多肽、 基质、 水凝胶以及使用它们进行组织再生和修复的方 法 技术领域和背景技术
本发明在其一些实施方案中涉及包含新型层粘连蛋白多肽的组合物， 更具体涉及 但不唯独涉及包含该组合物的基质和水凝胶以及使用该组合物的方法。
水合凝胶 ( 水凝胶 ) 在生理温度和 pH 下是粘稠、 半固体物质， 其可用于组织工程、 再生医学和用作生物材料。例如， 水凝胶是从多糖 (Coviello 等人， 2007) 如透明质酸 ( 例 如使用透明质酸与磷酸钙、 壳聚糖、 明胶或藻酸盐的混杂组合 ) 或壳聚糖 ( 例如壳聚糖与层 粘连蛋白肽 ； Suzuki 等人， 2003 ； Itoh 等人， 2005 ； Matzuda 等人， 2005 ； Ho 等人， 2005) 以及 从合成材料如聚 ( 甲基丙烯酸 -2- 羟乙酯 ) 制备。透明质酸基水凝胶为细胞和组织 ( 如为 神经再生 ) 提供生长支持环境 (Suzuki 等人， 2003 ； Itoh 等人， 2005)， 同时指导营养剂和抗 氧化剂的迁移和再生。
层粘连蛋白是基膜糖蛋白， 其充当黏附分子介导细胞骨架结合的整联蛋白、 钙黏 着蛋白、 细胞黏附分子 (CAMs) 和胞外基质 (ECM) 组分并与它们相互作用， 并支持细胞迁移、 附着、 增殖、 分化和存活。 用层粘连蛋白修饰的透明质酸剂水凝胶被证明能促进神经突延伸 (Hou 等人， 2005)。某些层粘连蛋白序列重复被发现对细胞表面受体具有生物活性。这些 序列重复包括 IKVAV(SEQ ID NO ： 1) 和 YIGSR(SEQ IDNO ： 2)， 它们充当迁移、 再生和生长的 “导轨” (Tashiro 等人， 1989 ； Powell 和 Kleinmann， 1997 ； Niece 等人， 2003 ； Hallmann 等人， 2005)。
针对氧化胁迫的主要防御机制是超氧化物歧化酶 (SOD)， 其催化超氧化物阴离子 自由基 (O2 ) 歧化成过氧化氢 (H2O2) 和氧 (O2)。包含来自牛红细胞、 与透明质酸钠缀合的 SOD 的水凝胶被发现在小鼠中没有免疫原性， 且显示出比单独的透明质酸和 SOD 高得多的 抗炎活性 (Sekurai 等人， 1997)。 另外， 还发现 SOD 不仅能抑制活性氧中间体 (ROS) 的诱导， 而且能抑制由机械胁迫引起的 HA 解聚作用 (Yamazaki 等人， 2003)。
另外的背景技术包括 Hartman JR.， 1986(Proc.Natl.Acad.Sci.83 ： 7142-7146)。
发明概述
本发明一些实施方案的一个方面提供包含 SEQ ID NO ： 3 所示的氨基酸序列的多 肽。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含多糖和本发明多肽的组成物。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含透明质酸、 层粘连蛋白多肽和抗氧化剂 的组成物。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含透明质酸、 超氧化物歧化酶 (SOD) 和本 发明多肽的组成物。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含本发明组成物的基质。
本发明一些实施方案的一个方面提供包含本发明组成物的水凝胶。
本发明一些实施方案的一个方面提供产生水凝胶的方法， 该方法包括将本发明组 成物悬浮于水中以获得包含至少 80％水的悬浮液， 从而产生水凝胶。
本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的离体形成的方法， 该方法包括 ： (a) 提供本发明的基质或水凝胶 ； (ii) 用处于适合细胞的增殖、 分化和 / 或迁移的培养基中 的细胞接种该基质或水凝胶， 从而诱导组织的形成。
本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的体内形成的方法， 该方法包括将 本发明的基质或水凝胶植入受试者体内， 从而诱导组织的形成。
本发明一些实施方案的一个方面提供治疗具有以组织患病、 损伤或损失为特征的 病状的受试者的方法， 该方法包括将本发明的基质或水凝胶植入在受试者的患病、 损伤或 损失的组织处或附近， 从而诱导组织的形成和治疗受试者。
根据本发明的一些实施方案， 多糖是透明质酸。
根据本发明的一些实施方案， 组成物还包含抗氧化剂。
根据本发明的一些实施方案， 抗氧化剂是超氧化物歧化酶 (SOD)。
根据本发明的一些实施方案， 层粘连蛋白多肽为 SEQ ID NO ： 3 所示。
根据本发明的一些实施方案， 层粘连蛋白多肽由 SEQ ID NO ： 3 所示的氨基酸序列 组成。
根据本发明的一些实施方案， 超氧化物歧化酶包含 SEQ ID NO ： 4 所示的氨基酸序 列。
根据本发明的一些实施方案， 组成物是经交联的。
根据本发明的一些实施方案， 多糖、 抗氧化剂和 / 或多肽是经交联的。
根据本发明的一些实施方案， 透明质酸、 超氧化物歧化酶 (SOD) 和多肽是经交联 的。
根据本发明的一些实施方案， 该方法还包括将组成物进行交联。
根据本发明的一些实施方案， 交联是用选自 EDC-N-(3- 二甲基 (dimenthy)- 氨基 丙基 (aminoprophyl))-N- 乙基碳二亚胺、 DVS- 二乙烯基砜和京尼平的交联剂来实现。
根据本发明的一些实施方案， 悬浮液包含至少 95％水。
根据本发明的一些实施方案， 透明质酸以在水凝胶中约 0.5-1.5％的浓度范围提 供。
根据本发明的一些实施方案， 多肽以在水凝胶中约 20-100μg/ml 的浓度范围提 供。
根据本发明的一些实施方案， 超氧化物歧化酶以在水凝胶中约 5-40μg/ml 的浓 度范围提供。
根据本发明的一些实施方案， 基质或水凝胶还包含细胞。
根据本发明的一些实施方案， 组织是神经组织。
根据本发明的一些实施方案， 细胞是干细胞。
根据本发明的一些实施方案， 干细胞当接种在基质或水凝胶中时分化成神经元细 胞。
根据本发明的一些实施方案， 水凝胶为冻干形式。
除非另有定义， 否则本文所用的所有技术和 / 或科学术语的含义与本发明所属技 术领域普通技术人员通常理解的含义相同。下文描述的是示例性的方法和 / 或材料， 不过 与本文所述的这些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于实施或试验本发明的实施方案。如有冲突， 将以本发明说明书 ( 包括定义在内 ) 为准。另外， 材料、 方法和实施例 仅仅旨在说明本发明， 并不表示必定限制本发明。 附图说明
本文仅以举例的方式参照以下附图描述了本发明的一些实施方案。 现将具体详细 地说明附图， 不过要强调的是附图所示的细节仅以举例方式给出， 目的是对本发明的实施 方案进行说明性讨论。 这样， 将说明书与附图相结合， 能使本领域技术人员清楚明白如何可 以实施本发明的实施方案。
本专利或申请文件含有至少一张彩色制作的图画。在提出请求并支付必要费用 后， 专利局可提供带彩色图画的本专利或专利申请公开说明书的拷贝。
附图中 ：
图 1 是现有技术的示意图， 描绘了超氧化物歧化酶 (SOD) 同源物的氧化还原活性 位点， 该位点包括包围着催化活性金属阳离子 ( 在这里是铜 Cu) 的三个组氨酸残基 (His 26、 74 和 163) 和一个天冬氨酸残基 (Asp 159)。另选的金属阳离子有锌 (Zn)、 锰 (Mn) 和铁 (Fe)。 图 2A-F 是各种培养条件下用博迪恩氏胶体银染色法 ( 图 2A-C) 或结晶紫染色法 ( 图 2D-F) 进行染色的原代细胞的显微照片。衍自大鼠胚胎 ( 妊娠 16-18 天 ) 的大脑半球 的原代胎鼠脑细胞在塑料平皿上在 Eagle 培养基 ( 补加 2mM 谷氨酰胺和 5mg/ml 葡萄糖的 Eagle 基础培养基 ) 存在下培养 3 天， 然后用水凝胶 [1.2％透明质酸水凝胶 ( 图 2B) 或透 明质酸超氧化物歧化酶 - 层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3) 水凝胶 ( 图 2C-F)] 或用 Eagle 培 养基覆盖细胞， 再培养 12 天后进行染色和拍照。图 2A- 在 Eagle 培养基存在下培养的用 博迪恩氏胶体银染色法进行染色的原代细胞。注意细胞为单层， 不存在分化细胞的聚集体 ( 放大倍数， x100) ； 图 2B- 用 1.2％透明质酸水凝胶覆盖和用博迪恩氏胶体银染色法进行 染色的原代细胞。注意细胞聚集体 ( 放大倍数， x100) ； 图 2C- 用透明质酸 - 超氧化物歧化 酶 - 层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3) 水凝胶覆盖和用博迪恩氏胶体银染色法进行染色的原代 细胞。注意分化的神经元细胞， 为典型的神经元生长， 细胞结合成聚集体和聚结体， 具有密 集的轴突出芽 ( 放大倍数， x200)。图 2D-F- 用透明质酸 - 超氧化物歧化酶 - 层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3) 水凝胶覆盖下生长和用结晶紫染色法进行染色的原代细胞。注意具有密集 的轴突出芽的分化神经元细胞。图 2D 和 E 的放大倍数为 x200， 图 2F 的放大倍数为 x400。
图 3 是描绘本发明的新型层粘连蛋白肽的序列 (SEQ ID NO ： 3) 的示意图， 该序列 由两个分别包含 SEQ ID NO ： 1 和 2 所示的氨基酸序列 ( 以红色显示 ) 的五肽 ( 加框表示的 序列 ) 和以下 3 个另外的二聚体组成 ： 在 N 末端位置的二聚体 (KS)、 在两个五肽之间的第 二二聚体 (RS) 和在尾部羧基末端的第三二聚体 (CV)。
本发明具体实施方案的描述
本发明在其一些实施方案中涉及包含新型层粘连蛋白多肽的组合物， 更具体涉及 但不唯独涉及包含该组合物的基质和水凝胶以及使用该组合物进行组织形成、 再生和 / 或 修复的方法。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前， 应理解本发明在其应用上并不一定 局限于以下描述中提出的或实施例所例示的细节内容。本发明还能有其他的实施方案， 或
者能以多种方式实施或执行。
