复合物， 其中基于 miR-141 的核酸药物为过表达 miR-141 的质粒或 miR-141 前体或 miR-141 模拟物， 聚乙烯亚胺可以为线性结构或分枝状结构， 聚乙烯亚胺 的分子量不受限制， 。
7、本次实验中采用的核酸药物载体是分子量为 25kDa 的线性聚乙烯亚胺 （polymine， PEI） ， 但是不应视为对聚乙烯亚胺使用种类的限制。 0006 本项发明中使用的基于 miR-141 的核酸药物包括 ： 过表达 miR-141 的质粒或 miR-141 前体或 miR-141 模拟物 （miR-141mimics） 。本次实验中采用的基于 miR-141 的核 酸药物为 miR-141 前体， 但是不应视为对基于 miR-141 的核酸药物的使用种类的限制。 0007 本发明中， miR-141 前体 /PEI 核酸给药体系采取灌肠原位给药给予合适剂量。该 试剂的 有效量是能导致炎。
8、症性肠病症状明显降低的剂量。 0008 本发明通过动物体内实验对 IBD 疗效进行例证。此处的动物包括但是不限于 ： 小 鼠， 大鼠， 驯养动物包括但是不限于猫， 狗， 以及其它一些动物包括但是不限于牛， 羊， 猪， 说 明 书 CN 103405787 B 3 2/5 页 4 马， 灵长类动物包括但是不限于猴子和人。小鼠 IBD 疾病模型是被广泛认可和接受的体内 药物活性检测模型， 同时也可以为其它生物包括但是不限于人提供参考。 0009 下面的部分用以描述这项发明的内容， 但是不应被视作对这项发明的功能范围的 限定。 0010 本发明所述的miR-141前体/PEI核酸纳米药物的制备方法 。
9、： 将PEI用生理盐水溶 解制得 PEI 溶液， 然后加入适量 miR-141 前体， 搅拌混匀， 室温静置， 即可制得 miR-141 前体 /PEI 核酸纳米药物。 0011 本发明所述的 miR-141 前体 /PEI 核酸纳米药物在 TNBS 肠炎模型治疗中的应用 ： 0012 （1） BALB/C 小鼠禁食 24 小时， 灌肠给入 TNBS 溶液， 0013 （2） TNBS 小鼠模型建立 12 小时后， 将预先制备好的 miR-141 前体 /PEI 核酸纳米 药物通过灌肠给药方式注入小鼠结肠内， 0014 （3） 造模后每天称量小鼠体重， 观察小鼠是否腹泻， 便血， 0015 （。
10、4） 模型建立 3 天后处死小鼠， 取结肠做 H&E 染色， 并评分。 0016 本发明所述的 miR-141 前体 /PEI 核酸纳米药物在 IL-10 敲除小鼠慢性肠炎模型 治疗中的应用 ： 0017 （1） IL-10 敲除小鼠饲养于普通环境中， 从 12 周到第 20 周期间每周灌肠给入 miR-141 前体 /PEI 复合物核酸纳米药物， 0018 （2） 给药后每周观察小鼠状态， 粪便性状， 小鼠饲养到模型建立第 20 周时， 处死小 鼠， 眼眶取血， 测量血清淀粉样蛋白 A（SAA） 浓度， 作为炎症的衡量指标， 同时取结肠切片做 H&E 染色， 并进行评分。 0019 本发明具。
11、的有益效果 ： 我们应用聚乙烯亚胺作为核酸药物载体， 发展了过表达 miR-141的质粒或miR-141前体或miR-141模拟物的核酸药物输送系统， 大大提高了核酸药 物在体内的稳定性 ； 本发明应用结肠原位核酸输送技术， 在核酸的转染效率和结肠上皮细 胞的靶向输送上取得重要突破 ； 该核酸纳米药物通过原位给药能直接上调小鼠结肠上皮细 胞中 miR-141 水平， 通过特异性的分子靶向对趋化因子 CXCL12 的表达进行调控， 抑制了 免疫细胞的大量浸润， 最终明显缓解小鼠肠炎症状。本发明为炎症性肠病开发了一种疗效 显著的新药。 四、 具体实施方式 0020 1.miR-141 前体 /PE。
12、I 核酸纳米药物的制备方法 0021 miR-141 前体 /PEI 核酸纳米药物通过等体积混合 4mg/ml 的 PEI 生理盐水溶液和 2mg/ml 的 miR-141 前体生理盐水溶液而制备得到。 0022 2.miR-141 前体 /PEI 核酸纳米药物对 TNBS 肠炎的治疗作用 0023 按照文献报道方法建立小鼠 TNBS 肠炎模型， 即取雌性 BALB/C 小鼠 50 只， 体重 16-18g， 将小鼠随机分为 5 组， 正常对照组， TNBS 模型组， miR-141 前体 /PEI 复合物组， 错配 miR-141 前体 /PEI 复合物组， PEI 组 ； BALB/C 小。
