粉末状蛋白质组合物及其制备方法 相关申请
本申请要求于 2008 年 1 月 15 日提交的美国临时专利申请号 61/021,298 的优先 权利益， 所述美国临时专利申请号各自的内容在此整体引入本文作为参考。
发明背景
药物蛋白质制剂的基本原理是必须克服一定的不稳定性。 蛋白质的降解途径可以 分成 2 个不同类别， 涉及化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性导致通过键形成或 切割的蛋白质修饰。 化学不稳定性问题的例子包括脱酰胺、 外消旋化、 水解、 氧化、 β 消除和 二硫键交换。另一方面， 物理不稳定性不导致蛋白质中的共价改变。相反， 它们涉及蛋白质 的高级结构 ( 二级及以上 ) 中的改变。这些包括变性、 与表面吸附、 聚集和沉淀。Manning 等人， Pharm.Res.6， 903(1989)。
在通过 Watson 和 Crick(1953) 的 DNA 结构发现以及随后的人类基因组测序计划 完成后， 对蛋白质化学作用的兴趣增长得非常快速。 在疾病、 组织或发育中基因及其蛋白质 产物的关系是特别感兴趣的。 Nextgeneration pharmaceutical， Issue 6(GDS publishing Ltd.， 2006)。在介于其间的数十年期间， 基于蛋白质的药物数目增加得非常快速。今天， 特 定蛋白质或肽可以得到分离或合成、 修饰且递送用于减轻或治愈特定病症和疾病。关于基 于蛋白质的药物的主要应用途径仍是液体制剂的静脉内注射， 但其他途径也已进行测试且 使用。
已付出诸多努力以将蛋白质溶液转变成固体形式。粉末状组合物提供许多优点， 例如通过涉及少得多的空间和重量可以贮藏或转运更大量的蛋白质， 并且能量消耗低于在 贮藏和运送过程中使液体制剂冷却所需的能量消耗。粉末状组合物还促进新的递送途径， 例如吸入 (Tzannis 等人， 国际公开号 WO 2005067898)、 或无针注射 (Burkoth， The Drug Delivery Companies Report 76-78(2001))。几种方法已用于由蛋白质水溶液产生粉 末， 其中有喷雾干燥、 喷雾 - 冷冻干燥、 冷冻干燥、 或由超临界流体或 ( 部分 ) 有机溶液沉 淀。winters 等人， Journal ofPharm.Sci.85(6) ： 586-594(1996)。与非常昂贵且费时的 冷冻干燥形成对比， 喷雾干燥是产生蛋白质装载固体的有效的、 高效的方法， 这提供了开发 关于生物药物 (biopharmaceuticals) 的新递送形式例如吸入的机会。Maa 等人， Pharm. Res.16(2) ： 249-254(1999)。
使纯蛋白质溶液喷雾干燥有引起部分失活的风险， 这自动导致较低品质的药剂。 失活可以例如通过过程相关的物理应力引起， 所述物理应力是由于高温、 剪切应力和大相 界面 ( 液体 / 气体 ) 例如变性或聚集， 或通过化学反应例如水解或氧化引起。
发明概述
本发明涉及用于使包括蛋白质和赋形剂的蛋白质制剂喷雾干燥的方法。具体而 言， 本发明的方法和组合物基于其中使包含目的蛋白质和赋形剂的溶液喷雾干燥的喷雾干 燥过程。
本发明的制剂具有超过标准溶液和冷冻干燥制剂的许多优点。特别地， 本发明的 喷雾干燥方法使过程相关的降解降到最低， 并且增加在环境温度下的蛋白质稳定性 ( 例
如， 与冷冻干燥组合物相比较 )。 此外， 喷雾干燥制剂也更易于运输， 并且用于制造高浓度制 剂、 改善蛋白质的生物利用率、 和开发局部释放 ( 例如， 肺递送 ) 和持续释放 ( 例如， 脂质体 和 (D， L- 丙交酯 - 乙交酯共聚物 )PLGA 包被的小球体 ) 制剂。
本发明的方法和组合物可以用于提供包括任何目的蛋白质和赋形剂的稳定的粉 末状组合物或制剂。 在一个方面， 本发明的方法和组合物用于抗体及其片段， 包括用于体内 和体外目的的那些。在进一步的实施方案中， 抗体片段是免疫球蛋白 G(IgG) 片段。
此外， 制备蛋白质和肽制剂所必需的多步纯化和浓缩过程通常引入组合物中的变 异性， 从而使得制剂的精确组成可能在批次到批次之间变动。联邦法令要求不管制造场所 或批号， 药物组合物在其制剂中高度一致。本发明的方法可以用于生成赋形剂以精确量加 入其中的蛋白质的粉末状制剂， 从而允许生成具有赋形剂的精确浓度的蛋白质制剂。
在一个方面， 本发明提供了用于制备蛋白质或肽粉末的方法， 其包括使包含超过 约 50mg/mL 蛋白质或肽和至少一种赋形剂的溶液喷雾干燥， 从而制备蛋白质或肽粉末。在 一些实施方案中， 溶液包括超过约 100mg/mL 蛋白质或肽。蛋白质还可以是双重可变结合结 构域 (DVD) 结合蛋白质。
在一些实施方案中， 该方法包括制备抗体粉末， 其包括使包含超过约 50mg/mL 抗 体或其抗原结合部分和至少一种赋形剂的溶液喷雾干燥， 从而制备抗体粉末。在一些实 施方案中， 溶液包括超过约 100mg/mL 抗体或其抗原结合部分。抗体或其抗原结合部分可 以是免疫球蛋白 G(IgG)， 例如 MAK 195F、 阿达木单抗 (Adalimumab)、 ABT-325、 ABT-308 或 ABT-147。 在一些实施方案中， 粉末在环境温度和湿度下稳定至少 3 个月和 / 或在 40℃下稳 定至少 3 个月。 赋形剂可以包括例如海藻糖、 蔗糖、 山梨糖醇、 聚乙二醇、 至少一种氨基酸、 组氨 酸、 丙氨酸、 精氨酸、 甘氨酸或其混合物。在一些实施方案中， 溶液包括约 0.27 ∶ 1.0 至约 2.8 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 1.4 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 0.7 ∶ 1.0 的赋形剂∶蛋 白质比、 或约 0.7 ∶ 1.0 的比。在一些实施方案中， 溶液包括约 20 至约 30mM 赋形剂、 或约 25mM 赋形剂。
在一些实施方案中， 该方法包括用约 100℃至约 180℃的入口空气温度 (Tin) 和约 60℃至约 110℃的出口空气温度 (Tout) 的喷雾干燥。在特定实施方案中， 该方法包括用约 130℃的 Tin 和约 80℃的 Tout 的喷雾干燥。该方法可以包括例如使溶液雾化以形成溶液小 滴， 用气体使小滴干燥以形成粉末， 并且从气体中回收粉末。 该方法可以包括用压力喷嘴雾 化器使溶液雾化和 / 或用旋风分离器 (cyclone) 从气体中分离且回收抗体粉末。
该方法还可以包括使抗体粉末包埋在药学上可接受的载体中。 药学上可接受的载 体可以是对于肠胃外、 经口、 经肠和 / 或局部施用可接受的。药学上可接受的载体可以包括 液体例如水。
在另一个方面， 本发明涉及根据本文描述的任何一种方法制备的药物制剂， 其包 括有效量的抗体或其抗原结合部分。在另外一个方面， 本发明涉及根据本文描述的任何一 种方法制备的药物制剂， 其包括有效量的蛋白质或肽。
在另外一个方面， 本发明提供了包括蛋白质或肽和赋形剂的稳定的粉末状组合 物， 其中所述组合物包括小于约 6％的残留水分， 在一些实施方案中， 小于约 4％或 3％的残 留水分。蛋白质或肽可以包括抗体或其抗原结合部分， 例如 IgG 抗体或其抗原结合部分， 例
如 MAK 195F、 阿达木单抗、 ABT-325、 ABT-308 或 ABT-147。蛋白质还可以是双重可变结合结 构域 (DVD) 结合蛋白质。
在一些实施方案中， 粉末状组合物在环境温度和湿度下稳定至少 3 个月和 / 或在 40℃下稳定至少 3 个月。在一些实施方案中， 蛋白质或肽、 或抗体或其抗原结合部分， 保留 其生物活性。
赋形剂可以包括海藻糖、 蔗糖、 山梨糖醇、 聚乙二醇、 至少一种氨基酸、 组氨酸、 丙氨酸、 精氨酸、 甘氨酸或其混合物。组合物可以具有约 0.27 ∶ 1.0 至约 2.8 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 1.4 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 0.7 ∶ 1.0、 或约 0.7 ∶ 1 的赋形剂 ( 例如， 海藻糖和 / 或蔗糖 ) 与抗体或其抗原结合部分的质量比。 组合物可以具有约 0.27 ∶ 1.0 至 约 2.8 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 1.4 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 0.7 ∶ 1.0、 约 0.7 ∶ 1 或约 0.35 ∶ 1 的赋形剂 ( 例如， 山梨糖醇 ) 与抗体或其抗原结合部分的质量比。
在另外一个方面， 本发明提供了制造药物组合物的方法， 其包括使有效量的本发 明的稳定的粉末状组合物与药学上可接受的载体例如液体例如水混合。在一些实施方案 中， 药物组合物适合于肠胃外、 经口、 经肠或局部施用。该方法可以进一步包括在显著高于 环境温度的温度下加工稳定的粉末状组合物 ( 例如， 熔体挤出 )， 而不显著影响粉末状组合 物的稳定性。 在特定实施方案中， 该方法包括例如用聚合物例如 PLGA 包被粉末状组合物， 以形 成持续释放或延迟释放的药物组合物。 另外或可替代地， 该方法可以包括用肠溶衣包被。 在 一些实施方案中， 蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合部分的活性通过赋形剂针对经由有机溶剂 的沉淀、 变性或氧化进行保护， 所述有机溶剂例如 PEG 400、 乙醇、 DMSO、 NMP 或冰乙酸。
目前， 几乎所有公司都使用冷冻的大量药物 (bulk drug) 组合物， 并且面临问题例 如冻融条件的再现性、 赋形剂在大量药物物质内出乎意料的结晶、 缓冲液在冷冻过程中的 pH 改变、 和由于解冻例如在约 37℃温度下的 2 升容器的长滞后时间。使用喷雾干燥的大量 药物组合物可以避免这些问题。此外， 喷雾干燥的大量药物组合物在最终药物产品组合物 的配料过程中非常便于处理， 并且允许制造广泛的浓度范围。 此外， 其中仅添加水的喷雾干 燥的药物组合物可以代替传统配料， 并且因此降低药物产品制造过程中的风险同时增加输 出能力。此外， 与单克隆抗体 (mAb) 片段相比较， 全长 / 完全抗体可能更不易于物理降解。 另外， 随着蛋白质浓度增加直至 100mg/mL， 一般存在很少的物理或化学降解中的增加或无 增加。因为更高浓度的溶液将增加过程的效率， 所以 100mg/mL 蛋白质浓度的使用将是有利 的。
附图简述
通过参考与附图结合的下述详述， 可以更充分地理解本文公开的方法和组合物的 这些及其他特征和优点， 其中 ：
图 1 描述了如在实施例中使用的 Büchi 喷雾干燥器 B-191 ；
图 2 描述了不同山梨糖醇 -MAK 混合物的得率和 Tg ；
图 3 描述了不同山梨糖醇 -MAK 混合物的聚集、 结晶度和含水量 ；
图 4 提 供 了 山 梨 糖 醇 -MAK 混 合 物 3000x 的 扫 描 电 镜 术 (SEM) 图 像 (a)25mM(b)100mM ；
图 5 描述了不同海藻糖 -MAK 混合物的得率和 Tg ；
图 6 描述了不同海藻糖 -MAK 混合物的聚集、 结晶度和含水量 ；
图 7 提供了海藻糖混合物 (3000x) 的 SEM 图像 (a)10mM 海藻糖 ； (b)100mM 海藻糖 和 (c) 纯海藻糖喷雾干燥的 ；
图 8 描述了不同蔗糖 -MAK 混合物的得率和 Tg ；