本发明人在将本发明付诸实施时设计了能够支持细胞 ( 如神经元细胞 ) 的增殖、 分化和 / 或迁移的新型层粘连蛋白多肽 (SEQ ID NO ： 3)。该新型层粘连蛋白多肽包括两个 层粘连蛋白五肽 IKVAV(SEQ IDNO ： 1) 和 YIGSR(SEQ ID NO ： 2) 以及以下三个被设计作为潜 在的交联位点的二聚体 ： 在 N 末端位置的二聚体 (KS)、 在两个五肽之间的第二二聚体 (RS) 和在羧基末端的第三二聚体 (CV)。
因此， 如下文的实施例部分所示， 本发明人产生了包含新型层粘连蛋白多肽和抗 氧化剂 ( 超氧化物歧化酶 ) 的多糖 ( 透明质酸 )- 基水凝胶。该水凝胶当与干细胞混合时 能够诱导神经元细胞分化 ( 实施例 2 和图 2C-F)。 相反， 没有新型层粘连蛋白多肽的透明质 酸基水凝胶不能支持神经元细胞分化 ( 实施例 2， 图 2B)。另外， 用京尼平对水凝胶组分进 行交联并没有降低水凝胶支持细胞增殖和分化的能力 ( 实施例 2)。
因此， 本发明的一个方面提供包含 SEQ ID NO ： 3 所示的氨基酸序列的分离多肽。
术语 “多肽” 或 “肽” 在本文中可互换使用， 涵括天然肽 ( 降解产物、 合成法合成的 肽或重组肽 ) 和模拟肽 ( 通常为合成法合成的肽 ) 以及作为肽类似物的拟肽和半拟肽， 所 述肽类似物可具有例如能使肽在体内时更稳定或更能够渗透到细胞中的修饰。 这种修饰包 括但不限于 N 末端修饰、 C 末端修饰、 肽键修饰 ( 包括但不限于 CH2-NH、 CH2-S、 CH2-S ＝ O、 O ＝ C-NH、 CH2-O、 CH2-CH2、 S ＝ C-NH、 CH ＝ CH 或 CF ＝ CH)、 主链修饰和残基修饰。制备模拟 肽化合物的方法是本领域公知的， 在例如 Quantitative Drug Design， C.A.Ramsden Gd.， Chapter 17.2， F.Choplin Pergamon Press(1992) 中有详细说明， 该文献通过引用并入本 文， 犹如在本文中全文给出。这个方面的更多细节在下文提供。
肽当中的肽键 (-CO-NH-) 可例如被以下的键取代 ： N- 甲基化键 (-N(CH3)-CO-)、 酯 键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、 酮亚甲基键 (-CO-CH2-)、 α- 氮杂键 (-NH-N(R)-CO-)， 其中 R 为任何烷基， 例如甲基、 carba 键 (-CH2-NH-)、 羟亚乙基键 (-CH(OH)-CH2-)、 硫代酰胺键 (-CS-NH-)、 烯烃双键 (-CH ＝ CH-)、 反酰胺键 (-NH-CO-)、 肽衍生物 (-N(R)-CH2-CO-)， 其中 R 为天然呈现在碳原子上的 “正常” 侧链。
这些修饰可出现在肽链上的任何键， 甚至同时出现在几个 (2-3 个 ) 键。
天然芳族氨基酸 Trp、 Tyr 和 Phe 可用合成的非天然酸如 TIC、 萘基丙氨酸 (Nol)、 Phe 的环甲基化衍生物、 Phe 的卤化衍生物或 o- 甲基 -Tyr 取代。
除以上之外， 本发明的肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或一个或多个非氨基酸 单体 ( 例如脂肪酸、 复合碳水化合物等 )。
术语 “氨基酸” 理解为包括 20 个天然氨基酸 ； 常在体内进行翻译后修饰的氨基酸， 例如羟脯氨酸、 磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸 ； 以及其他非常见氨基酸， 包括但不限于 2- 氨基 己二酸、 羟赖氨酸、 异锁链素、 正缬氨酸、 正亮氨酸和鸟氨酸。此外， 术语 “氨基酸” 包括 D- 和 L- 氨基酸。
下表 1 和 2 列出了可用于本发明的天然氨基酸 ( 表 1) 或修饰氨基酸 ( 例如合成 氨基酸， 表 2)。
表1
7101965357 A CN 101965358说氨基酸 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 氨基酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 任何上述氨基酸明书单字母符号 A R N D C Q E G H 单字母符号 I L K M F P S T W Y V X5/23 页三字母缩写 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His 三字母缩写 Iie Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Xaa
表2 代号 Abu Mgabu Cpro 非常规氨基酸 L-N- 甲基丙氨酸 L-N- 甲基精氨酸 L-N- 甲基天冬酰胺 L-N- 甲基天冬氨酸 Aib Norb L-N- 甲基半胱氨酸 L-N- 甲基谷氨酰胺 L-N- 甲基谷氨酸 Chexa Cpen Dal Darg Dasp Dcys Dgln Dglu Dhis Dile Dleu Dlys L-N- 甲基组氨酸 L-N- 甲基异亮氨酸 L-N- 甲基亮氨酸 L-N- 甲基赖氨酸 L-N- 甲基甲硫氨酸 L-N- 甲基正亮氨酸 L-N- 甲基正缬氨酸 L-N- 甲基鸟氨酸 L-N- 甲基苯丙氨酸 L-N- 甲基脯氨酸 L-N- 甲基丝氨酸 L-N- 甲基苏氨酸 代号 Nmala Nmarg Nmasn Nmasp Nmcys Nmgin Nmglu Nmhis Nmile Nmleu Nmlys Nmmet Nmnle Nmnva Nmorn Nmphe Nmpro Nmser Nmthr非常规氨基酸 α- 氨基丁酸 α- 氨基 -α- 甲基丁酸 氨基环丙烷 羧酸 氨基异丁酸 氨基降冰片基 羧酸 环己基丙氨酸 环戊基丙氨酸 D- 丙氨酸 D- 精氨酸 D- 天冬氨酸 D- 半胱氨酸 D- 谷氨酰胺 D- 谷氨酸 D- 组氨酸 D- 异亮氨酸 D- 亮氨酸 D- 赖氨酸9101965357 A CN 101965358说Dmet Dorn Dphe Dpro Dser Dthr Dtrp 代号 Dtyr Dval Dmala Dmarg Dmasn Dmasp Dmcys Dmgln Dmhis Dmile Dmleu Dmlys Dmmet明书L-N- 甲基色氨酸 L-N- 甲基酪氨酸 L-N- 甲基缬氨酸 L-N- 甲基乙基甘氨酸 L-N- 甲基 - 叔丁基甘氨酸 L- 正亮氨酸 L- 正缬氨酸 非常规氨基酸 α- 甲基 - 氨基异丁酸 α- 甲基 -γ- 氨基丁酸 α- 甲基环己基丙氨酸 α- 甲基环戊基丙氨酸 α- 甲基 -α- 萘基丙氨酸 α- 甲基青霉胺 N-(4- 氨基丁基 ) 甘氨酸 N-(2- 氨基乙基 ) 甘氨酸 N-(3- 氨基丙基 ) 甘氨酸 N- 氨基 -α- 甲基丁酸 α- 萘基丙氨酸 N- 苄基甘氨酸 N-(2- 氨基甲酰基乙基 ) 甘氨酸7/23 页D- 甲硫氨酸 D- 鸟氨酸 D- 苯丙氨酸 D- 脯氨酸 D- 丝氨酸 D- 苏氨酸 D- 色氨酸 非常规氨基酸 D- 酪氨酸 D- 缬氨酸 D-α- 甲基丙氨酸 D-α- 甲基精氨酸 D-α- 甲基天冬酰胺 D-α- 甲基天冬氨酸 D-α- 甲基半胱氨酸 D-α- 甲基谷氨酰胺 D-α- 甲基组氨酸 D-α- 甲基异亮氨酸 D-α- 甲基亮氨酸 D-α- 甲基赖氨酸 D-α- 甲基甲硫氨酸Nmtrp Nmtyr Nmval Nmetg Nmtbug Nle Nva 代号 Maib Mgabu Mchexa Mcpen Manap Mpen Nglu Naeg Norn Nmaabu Anap Nphe Ngln10101965357 A CN 101965358说Dmorn Dmphe Dmpro Dmser Dmthr Dmtrp Dmty Dmval Dnmala Dnmarg Dnmasn Dnmasp Dnmcys Dnmleu Dnmlys Nmchexa Dnmorn Nala Nmaib Nile Nile明书N-( 氨基甲酰基甲基 ) 甘氨酸 N-(2- 羧基乙基 ) 甘氨酸 N-( 羧基甲基 ) 甘氨酸 N- 环丁基甘氨酸 N- 环庚基甘氨酸 N- 环己基甘氨酸 N- 环癸基甘氨酸 N- 环十二烷基甘氨酸 N- 环辛基甘氨酸 N- 环丙基甘氨酸 N- 环十一烷基甘氨酸 N-(2， 2- 二苯基乙基 ) 甘氨酸 N-(3， 3- 二苯基丙基 ) 甘氨酸 N-(3- 吲哚基乙基 ) 甘氨酸 N- 甲基 -γ- 氨基丁酸 D-N- 甲基甲硫氨酸 N- 甲基环戊基丙氨酸 D-N- 甲基苯丙氨酸 D-N- 甲基脯氨酸 D-N- 甲基丝氨酸 D-N- 甲基丝氨酸8/23 页D-α- 甲基鸟氨酸 D-α- 甲基苯丙氨酸 D-α- 甲基脯氨酸 D-α- 甲基丝氨酸 D-α- 甲基苏氨酸 D-α- 甲基色氨酸 D-α- 甲基酪氨酸 D-α- 甲基缬氨酸 D-α- 甲基丙氨酸 D-α- 甲基精氨酸 D-α- 甲基天冬酰胺 D-α- 甲基天冬氨酸 D-α- 甲基半胱氨酸 D-N- 甲基亮氨酸 D-N- 甲基赖氨酸 N- 甲基环己基丙氨酸 D-N- 甲基鸟氨酸 N- 甲基甘氨酸 N- 甲基氨基异丁酸 N-(1- 甲基丙基 ) 甘氨酸 N-(2- 甲基丙基 ) 甘氨酸Nasn Nglu Nasp Ncbut Nchep Nchex Ncdec Ncdod Ncoct Ncpro Ncund Nbhm Nbhe Nhtrp Nmgabu Dnmmet Nmcpen Dnmphe Dnmpro Dnmser Dnmser11101965357 A CN 101965358说Nleu Dnmtrp Dnmtyr Dnmval Gabu Tbug Etg Hphe 代号 Marg Masp Mcys Mgln Mhis Mile Dnmgln Dnmglu Dnmhis Dnmile Dnmleu Dnmlys明书D-N- 甲基苏氨酸 N-(1- 甲基乙基 ) 甘氨酸 N- 甲基 a- 萘基丙氨酸 N- 甲基青霉胺 N-( 对羟苯基 ) 甘氨酸 N-( 硫代甲基 ) 甘氨酸 青霉胺 L-α- 甲基丙氨酸 非常规氨基酸 L-α- 甲基天冬酰胺 L-α- 甲基 - 叔丁基甘氨酸 L- 甲基乙基甘氨酸 L-α- 甲基谷氨酸 L-α- 甲基高苯丙氨酸 N-(2- 甲基硫代乙基 ) 甘氨酸 N-(3- 胍基丙基 ) 甘氨酸 N-(1- 羟乙基 ) 甘氨酸 N-( 羟乙基 ) 甘氨酸 N-( 咪唑基乙基 ) 