13、鼠禁食 24 小时， 使用乙醚麻醉， 缓慢注入总 体积为 100l 的 TNBS 溶液， 其中 TNBS 溶液是用 3mg 的 TNBS 溶于 1ml 的 50% 的乙醇溶液， 正常对照小鼠灌入 100l 的 50% 乙醇溶液 ； 模型建立 12 小时后， miR-141 前体 /PEI 复合 物组的小鼠原位灌肠 miR-141 前体 /PEI 复合物， 给药体积为 100l （含有 100g miR-141 说 明 书 CN 103405787 B 4 3/5 页 5 前体） 。错配 miR-141 前体 /PEI 复合物组的小鼠给入等量的错配 miR-141 前体， PEI 组的 给入等量。
14、的 PEI， 模型组不做任何处理。 0024 （1） 疾病活动度 （DAI） 评分 0025 给药后每天观察小鼠毛发状况， 粪便性状， 称量小鼠体重， 并详细记录， 共计三天， DAI 评分标准如下表。 0026 表 1DAI 积分计分法 0027 0028 DAI 评分 =（体重丢失积分 + 粪便连续积分 + 隐血肉眼血积分） /3 0029 （2） 结肠 HE 病理切片评分 0030 模型建立后 3 天处死动物， 取小鼠结肠， 4甲醛固定 12 时， 包埋切片， H&E 染色， 显微镜观察其病理变化， 并进行评分， 评分标准如下。 0031 表 2 小鼠结肠 HE 病理切片评分标准 ： 0。
15、032 0033 0034 TNBS 灌肠造模后， 小鼠出现明显腹泻， 体重降低， 便血等症状， DAI 评分可以综合 上述指标评价小鼠结肠炎的疾病严重程度， 如表 3 所示， TNBS 模型小鼠的 DAI 评分远高于 正常健康小鼠， 而 miR-141 前体 /PEI 复合物治疗能有效缓解肠炎症状， 降低 DAI 评分， 此 说 明 书 CN 103405787 B 5 4/5 页 6 外 PEI 和错配 miR-141 前体 /PEI 复合物处理对 DAI 评分没有影响， 如表 3 所示， 通过组织 学评分可以发现 miR-141 前体 /PEI 复合物治疗组中的组织学评分显著低于 TNB。
16、S 模型组， 而 PEI 或错配 miR-141 前体 /PEI 复合物单独处理对结肠的病理学评分并无影响， 由此可见 miR-141 前体 /PEI 复合物治疗可以有效缓解 TNBS 诱导的肠道炎症。 0035 表 3miR-141 前体 /PEI 复合物治疗 TNBS 肠炎模型小鼠疗效 0036 0037 数据均以平均值 标准差的形式加以显示， 显著性差异通过 ANOVA 检验加以确 定。 0038 * 代表 P 0.05 0039 3.miR-141 前体 /PEI 核酸纳米药物在 IL-10 敲除小鼠慢性肠炎中应用 0040 按照文献报道方法建立IL-10敲除小鼠肠炎模型， 即取雌性C。
17、3He野生型小鼠作为 正常对照组， 取雌性 C3He 背景 IL-10 敲除小鼠 40 只， 体重 16-18g， 将小鼠随机分为 4 组， 分别为模型组， miR-141 前体 /PEI 复合物组， 错配 miR-141 前体 /PEI 复合物组， PEI 组 ； IL-10 敲除小鼠从 12 周到第 20 周期间给药， 每周给药一次， miR-141 前体 /PEI 复合物组灌 肠给入 miR-141 前体 /PEI 复合物， 给药体积为 100l（含有 100g miR-141 前体） ； 错配 miR-141 前体 /PEI 复合物组给入等量的错配 miR-141 前体， PEI 组给。
18、入等量的 PEI， 模型组 不做处理。 0041 给药后每周观察小鼠状态， 粪便性状， 小鼠饲养到模型建立第 20 周时， 处死小鼠， 眼眶取血， 测量血清淀粉样蛋白 A 浓度 （SAA） ， 作为炎症的衡量指标 ； 同时取小鼠结肠， 4 甲醛固定 12 小时， 包埋切片， H&E 染色， 显微镜观察其病理变化， 并进行评分， 评分标准同实 施例 2 中的表 2。 0042 表 4miR-141 前体 /PEI 复合物治疗 IL-10 敲除小鼠肠炎疗效 0043 0044 数据均以平均值 标准差的形式加以显示， 显著性差异通过 ANOVA 检验加以确 说 明 书 CN 103405787 B 。
19、6 5/5 页 7 定。 0045 * 代表 P 0.05 0046 本发明分别测定了各组小鼠血清中的 SAA 的含量， 如表 4 所示， IL-10 敲除小鼠血 清中的 SAA 含量相对于正常健康小鼠显著升高， 说明 IL-10 敲除小鼠体内存在较严重的炎 症， 而 miR-141 前体 /PEI 复合物治疗显著降低了 SAA 浓度， 表明复合物治疗可以有效抑制 了IL-10敲除小鼠体内的炎症发作， 而PEI或者PEI+错配的miR-141前体处理对血清中SAA 的浓度并无影响， 结肠病理学评分同样证实 miR-141 前体 /PEI 复合物可以显著降低 IL-10 敲除小鼠结肠组织的病理程度。 说 明 书 CN 103405787 B 7 。