图 9 描述了不同蔗糖 -MAK 混合物的聚集、 结晶度和含水量 ；
图 10 描述了关于喷雾干燥的 MAK 195F 制剂的尺寸排阻层析 (SEC) 物理稳定性数 据： (A) 山梨糖醇、 海藻糖和蔗糖对蛋白质聚集量的作用和 (B) 稳定剂浓度对蛋白质聚集量 的作用 ； 和
图 11 描述了加工和 3 个月贮藏 (A) 对溶于 200mM 海藻糖溶液的喷雾干燥的高浓 度 MAK 195F、 阿达木单抗和 ABT-325 物理稳定性的作用和 (B) 对其化学稳定性的作用。
发明详述
I. 定义
为了使本发明可以更容易理解， 首先定义了特定术语。
如本文所使用的， 术语 “酸性组分” 指具有酸性 pH 即小于 7.0 的试剂， 包括溶液。 酸性组分的例子包括磷酸、 盐酸、 乙酸、 柠檬酸、 草酸、 琥珀酸、 酒石酸、 乳酸、 苹果酸、 乙醇酸 和延胡索酸。 如本文所使用的， 术语 “抗氧化剂” 意指这样的试剂， 其抑制氧化或充当抗氧化剂 增效剂， 并且因此用于预防通过氧化过程的制剂变质。 此种化合物包括例如但不限于， α生 育酚 ( 维生素 E)、 抗坏血酸、 棕榈酸抗坏血酸酯、 柠檬酸、 丁化羟基苯甲醚、 丁化羟基甲苯、 依地酸 (EDTA， 依地酸盐 ) 及其盐、 氢亚磷酸 (hydrophosphorous acid)、 苹果酸、 一硫代甘 油、 丙酸、 桔酸丙酯、 甲硫氨酸、 抗坏血酸钠、 柠檬酸钠、 硫化钠、 亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 偏亚 硫酸氢钠和本领域普通技术人员已知的其他化合物。
除非本文另有说明， 否则术语 “组合物” 和 “制剂” 可互换使用。
术语 “赋形剂” 指可以加入制剂中的试剂， 以提供所需一致性例如改变堆积性能 (bulk property)， 改善稳定性和 / 或调整重量摩尔渗透压浓度。常用赋形剂的例子包括但 不限于， 稳定剂、 糖、 多元醇、 氨基酸、 表面活性剂、 螯合剂和聚合物。
如本文所使用的， 术语 “药物” 就组合物例如水制剂而言时， 是对于治疗疾病或病 症有用的那种。
术语 “蛋白质” 意欲包括关于其链长足以产生更高水平的二级和 / 或三级和 / 或四 级结构的氨基酸序列。这与不具有此种结构的 “肽” 或其他小分子量分子区分。在本文使 用的定义内包括的蛋白质的例子包括治疗蛋白质。 “治疗活性蛋白质” 或 “治疗蛋白质” 指 可以用于治疗目的的蛋白质， 即用于治疗受试者中的病症。应当指出尽管治疗蛋白质可以 用于治疗目的， 但本发明并不限于此种用途， 因为蛋白质还可以用于体外研究。 在优选实施 方案中， 治疗蛋白质是融合蛋白或抗体或其抗原结合部分。 在一个实施方案中， 本发明的方 法和组合物包括至少 2 种不同的蛋白质， 其定义为具有不同氨基酸序列的 2 种蛋白质。另 外的不同蛋白质不包括蛋白质的降解产物。
术语 “蛋白质粉末” 指包括根据本发明的喷雾干燥法制备的蛋白质的组合物。 “抗 体粉末” 指包括本发明的喷雾干燥法制备的抗体或其抗原结合部分的组合物。
术语 “药物制剂” 指这样的制剂， 其处于此种形式， 以便允许活性成分的生物活性
是有效的， 并且因此可以施用于受试者用于治疗用途。
术语 “溶液” 指至少一种赋形剂或蛋白质或肽在液体内的混合物。溶液可以包括 在液体内溶解的蛋白质分子、 胶态溶解的蛋白质分子、 分散的蛋白质聚集物或晶体或沉淀 物或悬浮液， 或其组合。
“稳定的” 组合物是其中蛋白质在加工过程中和 / 或在贮藏后例如基本上保留其物 理稳定性和 / 或化学稳定性和 / 或生物活性的组合物。用于测量蛋白质稳定性的各种分析 技术是本领域可用的， 并且在例如 Peptide and Protein Drug Delivery， 247-301， Vincent Lee 编辑， MarcelDekker， Inc.， New York， N.Y.， Pubs.(1991) 和 Jones， A.Adv.DrugDelivery Rev.10 ： 29-90(1993) 中综述。在一个实施方案中， 蛋白质的稳定性根据溶液中的单体蛋白 质百分比进行测定， 具有低百分比的降解的 ( 例如， 断裂的 ) 和 / 或聚集的蛋白质。例如， 包括稳定蛋白质的水组合物可以包括至少 95％单体蛋白质。可替代地， 本发明的水组合物 可以包括不超过 5％聚集物和 / 或降解的蛋白质。
术语 “稳定剂” 指改善或以其他方式增强稳定性的赋形剂。稳定剂包括但不限 于 α- 硫辛酸， α- 生育酚， 棕榈酸抗坏血酸酯， 苯甲醇， 亚硫酸氢盐， 硼， 丁化羟基苯甲醚 (BHA)， 丁化羟基甲苯 (BHT)， 抗坏血酸及其酯， 类胡萝卜素， 柠檬酸钙， 乙酰 -L- 肉碱， 螯合 剂， 软骨素， 硫酸软骨素， 柠檬酸， 辅酶 Q-10， EDTA( 乙二胺四乙酸 ； 依地酸二钠 )， 异抗坏血 酸， 延胡索酸， 桔酸烷基酯， 葡糖胺 ( 壳聚糖、 透明质酸钠 )， 苹果酸， 偏亚硫酸氢盐， 桔酸丙 酯， 亚硫酸氢钠， 偏亚硫酸氢钠， 亚硫酸钠， 亚硫酸钾， 酒石酸， 硫代硫酸盐， 硫甘油， 生育酚 及其酯， 例如生育酚乙酸酯、 生育酚琥珀酸酯、 生育三烯酚 (tocotrienal)、 d-α- 生育酚乙 酸酯， 维生素 C 及其酯， 维生素 E 及其酯， 例如维生素 E 乙酸酯， 及其组合。
如本文所使用的， 术语 “张力调节剂” 意指可以用于调整液体制剂的张力的一种或 多种化合物。合适的张力调节剂包括甘油、 乳糖、 甘露糖醇、 葡萄糖、 氯化钠、 硫酸镁、 氯化 镁、 硫酸钠、 山梨糖醇、 海藻糖、 蔗糖、 棉子糖、 麦芽糖和本领域普通技术人员已知的其他。 在 一个实施方案中， 液体制剂的张力接近血液或血浆的张力。
如本文所提及的， 术语 “抗体” 包括完整抗体及其任何抗原结合片段 ( 即 “抗原结 合部分” ) 或单链。 “抗体” 指一般包括通过二硫键互联的至少 2 条重 (H) 链和 2 条轻 (L) 链的糖蛋白， 或其抗原结合部分。术语 “抗体” 还包括其分离的天然存在的变体。每条重链 由重链可变区 ( 本文缩写为 VH) 和重链恒定区组成。重链恒定区由 3 个结构域 CH1、 CH2 和 CH3 组成。每条轻链由轻链可变区 ( 本文缩写为 VL) 和轻链恒定区组成。轻链恒定区由 1 个结 构域 CL 组成。 VH 和 VL 区可以进一步再分成高变区， 称为互补性决定区 (CDR)， 点缀着更保守 的称为构架区 (FR) 的区域。每个 VH 和 VL 由 3 个 CDRs 和 4 个 FRs 组成， 从氨基末端到羧基 末端以下述顺次排列 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。重和轻链的可变区包含与抗 原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞 ( 例如， 效应细胞 ) 和经典补体系统的第一 种组分 (C1q)。
如本文所使用的， 术语抗体的 “抗原结合部分” ( 或简单地 “抗体部分” ) 指保留与 抗原 ( 例如， TNFα、 IL-12、 IL-13) 特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。抗体的抗原 结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。在术语抗体的 “抗原结合部分” 内包括的结合 片段的例子包括 (i)Fab 片段， 由 VL、 V H、 CL 和 CH1 结构域组成的单价片段 ； (ii)F(ab′ )2 片段， 包括在铰链区由二硫键连接的 2 个 Fab 片段的二价片段 ； (iii) 由 VH 和 CH1 结构域组成 的 Fd 片段 ； (iv) 由抗体单臂的 VL 和 VH 结构域组成的 Fv 片段， (v) 由 VH 或 VL 结构域组成的 dAb 片段 (ward 等人， (1989)Nature 341 ： 544-546) ； 和 (vi) 分离的互补性决定区 (CDR)。 此外， 尽管 Fv 片段的 2 个结构域 VL 和 VH 由单独的基因编码， 但它们可以使用重组方法通过 合成接头进行连接， 所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链， 其中 VL 和 VH 区配对 以形成单价分子 ( 称为单链 Fv(scFv) ； 参见例如， Bird 等人 (1988)Science242 ： 423-426 ； 和 Huston 等人 (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85 ： 5879-5883)。此种单链抗体也意欲包 括在术语抗体的 “抗原结合部分” 内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术 获得， 并且片段与完整抗体相同的方式就效用进行筛选。 在本发明的一个实施方案中， 抗体 片段选自 Fab、 Fd、 Fd′、 单链 Fv(scFv)、 scFva 和结构域抗体 (dAb)。
再进一步地， 抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其 他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大的免疫粘附分子的部分。 这些其他蛋白质或 肽可以具有这样的功能性， 其允许纯化抗体或其抗原结合部分， 或允许其与彼此或其他分 子结合。 因此， 此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用， 以制备四聚 单链可变片段 (scFv) 分子 (Kipriyanov 等人 (1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6 ： 93-101)， 和半胱氨酸残基、 标记肽和 C 末端聚组氨酸标记的使用， 以制备二价和生物素化 的 scFv 分子 (Ki priyanov 等人 (1994)Mol.Immunol.31 ： 1047-1058)。抗体部分例如 Fab 和 F(ab′ )2 片段可以使用常规技术由完整抗体进行制备， 例如分别地完整抗体的木瓜蛋 白酶或胃蛋白酶消化。此外， 抗体、 抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组 DNA 技术获 得。
当 2 个抗体结构域属于形成关联对或组的结构家族或者衍生自此种家族且保留 这个特征时， 它们是 “互补的” 。例如， 抗体的 VH 结构域和 VL 结构域是互补的 ； 2 个 VH 结构 域不是互补的， 并且 2 个 VL 结构域不是互补的。互补结构域可以在免疫球蛋白超家族的其 他成员中发现， 例如 T 细胞受体的 Vα 和 Vβ( 或 γ 和 δ) 结构域。
术语 “结构域” 指不依赖于蛋白质的其余部分保留其三级结构的折叠蛋白质的结 构。一般地， 结构域负责离散的蛋白质功能性质， 并且在许多情况下可以添加、 去除或转移 给其他蛋白质， 而不丧失蛋白质和 / 或结构域的剩余部分的功能。单抗体可变结构域意指 包括抗体可变结构域的序列特征的折叠的多肽结构域。 它因此包括完整抗体可变结构域和 修饰的可变结构域， 例如其中一个或多个环已用并非抗体可变结构域特有的序列替换， 或 已截短或包括 N 或 C 末端延长的抗体可变结构域， 以及保留全长结构域的至少部分结合活 性和特异性的可变结构域的折叠片段。