甘氨酸 N-(3- 吲哚基乙基 ) 甘氨酸 N- 甲基 -γ- 氨基丁酸9/23 页N-(2- 甲基丙基 ) 甘氨酸 D-N- 甲基色氨酸 D-N- 甲基酪氨酸 D-N- 甲基缬氨酸 γ- 氨基丁酸 L- 叔丁基甘氨酸 L- 乙基甘氨酸 L- 高苯丙氨酸 非常规氨基酸 L-α- 甲基精氨酸 L-α- 甲基天冬氨酸 L-α- 甲基半胱氨酸 L-α- 甲基谷氨酰胺 L-α- 甲基组氨酸 L-α- 甲基异亮氨酸 D-N- 甲基谷氨酰胺 D-N- 甲基谷氨酸 D-N- 甲基组氨酸 D-N- 甲基异亮氨酸 D-N- 甲基亮氨酸 D-N- 甲基赖氨酸Dnmthr Nva Nmanap Nmpen Nhtyr Ncys Pen Mala 代号 Masn Mtbug Metg Mglu Mhphe Nmet Narg Nthr Nser Nhis Nhtrp Nmgabu12101965357 A CN 101965358说Nmchexa Dnmorn Nala Nmaib Nile Nleu Dnmtrp Dnmtyr Dnmval Gabu Tbug Etg Hphe Marg Masp Mcys Mgln Mhis Mile Mleu Mmet明书D-N- 甲基甲硫氨酸 N- 甲基环戊基丙氨酸 D-N- 甲基苯丙氨酸 D-N- 甲基脯氨酸 D-N- 甲基丝氨酸 D-N- 甲基苏氨酸 N-(1- 甲基乙基 ) 甘氨酸 N- 甲基 a- 萘基丙氨酸 N- 甲基青霉胺 N-( 对羟苯基 ) 甘氨酸 N-( 硫代甲基 ) 甘氨酸 青霉胺 L-α- 甲基丙氨酸 L-α- 甲基天冬酰胺 L-α- 甲基 - 叔丁基甘氨酸 L- 甲基乙基甘氨酸 L-α- 甲基谷氨酸 L-α- 甲基高苯丙氨酸 N-(2- 甲基硫代乙基 ) 甘氨酸 L-α- 甲基赖氨酸 L-α- 甲基正亮氨酸10/23 页N- 甲基环己基丙氨酸 D-N- 甲基鸟氨酸 N- 甲基甘氨酸 N- 甲基氨基异丁酸 N-(1- 甲基丙基 ) 甘氨酸 N-(2- 甲基丙基 ) 甘氨酸 D-N- 甲基色氨酸 D-N- 甲基酪氨酸 D-N- 甲基缬氨酸 γ- 氨基丁酸 L- 叔丁基甘氨酸 L- 乙基甘氨酸 L- 高苯丙氨酸 L-α- 甲基精氨酸 L-α- 甲基天冬氨酸 L-α- 甲基半胱氨酸 L-α- 甲基谷氨酰胺 L-α- 甲基组氨酸 L-α- 甲基异亮氨酸 L-α- 甲基亮氨酸 L-α- 甲基甲硫氨酸Dnmmet Nmcpen Dnmphe Dnmpro Dnmser Dnmthr Nval Nmanap Nmpen Nhtyr Ncys Pen Mala Masn Mtbug Metg Mglu Mhphe Nmet Mlys Mnle13101965357 A CN 101965358说Mnva Mphe mser Mtrp Mval Nnbhm明书L-α- 甲基鸟氨酸 L-α- 甲基脯氨酸 L-α- 甲基苏氨酸 L-α- 甲基酪氨酸 L-N- 甲基高苯丙氨酸 N-(N-(3， 3- 二苯基丙基 )11/23 页L-α- 甲基正缬氨酸 L-α- 甲基苯丙氨酸 L-α- 甲基丝氨酸 L-α- 甲基缬氨酸 L-α- 甲基亮氨酸 N-(N-(2， 2- 二苯基乙基 ) 氨基甲酰基甲基 - 甘氨酸 1- 羧基 -1-(2， 2- 二苯基 乙基氨基 ) 环丙烷
Morn Mpro Mthr Mtyr NmhpheNnbhm Nmbc氨基甲酰基甲基 (1) 甘氨酸Nnbhe本发明的肽优选以线性形式应用， 不过要领会， 在环化不会严重干扰肽特性的情 况中， 也可应用环形的肽。
由于本发明的肽可应用于要求肽为可溶性形式的治疗或诊断中， 本发明的肽优选 包含一个或多个非天然的或天然的极性氨基酸， 包括但不限于由于其含羟基的侧链而能够 增加肽的溶解度的丝氨酸和苏氨酸。
本发明的肽可通过肽合成领域的技术人员知道的任何技术来合成。 对于固相肽合 成， 多种技术的概述可见于 J.M.Stewart 和 J.D.Young， Solid Phase Peptide Synthesis， W.H.Freeman Co.( 美 国 旧 金 山 )， 1963 及 J.Meienhofer， Hormonal Proteins and Peptides， 第 2 卷第 46 页， Academic Press( 美国纽约 )， 1973。对于经典的溶液合成， 参见 G.Schroder 和 K.Lupke， The Peptides， 第 1 卷， Academic Press( 美国纽约 )， 1965。
大体上说， 这些方法包括将一个或多个氨基酸或经适当保护的氨基酸依次添加到 增长中的肽链。 通常， 用合适的保护基保护第一个氨基酸的氨基或羧基。 接着可将该经保护 的或衍生化的氨基酸连接到惰性固相载体或应用于溶液中， 在适合形成酰胺键的条件下添 加序列中的具有经适当保护的互补基团 ( 氨基或羧基 ) 的下一个氨基酸。然后从这个新添 加的氨基酸残基除去保护基， 再添加下一个氨基酸 ( 经适当保护 )， 如此不断进行下去。在 所有所需的氨基酸已按正确顺序连接后， 将任何剩余的保护基 ( 和任何固相载体 ) 依次或 同时除去， 以得到最终的肽化合物。 通过对这个通用的程序进行简单更改， 就可以将一个以 上的氨基酸一次添加到增长中的链， 例如通过 ( 在不会使手性中心外消旋化的条件下 ) 将 经保护的三肽与经适当保护的二肽偶联以在脱保护后形成五肽， 如此不断添加。有关肽合 成的更多描述在美国专利第 6,472,505 号中公开。
制备本发明肽化合物的优选方法涉及固相肽合成。
大规模肽合成由 Andersson Biopolymers 2000 ； 55(3) ： 227-50 描述。
在 需 要 大 量 的 或 者 长 的 多 肽 ( 例 如 长 度 超 过 20 个 氨 基 酸 ) 的 情 况 中， 可用 例如以下文献中所述的重组技术产生本发明的多肽 ： Bitter 等人， (1987)Methods in Enzymol.153 ： 516-544， Studier 等 人 (1990)Methods in Enzymol.185 ： 60-89， Brisson 等 人 (1984)Nature310 ： 511-514， Takamatsu 等 人 (1987)EMBO J.6 ： 307-311， Coruzzi 等 人 (1984)EMBO J.3 ： 1671-1680， Brogli 等 人， (1984)Science224 ： 838-843， Gurley 等 人 (1986)Mol.Cell.Biol.6 ： 559-565 及 Weissbach&Weissbach， 1988， Methods for Plant Molecular Biology， Academic Press， NY， Section VIII， 第 421-463 页。
可将本发明的多肽与多糖进行组合以产生水凝胶或基质。
多糖可从生物如细菌 ( 例如假单胞杆菌 (Pseudomonas sp NCIB11264， 美国专利 第 4298725 号 ) 提取和分离， 或者可通过在合适的条件下使碳水化合物亚单位 ( 例如糖类 如葡萄糖、 葡糖胺、 N-Ac-glcNH2、 糖醛酸或其他单糖或二糖 ) 进行化学反应而合成产生 ( 参 见例如美国专利第 5,558,899 号 )。多糖可为线性结构或带支链结构， 分子量为约 10,000 6 至约 3×10 道尔顿。
根据本发明的一些实施方案， 多糖是生物学上惰性的， 在普通条件下与其他物质 的反应率低。 根据本发明的一些实施方案， 多糖是生物相容性的， 例如当与生物的细胞、 组织或 体液接触时不会引起不良反应， 如免疫反应和 / 或排斥、 细胞死亡等。生物相容性多糖也可 以是生物可降解的。
根据本发明的一些实施方案， 多糖能够在水溶液中形成高度水合的凝胶。
合适的多糖的实例包括但不限于透明质酸 [ 例如透明质酸钠 (Na-HA)， Hou S 等 人， 2005， J.Neurosci.Methods.6 月 21 日 ； 印刷前电子版 ]、 藻酸盐、 琼脂糖、 壳聚糖、 果胶、 合成聚合物如甲基纤维素、 聚乙醇酸和聚乳酸 ( 例如 Fukuhara S. 等人 Circ.J.69 ： 850-7， 2005)、 透明质酸 (HA) 水凝胶、 纤维素、 糖原、 淀粉、 麦芽糖糊精、 右旋糖酐、 β- 葡聚糖、 海带 多糖和几丁质。根据本发明的一些实施方案， 本发明的多糖是透明质酸。
根据本发明的一些实施方案， 组成物还包含能保护细胞或大分子 ( 例如多糖 ) 免 受氧化胁迫 ( 由自由基引起的氧化损害 ) 的抗氧化剂。因此， 抗氧化剂能通过防止大分子 的氧化解聚而延长它们的存留期。
合适的抗氧化剂的非限制性实例包括分子类如谷胱甘肽、 维生素 C( 抗坏血酸 钠 )、 维生素 E( 生育酚和生育三烯醇 )、 N-Ac-L- 半胱氨酸、 氢醌、 谷氨酸盐， 或者酶类如过氧 化氢酶、 超氧化物歧化酶、 谷胱甘肽过氧化物酶或其他过氧化物酶以及葡萄糖 -6- 磷酸脱 氢酶 (G6PD)( 参见 Osmen I.， Naziroglu M.， Okutan R.Comparative study ofantioxidant enzymes in tissues surrounding implant in rabbits( 兔子中植入物周围的组织中的抗 氧化酶的比较研究 ).Cell.Biochem.Funct.24 ： 275-281， 2006)。
超氧化物歧化酶除了它已知的作为抗氧化剂的活性之外， 当在体内使用时还可充 当抗炎剂。可用于本发明组合物的超氧化物歧化酶 (SOD) 的非限制性实例包括 SOD-1( 可 溶性 )、 SOD-2( 线粒体 ) 或 SOD-3( 胞外 )， 如人类可溶性超氧化物歧化酶 1(SOD-1)GenBank 登录号 NP_000445(SEQ ID NO ： 4) ； 人类线粒体超氧化物歧化酶 2(SOD-2)GenBank 登录号 NP_001019637.1( 同 种 型 B)、 NP_001019636.1( 同 种 型 A)、 NP_0627.2( 同 种 型 A) ； 人类
胞外超氧化物歧化酶 3(SOD-3)GenBank 登录号 NP_003093.2 ； 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)SOD-1GenBank 登 录 号 NP_012638.1 ；和 褐 家 鼠 (Rattus norvegicus) SOD-1GenBank 登录号 NP_058746。
