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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410505699.7 (22)申请日 2014.09.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105520937 A (43)申请公布日 2016.04.27 (73)专利权人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路220号 (72)发明人 陈道峰 殷翔 史训龙 朱海燕 卢燕 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所(普通合伙) 31268 代理人 吴桂琴 (51)Int.Cl. A61K 31/37(2006.01) C07D 311。
2、/92(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (56)对比文件 CN 102188461 A,2011.09.21, 黄权芳 等.山芝麻抗鸭乙型肝炎病毒作用. 中国实验方剂学杂志 .2011,第17卷(第20期), 第179-181页. Wenliang Chen等.Pregnane, coumarin and lupane derivatives and cytotoxic constituents from Helicteres angustifolia. PHYTOCHEMISTRY .2006,第67卷 第1041-1047页. 黄权芳 等.山芝麻对鸭乙型肝炎动物模。
3、型 体内血清超氧化物歧化酶等3项指标的影响. 时 珍国医国药 .2011,第22卷(第11期),第2683- 2684页. 审查员 范鑫萌 (54)发明名称 香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中 的用途 (57)摘要 本发明属于医药领域， 涉及一种香豆素类化 合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。 本发明从 山 芝 麻 属 H e l i c t e r e s 植 物 山 芝 麻 H.angustifolia中提取分离得到一种香豆素类 化合物6,7,9-三羟基-3,8,11-三甲基环己 烷嵌-d,e-香豆素并证实其抗乙肝病毒活性。 所述的化合物经与阳性对照拉米呋啶药理试验 比较， 结果证实前者具。
4、有显著的抗乙肝病毒作 用， 对HBsAg的IC50值为11.8g/ml， 对HBeAg的 IC50值为34.2g/ml， 显著高于阳性对照拉米呋 啶， 可作为活性成分用于制备抗乙肝病毒的药 物。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 105520937 B 2018.07.24 CN 105520937 B 1.6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基环己烷嵌-d,e-香豆素作为唯一活性成分在制备 抗乙肝病毒药物中的用途， 2.按权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述化合物6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基 环己烷嵌-d,e-香豆素作为唯一活性成分抗HBV活性。 权 利。
5、 要 求 书 1/1 页 2 CN 105520937 B 2 香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 涉及香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途， 具 体涉及一种从药用植物山芝麻中分离得到的香豆素类化合物6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三 甲基环己烷嵌-d,e-香豆素在制备抗乙肝病毒药物中的用途。 背景技术 0002 据有关统计显示， 全世界约有3亿多人为慢性乙肝病毒(HBV)携带者， 我国约占半 数。 乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一， 由于HBV感染可以导致慢 性肝炎、 肝硬化和原发性肝癌， 因此成为影响人类寿命。
6、的九大疾病之一。 由于慢性HBV感染 者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217， 因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引 起的肝硬化和肝癌， 而我国又是乙型肝炎的高发区， 每年约有25万人死于与乙肝相关的慢 性肝病(肝硬化与肝癌)。 上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。 因此， 寻求高效低 毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。 0003 药物化学工作者在筛选抗HBV药物的过程中进行了不懈的努力， 但到目前为止还 在寻找能治愈HBV感染的特效药。 临床上已获得FDA正式批准使用的 -干扰素和核苷类药物 拉米呋啶能在某种程度上获得治疗效果， 但对大多数病人还达不到治愈的目的， 且停止治。
7、 疗后的 “反跳” 现象是医药工作者最感棘手的问题， 所以开发研制高效、 低毒、 不 “反跳” 的抗 HBV新药向药物化学工作者提出了挑战。 在筛选抗HBV新药的过程中， 越来越多的药物化学 工作者将注意力转向了植物来源丰富、 价廉易得、 毒副作用小、 分子结构复杂多样的天然化 合物。 0004 山芝麻为梧桐科植物山芝麻(Helicteres angustifolia L.)的干燥根或全株， 味 苦、 性寒， 归肺、 大肠经， 可解表清热、 解毒消肿， 用于治疗感冒发热、 痄腮、 乳娥、 麻疹、 咳嗽、 泄泻痢疾、 痈肿。 药理研究表明山芝麻具有抗菌、 抗炎、 抗病毒及抗肿瘤等活性。 有研究表。