本发明的可变结构域可以组合以形成结构域组 ； 例如互补结构域可以组合， 例如 VL 结构域与 VH 结构域组合。非互补结构域也可以组合。结构域可以以许多方式组合， 涉及 通过共价或非共价方式的结构域连接。
“dAb” 或 “结构域抗体” 指特异性结合抗原的单抗体可变结构域 (VH 或 VL) 多肽。
如本文所使用的， 术语 “抗原结合区” 或 “抗原结合部位” 指抗体分子或其抗原结 合部分的一个或多个部分， 其包含与抗原相互作用的氨基酸残基， 并且赋予抗体其对于抗 原的特异性和 / 或亲和力。
术语 “表位” 意指在一个或多个抗体的抗原结合区处能够由抗体识别且由抗体结合的任何分子的部分。在本发明的背景中， 第一个和第二个 “表位” 应理解为并不相同且不 由单个单特异性抗体或其抗原结合部分结合的表位。
短语 “重组抗体” 指通过重组方法制备、 表达、 生成或分离的抗体， 例如使用转染到 宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体， 从重组、 组合抗体文库中分离的抗体， 从对于人免 疫球蛋白基因是转基因的动物 ( 例如， 小鼠 ) 中分离的抗体 ( 参见例如， Taylor 等人 (1992) Nucl.AcidsRes.20 ： 6287-6295)， 或通过任何其他方式制备、 表达、 生成或分离的抗体， 所述 任何其他方式涉及特定免疫球蛋白基因序列 ( 例如， 人免疫球蛋白基因序列 ) 剪接至其他 DNA 序列。重组抗体的例子包括嵌合、 CDR 嫁接和人源化抗体。
术语 “人抗体” 指具有相应于或衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的 抗体， 如由例如 Kabat 等人描述的 ( 参见 Kabat， 等人 (1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest， 第 5 版， U.S.Department of Health and Human Services， NIH 公开号 91-3242)。然而， 本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基 酸残基 ( 例如， 通过体外随机或位点专一诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变 )， 例如 CDRs 且特别是 CDR3。
本发明的重组人抗体具有可变区， 并且还可以包括衍生自人种系免疫球蛋白序列 的恒定区 ( 参见 Kabat 等人 (1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest， 第 5 版， U.S.Department of Health andHuman Services， NIH 公开号 91-3242)。 然而， 在特定 实施方案中， 对此种重组人抗体实施体外诱变 ( 或当使用对于人 Ig 序列转基因的动物时， 体内体细胞诱变 )， 并且因此重组抗体的 VH 和 VL 区的氨基酸序列是这样的序列， 其虽然衍生 自人种系 VH 和 VL 序列且与之相关， 但可能不天然存在于体内人抗体种系谱 (repertoire) 内。然而， 在特定实施方案中， 此种重组抗体是选择性诱变或回复突变或两者的结果。
术语 “回复突变” 指其中人抗体的体细胞突变的氨基酸中的一些或全部替换为来 自同源种系抗体序列的相应种系残基的过程。本发明的人抗体的重和轻链序列与 VBASE 数 据库中的种系序列单独比对， 以鉴定具有最高同源性的序列。通过使编码此种一个或多个 不同氨基酸的限定核苷酸位置突变， 使本发明的人抗体中的差异返回到种系序列。因此鉴 定为用于回复突变的候选物的每个氨基酸的作用应就在抗原结合中的直接或间接作用进 行研究， 并且在突变后发现影响人抗体的任何所需特征的任何氨基酸都不应包括在最终人 抗体中。为了使实施回复突变的氨基酸数目降到最低， 可以保留发现与最紧密的种系序列 不同但与第二个种系序列中的相应氨基酸等同的氨基酸位置， 条件是第二个种系序列与本 发明的人抗体序列在所讨论的氨基酸两侧上的至少 10 个、 优选 12 个氨基酸是等同且共线 的。回复突变可以在抗体最优化的任何阶段时发生。
术语 “嵌合抗体” 指包括来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物 种的恒定区序列的抗体， 例如具有与人恒定区连接的鼠类重和轻链可变区的抗体。
术语 “CDR 嫁接的抗体” 指包括来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体， 但其 中 VH 和 / 或 VL 的一个或多个 CDR 区的序列替换为另一个物种的 CDR 序列， 例如具有鼠类重 和轻链可变区的抗体， 其中一个或多个鼠类 CDRs( 例如， CDR3) 已替换为人 CDR 序列。
术语 “人源化抗体” 指包括来自非人物种 ( 例如， 小鼠 ) 的重和轻链可变区序列的 抗体， 但其中已改变 VH 和 / 或 VL 序列的至少部分以更 “象人” ， 即与人种系可变序列更相似。 一种类型的人源化抗体是 CDR 嫁接的抗体， 其中将人 CDR 序列引入非人 VH 和 VL 序列内， 以替换相应的非人 CDR 序列。
本发明的各个方面在下述小节中更详细地描述。
II. 本发明的方法
本发明的方法和所得到的本发明的组合物提供关于药品运送和 / 或分发的多种 优点， 例如制剂是重量轻的， 并且在环境温度下是稳定的。还存在关于药物配料和 / 或制造 的优点， 例如本体溶液在受控速率下的非过长解冻。人们可以容易地称出对于所需浓度足 够量的本发明的干蛋白质粉末， 并且与所需赋形剂例如水混合或化合。蛋白质沉淀物或蛋 白质晶体悬浮液的分离和干燥也不一定与常规制剂一样。 存在对于药物产品开发关于下述 的另外优点 ： 取得高浓度制剂的能力、 改善的生物利用率、 局部释放 ( 例如， 肺递送 )、 持续 释放 ( 例如， 脂质体和 PLGA 包被的小球体 )、 和可以以多种方式包括经口和局部施用的固体 或水凝胶蛋白质新剂型。因此， 在一些实施方案中， 该方法还包括进一步加工， 例如将粉末 状组合物掺入包被的持续释放组合物、 脂质体、 PLGA 包被的小球体内， 通过熔体挤出掺入赋 形剂基质内等。所得到的组合物也是本发明的进一步实施方案， 例如持续释放或靶向组合 物和 / 或允许可替代施用途径例如经口、 经皮和经肠施用的组合物。另一个优点是本发明 的组合物可以在比常规制剂更高的温度下进行加工。例如， 粉末可以通过熔体挤出技术例 如 MELTREX 熔体挤出技术进行加工。 在一个方面， 本发明提供了高效且有效制备包括一种或多种蛋白质或肽的稳定粉 末的方法。 在特定实施方案中， 蛋白质或肽是抗体和 / 或其抗原结合部分。 用于制备粉末的 方法包括使蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合部分的溶液喷雾干燥。例如， 溶液可以包括至少 约 50mg/mL 蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合部分。在进一步的实施方案中， 溶液可以具有不 同浓度， 例如更浓缩， 例如溶液可以包括至少约 40mg/mL、 50mg/mL、 60mg/mL、 70mg/mL、 80mg/ mL、 90mg/mL、 100mg/mL、 130mg/mL、 150mg/mL、 180mg/mL 等的蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合 部分。溶液还可以包括一种或多种赋形剂。该方法可以包括通过任何已知方法包括例如超 滤使溶液浓缩或进一步浓缩。蛋白质或肽可以是任何合适的蛋白质或肽。蛋白质可以是 抗体或其抗原结合部分， 例如免疫球蛋白 G(IgG) 抗体或其抗原结合部分。在特定实施方案 中， 抗体或其抗原结合部分是 MAK 195F、 阿达木单抗、 ABT-325、 ABT-308 或 ABT-147。
在一些实施方案中， 溶液包括赋形剂。合适的赋形剂包括但不限于海藻糖、 蔗糖、 山梨糖醇、 聚乙二醇、 至少一种氨基酸、 组氨酸、 丙氨酸、 精氨酸、 甘氨酸或其混合物。 该方法 可以进一步包括向溶液或粉末中加入酸性组分、 抗氧化剂和 / 或张力调节剂。
溶液可以包括约 15 至约 140mM、 或约 20 至约 30mM 赋形剂。在特定实施方案中， 溶液包括约 25mM 赋形剂。在一些实施方案中， 溶液包括约 0.27 ∶ 1.0 至约 2.8 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 1.4 ∶ 1.0、 或约 0.27 ∶ 1.0 至约 0.7 ∶ 1.0 的赋形剂∶蛋白质比。在特 定实施方案中， 溶液包括约 0.7 ∶ 1.0 的赋形剂∶蛋白质比。
在一些实施方案中， 溶液具有低百分比的蛋白质聚集物， 尽管蛋白质水制剂的高 浓度。在一个实施方案中， 甚至在不存在表面活性剂或其他类型的赋形剂的情况下， 包括 水和高浓度的蛋白质例如抗体的水溶液也包含小于约 5％的蛋白质聚集物。在一个实施方 案中， 溶液包括不超过约 7.3％的聚集蛋白质 ； 溶液包括不超过约 5％的聚集蛋白质 ； 溶液 包括不超过约 4％的聚集蛋白质 ； 溶液包括不超过约 3％的聚集蛋白质 ； 溶液包括不超过 约 2％的聚集蛋白质 ； 或溶液包括不超过约 1％的聚集蛋白质。在一个实施方案中， 溶液包
括至少约 92％、 至少约 93％、 至少约 94％、 至少约 95％、 至少约 96％、 至少约 97％、 至少约 98％、 或至少约 99％的单体蛋白质。上述浓度中间的范围， 例如至少约 98.6％的单体蛋白 质、 不超过约 4.2％的聚集蛋白质， 也预期是本发明的部分。 此外， 预期包括使用任何上述值 的组合作为上和 / 或下限的值范围。
在一些实施方案中， 入口空气温度 (Tin) 为约 105 ℃至约 175 ℃、 约 130 ℃至约 155℃、 约 120℃至约 160℃、 或约 125℃至约 160℃。在特定实施方案中， Tin 为约 130℃。在 一些实施方案中， 出口空气温度 (Tout) 为约 60℃至约 112℃、 约 60℃至约 90℃、 约 70℃至约 90℃、 或约 75℃至约 85℃。在特定实施方案中， Tout 为约 80℃。
在一些实施方案中， 本发明的方法包括用约 100 ℃至约 180 ℃的入口空气温度 (Tin) 和约 60℃至约 110℃的出口空气温度 (Tout) 的喷雾干燥。在特定实施方案中， 该方法 包括用约 130℃的 Tin 和约 80℃的 Tout 的喷雾干燥。
在一些实施方案中， 所得到的粉末状组合物的残留水分含量是约 1％至约 3％、 约 1.5％至 2.5％、 约 1.4％至约 2％、 约 4％至约 6％、 或约 4.5％至约 5％。在其他实施方案 中， 粉末状组合物包括约 1 ％、 1.5 ％、 2 ％、 2.5 ％、 3 ％、 3.5 ％、 4 ％、 4.5 ％、 5 ％、 5.5 ％、 6 ％、 6.5％、 或 7％的残留水分。
在一个实施方案中， 粉末在环境温度和湿度下稳定至少 3 个月。在一些实施方案 中， 粉末在环境温度和湿度下稳定至少 6 个月、 9 个月、 1 年、 2 年、 3 年或 5 年。在其他实施 方案中， 粉末在 40℃下稳定至少 3 个月。在另外的实施方案中， 粉末在 40℃下稳定至少 3 个月、 6 个月、 9 个月、 1 年、 2 年或 5 年。