本 发 明 的 抗 氧 化 剂 可 通 过 重 组 技 术 产 生。 例 如， 可将编码超氧化物歧化酶 1(GenBank 登录号 NM_000454 ； SEQ ID NO ： 5) 的多核苷酸连接到适合在宿主细胞 ( 例如细 菌细胞、 酵母细胞、 哺乳动物细胞 ) 中表达的核酸构建物。这种核酸构建物包含指导多核苷 酸序列在细胞中以组成型或诱导型方式转录的启动子序列， 且还可包含能使这个载体适合 于在原核生物、 真核生物或优选这两种生物 ( 例如穿梭载体的情况 ) 中复制和整合的序列 ； 转录和翻译起始序列、 增强子、 转录和翻译终止子和可提高 mRNA 翻译的效率的聚腺苷酸化 信号 ； 针对分泌的信号序列 ； 被工程改造成能增强所表达的多肽的稳定性、 生产、 纯化、 产 率或毒性的序列。
抗氧化剂可用多种标准的蛋白质纯化技术进行回收和纯化， 如但不限于亲和层 析、 离子交换层析、 过滤、 电泳、 疏水相互作用色谱、 凝胶过滤色谱、 反相色谱、 伴刀豆球蛋白 A 色谱、 色谱聚焦和差异溶解。
根据本发明的一些实施方案， 抗氧化剂以 “基本上纯的” 形式回收。本文所用的词 语 “基本上纯的” 指能让重组多肽作为抗氧化剂进行有效使用的纯度。 本发明人在将本发明进一步付诸实施时揭示， 包含透明质酸、 层粘连蛋白多肽和 超氧化物歧化酶的组成物 ( 例如为水凝胶的形式 ) 能支持神经元细胞分化。
本文所用的术语 “层粘连蛋白” 指构成基膜的主要非胶原组分的胞外基质糖蛋白 家族。层粘连蛋白已被指涉及很多种生物过程， 包括细胞黏着、 分化、 迁移、 信号转导、 神经 突长出和转移。层粘连蛋白由层粘连蛋白 α、 β、 γ 这 3 个不相同的链组成， 各链由不同的 基因编码。
本文所用的词语 “层粘连蛋白多肽” 指包含层粘连蛋白多肽的至少 4 个连续氨基 酸且显示生物活性 ( 例如支持细胞生长、 增殖、 分化和 / 或迁移 ) 的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施方案， 层粘连蛋白多肽可包括层粘连蛋白 α 链的氨基酸序 列， 如 LAMA1( 例如 GenBank 登录号 NP_005550.2)、 LAMA2( 例如 GenBank 登录号 NP_000417.2 和 NP_001073291.1)、 LAMA3( 例如 GenBank 登录号 NP_937762.1 和 NP_000218.2)、 LAMA4( 例 如 GenBank 登 录 号 NP_001098677.1、 NP_001098676.1、 NP_002281.2、 NP_001098679.1 和 NP_001098678.1) 及 LAMA5( 例如 GenBank 登录号 NP_005551.3) ； 层粘连蛋白 β 链的氨 基 酸 序 列， 如 LAMB1( 例 如 GenBank 登 录 号 NP_002282.1)、 LAMB2( 例 如 GenBank 登 录 号 NP_002283.3)、 LAMB3( 例如 GenBank 登录号 NP_000219.2 和 NP_001017402.1) 及 LAMB4( 例 如 GenBank 登录号 NP_031382.2) ； 和 / 或层粘连蛋白 γ 链的氨基酸序列， 如 LAMC1( 例如 GenBank 登录号 NP_002284.3)、 LAMC2( 例如 GenBank 登录号 NP_05553.2 和 NP_061486.2) 及 LAMC3( 例如 GenBank 登录号 NP_06050.3)。
根据本发明的一些实施方案， 层粘连蛋白多肽包括层粘连蛋白序列的重复氨基酸 序列 ( 例如 4 或 5 个氨基酸的重复序列 )。
可包含在本发明组成物中的层粘连蛋白多肽的非限制性实例包括 SEQ ID NO ： 1、 2 或 3 所示的肽。
应指出， 由于本发明组成物中所包含的各成分可用合成技术或重组技术制备， 它
们可作为分析级或药物级的高纯无菌制品获得。
如上所述， 本发明人从多糖 ( 透明质酸 )、 抗氧化剂 ( 超氧化物歧化酶 ) 和 SEQ ID NO ： 3 所示的新型层粘连蛋白多肽产生了水凝胶 ( 参见下文实施例部分的实施例 1)。
因此， 本发明一些实施方案的一个方面提供产生水凝胶的方法。该方法包括将本 发明的组成物悬浮于水中以获得包含至少约 50％水的悬浮液， 从而产生水凝胶。
本文所用的术语 “水凝胶” 指包含本发明的组成物和水的材料， 其中水占 50％以 上。
根据本发明的一些实施方案， 水凝胶包含至少约 60％水、 至少约 70％水、 至少约 80％水、 至少约 90％水、 至少约 95％水、 至少约 96％水、 至少约 97％水、 至少约 98％水、 至少 约 99％水。
根 据 本 发 明 的 一 些 实 施 方 案， 透 明 质 酸 以 在 水 凝 胶 中 约 0.3-2 ％、 例如约 0.4-1.8％、 例如约 0.5-1.6、 例如约 0.5-1.5％、 例如约 0.6-1.4％、 例如约 0.8-1.2％、 例如 约 1.2％的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案， 层粘连蛋白多肽 ( 例如 SEQ ID NO ： 3) 以在水凝胶中 约 10-200μg/ml、 例如约 20-100μg/ml、 例如约 50μg/ml 的浓度范围提供。
根据本发明的一些实施方案， 超氧化物歧化酶以在水凝胶中约 8μM( 约 0.25 微克 /ml) 至 8mM( 约 250 微克 /ml) 的浓度范围提供。例如， 超氧化物歧化酶可以以约 0.5μg/ ml 至约 200μg/ml、 例如约 1μg/ml 至约 100μg/ml、 例如约 2μg/ml 至约 80μg/ml、 例如 约 4μg/ml 至约 40μg/ml、 例如约 5μg/ml 至约 50μg/ml、 例如约 10μg/ml 至约 50μg/ ml、 例如约 15μg/ml 至约 40μg/ml、 例如约 20μg/ml 至约 30μg/ml、 例如约 25μ/ml 的浓 度范围提供。
根据本发明的一些实施方案， 该方法还包括将组成物进行交联。组成物中所包含 的各成分 ( 例如多糖、 抗氧化剂和层粘连蛋白多肽 ) 的交联 ( 即通过共价键或离子键结合 ) 可用本领域知道的任何交联剂或偶联剂来进行。
合适的交联剂的非限制性实例包括辛二亚氨酸二甲酯 ( 一种亚氨酸酯交联剂 ) ； 双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯 (BS3 ； 一种 NHS- 酯交联剂 ) ； 甲醛 ； 1- 乙基 -3-[3- 二甲氨基 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐 (EDC ； 碳二亚胺交联剂 ) ； N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)[Mao J.S 等人， Biomaterials.24， 1621-1629， 2003 ； Choi Y.S. 等 人， J.Biomed.Mater.Res.48， 631-639， 1999 ； Richert L. 等 人， Biomacromolecules， 5， 284-294， 2004)] ； 二 乙 烯 基 砜 (DVS) ； 和 京 尼 平 [Sung H.W. 等 人， J Biomed.Mater.Res.A， 64A ： 427-438， 2003 ； Chen SC. 等 人， J.Control Release.96， 285-300， 2004 ； Mwale F. 等 人， Tissue Eng.， 11， 130-40， 2005 ； Chen H. 等人， Biomacromolecules， 7， 2091-2098， 2006]。
对于离体或体内交联， 可将光活性氨基类似物 ( 亮氨酸和甲硫氨酸的 diazirine 类似物 ) 加到组成物， 在暴露于紫外光之后， diazirine 被活化而结合相互作用性的侧链 ( 例如羧基或氨基 )。
根据本发明的一些实施方案， 交联是用无毒的和 / 或生物相容性的物质进行。实 例包括但不限于 3- 二甲基 - 氨基丙基 )-N- 乙基碳二亚胺 (EDC-N ； Sigma-Aldrich-Fluka， 美国密苏里州 St Louis， 63178， 目录号 03459)、 二乙烯基砜 (DVS ； Sigma， 目录号 V-370-0) 和京尼平 (Sigma 目录号 G-4796)。根据本发明的一些实施方案， 将水凝胶通过本领域公知的方法进行冻干， 从而获 得干的基质。应指出的是， 无水基质可长时间保存而不被酶促降解或污染 ( 例如微生物污 染 )。
本文所用的词语 “基质” 指包含本发明组合物的二维或三维支持构架。
基质可以以干的形式或湿的形式保持， 或者可按照预定用途进行冷冻。
应指出的是， 干的基质可在水溶液 ( 例如水 ) 中再水化， 直到形成水凝胶。
根据本发明的一些实施方案， 水凝胶或基质还包含细胞 ( 参见下文实施例 2)， 如 干细胞或分化细胞。
本文所用的词语 “干细胞” 指在被诱导分化成具有特定的专门功能的其他细胞类 型 ( 例如完全分化细胞 ) 之前能够在培养中长时间保持在未分化状态的细胞 ( 例如万能或 多能干细胞 )。
本发明可使用的干细胞的非限制性实例包括胚胎干细胞、 诱导万能干细胞 (iPS)、 造血干细胞 ( 例如骨髓干细胞、 脐带血细胞、 外周血干细胞 )、 成人干细胞和间充质干细胞。
本发明可使用的分化细胞的非限制性实例包括神经细胞、 视网膜细胞、 表皮细胞、 肝细胞、 胰细胞、 骨细胞、 软骨细胞、 弹性细胞、 纤维状细胞、 肌细胞、 心肌细胞、 内皮细胞、 平 滑肌细胞和造血细胞 ( 例如淋巴细胞 )。
根据本发明的一些实施方案， 干细胞是神经元祖细胞 ( 如获自胚胎或胎儿神经元 组织或大脑的那些神经元祖细胞 )。
如上所述和实施例 2 中所述 ( 例如图 2C-F)， 水凝胶当用衍自胎儿大脑的干细胞接 种时， 能够使细胞分化成神经元细胞。
因此， 本发明一些实施方案的一个方面提供诱导组织的离体形成的方法。该方法 是如下实现的 ： (a) 提供本发明的基质或水凝胶， 和 (ii) 用在适合于细胞的增殖、 分化和 / 或迁移的培养基中的细胞对基质或水凝胶进行接种， 从而诱导组织的形成。