8、明 山芝麻粗提物具有抗HBV活性， 但对其抗HBV的药效物质却缺乏研究， 迄今为止， 尚未见有关 涉及本发明的6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基环己烷嵌-d,e-香豆素抗HBV活性的报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种从山芝麻中分离得到的香豆素类化合物6,7,9 -三羟 基-3,8,11 -三甲基环己烷嵌-d,e-香豆素在制备抗乙肝病毒药物中的用途。 0006 本发明应用现代药理筛选方法， 从梧桐科山芝麻属(Helicteres)植物山芝麻 (H.angustifolia)中提取分离得到1个香豆素类化合物： 6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基 环己烷嵌-d,e。
9、-香豆素， 并经与阳性对照拉米呋啶药理试验比较， 结果证实前者具有显著 的抗乙肝病毒作用， 对HBsAg的IC50值为11.8 g/ml， 对HBeAg的IC50值为34.2 g/ml， 显著高 于阳性对照拉米呋啶。 0007 本发明所述的活性化合物具有如下的化学结构： 说 明 书 1/3 页 3 CN 105520937 B 3 0008 0009 本发明的化合物通过下述方法制备： 0010 取山芝麻干燥根25kg， 95乙醇回流提取， 浓缩后分别用石油醚、 乙酸乙酯和正丁 醇萃取， 共得0.95kg， 取乙酸乙酯萃取物200g进行硅胶柱色谱， 以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱， 所得流份以不同洗脱。
10、剂进行反复硅胶柱色谱、 MPLC和半制备HPLC等分离纯化手段分离得到 化合物6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基环己烷嵌-d,e-香豆素。 0011 本发明所述的6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基环己烷嵌-d,e-香豆素可作为活 性成分用于制备抗HBV的药物。 附图说明 0012 图1是6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基环己烷嵌-d,e-香豆素的提取分离工艺 流程图。 具体实施方式 0013 实施例1制备6,7,9 -三羟基-3,8,11 -三甲基环己烷嵌-d,e-香豆素 0014 取山芝麻干燥根25kg， 粉碎， 用95乙醇回流提取3次(50L3)， 每次2h，。
11、 合并提取 液并浓缩得浸膏0.95kg， 加水(4L)混悬， 分别以等体积石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇萃取5次， 合并萃取液并浓缩至干， 得乙酸乙酯萃取物200g。 将乙酸乙酯萃取部位经硅胶(200-300目) 柱色谱分离， 依次以二氯甲烷-甲醇(50:1-0:1)梯度洗脱， 得到11个流份(Fr.1-11)， 其中流 份Fr.3(32g)再经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇， 30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1)、 MPLC(甲 醇-水， 20:80-80:20梯度洗脱)和半制备HPLC等手段纯化， 分离得到化合物6,7,9 -三羟基- 3 ,8 ,11-三甲基环己烷嵌-d ,e-。
12、香豆素(6 ,7 ,9-trihydroxy-3 ,8 ,11- trimethylcyclohexo-d,e-coumarin,1)。 0015所得化合物为棕色无定型粉末，+27.6(c 1.15,MeOH)； UV(MeOH)max nm (log ):322.3(3.54),210.6(4.67)； IR(KBr): max(cm-1):3358,2939,1687,1626,1562, 1392,1238； ESI-MS m/z:277M+H+。 1H-NMR(600MHz,DMSO-d6) H:4.90(1H,brs,H-9),3.33 (1H,m,H-11),2.19(3H,s,1。
13、3-OCH3),2.10(3H,s,12-OCH3),2.06(1H,brd,J14.4Hz,H- 10a),1.85(1H,m,H-10b),1.37(3H,d,J7.2Hz,14-OCH3)； 13C-NMR(150MHz,DMSO-d6) C: 163.1(C-2),147.7(C-8a),147.5(C-7),145.7(C-6),139.0(C-4),125.1(C-5),117.2(C- 3),109.4(C-8),107.5(C-4a),62.8(C-9),35.6(C-10),25.6(C-11),22.1(14-OCH3),12.2 (12-OCH3),8.9(13-OCH3。
14、)。 0016 实施例2体外抗HBV实验 0017 应用Hep G2的2.2.15细胞株(教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室， 上海)， 以每孔10105个细胞接种于24孔板， 培养基为DMEM， 生长液含10胎牛血清， 380 g/ml G418， 0.03谷胺酰胺， 青霉素、 链霉素各100 g/ml， 在5CO2孵箱中37培养， 48小时后， 换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液， 每种药物设35个浓度， 每个浓度设4个平行孔， 说 明 书 2/3 页 4 CN 105520937 B 4 继续培养9天(每3天换液一次)， 收集上清液用ELISA检测HBsAg及HBeAg含量。 同样条。
15、件下以 不含药物的培养液上清液作为对照组。 同时用上述细胞株， 用MTT法测定药物的细胞毒性。 阳性对照为拉米呋啶(3TC)， 结果证实本发明所述化合物具有显著的抗HBV活性， 且有效浓 度低， 其对HBsAg的IC50值为11.8 g/ml， 对HBeAg的IC50值为34.2 g/ml， 显著高于阳性对照 拉米呋啶(如表1所示)。 0018 表1.化合物1对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用 0019 0020 /： 当细胞毒性25时不进行抑制率测试 0021 本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术， 可市购。 说 明 书 3/3 页 5 CN 105520937 B 5 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 6 CN 105520937 B 6 。