在一些实施方案中， 喷雾干燥包括使溶液雾化以形成溶液小滴， 用气体使小滴干 燥以形成粉末， 并且从气体中回收粉末。溶液可以采用例如压力喷嘴雾化器进行雾化。粉 末可以采用例如旋风分离器进行回收。喷雾干燥的示例性方法在本文中讨论且例示。
在另一个方面， 本发明提供了用于制备药物制剂的方法， 其包括本文公开的用于 制备粉末的任何方法， 并且进一步包括使粉末与药学上可接受的载体混合 ( 例如， 包埋或 溶解 )。 药学上可接受的载体可以是对于肠胃外、 经口、 经肠或局部施用可接受的任何载体。 载体可以是固体、 半固体或液体 ( 例如， 水 ) 或其组合。
在一些实施方案中， 该方法包括在药学上可接受的载体中溶解抗体或其抗原结合 部分粉末。药学上可接受的载体可以是例如对于肠胃外施用可接受的， 并且可以包括例如 水。该方法可以进一步包括向药物组合物中加入一种或多种酸性组分、 抗氧化剂和 / 或张 力调节剂。另外或可替代地， 合适的添加剂可以加入本发明的药物组合物中， 例如缓冲剂、 粘性调节剂、 调味剂、 着色剂等。
该方法可以包括在高于环境温度的温度下进一步加工本发明的稳定的粉末状组 合物， 而不显著影响粉末状组合物的稳定性。 例如， 该方法可以包括熔体挤出稳定的粉末状 组合物。
在一些实施方案中， 将一种或多种包衣应用于粉末状组合物， 例如从而使得小颗 粒或颗粒聚集物被包被和 / 或从而使得颗粒的复合物例如挤压的片剂被包被。包衣可以包 括本领域常用且已知的任何包衣。此类包衣可以包括聚合物例如 PLGA 以形成持续释放或 延迟释放的药物组合物。 包衣可以是或包括肠溶衣。 组合物可以被囊化在例如明胶胶囊中， 或悬浮于水凝胶中。在特定实施方案中， 蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合部分的活性通过赋形剂针对经由有机溶剂的沉淀、 变性或氧化这样或以其他方式进行保护， 从而允许用仅在 有机溶剂中可溶的物质例如 PLGA 的包被。此种溶剂可以包括药物制剂中通常发现的溶剂， 包括但不限于聚乙二醇 ( 例如， 低分子量例如 PEG 400)、 乙醇、 二甲基亚砜 (DMSO)、 N- 甲基 吡咯烷酮 (NMP) 或冰乙酸。
喷雾干燥
在喷雾干燥器中， 使可泵抽的流体 ( 溶液、 悬浮液、 乳剂或糊剂 ) 转变成干燥颗粒 形式。通过使液体进料雾化到热的干燥介质 ( 正常为空气或惰性气体 )， 该过程使颗粒形 成和干燥组合在一个步骤中。 在本发明的一些实施方案中， 使浓缩的蛋白质溶液喷雾干燥。 因此， 本发明的方法可以包括采用任何合适方法使蛋白质溶液浓缩。 在一些实施方案中， 采 用切向流过滤 (TFF) 技术， 因为这是非常快速且温和的方法。然而， 另外或可替代地， 可以 使用正常流动过滤或透析。
流 体 的 雾 化 导 致 液 体 的 表 面 增 加 并 且 因 此 导 致 非 常 短 的 干 燥 时 间。 例 如， 使 小 滴 大 小 从 10μm 减 少 至 1μm， 导 致 表 面 积 从 600 增 加 至 6000m2， 并且使其干燥时 间 缩 短 到 1/100( 从 0.01 秒 到 0.0001 秒 )。Stahl， Feuchtigkeit und Trocknen in der Pharmazeutischen Technologie.Dr.Dieter Steinkopf Verlag GmbH&Co.KG ， Darmstadt(1999)。
液体进料和干燥空气之间的接触可以以 2 种不同方式发生。 在并流 (co-current) 系统中， 干燥空气和颗粒 ( 小滴 ) 以相同方向移动通过干燥室。 这是用于加热敏感材料 ( 例 如蛋白质 ) 的优选方式， 因为最热的空气接触潮湿的小滴。当干燥空气和小滴以相反方向 移动时， 这被称为逆流方式。以逆流方式产生的颗粒通常显示比废气更高的温度。废气其 自身可以离开系统 (“开式循环” ) 或可以再循环 (“闭合循环” ， 一般用于用惰性气体蒸 发有机溶剂 )。Spray Drying Process Principles(《www.niro.com》 ， 2007 年 2 月 )。通 过从各种喷雾干燥器设计 ( 大小、 雾化器、 无菌状态等 ) 中选择， 并且调整不同的过程参数 ( 干燥气流、 干燥空气温度等 )， 可以控制最终粉末性质如颗粒大小、 形状和结构或甚至无 菌性。 如果所得到的回收粉末的水分不足够低， 那么可能需要后处理， 例如以流化床干燥器 和冷却器、 接触干燥器或甚至微波干燥器的形式。Masters， Spray Drying in Practice. SprayDryConsultInternational ApS ； Charlottenlund(2002)。
喷雾干燥过程一般包括 ： 液体进料的雾化 ； 小滴的干燥 ； 以及干燥产物的分离和 回收。每个步骤对所得到的产物都具有其自身影响并且也提供困难， 尤其是当处理敏感材 料如蛋白质时。
为了使蛋白质或肽喷雾干燥， 使用稳定佐剂通常是有利的。糖例如海藻糖和蔗 糖是有效的蛋白质稳定剂。它们不仅可以减少蛋白质在喷雾干燥过程期间的聚集和 / 或 失活， 且如果低于其玻璃化转变温度贮藏， 那么它们还可以对所得到的粉末的贮藏稳定 性具有积极作用。Lee， Rational Design of Stable Protein Formulations， Theory andPractice(Kluwer Academic/Plenum Publishers， 2002)。
雾 化 是 液 体 断 裂 成 许 多 单 个 小 滴， 所 谓 的 喷 雾。 雾 化 设 备 的 选 择 影 响 最 终 产 物 品 质 和 通 量。Richter， Verfahrenstechnik， SonderausgabeMartübersicht 11 ： 96-100(1997)。所有雾化器共有的是使用能量以打碎液体。不同种类的能量区分不同的雾 化器。能量导致流出液体中的紊流。连同应用的气体压力， 克服液体的表面张力和粘性且发生崩解。
对于喷雾干燥操作， 最合适的喷雾是大致相等大小的小滴之一。并非所有雾化系 统都能够提供关于喷雾干燥粉末的窄颗粒大小分布。 Masters， Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。蛋白质是非常敏感的材 料， 因此雾化代表应激因素， 这是因为它暗示剪切力， 不稳定性的可能起因。Mahler 等人 发现高剪切力 ( 搅拌和振荡 ) 和 IgG 1 溶液的聚集增加之间的关联。Mahler 等人， Eur. Journal of Pharm.and Biopharm.59 ： 407-417(2005)。溶菌酶溶液也显示在雾化过程 中的聚集和丧失活性。Yu 等人， Eur.Journal of Pharm.Sci 27 ： 9-18(2006)。剪切应 力和液体 / 气体界面的突然扩大看起来负责这类蛋白质变质。Maa 等人， Biotechnology andBioengineering 54(6) ： 503-512(1997)。但即使在泵送程序中发生的剪切力也可以足 以对蛋白质溶液施加应激。Brennan 等人， Diabetes34， 353-359(1985)。许多不同类型的 雾化器可用于喷雾干燥程序。
旋转雾化器在液体进料排出到空气 / 气体大气内之前使其离心加速。液体进料 在中心分布在旋转轮、 盘或杯上。在低盘速下， 小滴的形成主要依赖于液体的粘性和表面 张力。盘速越高， 越多的惯性和空气阻力开始活动且促成小滴形成机制。此外， 小滴大小 受液体进料速率、 其固体含量和密度、 雾化器盘直径和设计的影响。不同设计的旋转雾化 器是可获得的 ： 无叶片的盘 / 碗 / 杯或具有弯曲或直叶片的叶轮。Masters， Spray Drying Handbook(Wiley&Sons Inc.， New York， 1991)。 旋转雾化器具有 360°的喷雾器角度并且因此需要一定直径的干燥室 ( 以使壁沉 积降到最低 )。这些系统正常用于更高的容量。
压力喷嘴系统通过将压能转换成动能获得从液体自身排出液体所需的所有能量。 最简单的单流体喷嘴是用于滴出单个小滴的管状毛细管。 这种设备仅用于产生小量相等的 小滴。通过增加流速， 可以达到雾化， 其中液体喷射经由紊流断裂成小滴。流体的崩解可以 通过使液体经历偏转、 旋转和转动得到改善， 例如通过提供具有旋涡插入物或涡流室的喷 嘴。所得到的小滴大小受所应用的压力和喷嘴直径， 加上先前讨论的参数 ( 粘性、 流速等 ) 的影响。Richter， Verfahrenstechnik， Sonderausgabe Martübersicht11 ： 96-100(1997)。 液体进料离开作为中空锥体的孔， 即压力喷嘴可以用于具有低直径干燥室的小型喷雾干 燥设备。大量不同喷嘴设计提供用于雾化溶液、 乳剂和悬浮液的各种应用， 仅受颗粒大小 ( 悬浮液 ) 和粘性 ( 需要非常高压力 ) 的限制。Masters， Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。
当采用气动喷嘴雾化时， 用液体碰撞高速气态介质 ( 通常为空气 ) 提供用于小滴 形成的能量。 依赖于其中流体和气体碰撞的场所， 区分内部混合和外部混合系统。 Richter， Verfahrenstechnik， SonderausgabeMartübersicht 11 ： 96-100(1997)。当高粘性流体必 须被打碎成细微尺寸的小滴时， 优选使用 2 个流体喷嘴。气态介质在喷嘴内增压 ( 最高达 7 巴 )， 所述喷嘴有时配备另外的涡旋插入物， 以产生气体紊流促进液体进料的崩解。后者 正常通过支持气流喷射器效应的低压泵进行泵送。气动喷嘴系统产生 5 至 75μm 范围中 的小滴。缺点是关于压缩气体 / 空气的高成本及其在干燥室内的冷却效应。当处理具有 非常高粘性的液体时， 还存在堵塞喷嘴孔的危险。Masters， Spray Drying inPractice. SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。
超声喷嘴采用高频声波以达到雾化。压电换能器接受来自超声波发生器的高频 电能， 并且将其转变成相同频率的振动机械运动。将液体引入运行喷嘴的长度。当液体进 料达到孔时， 它吸收振动能， 从而促使其雾化。Sono Tek Corporation ： Ultrasonic spray nozzle systems(SONO TEK Corporation， New York， 2007)。
声波喷嘴在低压力下工作 ( 尤其与气动喷嘴相比较 )， 并且所得到的小滴具有 10 至 50μm 的直径。使用超声雾化器的一个大缺点是连续操作的不可预知性， 例如， 当用于 含固体原料时， 喷嘴区域中的预干燥的风险可能导致发生器 / 雾化过程的结垢。因此， 这 些系统更常用于实验室规模的中试干燥器用于产生细微喷雾， 或当非牛顿学说或高粘性液 体不允许使用其他喷嘴系统时。Masters， Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。
预测在喷雾干燥过程中喷雾的干燥动力学通过监控整体喷雾的行为中的困难和 干燥室内的不均匀条件变得复杂。然而， 单个小滴的干燥动力学可以在理论上和实践上进 行研究。Elversson 等人， Journal ofPharm.Sci 94(9) ： 2049-2060(2005)。