词语 “组织” 指执行相似功能的一组细胞。实例包括但不限于大脑组织、 神经元组 织、 视网膜、 皮肤组织、 肝组织、 胰组织、 骨、 软骨、 结缔组织、 血组织、 肌肉组织、 心脏组织、 血 管组织、 肾组织、 肺组织、 性腺组织、 造血组织。根据本发明的一些实施方案， 词语 “组织” 还 涵括 “器官” ， 即动物中为某种特定功能而特化的完全分化的结构和功能单位。器官的非限 制性实例包括头、 大脑、 眼、 骨 ( 例如腿骨和手骨 )、 心脏、 肝脏、 肾脏、 肺、 胰脏、 卵巢、 睾丸和 胃。
根据本发明的一些实施方案， 组织是神经组织。
术语 “接种” 指将细胞铺板、 放置和 / 或滴落在本发明基质或水凝胶内部、 下方或 上方。
接种细胞的浓度取决于所用的细胞类型和基质或水凝胶各组分的浓度。
根据本发明这个方面所用的培养基可以是任何适于诱导本发明细胞 ( 例如干细 胞 ) 增殖、 分化和 / 或迁移成更特化的 ( 即分化的 ) 细胞的组织培养基。 根据本发明的一些 实施方案， 培养基补加有矿物质、 氨基酸和 / 或营养物 ( 例如如下文实施例 2 中所述， Eagle 培养基补加有谷氨酰胺和葡萄糖 )， 或者还补加有血清和 / 或生长因子。
在接种后， 用显微镜 ( 例如倒置显微镜、 轴平面光学显微镜或电子显微镜 ) 例行检 查基质或水凝胶， 以评估细胞的生长、 扩散和组织形成情况 ( 参见例如图 2A-F)。根据本发明的一些实施方案， 可将离体形成的组织再移植到受试者。在这种情况 中， 接种在基质或水凝胶当中的细胞可衍自被治疗个体 ( 自体同源 )， 或者衍自异基因来 源， 如预期不会引起免疫原性反应的胚胎干细胞。
本文所用的术语 “受试者” 包括男女老幼。根据本发明的一些实施方案， 该术语涵 括遭受如下所述的病状的个体。
本发明的一个方面提供诱导体内组织形成和 / 或治疗具有以组织患病、 损伤或损 失为特征的病状的受试者的方法。该方法是这样实现的 ： 将本发明的基质或水凝胶植入在 受试者的患病、 损伤或损失的组织处或附近， 从而诱导组织的形成和 / 或治疗受试者。
本文所用的词语 “以组织患病、 损伤或损失为特征的病状” 指任何显示组织损伤 ( 即不发挥功能的组织、 癌组织或前癌组织、 被破坏的组织、 断裂组织、 纤维化组织或局部缺 血组织 ) 或组织损失 ( 例如在创伤、 传染病、 遗传疾病等之后 ) 而要求进行组织再生的病 恙、 疾病或病况。要求进行组织再生的病恙或病况的实例包括但不限于如丙型肝炎患者中 的肝硬化 ( 肝脏 )、 I 型糖尿病 ( 胰脏 )、 囊性纤维变性 ( 肺、 肝脏、 胰脏 )、 骨癌 ( 骨 )、 烧伤 和伤口修复 ( 皮肤 )、 年龄相关性黄斑变性 ( 视网膜 )、 心肌梗塞、 心肌修复、 CNS 损伤 ( 髓 鞘质 )、 关节软骨缺陷 ( 软骨细胞 )、 膀胱变性、 肠变性等。
词语 “治疗” 指抑制或停止疾病、 病恙或病况的发展和 / 或造成疾病、 病恙或病况 的减少、 减弱或消退。本领域技术人员会知道， 有多种方法和测定可用来评估疾病、 病恙或 病况的发展， 同样也有多种方法和测定可用来评估疾病、 病恙或病况的减少、 减弱或消退。
本领域技术人员能够确定何时和如何植入基质或水凝胶， 从而在受试者中诱导 组织形成。参见例如 Artzi Z 等人， 2005， J.Clin.Periodontol.32 ： 193-9 ； Butler CE 和 Prieto VG， 2004， Plast.Reconstr.Surg.114 ： 464-73。
如果需要， 可将本发明的组合物、 基质和 / 或水凝胶在包装或分配器装置中提供， 如 FDA 批准的试剂盒， 或者制品 ( 带包装材料 )， 这些装置可装有一个或多个含活性成分的 单位剂量形式。包装可例如包含金属或塑料薄片， 如水泡眼包装。包装或分配器装置可附 有说明书， 说明如何进行给药、 植入， 和 / 或离体或体内形成、 再生和 / 或修复组织， 和/或 治疗受试者。包装或分配器还可附有监管药物的生产、 使用或销售的政府机关所规定形式 的告示， 该告示反映该机关对组合物形式或者人用或兽医用给药的批准。这种告示例如可 为美国食品与药物管理局对处方药所批准的标签， 或者可为经批准的产品插页。在相容的 药物载体中配制的本发明组合物、 基质或水凝胶也可制备、 放置在适当的容器中， 并标明用 于治疗上文所详述的指定病症。
本文所用的术语 “约” 指 ±10％。
术语 “包含” 、 “包括” 、 “具有” 指 “包括但不限于” 。
术语 “由 ...... 组成” 指 “包括且限于” 。
术语 “基本上由 ...... 组成” 指组合物、 方法或结构可包括另外的成分、 步骤和 / 或部分， 但要求这些另外的成分、 步骤和 / 或部分不实质上改变请求权利保护的组合物、 方 法或结构的基本和新型特征。
本文所用的名词形式上为单数， 但也具有复数指代含义， 除非上下文清楚表明并 非如此。例如， 术语 “化合物” 或 “至少一种化合物” 可包括多种化合物， 包括它们的混合物 在内。在本申请中， 本发明的多个实施方案可以以范围形式给出。 应理解， 以范围形式进 行描述仅仅是为了方便简明起见， 不应解释为对本发明的范围的硬性限制。 因此， 对某个范 围的描述应被认为是具体公开了该范围当中的所有可能的亚范围以及单个数值。例如， 对 诸如 1-6 的范围的描述应被认为是具体公开了诸如 1-3、 1-4、 1-5、 2-4、 2-6、 3-6 等的亚范 围， 以及该范围当中的单个数值， 例如 1、 2、 3、 4、 5 和 6。不管范围的宽度如何， 这都适用。
本文中当指定数值范围时， 意指包括该指定范围内的任何述及的数值 ( 分数或整 数 )。词语 “在第一指定数值和第二指定数值之间” 与 “从第一指定数值到第二指定数值” 在本文中可互换使用， 意指包括第一和第二指定数值以及它们之间的所有分数和整数。
本文所用的术语 “方法” 指完成给定任务的方式、 手段、 技术和程序， 包括但不限于 为化学、 药学、 生物学、 生化和医学领域的从业人员所知道的那些方式、 手段、 技术和程序， 或者这些从业人员容易从已知的方式、 手段、 技术和程序开发得到的那些方式、 手段、 技术 和程序。
应认识到， 本发明的某些特征为清楚起见在各个单独实施方案的情形中进行描述 的， 也可在单个实施方案中组合在一起来提供。 反过来， 本发明的多个特征为简明起见在单 个实施方案的情形中进行描述的， 也可以单独提供， 或者以任何合适的次级组合提供， 或者 在适当情况下在本发明的任何其他所描述的实施方案中提供。 某些在各个实施方案的情形 中描述到的特征不应被认为是这些实施方案的必要特征， 除非该实施方案没有这些要素的 话就不能起作用。
在上文描述的和在下文权利要求书中请求权利保护的本发明各个实施方案和方 面， 在以下实施例部分得到实验支持。 实施例 现将论及以下实施例， 这些实施例与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的 一些实施方案。
一 般 来 讲， 本 文 所 用 的 术 语 和 本 发 明 中 用 到 的 实 验 室 程 序 包 括 分 子 技 术、 生 化 技 术、 微 生 物 学 技 术 和 重 组 DNA 技 术。 这 些 技 术 在 文 献 中 有 详 尽 说 明。 参 见 例 如″ Molecular Cloning ： A laboratory Manual ″ Sambrook 等人， (1989) ；″ Current Protocols in Molecular Biology″第 I-III 卷， Ausubel， R.M. 编辑 (1994) ； Ausubel 等 人， ″ Current Protocols inMolecular Biology ″， John Wiley 和 Sons， Baltimore， Maryland(1989) ； Perbal，″ A Practical Guide 至 Molecular Cloning″， John Wiley &Sons， New York(1988) ； Watson 等 人， ″ Recombinant DNA ″， ScientificAmerican Books， New York ； Birren 等 人 ( 编 辑 ) ″ Genome Analysis ： ALaboratory Manual Series″， 第 1-4 卷， Cold Spring Harbor LaboratoryPress， New York(1998) ； 在美国专 利 第 4,666,828 号 ； 第 4,683,202 号 ； 第 4,801,531 号 ； 第 5,192,659 号 和 第 5,272,057 号 中 提 出 的 方 法 ；″ CellBiology ： A Laboratory Handbook ″， 第 I-III 卷， Cellis， J.E. 编 辑 (1994) ； ″ Current Protocols in Immunology ″，第 I-III 卷， Coligan J.E. 编 辑 (1994) ； Stites 等 人 ( 编 辑 )， ″ Basic and Clinical Immunology ″ ( 第 8 版 )， Appleton&Lange， Norwalk， CT(1994) ； Mishell 和 Shiigi( 编 辑 )， ″ Selected Methods in Cellular Immunology ″， W.H.Freeman 和 Co.， NewYork(1980) ； 可采用的