液体进料一雾化， 它的表面与质量比就增加， 并且空气和小滴之间的传热就加速， 并且小滴现在可以非常快速地干燥。在＜ 100μm 的常见小滴大小时， 蒸发在小于 1 秒内发 生。Nürnberg 等人， ActaPharmaceutica Technologica， 26(1) ： 39-67， Tab 3-1(1980)。涉 及 2 个对流过程 ： 传热 ( 空气→小滴 ) 和水分的质量传递 ( 小滴→空气 )。在后者中， 水分 必须穿过围绕每个小滴的边界层。传递速率受温度、 湿度、 周围空气的转运性质、 小滴直径 以及小滴和空气之间的相对速度的影响。Masters， Spray Drying Handbook(Wiley&Sons Inc.， NewYork， 1991)。起初， 蒸发以恒定速率发生 ( 第一个干燥阶段＝恒定速率阶段 )。 水分从小滴内的扩散维持饱和的表面状态。在所谓的 “临界点” 时， 水分含量变得太低而 无法维持小滴表面上的饱和， 并且干燥层开始在小滴的表面上形成。从那时起， 存在经由 扩散跨越的另外增长中的屏障。由于小滴 / 颗粒的持续改变的状态， 蒸发速率下降 ( 下降 速率阶段＝第二个干燥阶段 )。Masters， Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。 在过程期间小滴 / 颗粒的温度主要受入口干 燥空气温度 (TIn) 和液体进料速率 (QLF) 的影响， 在一定程度上受干燥空气流速 (QDA) 和雾化 空气流速 (QAA) 的影响。这 4 种参数也决定 TOut。在实践中， 与 TIn 相比较， 紧在喷嘴孔下的 温度更接近于 TOut， 因此 TOut 看起来是小滴干燥速率的决定变量。 当然小滴内的温度 (Ti) 低 于其表面上的温度 (Ts)。Ts 很快达到湿球温度 Twb， 并且在恒定速率阶段保持在那里。随着 下降速率阶段中小滴表面上逐渐增长的外壳， Ts 和 Ti 开始增加。Maa 等人， Biotechnology and Bioengeneering 53(6) ： 503-512(1997)。对于所得到的颗粒形态， 小滴大小以及外壳 的质地起关键作用。 Elversson 等人假定小滴大小和颗粒大小之间的线性关系， 但还暗示液 体进料中的固体含量强烈影响颗粒大小。Elversson 等人， Journal of Pharm.Sci.92(4) ： 900-910(2003)。
干燥暗示关于蛋白质的 2 种另外的应激因素 ： 热和脱水。蛋白质对于热应激的 稳定性是蛋白质制剂中的关键变量。在喷雾干燥过程期间温度中的改变对蛋白质稳定 性 ( 例如， 过程稳定性、 在加速稳定性测试过程中的贮藏期限 ) 具有极大影响。当暴露 于升高的温度时， 蛋白质变得更有柔性 ( 氢键减弱 )， 从而导致部分解折叠， 并且它们的 碰 撞 频 率 增 加。Brange， Pharmaceutical Formulation Development ofPeptides andProteins(Taylor&Francis Ltd.， 2000)。 这个过程通常是可逆的， 但一旦部分解折叠， 蛋白 质就对进一步的降解途径如聚集或不正确的折叠非常易感， 这强烈影响其功能和长期稳定 性。
关于最大限度稳定性的温度对于大多数蛋白质在 -10 至 35℃之间。Bummer 等人， Protein Formulation and Delivery(Marcel Dekker AG， Basel， 2000)。Mumenthaler 等 人假设干燥颗粒达到低于 TOut 约 25℃的最高温度。Mumenthaler 等人， Pharm.Res.11(1) ： 12-20(1994)。在本发明中， TOut 可以为约 60 ℃至约 80 ℃。热变性一般不视为喷雾干燥 过程中的主要不稳定性因素。Maa 等人， Current PharmaceuticalBiotechnology 1(3) ： 283-302(2000)。
蛋白质的生物活性依赖于其天然的三维结构。在水溶液中， 蛋白质通过被其表面 上非共价结合的水分子围绕而维持其天然结构。正常非极性氨基酸残基埋入内部， 并且极 性氨基酸残基存在于表面上。这导致蛋白质在溶液中非常紧密的堆积 ( 比有机分子晶体中 更高的堆积密度 )。Brange， Pharmaceutical Formulation Development of Peptidesand Proteins(Taylor&Francis Ltd.， 2000)。去除水可以使这种堆积去稳定， 并且可以发生构 象变化。
喷雾干燥过程的最后一个步骤一般是粉末与空气 / 气体分离和取出干燥产 物。在一些实施方案中， 这个步骤尽可能有效， 以获得高粉末得率且防止通过粉末散 发 至 大 气 的 空 气 污 染。 为 此， 可 以 使 用 干 和 湿 收 集 设 备， 如 旋 风 分 离 器、 袋滤器或静 电 沉 积 器。 甚 至 可 以 安 装 这 些 单 元 的 组 合。Masters， Spray Drying in Practice. SprayDryConsultInternational ApS ； Charlottenlund(2002)。 因 为 它 的 简 单 设 计 及 其有效性， 旋风分离器是最常见的分离器之一， 并且在各种工业中使用。Coulson 和 Richardson， Chemical Engineering， 4th， 第 2 卷 (Butterworth-Heinemann， Oxford， 1991)。在旋风分离器内的粒子运动是 2 个相反力量的结果。离心力使粒子向旋风分 离器壁运动， 而空气 / 气体的曳力试图携带粒子进入中心气体核内， 以离开旋风分离 器。 Masters ， Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。粉末和空气成切线地进入旋风分离器， 并且以螺旋形式向下旋 涡至旋风分离器的底部 ( 外部旋涡 )。在这一点上， 大多数颗粒离开旋风分离器以被收 集到底部安装的容器中， 仅包含细小颗粒级分和无法被分离的其他颗粒的空气在旋风分 离器的中心 ( 内部旋涡 ) 向上螺旋， 并且离开顶部。在实践中应当可以回收超过 30μm 的 颗 粒 大 小， 这 也 依 赖 于 喷 雾 干 燥 器 的 尺 度。Masters， Spray Drying inPractice. SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。然而， 得率可以通过改变 旋风分离器尺度得到最优化。 与标准旋风分离器相比较， Maury 等人用新近开发的旋风分离 器在 Büchi B-191 喷雾干燥器上达到高得多的得率。Maury 等人， Eur.Journal of Pharm. andBiopharm.59(3) ： 565-573(2005)。高性能旋风分离器 ( 小直径 ) 分离更多包括甚至非 常小的颗粒 ( 直径小于 1.5μm)。
已执行关于计算旋风分离器效率的理论工作。一种方法是计算所谓的 “截止点” ， 例如通过下述等式 ：
dp* 是截止粒径， η 是空气粘度， ri 代表内部旋涡的半径， vri 是在空气进口处的 径向空气速度， ρs 和 ρg 代表固体和气体的密度， ui 是在 ri 处的切向颗粒速度。在这一 点上 ( 颗粒的直径 )， 离心力和曳力具有相等值。那个尺寸的颗粒无向内部或外部旋涡的 趋势旋转， 更小的颗粒通过废气冲走， 更大的颗粒落入收集容器内。Staudinger 等人， VDI Berichte1511 ： 1-23(1999)。
飞行时间方法是计算临界粒径的另一种方法。 它考虑颗粒花费多久行进至旋风分 离器壁。在这种方法中， 可以考虑收集容器的几何形状， 因为它影响旋风分离壁内的气流。 Qian 等人， Chem.Eng.Technol.29(6) ： 724-728(2006)。
无 任 何 佐 剂 使 蛋 白 质 水 溶 液 喷 雾 干 燥 正 常 导 致 解 折 叠、 聚 集 和 失 活。 已 用各种蛋白质尝试几次 ： 氧 合 血 红 蛋 白 (Labrude 等 人 )、 胰 蛋 白 酶 原 (Tzannis 等 人 )、 IgG(Maury 等人 2005)， 并 且 在 所 有情况下 观察到过程不稳 定性。Labrude 等人， Journal of Pharm.Sci.78(3) ： 223-229(1989)， Tzannis， 等 人， Journal of Pharm. Sci.88(3) ： 351-359(1999)， 和 Maury 等人， Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(2) ： 251-261(2005)。因此， 在一些实施方案中， 本发明的组合物在喷雾干燥过程期间以及在 贮藏期间保护活性药物成分 (API)。在蛋白质的冷冻干燥中， 糖 ( 海藻糖、 蔗糖 )、 氨基酸 ( 精氨酸 ) 或表面活性剂 (Tween) 已用作稳定试剂。Lee， Rational Design of Stable ProteinFormulations， Theory and Practice(Kluwer Academic/PlenumPublishers， 2002)。对于多元醇、 二糖和氨基酸的使用， 已提出几种稳定理论。其中之一是由 Arakawa 和 Timasheff 确 立 的 所 谓 的 “优 先 排 除” 理 论。Arakawa 等 人， Biochemistry 21 ： 6536-6544(1982)， Arakawa 等人， Advanced Drug Delivery Reviews46 ： 307-326(2001)， 和 Timasheff， Annual Reviews Biophys.Biomol.Struct.22 ： 67-97(1993)。它基于下述前 提： 蛋白质在溶液中优先水合， 因此共溶质被排除与蛋白质表面接触。 因为解折叠将导致更 大的蛋白质表面， 所以共溶质必须从其中被排除的面积也将更大。 在这种情况下， 解折叠导 致热力学上不利的情况， 因此蛋白质保持其折叠的天然构象。Arakawa 等人， AdvancedDrug Delivery Reviews46 ： 307-326(2001)。蛋白质还可以通过 “水置换” 机制进行保护。这种 理论宣称赋形剂通过代替蒸发的水与干燥蛋白质氢键键合而阻止解折叠。Carpenter 等 人， Rational Design of StableProtein Formulations， Theory and Practice(Kluwer Academic/PlenumPublishers， 2002)。同样， 使蛋白质固定的玻璃状基质的形成可以是关 于在干燥和贮藏后的蛋白质稳定性的原因。Tzannis 等人， Journal ofPharm.Sci.88(3) ： 360-370(1999)。因此， 需要显示高玻璃化转变温度 (Tg) 的制剂， 例如高于贮藏温度的 Tg 以阻碍分子运动。表面活性剂的稳定作用机制基于表面活性剂和蛋白质竞争占据界面 ( 例 如， 液体 / 空气界面 )， 从而显示对于表面活性剂的热力学优势 (edge)。由于蛋白质在界 面处吸附的小机会， 解折叠和聚集的风险显著减少。Adler 等人， Journal of Pharm.Sci.， 88(2)， 199-208(1999)。
湿度是影响蛋白质稳定性的另一种因素， 尤其是在长期贮藏过程中。水分对蛋白 质粉末的影响在文献中得到充分证明。正常， 由于水充当反应剂或充当关于反应剂动员的
介质， 固体蛋白质制剂的化学稳定性随着增加的水分含量而下降。它还可以负责蛋白质结 构中的构象变化。除此之外， 喷雾干燥粉末的 Tg 也受水的影响。水充当增塑剂， 这意味着 它降低物质的 Tg。 水的影响可以使用 Gordon Taylor Equation 进行计算， 这是计算二元混 合物的 Tg(Tgmix) 的等式。
Tgmix ＝ (ω1·Tg1+K·ω2·Tg2)/(ω1+K·ω2)
K ＝ (ρ1·Tg1)/(ρ2·Tg2)
ω、 Tg 和 ρ 分别代表不同组分的重量分数、 玻璃化转变温度和密度。对于具有 约 -138℃的 Tg 的水， 显而易见的是所得到的粉末的含水量应当低。Hancock 等人， Pharm. Res.11(4) ： 471-477(1994)。然而， 含水量和稳定性之间的相关性看起来不是线性的。 Chang 等人获得冻干 IgG 在 2-3％的中间含水量时的最佳稳定作用。Chang 等人， Journal ofPharm.Sci 94(7) ： 1427-1444(2005)。
由于这个知识， 起因于喷雾干燥过程的粉末应显示低残留水分， 并且还在贮藏过 程中被保护免于潮湿。Maa 等人， Pharm.Res.15(5) ： 768-775(1998)。在一定程度上， 前者 可以受过程条件 ( 入口空气温度 (TIn)、 入口空气的相对湿度 (RH)) 的影响 ； 后者是密封小 瓶或可控贮藏条件的问题。
III. 本发明的制剂
任何合适的蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合部分都可以用于制备本发明的组合 物。例如， 它可以是 IgG 类型。示例性抗体或其抗原结合部分包括但不限于 MAK 195F、 阿达木单抗或 ABT-325。适合于根据本发明使用的抗 TNF 抗体是众所周知的 ( 例如， 如 EP-A-0260610、 EP-A-0351789、 EP-A-0218868 中描述的 )。可以使用多克隆和单克隆抗体。 此外， TNF 结合抗体片段例如 Fab 或 F(ab′ )2 片段或单链 Fv 片段也是合适的。合适的单 克隆抗 hTNF-α 抗体在 EP-A-0260610 中描述， 指定为 AM-195 或 MAK-195， 这通过在登记号 87050803 下保藏于 ECACC 的杂交瘤细胞系产生。鼠类抗 TNF 抗体片段 (F(ab′ )2) 也指定 为 MAK 195F(INN ： 阿非莫单抗 (Afelimomab))， 也是合适的。
在一个实施方案中， 本发明的制剂包括结合人 TNFα 的抗体或其抗原结合部分， 包括例如阿达木单抗 ( 也称为 Humira 或 D2E7 ； AbbottLaboratories)。在一个实施方案 -8 中， 抗体或其抗原结合部分以 1x 10 M 或更少的 Kd， 和 1x 10-3s-1 或更少的 Koff 速率常数与 人 TNF α 解离， 两者都通过表面等离振子共振进行测定， 并且在标准体外 L929 测定中以 -7 1x10 M 或更少的 IC50 中和人 TNFα 细胞毒性。 用于制备对于人 TNFα 具有高亲和力的人中 和抗体的例子和方法， 包括抗体的序列， 在引入本文作为参考的美国专利号 6,090,382 中 得到描述。
在一个实施方案中， 本发明的制剂包括结合人白细胞介素 -12(IL-12) 的抗体或 其抗原结合部分， 包括例如抗体 ABT-874(AbbottLaboratories)( 美国专利号 6,914,128)。 ABT-874 是设计为靶向且中和白细胞介素 -12 和白细胞介素 -23 的全人单克隆抗体。在一 个实施方案中， 抗体或其抗原结合部分具有下述特征中的一种或多种 ： 它以 3x10-7M 或更少 的 KD 与人 IL-1α 解离 ； 以 5x 10-5M 或更少的 KD 与人 IL-1β 解离 ； 并且不结合小鼠 IL-1α 或小鼠 IL-1β。用于制备对于人 IL-12 具有高亲和力的人中和抗体的例子和方法， 包括抗 体的序列， 在引入本文作为参考的美国专利号 6,914,128 中得到描述。
在一个实施方案中， 本发明的制剂包括结合人 IL-18 的抗体或其抗原结合部分，包括例如抗体 ABT-325(Abbott Laboratories)( 参见美国专利申请号 2005/0147610)。
在 一 个 实 施 方 案 中， 本 发 明 的 制 剂 包 括 结 合 人 IL-12 的 抗 体 或 其 抗 原 结 合 部 分， 例 如 抗 体 ABT-147(Abbott Laboratories)( 参 见 2007 年 1 月 11 日 公 开 的 WO 2007/005608A2)。
在一个实施方案中， 本发明的制剂包括结合人 IL-13 的抗体或其抗原结合部分， 例如抗体 ABT-308(Abbott Laboratories)( 参见 PCT/US2007/19660)。
可以包括在粉末状制剂中的蛋白质的例子包括抗体或其抗原结合部分。 可以在本 发明中使用的不同类型抗体或其抗原结合部分的例子包括但不限于， 嵌合抗体、 人抗体、 人 源化抗体和结构域抗体 (dAb)。 在一个实施方案中， 在本发明的方法和组合物中使用的抗体 是抗 TNFα 抗体或其抗原结合部分、 或抗 IL-12 抗体、 或抗 IL-13 抗体或其抗原结合部分。 可以在本发明中使用的抗体或其抗原结合部分的另外例子包括但不限于， ABT-147(Abbott Laboratories) 、ABT-325( 抗 IL-18 ； AbbottLaboratories) 、ABT-308(Abbott Laboratories)、 ABT-874( 抗 IL-12 ； Abbott Laboratories)、 阿非莫单抗 (Fab 2 抗 TNF ； Abbott Laboratories)、 Humira( 阿达木单抗 ； Abbott Laboratories)、 Campath( 阿仑单抗 (Alemtuzumab))、 CEA-Scan 阿西莫单抗 (Arcitumomab)(fab 片段 )、 爱比妥 (Erbitux)( 西 妥昔单抗 (Cetuximab))、 赫赛汀 (Herceptin)( 司徒曼布 )、 Myoscint( 戊酸印西洛马 )、 ProstaScint( 卡罗单抗喷地肽 (Capromab Pendetide))、 类克 (Remicade)( 英夫单抗 )、 ReoPro( 阿昔单抗 )、 Rituxan( 利妥希码 )、 舒莱 (Simulect)( 巴利昔单抗 (Basiliximab))、 Synagis( 帕 利 珠 单 抗 (Palivizumab))、 Verluma(Nofetumomab)、 Xolair( 奥 马 珠 单 抗 (Omalizumab))、 赛 尼 哌 (Zenapax)( 达 利 珠 单 抗 (Daclizumab))、 Zevalin( 替 伊 莫 单 抗 (Ibritumomab))、 Orthoclone OKT3( 鼠 单 克 隆 抗 体 -CD3)、 Panorex( 依 决 洛 单 抗 (Edrecolomab)、 和麦罗塔 (Mylotarg)( 吉妥珠单抗奥佐米星 (Gemtuzumab ozogamicin))。
在一个可替代实施方案中， 蛋白质是融合蛋白， 包括但不限于 Pulmozyme( 阿法链 道酶 )、 利比 (Rebif)、 Regranex( 贝卡普勒明 )、 激活酶 ( 阿替普酶 )、 Aldurazyme( 拉罗尼酶 (Laronidase))、 Amevive( 阿法赛特 (Alefacept))、 Aranesp( 阿法达贝泊汀 (Darbepoetin alfa)、 贝 卡 普 勒 明 浓 缩 物、 Betaseron( 干 扰 素 β-1b)、 BOTOX(A 型 肉 毒 杆 菌 毒 素 )、 Elitek( 拉布立酶 (Rasburicase))、 左旋爱旋巴 ( 天冬酰胺酶 )、 红细胞生成素 ( 阿法依伯 汀 )、 Enbrel( 依那西普 (Etanercept)) 法布瑞酶 (Fabrazyme)( 阿加糖酶 β(Agalsidase beta))、 干复津 (Infergen)( 复合 α 干扰素 (Interferon alfacon-1))、 Intron A( 干扰素 α-2a)、 Kineret( 阿那白滞素 (Anakinra))、 MYOBLOC(B 型肉毒杆菌毒素 )、 Neulasta( 聚 乙二醇化非格司亭 (Pegfilgrastim))、 Neumega( 奥普瑞白介素 (Oprelvekin))、 优供津 ( 非格司亭 )、 Ontak( 地尼白介素 2(Denileukindiftitox))、 PEGASYS( 聚乙二醇化干扰素 α-2a(Peginterferon alfa-2a))、 阿地流津 ( 阿地白介素 )、 Pulmozyme( 阿法链道酶 )、 利 比 ( 干扰素 β-1a)、 Regranex( 贝卡普勒明 )、 Retavase( 瑞替普酶 )、 Roferon-A( 干扰素 α-2)、 TNKase( 替尼普酶 )、 和 Xigris(Drotrecogin alfa)。
可以包括在本文描述的方法和组合物中的蛋白质的其他例子包括哺乳动物蛋白 质， 包括其重组蛋白质， 例如生长激素， 包括人生长激素和牛生长激素 ； 生长激素释放因子 ； 甲状旁腺激素 ； 促甲状腺激素 ； 脂蛋白 ； α-1- 抗胰蛋白酶 ； 胰岛素 A 链 ； 胰岛素 B 链 ； 胰岛 素原 ； 促卵泡激素 ； 降钙素 ； 黄体生成素 ； 胰高血糖素 ； 凝血因子例如因子 VIIIC、 因子 IX、组织因子和 von Willebrands 因子 ； 抗凝血因子例如 C 蛋白 ； 心钠素 ； 肺表面活性剂 ； 纤溶 酶原激活物， 例如尿激酶或组织型纤溶酶原激活物 (t-PA) ； bombazine ； 凝血酶 ； 肿瘤坏死 因子 -α 和 -β 脑啡肽酶 ； RANTES( 受激活调节的正常 T 细胞表达和分泌的因子 ) ； 人巨 噬细胞炎性蛋白质 (MIP-1-α) ； 血清清蛋白例如人血清白蛋白 ； 苗勤管 (mullerian) 抑 制物质 ； 松弛素 A 链 ； 松弛素 B 链 ； 松弛素原 ； 小鼠促性腺素相关肽 ； DNA 酶 ； 抑制素 ； 激活 蛋白 ； 血管内皮生长因子 (VEGF) ； 关于激素或生长因子的受体 ； 整联蛋白 ； A 蛋白或 D 蛋 白； 类风湿因子 ； 神经营养因子例如骨衍生神经营养因子 (BDNF)、 神经营养蛋白 -3、 -4、 -5 或 -6(NT-3、 NT4、 NT-5 或 NT-6)， 或 神 经 生 长 因 子 例 如 NGF-β ； 血小板衍生生长因子 (PDGF) ； 成纤维细胞生长因子例如 aFGF 和 bFGF ； 表皮生长因子 (EGF) ； 转化生长因子 (TGF) 例如 TGF α 和 TGF-β， 包括 TGF-β1、 TGF-β2、 TGF-β3、 TGF-.β4 或 TGF-β5 ； 胰岛素样生 长因子 -I 和 -II(IGF-I 和 IGF-II) ； des(1-3)-IGF-I( 脑 IGF-I) ； 胰岛素样生长因子结合蛋 白质 ； CD 蛋白质例如 CD3、 CD4、 CD8、 CD 19 和 CD20 ； 促红细胞生成素 (EPO) ； 血小板生成素 (TPO) ； 骨诱导因子 ； 免疫毒素 ； 骨形态发生蛋白 (BMP) ； 生长和分化因子， 干扰素例如干扰 素 -α、 -β 和 -γ ； 集落刺激因子 (CSFs)， 例如 M-CSF、 GM-CSF 和 G-CSF ； 白细胞介素 (ILs)， 例如 IL-1 至 IL-10 ； 超氧化物歧化酶 ； T 细胞受体 ； 表面膜蛋白质 ； 衰变加速因子 (DAF) ； 病 毒抗原例如 AIDS 被膜的部分 ； 转运蛋白质 ； 归巢受体 ； 地址素 ； 调节蛋白质 ； 免疫粘附素 ； 抗体 ； 和任何上述多肽的生物学活性片段或变体。