免疫测定法在专利和科学文献中有广泛描述， 参见例如以下各号美国专利 3,791,932、 3,839,153 、 3,850,752 、 3,850,578 、 3,853,987 、 3,867,517 、 3,879,262 、 3,901,654 、 3,935,074 、 3,984,533 、 3,996,345 、 4,034,074 、 4,098,876 、 4,879,219 、 5,011,771 和 5,281,521 ； ″ Oligonucleotide Synthesis ″ Gait， M.J. 编 辑 (1984) ； “Nucleic Acid Hybridization ″ Hames， B.D. 和 Higgins S.J. 编 辑 (1985) ；″ Transcription and Translation ″ Hames， B.D. 和 Higgins S.J. 编 辑 (1984) ； ″ Animal Cell Culture ″ Freshney， R.I. 编 辑 (1986) ； ″ ImmobilizedCells and Enzymes ″ IRL Press， (1986) ； ″ A Practical Guide to MolecularCloning″ Perbal， B.， (1984) 以 及 ″ Methods in Enzymology ″，第 1-317 卷， Academic Press ； ″ PCR Protocols ： A Guide to Methods AndApplications ″， Academic Press， San Diego， CA(1990) ； Marshak 等 人， ″ Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual″ CSHL Press(1996) ； 所有这些文献和专利都通过引用并入本 文， 犹如在本文中全文提出。其他的一般参考文献在本文件通篇有提供。这些文献中的程 序方法据信是本领域公知的， 并为读者方便起见而提供。这些文献中所包含的所有信息都 通过引用并入本文。
实施例 1
透明质酸 - 超氧化物歧化酶和层粘连蛋白肽水凝胶的产生
透明质酸 - 透明质酸钠是天然的高分子量 (3×106 道尔顿 ) 线性多糖， 存在于结缔 组织的胞外基质、 皮肤、 软骨、 滑液、 眼睛的玻璃状液和许多其他部位。透明质酸钠 (Na-HA) 是药理学上惰性聚合物， 在水溶液中形成具有粘弹性特征的高度水化凝胶形式。这种制品 被： (1) 用作眼科手术助剂， 保持手术过程中眼睛组织细胞器完整， 所述手术例如人工晶体 插入、 晶状体囊内和囊外摘出、 白内障和青光眼手术、 角膜移植手术、 视网膜脱离和玻璃体 置换手术 ； (2) 用于关节置换手术。 Na-HA 注射液可充当粘弹补充物以改善炎性状态和炎性 介质， 充当抗炎剂和抗炎介质， 通过其自身 (HA) 切割和解聚起到中和自由基和氧化剂的作 用； 和 (iii) 有新的方法采用 HA 作为友好生物材料， 结合在组织工程构建物中， 作为细胞和 组织的支持结构、 定向、 迁移和再生的支架凝胶， 在肿瘤切除时用作空缺填充物。 反过来， HA 容易被透明质酸酶切割消除， 从而为细胞迁移腾出通路。
超氧化物歧化酶 - 存在于细胞的胞质中的人细胞溶胶 Cu-Zn-SOD 是分子量为 32,500 道尔顿的同型二聚体。 两个相同的亚单位主要通过疏水相互作用和静电相互作用连 接在一起。铜和锌的配体是组氨酸侧链 ( 图 1)。
新型层粘连蛋白合成肽 KSIKVAVRSYIGSRCV(SEQ ID NO ： 3) 的产生 - 层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3) 含有两个五肽 ： IKVAV 序列 (SEQ ID NO ： 1) 和 YIGSR 序列 (SEQ ID NO ： 2)， 这两个五肽模拟神经元上的完整层粘连蛋白分子的活性 ； 以及 3 个另外的二聚体 ： 在N末 端位置的二聚体 (KS)、 在两个五肽之间的第二二聚体 (RS) 和在尾部羧基末端的第三二聚 体 (CV)( 参见图 3)。二聚体是作为间隔物和作为潜在的交联位点设置， 因此它们不应打断 两个五肽的序列 (SEQ ID NO ： 1 和 2)。
交联剂 - 交联剂在构成水凝胶的三个元件 (Na-HA( 透明质酸钠 ) ； LN 肽 ( 层粘连 蛋白肽 ) ； Cu-Zn-SOD) 之间形成共价键。为了在交联过程中形成共价键而又不丧失被键合 的元件的生物活性， 有几种交联剂可以使用， 如 EDC-N-(3- 二甲氨基丙基 )-N- 乙基碳二亚胺、 DVS- 二乙烯基砜和京尼平。交联的原理主要在于 ： 使游离伯氨基与羧基结合， 或者在接 近的羟基之间氧化， 形成活性醛， 互相相互作用， 或者与另外的缀合物的胺相互作用， 通过 硫醇残基形成。
材料和实验方法
透明质酸钠 - 透明质酸钠 (HA) 由 Bio-Technology General(BTG)Corporation Ltd.( 以色列 Kiryat Weizmann， Rehovot 76326 和 Be’ erTuvia， Industrial Zone， P.O.Box 571， Kiryat Malachi， 83104) 从因其荚膜分泌量高而被选出的链球菌属菌株生产。它是 从分泌的荚膜经多步骤纯化产生不含蛋白质、 氮或热原物质的无菌制品而作为高度纯品获 得。
Cu， Zn 超氧化物歧化酶 (Cu-Zn-SOD)-SOD[EC 1.15.1.1， 可溶性人类超氧化物歧 化酶 1 ； GenBank 登录号 NP_000445(SEQ ID NO ： 4 多肽 ) 和 GenBank 登录号 NM_000454(SEQ ID NO ： 5 多核苷酸 )] 是由 BTG Ltd(Savient et.Ferring) 基本上按 Hartman JR. 等人， 1986(Proc.Natl.Acad.Sci.USA， Vol ： 83， 第 7142-7146 页 ) 的描述在细菌 ( 大肠杆菌 ) 中 重组产生。
新型层粘连蛋白肽的合成 (SEQ ID NO ： 3)- 由美国加州 Hayward(94545) 的 Elim Biopharmacenticals， Inc 进行。 水凝胶的产生 - 为制备 10ml 水凝胶， 用磁力搅拌器将 120mg 的透明质酸钠 (HA) 在水中溶解 24 小时， 然后加入 50μl 的 SOD(5mg/ml) 和 500μg 的层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3， 为干粉形式 ) 并混合成水凝胶。
构成水凝胶的元件的分析测定 ：
透 明 质 酸 钠 - 透 明 质 酸 的 总 含 量 是 基 于 糖 醛 酸 ( 葡 糖 醛 酸 ) 的 含 量， 采用 carbazol 试 剂 按 Dische(Dische Z.A new specific color reactionof hexuronic Acids.J.Biol.Chem， 167， 189-197， 1947) 的常规试验法进行测定。透明质酸的分子量是 通 过 用 Brookfield 牌 Cone/Plate DVII+Per(Brookfield Engineering Laboratories Inc. 美国马萨诸塞州 Middleboro， 02346-1031) 数字粘度计测量粘度来估计。透明质酸 的分子量也可通过 Dische 测定中获得的数值与 Park-Johnson(Park J.T.Johnson M.J.A submicrodetermination of glucose J.Biol.Chem.181， 149-151， 1949)) 的还原糖测定所 获得的数据之间的差异进行计算。
超氧化物歧化酶活性的测定 -SOD 活性是在 560nm 处测定为黄嘌呤氧化酶对黄 嘌呤氧化过程中产生超氧化物阴离子时硝基四氮唑蓝的还原的抑制速率。反应混合物含 有溶于 50mM 磷酸钾钠缓冲液 (pH 7.8， 25℃ ) 的 50mM 碳酸钠、 0.1mM EDTA、 0.1mM 黄嘌呤、 0.025mM 硝基四氮唑蓝。对于 1 单位的活性， 取在标准条件下使硝基四氮唑蓝还原被抑制 50％的蛋白质的量。膜结合的含锰 (Mn)SOD 可测定为总 SOD 活性与用 2％ SDS Cu/Zn-SOD 处理样品后测定的 Cu/Zn- 酶活性之差， 在组织的细胞溶胶部分和在从细胞获得的裂解液 测量。
LN 的活性肽测定 - 用免疫组织化学染色方法， 通过特异性的抗 IKVAV(SEQ ID NO ： 1) 和 YIGSR(SEQ ID NO ： 2) 抗 体 或 者 抗 层 粘 连 蛋 白 抗 体 (Sigma 目 录 号 L 9393， Sigma-Aldrich， 以色列 ) 检测 LN 的五肽。
实验结果
本发明人从以下三个元件产生了水凝胶 ： 透明质酸钠、 新型层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3) 和抗氧化剂 ( 例如 SOD)。
这种水凝胶显示独特的物理特征 ： (i) 与涂覆塑料表面的膜例如纤连蛋白、 聚赖 氨酸共存 ； (ii) 在等渗盐溶液 ( 培养基 ) 中的导电率为 11.0mOhm/cm( 相比之下， 单独的透 明质酸的导电率为 1.37mOhm/cm) ； (iii) 具有粘稠性， 例如 1％ HA 在 100rpm 和 25℃下为 82 厘泊 ； (iv) 具有透明性 ； 和 (v) 所添加成分的含量释放慢。
该水凝胶中的透明质酸 - 透明质酸盐组分 (NaHA) 是 (i) 线性、 伸展、 高分子量、 高 度水化的透明质酸 (HA) 钠盐。浓度范围在 0.5％至 1.5％之间 ； (ii) 仅用每个二聚体的羧 基形成聚阴离子聚合物。 其他潜在的低活性基团、 羟基和 N- 乙酰化胺 ； (iii) 产生粘度取决 于 HA 浓度的水凝胶构建物 ； (iv) 友好的环境， 保持气态氛围， 保护营养添加剂， 在室温下， 培养箱外 ； 和 (v) 表征胎儿生命的健康环境， 支持快速完美无疤痕的创伤愈合。
可作为水凝胶溶液长时间保持独特的水凝胶特征， 数星期到 1-2 个月时间里各成 分释放慢或者无释放， 可在使用前较长时间加入 ； 生物相容性 ( 不引起炎症介质 ) ； 在修复 组织的再生 - 愈合期间生物可降解。
这个水凝胶可用来支持各种细胞如神经元细胞的生长、 增殖和分化。该水凝胶可 影响富神经元培养物中以及体内移植的富复合神经元植入物中的出芽轴突增殖密度， 比不 包含这种水凝胶的培养物和植入物显著多得多。因此， 预期当施加于损失量大的受伤周围 神经上时， 再生、 愈合和功能化的步伐加快。
本发明人开发的独特水凝胶能刺激胞外环境， 在植入时能支持体外和体内细胞， 且可用作空穴填充物， 例如在摘除肿瘤后产生的空腔。