多克隆抗体
多克隆抗体一般指抗体的混合物， 所述抗体对于特定抗原特异， 但与抗原上的不 同表位结合。多克隆抗体一般通过相关抗原和佐剂的多次皮下 (sc) 或腹膜内 (ip) 注射在 动物中产生。使用双功能或衍生剂， 例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯 ( 通过半胱 氨酸残基缀合 )、 N- 羟基琥珀酰亚胺 ( 通过赖氨酸残基 )、 戊二醛、 琥珀酐、 SOCl2 或 R1NCNR， 其中 R 和 R1 是不同的烷基， 使相关抗原与在待免疫接种的物种中是免疫原性的蛋白质 ( 例 如， 钥孔 血蓝蛋白、 血清清蛋白、 牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂 ) 缀合， 可以是 有用的。用于制备多克隆抗体的方法是本领域已知的， 并且例如在引入本文作为参考的 Antibodies ： A Laboratory Manual， Lane 和 Harlow(1988) 中得到描述。
单克隆抗体
如本文所使用的， “单克隆抗体” 意指杂交瘤衍生的抗体 ( 例如， 通过由杂交瘤技术 例如标准 Kohler 和 Milstein 杂交瘤法制备的杂交瘤分泌的抗体 )。例如单克隆抗体可以 使用首先由 Kohler 等人， Nature， 256 ： 495(1975) 描述的杂交瘤法进行制备， 或可以通过重 组 DNA 法 ( 美国专利号 4,816,567) 进行制备。因此， 本发明的杂交瘤衍生的双重特异性抗 体仍指的是单克隆抗体， 尽管它对于超过单个抗原具有抗原特异性。 单克隆抗体得自基本上均质抗体的群体， 即构成群体的个别抗体是等同的， 除可 能以小量存在的可能天然发生的突变外。因此， 修饰词 “单克隆” 指示抗体不是分离的抗体 的混合物的特征。
在进一步的实施方案中， 使用 McCafferty 等人， Nature， 348 ： 552-554(1990) 中 描述的技术， 可以从产生的抗体噬菌体文库中分离抗体。Clackson 等人， Nature， 352 ： 624-628(1991) 和 Marks 等人， J.Mol.Biol.， 222 ： 581-597(1991) 分别描述了使用噬菌体 文库分离鼠类和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力 (nM 范围 ) 人抗体
(Marks 等人， Bio/Technology， 10 ： 779-783(1992))， 以及组合感染和体内重组作为用于构 建非常大噬菌体文库的策略 (Waterhouse 等人， Nuc.Acids.Res.， 21 ： 2265-2266(1993))。 因此， 这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
抗体和抗体片段还可以使用表达文库从酵母和其他真核细胞中分离， 如美国专利 号 6,423,538 ； 6,696,251 ； 6,699,658 ； 6,300,065 ； 6,399,763 ； 和 6,114,147 中描述的。真 核细胞可以进行工程改造， 以表达文库蛋白质， 包括来自组合抗体文库， 用于在细胞表面上 展示， 允许在包含文库克隆的特定细胞中选择具有亲和力的抗体， 以选择靶分子。 在从分离 细胞中回收后， 编码目的抗体的文库克隆可以以高水平由合适的哺乳动物细胞系表达。
用于开发目的抗体的另外方法包括使用核酸展示技术的无细胞筛选， 如美国专 利 号 7,195,880 ； 6,951,725 ； 7,078,197 ； 7,022,479 ； 6,518,018 ； 7,125,669 ； 6,846,655 ； 6,281,344 ； 6,207,446 ； 6,214,553 ； 6,258,558 ； 6,261,804 ； 6,429,300 ； 6,489,116 ； 6,436,665 ； 6,537,749 ； 6,602,685 ； 6,623,926 ； 6,416,950 ； 6,660,473 ； 6,312,927 ； 5,922,545 ； 和 6,348,315 中描述的。 这些方法可以用于以这样的方式在体外从核酸转录蛋 白质， 从而使得蛋白质在物理上与它由其起源的核酸联合或结合。通过用靶分子选择表达 的蛋白质， 也选择编码蛋白质的核酸。 在关于无细胞筛选技术的一个变动中， 从免疫系统细 胞中分离的抗体序列可以分离且部分随机化， 聚合酶链反应诱变技术可以用于增加抗体多 样性。这些部分随机化的抗体基因随后在无细胞系统中表达， 伴随在核酸和抗体之间产生 的同时发生的物理结合。
DNA 还可以这样进行修饰 ： 例如通过置换关于人重和轻链恒定结构域的编码序列 代替同源鼠类序列 ( 美国专利号 4,816,567 ； Morrison， 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851(1984))， 或通过使免疫球蛋白编码序列与关于非免疫球蛋白多肽的全部或部分编 码序列共价连接。
一般地， 此种非免疫球蛋白多肽置换抗体的恒定结构域， 或它们置换抗体的一个 抗原组合位点的可变结构域， 以产生包括对于抗原具有特异性的一个抗原组合位点和对于 不同抗原具有特异性的另一个抗原组合位点的嵌合二价抗体。
嵌合或杂交抗体也可以在体外使用合成蛋白质化学中的已知方法进行制备， 包括 涉及交联剂的那些。 例如， 免疫毒素可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键进行构建。 用于这个目的的合适试剂的例子包括亚氨基硫羟酸盐 (iminothiolate) 和甲基 -4- 巯基丁 亚氨酸酯 (methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
人源化抗体
用于使非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。一般地， 人源化抗体具有 引入其内的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为 “输 入” 残基， 这一般取自 “输入” 可变结构域。人源化可以基本上遵循 Winter 和同事的方法 (Jones 等人， Nature， 321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等人， Nature， 332 ： 323-327(1988) ； Verhoeyen 等人， Science， 239 ： 1534-1536(1988)) 来执行， 通过用非人 ( 例如， 啮齿类动 物 )CDRs 或 CDR 序列置换人抗体的相应序列。因此， 此种 “人源化” 抗体是嵌合抗体 ( 美国 专利号 4,816,567)， 其中基本上小于完整的人可变结构域已通过来自非人物种的相应序列 置换。在实践中， 人源化抗体一般是人抗体， 其中一些 CDR 残基和可能地一些构架 (FR) 残 基通过来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基置换。 描述人源化过程的另外参考文献包括 Sims 等人， J.Immunol.， 151 ： 2296(1993) ； Chothia 等人， J.Mol.Biol.， 196 ： 901(1987) ； Carter 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89 ： 4285(1992) ； Presta 等 人， J.Immunol.， 151 ： 2623(1993)， 其各自引入本文作为参考。
人抗体
可替代地， 现在可能产生转基因动物 ( 例如， 小鼠 )， 在免疫接种后， 在不存在内源 免疫球蛋白生产的情况下， 其能够产生人抗体的全部谱 (repertoire)。例如， 已描述抗体 重链连接区 (JH) 基因在嵌合和种系突变小鼠中的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。 人种系免疫球蛋白基因阵列在此种种系突变小鼠中的转移将导致在抗原攻击后人抗体的 产生。 参见例如， Jakobovits 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90 ： 2551(1993) ； Jakobovits 等人， Nature， 362 ： 255-258(1993) ； Bruggermann 等人， Year in Immuno.， 7： 33(1993)。人 抗体也可衍生自噬菌体展示文库 (Hoogenboom 等人， J.Mol.Biol.， 227 ： 381(1991) ； Marks 等人， J.Mol.Biol.， 222 ： 581-597(1991))。
双特异性抗体
双特异性抗体 (BsAbs) 是具有对于至少 2 个不同表位的结合特异性的抗体。此种 抗体可以衍生自全长抗体或抗体片段 ( 例如， F(ab′ )2 双特异性抗体 )。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。 全长双特异性抗体的传统产生基 于 2 个免疫球蛋白重链 - 轻链对的共表达， 其中 2 条链具有不同的特异性 (Millstein 等人， Nature， 305 ： 537-539(1983))。 因为免疫球蛋白重和轻链的随机组合， 这些杂交瘤 ( 四源杂 交瘤 (quadromas)) 产生 10 种不同抗体分子的潜在混合物， 其中仅 1 种抗体分子具有正确 的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤完成的正确分子的纯化是相当麻烦的， 并且产物 得率低。类似程序公开于 WO93/08829 和 Traunecker 等人， EMBO J.， 10 ： 3655-3659(1991) 中。
根据不同方法， 使具有所需结合特异性 ( 抗体 - 抗原组合位点 ) 的抗体可变结构 域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。
融合优选用免疫球蛋白重链恒定结构域， 包括铰链、 CH2 和 CH3 区的至少部分。优 选具有在融合物的至少一个中存在的、 包含对于轻链结合所必需的位点的第一个重链恒定 区 (CH1)。 将编码免疫球蛋白重链融合物以及需要时免疫球蛋白轻链的 DNAs 插入分开的表 达载体内， 并且共转染到合适的宿主生物内。当在构建中使用的 3 条多肽链的不等比提供 最佳得率时， 这提供了调整实施方案中 3 种多肽片段的相互比例的极大灵活性。然而， 当至 少 2 条多肽链以相等比的表达导致高得率时、 或当比无特别重要性时， 可能在 1 个表达载体 中插入关于 2 条或所有 3 条多肽链的编码序列。