从 HA、 SOD 和 LN 肽 (Na-HA 1.2％ ； LN 肽 50μg/ml、 SOD 25μg/ml) 这三个元件共 价交联配制水凝胶具有许多明确的优点 ： 由于 SOD 保护 HA 大分子免于解聚作用的氧化损 害， HA 大分子能长时间保持分子完整。SOD 分子和高分子量 HA 链两者都充当抗炎剂， 改善 炎性介导物状态。SOD 能减少在培养物中和在体内植入的移植构建物中产生的氧化胁迫条 件。本文设计的层粘连蛋白合成肽 (SEQ IDNO ： 3) 呈现层粘连蛋白的生物活性的大多数积 极优点， 而没有完整层粘连蛋白大分子所引起的免疫原性反应的缺点。 此外， 层粘连蛋白的 主要来源 (LN-1) 是从荷 Engelbreth-Holm-Swarm 腹水瘤的小鼠分离， 对于临床应用是个缺 点。 而交联的构建物保留了其各组分的全部生物活性， 具有极大的优点， 所有的功能团紧紧 靠在一起。通过 SOD 的抗氧化活性克服植入物当中和周围的恶劣残酷条件的危难时期， 且 LN 肽的保卫特性确保要由开始从周围环境到达的可扩散营养物再滋养的植入物的存活。
实施例 2
神经元祖细胞在透明质酸 - 超氧化物歧化酶 - 层粘连蛋白肽水凝胶当中离体分化 成神经元
材料和实验方法
细胞 - 按先前的描述 (Reshef 等人， 1996 ； Reshef， A.， Sperling， O.， Zoref-Shan E.Preconditioning of primary rat neuronal cultures againstischemic injury ： characterization of the time window of protection( 针对局部缺血损伤的原代大鼠神 经元培养物的预调理 ： 保护的时间窗的表征 ).Brain Res.741， 252-257， 1996)， 制备衍自妊 娠 16-18 天的大鼠大脑半球的解离、 未分化干细胞。将细胞在含 Eagle 培养基 [ 含 Earle盐的 Eagle 基础培养基 (Sigma， 美国密苏里州 St.Louis)， 补加 2mM 谷氨酰胺和 5mg/ml 葡 萄糖 (Biological Industries， Kibbuts Beit Haemek， 以色列 )] 的塑料平皿上在加湿环 境中于 95％空气和 5％ CO2 中 37℃下保持。为试验各种培养条件， 将细胞在塑料平皿上在 Eagle 培养基存在下培养 3 天不更换培养基， 然后更换培养基， 再将细胞在塑料平皿上在培 养基 ( 对照， 培养条件 “i” ) 存在下或者在各种水凝胶 ( 培养条件 “ii” 、 “iii” 和 “iv” )覆 盖下再培养 12 天。各培养条件如下 ：
培养条件
(i) 对照培养物包括在 Eagle 培养基存在下培养和在塑料平皿上保持的细胞 ；
(ii) 透明质酸水凝胶培养物 - 在接种后第三天向附着细胞添加 1.2％透明质酸 ；
(iii) 透明质酸 - 层粘连蛋白肽 - 抗氧化剂水凝胶培养物 - 在培养的第三天将细 胞在混合的透明质酸 (1.2％ )、 由 16 个氨基酸 (SEQ IDNO ： 3； KSIKVAVRSYIGSRCV) 组成的层 粘连蛋白合成肽 (50μg/ml) 和抗氧化剂 (Cu-Zn 超氧化物歧化酶 (Cu-Zn-SOD， 25μg/ml) 的存在下进行培养。
(iv) 交联的透明质酸 - 层粘连蛋白肽 - 抗氧化剂水凝胶培养物 - 在培养的第三 天将细胞在交联的透明质酸 (1.2％ )、 由 16 个氨基酸 (SEQ ID NO ： 3； KSIKVAVRSYIGSRCV) 组成的层粘连蛋白合成肽 (50μg/ml) 和抗氧化剂 (Cu-Zn 超氧化物歧化酶 (Cu-Zn-SOD， 25μg/ml) 的存在下进行培养。 在大部分实验中所用的交联剂是京尼平， 不过其他的交联剂 如碳二亚胺、 二乙烯基砜或者仅仅是糖类 ( 单糖 ) 也已被成功用作交联剂。
神经元的 Nissl 染色方法 - 结晶紫 0.1％ (0.1 克于 100ml 蒸馏水中， 加 10 滴冰乙 酸， 临用前过滤 )。 该染色法检测固定在福尔马林中和包埋在石蜡中的培养物或组织切片中 的神经元的细胞质中的 Nisll 体。 Nissl 体被染成紫 - 蓝色至粉红 - 紫罗兰色。 另外的神经 元特异性染色方法 ： Pearse(1972 ； Pearse， A.Histochemistry， Theoretical andApplied. 第 1 和 2 卷， 第 3 版， Little， Brown&Co， Boston， MA， 1972) 中描述的博迪恩氏胶体银染色 法； 免疫组织化学方法 ： 进一步使用抗 MAP-2、 抗 GAP-43 或抗神经特异性烯醇酶来评估分化 中的神经元。
实验结果
如图 2A 所示， 保持在塑料平皿上的对照培养物显示生长出了不铺满的单层培养 物。与之对比， 在 1.2％透明质酸水凝胶存在下生长的培养物中， 细胞趋向于形成细胞聚集 体 ( 聚结体 )( 图 2B)。第三种类型的培养物包括在含有透明质酸 (1.2％ )、 合成的层粘连 蛋白肽 (SEQID NO ： 3； 50μg/ml) 和 Cu-Zn 超氧化物歧化酶 (Cu-Zn-SOD， 25μg/ml) 抗氧化 剂的水凝胶存在下生长的细胞。如图 2C-F 所示， 用含有透明质酸、 层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3) 和 Cu-Zn 超氧化物歧化酶的水凝胶生长的细胞形成了细胞聚集体， 伴有大量的树突 出芽， 刺激成熟的功能神经元。
应指出的是， 在包含混合的组分 ( 培养物 iii) 或交联的组分 ( 培养物 iv) 的水凝 胶中培养的原代细胞相互间没有显著差异 ( 数据未显示 )。 因此， 为防止小分子量组分 ( 例 如层粘连蛋白肽和 / 或 SOD) 可能从水凝胶脱离， 可在不丧失水凝胶的内在特性和支持细胞 增殖、 分化和迁移的特性的情况下将水凝胶加以交联。
包含透明质酸、 SOD 和充当导向生长因子的层粘连蛋白合成肽 (SEQ ID NO ： 3) 的 水凝胶能推动在其中培养的细胞进行分化 ( 例如神经发生 )， 而超氧化物歧化酶充当神经保护剂。 对细胞聚集体进行进一步的处理， 例如通过在用胰蛋白酶消化后对细胞进行传代 培养， 预期可释放和扩散迁移中的神经元。在含有透明质酸、 层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3) 和 Cu-Zn 超氧化物歧化酶的水凝胶存在下生长的这种培养物， 可用作 3D 构建物供进一步移 植、 再生到体内受伤、 变性或损失的神经元元件中， 容易用密集的纤维调整供植入到损伤的 周围神经组织。
作为与以色列技术学院 (Technion) 的 Eyal Zusmann 教授的合作研究， 使用了直 径 2mm 的聚己酸内酯 (PCL) 管作为大片区域损失的接桥， 将拉断的周围神经的两个断头连 接起来。管中充入含有透明质酸 (1.2％ )、 合成的层粘连蛋白肽 (SEQ ID NO ： 3； 50μg/ml) 和 Cu-Zn 超氧化物歧化酶 (Cu-Zn-SOD， 25μg/ml) 的水凝胶， 对照管为空管。在两只受伤大 鼠中的一只观察到较高密度的神经元出芽， 证明 2cm 区域损失得到完全和完美的桥接。这 些研究证明了本发明一些实施方案的水凝胶可用于神经元组织再生和修复。
上文已结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述， 但显然的是许多替代方 案、 修改方案和变化方案对于本领域技术人员将是显而易见的。 因此， 本发明也意在涵括落 入所附权利要求书的精神和宽泛范围内的所有这些替代方案、 修改方案和变化方案。
本说明书中提到的所有出版物、 专利和专利申请都通过引用全文并入本说明书 中， 犹如每个单独的出版物、 专利或专利申请都具体和单独地被指出通过引用并入本文。 另 外， 在本申请中引用或确认任何参考文献的做法， 不应被解释为承认所述参考文献可利用 作为本发明的现有技术。本文所用的章节标题不应解释为必定限制本发明。
参考文献
( 另外的参考文献在正文中引用 )
Coviello T.， Matricardi P.， Marianecci C.， Alhaique F.Polysaccharide hydrogels for modified release formulations( 用于修饰释放制剂的多糖水凝胶 ).J Controlled Release.119， 5-24， 2007。
Hallmann R. ，Horn N. ，Selg M. ，Wendler O. ，Pausch F. ，Sorokin L.M.Expression and function of laminins in the embryonic and maturevasculature( 层 粘 连 蛋 白 在 胚 胎 和 成 熟 脉 管 系 统 中 的 表 达 和 功 能 ).Physiol. Rev.85， 979-1000， 2005。
Hartman JR.， 1986.， Proc.Natl.Acad.Sci.83 ： 7142-7146。
Ho M.H. ， Wang D.M. ， Hsieh H.J. ， Liu H.C. ， Hsien T.Y. ， LaiJ.Y. ， Hou L.T.Preparation and characterization of RGD-immobilizedchitosan scaffolds(RGD 固定化的壳聚糖支架的制备和表征 ).Biomaterials.26， 3197-3206， 2005。
Hou S.， Xu Q.， Tian W.， Cui F.， Cai Q.， Ma J.， Lee I.S.The repair ofbrain by implantation of hyaluronic acid hydrogels modified with laminin( 通过植入用 层粘连蛋白修饰的透明质酸水凝胶修复大脑 ).J.Neurosci.Met.148， 60-70， 2005。
Itoh S.， Matsuda A.， Kobayashi H.， Ichinose S.， Shinomiya K.， Tanaka J.Effects of a laminin peptide(YIGSR)immobilized oncrab-tendon chitosan tubes on nerve regeneration( 固定化在蟹腱壳聚糖管上的层粘连蛋白肽 (YIGSR) 对神经再生的 作用 ).J Biomed.Mater.Res.B Appl.Biomater.73， 375-382， 2005。
Matsuda A.， Kobayashi H.， Itoh S.， Kataoka K.， Tanaka J.Immobilization of laminin peptide in molecularly aligned chitosan bycovalent bonding( 通过共价键 将层粘连蛋白肽固定化在分子上对齐的壳聚糖中 ).Biomaterials 26， 2273-2279， 2005。
Niece K.L， Hartgerink J.D， Donners J.J， Stupp S.I.Self-assemblycombining two bioactive peptide-amphiphile molecules into nanofibersby electrostatic attraction( 通 过 静 电 吸 引 将 两 个 生 物 活 性 肽 - 亲 水 脂 分 子 自 组 装 结 合 成 纳 米 纤 维 ).J.Am.Chem.Soc.125， 7146-7147， 2003。
P o w e l l S . K . ，K l e i n m a n H . K . N e u r o n a l l a m i n i n s a n d t h e i r cellularreceptors( 神 经 元 层 粘 连 蛋 白 和 它 们 的 细 胞 受 体 ).Int.J.Biochem. CellBiol.29， 401-414， 1997。
Sekurai K.， Miyazaki K.， Kodera Y.， Nishimura H.， Shingu M.， InadaY. Anti-inflammatory activity of superoxide dismutase conjugated withsodium hyaluronate( 与透明质酸钠缀合的超氧化物歧化酶的抗炎活性 ).Glycoconjugate J.14 ： 723-728， 1997。
Suzuki M.， Itoh S.， YamaguchiI.， Takakuda K.， Kobayashi H.， Shinomiya K.， Tanaka J.Tendon chitosan tubes covalently coupledwith synthesized laminin peptides facilitate nerve regeneration in vivo( 与合成的层粘连蛋白肽共价偶联的 腱壳聚糖管能促进体内神经再生 ).J Neurosci.Res.72， 646-659， 2003。
Tashiro K.， Sephel G.C.， Weeks B.， Sasaki M.， Martin G.R.， Kleinman H.K.， Yamada Y.A synthetic peptide containing the IKVAVsequence from the A chain of laminin mediates cell attachment， migration， and neurite outgrowth( 含有来 自层粘连蛋白 A 链的 IKVAV 序列的合成肽能介导细胞附着、 迁移和神经突长出 ).J Biol Chem.264， 16174-16182， 1989。
Yamazaki K.， Fukuda K.， Matsukawa M.， Hara F.， Matsushita T.， Yamamoto N.， Yoshida K.， Munakata H.， Hamanishi C.Cyclic tensilestretch loaded on bovine chondrocytes causes depolymerization ofhyaluronan ： involvement of reactive oxygen species( 负荷在牛软骨细胞上的环拉伸会造成乙酰透明质酸的解聚 ： 活性氧中间 体的参与 ).Arthritis&Rheum， 48 ： 3151-3158， 2003。26101965357 A CN 101965358序列 序列表表1/3 页<110>Ramot At Tel Aviv University Ltd. Medical Research Fund of Tel Aviv Sourasky Medical Center Rochkind， Shimon Nevo， Zvi <120> 多肽、 基质、 水凝胶以及使用它们进行组织再生和修复的方法 <130>42215 <150>US 60/935,487 <151>2007-08-15 <160>5 <170>PatentIn version 3.5 <210>1 <211>5 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 层粘连蛋白模拟合成肽 <400>1 Ile Lys Val Ala Val 1 5 <210>2 <211>5 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 层粘连蛋白模拟合成肽 <400>2 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210>3 <211>16 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 层粘连蛋白模拟合成肽 <400>3 Lys Ser Ile Lys Val Ala Val Arg Ser Tyr Ile Gly Ser Arg Cys Val 1 5 10 1527101965357 A CN 101965358序列表2/3 页<210>4 <211>154 <212>PRT <213> 人类 <400>4 Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly 1 5 10 Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn 20 25 Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu 35 40 His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr 50 55 Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro 65 70 75 His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp 85 90 Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu 100 105 Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys 115 120 Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly 130 135 Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln 145 150 <210>5 <211>981 <212>DNA <213> 人类 <400>5 gtttggggcc agagtgggcg aggcgcggag gtctggccta ggtgctggtt tgcgtcgtag tctcctgcag cgtctggggt ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag cgacggccca gtgcagggca tcatcaattt cgagcagaag ggtgtgggga agcattaaag gactgactga aggcctgcat tggagataat acagcaggct gtaccagtgc aggtcctcac acacggtggg ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac caaagatggt gtggccgatg tgtctattga agattctgtg ttgcatcatt ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca28Asp Gly Pro Val 15 Gly Pro Val Lys 30 His Gly Phe His 45 Ser Ala Gly Pro 60 Lys Asp Glu Glu Lys Ser Ala Asn 140Gln Val Val HisArg 80 Asp Gly Val Ala 95 Gly Asp His Cys 110 Asp Asp Leu Gly 125 Ala Gly Ser Argtaaagtagtc ttccgttgca gccgtgtgcg gaaagtaatg ggattccatg tttaatcctc ttgggcaatg atctcactct gatgacttgggcggagacgg gtcctcggaa tgctgaaggg gaccagtgaa ttcatgagtt tatccagaaa tgactgctga caggagacca gcaaaggtgg60 120 180 240 300 360 420 480 540101965357 A CN 101965358序agtacaaaga taaacattcc agaaatgtat ttcagagttg gtatagtttt taaatcacag aaaccctgta aaaaaaaaaa caggaaacgc cttggatgta cctgataaac ctttaaagta ataaaactca atgggtatta tggcacttat a列表ttggcttgtg ccttaactca gtaatcttaa gaaactgatt ctgtttcaat aatttctttg ttaaaagaat gtgtaattgg tctgttatcc aagtgtaatt tatgatcact gacctgtatt tcattcaagc ccaaattcaa3/3 页aaatgaagaa gatcgcccaa tgctagctgt gtgtgacttt tggaagattt ttgccagact ctgtgaataa actaaaaaaatggaagtcgt gtctgaggcc attaaacact cctgtagtga gttaaaatgt aacttgtcag tatgaggcta600 660 720 780 840 900 960 981