在这种方法的优选实施方案中， 双特异性抗体由在一个臂中具有第一种结合特异 性的杂交免疫球蛋白重链、 和在另一个臂中的杂交免疫球蛋白重链 - 轻链对 ( 提供第二种 结合特异性 ) 组成。发现这种不对称结构促进所需双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白 链组合中分离， 因为免疫球蛋白轻链在仅一半双特异性分子中的存在提供了容易的分离方 法。这种方法公开于 1994 年 3 月 3 日公开的 WO 94/04690 中。关于产生双特异性抗体的 进一步细节， 参见例如， Suresh 等人， Methodsin Enzymology， 121 ： 210(1986)。
双特异性抗体包括交联或 “异缀合物 (heteroconjugate)” 抗体。例如， 异缀合物 中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联， 并且另一个与生物素偶联。已提出此种抗体例如使免疫系统细胞靶向不需要的细胞 ( 美国专利号 4,676,980)， 并且用于治疗 HIV 感染 (WO 91/00360、 WO 92/200373 和 EP 03089)。异缀合物抗体可以使用任何方便的交联法进行 制备。合适的交联剂是本领域众所周知的， 并且连同许多交联技术一起公开于美国专利号 4,676,980 中。
用于由抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中得到描述。下述技术也 可以用于产生不必定是双特异性的二价抗体片段。例如， 从大肠杆菌 (E.coli) 中回收的 Fab′片段可以在体外用化学方法偶联以形成二价抗体。参见， Shalaby 等人， J.Exp.Med.， 175 ： 217-225(1992)。
用于直接由重组细胞培养制备且分离二价抗体片段的各种技术也已得到描 述。例如， 二价异二聚体已使用亮氨酸拉链产生。Kostelny 等人， J.Immunol.， 148(5) ： 1547-1553(1992)。来自 Fos 和 Jun 蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合与 2 种不同抗体 的 Fab′部分连接。 抗体同二聚体在铰链区处还原以形成单体， 并且随后再氧化以形成抗体 异二聚体。由 Hollinger 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90 ： 6444-6448(1993) 描述的 “双 抗体” 技术已提供用于制备双特异性 / 二价抗体片段的可替代机制。片段包括通过接头与 轻链可变结构域 (VL) 连接的重链可变结构域 (VH)， 所述接头太短而不允许相同链上的 2 个 结构域之间的配对。因此， 一个片段的 VH 和 VL 结构域被迫与另一个片段的互补 VL 和 VH 结 构域配对， 从而形成 2 个抗原结合部位。 通过使用单链 Fv(sFv) 二聚体用于制备双特异性 / 二价抗体片段的另一种策略已得到报告。 参见 Gruber 等人， J.Immunol.， 152 ： 5368(1994)。
在一个实施方案中， 本发明的制剂包括对于 IL-1( 包括 IL-1α 和 IL-1β) 双特异 性的抗体。用于制备双特异性 IL-1 抗体的例子和方法可以在 2008 年 7 月 10 日公开的 WO 08/082651 中找到。
双重可变结构域 (DVD) 结合蛋白质
双重可变结构域 (DVD) 结合蛋白质是包括 2 个或更多个抗原结合部位的蛋白质， 并且是四价或多价结合蛋白质。 DVDs 可以是单特异性的， 即能够结合 1 种抗原， 或是多特异 性的， 即能够结合 2 种或更多种抗原。包括 2 条重链 DVD 多肽和 2 条轻链 DVD 多肽的 DVD 结合蛋白质被称为 DVD IgTM。DVD Ig 的每一半包括重链 DVD 多肽和轻链 DVD 多肽、 和2个 抗原结合部位。每个结合部位包括重链可变结构域和轻链可变结构域， 具有涉及抗原结合 的总共 6 个 CDRs/ 抗原结合部位。在特定实施方案中， DVD 可以包括 2007 年 3 月 29 日公 开的、 给予 Wu 等人的美国专利公开号 20070071675 中公开的任何一种 DVDs， 所述美国专利 公开引入本文作为参考。
DVD-Igs 作为治疗剂用于同时封闭 2 种不同靶， 以增强功效 / 安全和 / 或增加患者 覆盖度。此种靶可以包括可溶靶 (IL-13 和 TNF) 和细胞表面受体靶 (VEGFR 和 EGFR)。它还 可以用于诱导肿瘤细胞和 T 细胞 (Her2 和 CD3) 之间的重定向细胞毒生用于癌症治疗， 或自 身反应细胞和效应细胞之间的重定向细胞毒性用于自身免疫 / 移植， 或任何靶细胞和效应 细胞之间的重定向细胞毒性以消除任何给定疾病中引起疾病的细胞。
此外， 当 DVD-Ig 设计为靶向相同受体上的 2 种不同表位时， 它可以用于触发受体 成簇和激活。这可以在制备激动性和拮抗性抗 GPCR 治疗剂中具有利益。在这种情况下， DVD-Ig 可以用于靶向 1 种细胞上的 2 种不同表位用于成簇 / 发信号 (2 种细胞表面分子 ) 或发信号 ( 在 1 种分子上 )。类似地， DVD-Ig 分子可以设计为触发 CTLA-4 连接， 以及通过靶向 CTLA4 细胞外结构域的 2 种不同表位 ( 或相同表位的 2 个拷贝 ) 的负信号， 从而导致 免疫应答的下调。类似地， DVD-Ig 可以靶向细胞表面受体复合物 ( 例如， IL-12Rα 和 β) 的 2 种不同成员。此外， DVD-Ig 可以靶向 CR1 和可溶性蛋白质 / 病原体， 以驱动靶可溶性 蛋白质 / 病原体的快速清除。
此外， 本发明的 DVD-Igs 可以用于组织特异性递送 ( 靶向组织标记和疾病介质用 于增强的局部 PK， 因此更高的功效和 / 或更低的毒性 )， 包括细胞内递送 ( 靶向内在化受 体和细胞内分子 )， 递送至脑内 ( 靶向运铁蛋白受体和 CNS 疾病介质用于经过血脑屏障 )。 DVD-Ig 还可以充当载体蛋白质， 以经由与那种抗原的非中和表位结合将抗原递送至特定位 置， 以及增加抗原的半衰期。
本发明提供了包括任何合适蛋白质的稳定的粉末状组合物， 包括本文描述的那 些， 并且如本文所描述的进行制备。例如， 粉末可以包括蛋白质或肽 ( 例如， 抗体或其抗原 结合部分 ) 和赋形剂， 其中组合物包括小于约 6％的残留水分。在特定实施方案中， 组合物 包括小于约 5.5％、 5％、 4.4％、 4％、 3.5％或 3％的残留水分。在一些实施方案中， 组合物包 括小于 2％或 1％的残留水分。在其他实施方案中， 组合物包括限于上述值的残留水分范 围， 例如约 4％至 6％、 约 4.5％至 5.5％、 或约 3％至 5％的残留水分。在一些实施方案中， 所得到的粉末状组合物的残留水分含量为约 1 ％至约 3 ％、 约 1.5 ％至 2.5 ％、 约 1.4 ％至 约 2％、 约 4％至 6％、 或约 4.5％至约 5％。在其他实施方案中， 粉末状组合物包括约 1％、 1.5％、 2％、 2.5％、 3％、 3.5％、 4％、 4.5％、 5％、 5.5％、 6％、 6.5％或 7％的残留水分。
在一些实施方案中， 蛋白质将其生物活性保留所需时间段。 在一个实施方案中， 粉 末在环境温度和湿度下稳定至少 3 个月。在一些实施方案中， 粉末在环境温度和湿度下稳 定至少 6 个月、 9 个月、 1 年、 2 年、 3 年或 5 年。在其他实施方案中， 粉末在 40℃下稳定至少 3 个月。在另外的实施方案中， 粉末在 40℃下稳定至少 3 个月、 6 个月、 9 个月、 1 年、 2 年或 5 年。在另外其他的实施方案中， 粉末在 40℃和环境湿度下稳定 3 个月、 6 个月、 9 个月、 1 年、 2 年或 5 年。
本发明的粉末状组合物和 / 或包括粉末状组合物的药物组合物可以包括赋形剂。 合适的赋形剂包括但不限于海藻糖、 蔗糖、 山梨糖醇、 聚乙二醇、 至少一种氨基酸、 组氨酸、 丙氨酸、 精氨酸、 甘氨酸或其混合物。该方法可以进一步包括添加酸性组分、 抗氧化剂和 / 或张力调节剂。
在一些实施方案中， 组合物具有约 0.27 ∶ 1.0 至约 2.8 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至 约 1.4 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 0.7 ∶ 1.0、 或约 0.7 ∶ 1 的赋形剂与抗体或其抗原结合 部分的质量比， 并且赋形剂是海藻糖或蔗糖。 在其他实施方案中， 组合物具有约 0.27 ∶ 1.0 至约 2.8 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 1.4 ∶ 1.0、 约 0.27 ∶ 1.0 至约 0.7 ∶ 1.0、 约 0.7 ∶ 1 或约 0.35 ∶ 1 的赋形剂与抗体或其抗原结合部分的质量比， 并且赋形剂是山梨糖醇。
此外， 本发明提供了包括有效量的本文描述的粉末的药物制剂。药学上可接受的 载体可以是对于肠胃外、 经口、 经肠或局部施用可接受的任何载体。载体可以是固体、 半固 体或液体 ( 例如， 水或有机液体 ) 或其组合。
粉末可以在药学上可接受的载体中混合 ( 例如， 溶解或包埋 )。 药学上可接受的载 体可以是例如对于肠胃外施用可接受的， 并且可以包括例如水。该方法可以进一步包括向 药物组合物中加入一种或多种酸性组分、 抗氧化剂和 / 或张力调节剂。另外或可替代地， 合适的添加剂可以加入本发明的药物组合物中， 例如缓冲剂、 粘性调节剂、 调味剂、 着色剂等。
粉末状药物组合物可以熔体挤出、 压缩或以其他方式进行加工， 以形成例如片剂 或其他固体或半固体组合物。粉末可以用例如聚合物例如 PLGA 包被， 以形成持续释放和 / 或延迟释放的药物组合物。 另外或可替代地， 组合物可以用例如肠溶衣进行被囊化或包被。 包衣和 / 或赋形剂可以用于例如保护药物不受经由有机溶剂的沉淀、 变性或氧化， 所述有 机溶剂例如聚乙二醇 ( 例如 PEG 400)、 乙醇、 DMSO、 NMP、 冰乙酸等。
还预期了液体组合物例如水组合物。 此种组合物可以适合于例如经口或静脉内施 用， 并且可以包括任何合适的赋形剂或添加剂， 例如张力调节剂或缓冲剂。 在一些实施方案 中， 液体药物组合物具有低百分比的蛋白质聚集物， 尽管蛋白质水制剂的浓度高。在一个 实施方案中， 水组合物包括水和高浓度的蛋白质例如抗体， 甚至在不存在表面活性剂或其 他类型的赋形剂的情况下， 其也包含小于约 5％的蛋白质聚集物。在一个实施方案中， 组合 物包括不超过约 7.3％的聚集蛋白质 ； 组合物包括不超过约 5％的聚集蛋白质 ； 组合物包括 不超过约 4％的聚集蛋白质 ； 组合物包括不超过约 3％的聚集蛋白质 ； 组合物包括不超过约 2％的聚集蛋白质 ； 或组合物包括不超过约 1％的聚集蛋白质。在一个实施方案中， 组合物 包括至少约 92％、 至少约 93％、 至少约 94％、 至少约 95％、 至少约 96％、 至少约 97％、 至少 约 98％、 或至少约 99％的单体蛋白质。上述浓度中间的范围， 例如至少约 98.6％的单体蛋 白质、 不超过约 4.2％的聚集蛋白质， 也预期是本发明的部分。 此外， 预期包括使用任何上述 值的组合作为上和 / 或下限的值范围。
IV. 本发明的用途
本发明的组合物可以在治疗上即在体内使用， 或作为试剂用于体外或原位目的。 如本文描述且例示的， 喷雾干燥可以用于制备干燥蛋白质粉末用于用作用于开发 / 制造例 如下述的原材料 ： (a) 用于治疗溃疡性结肠炎的 ABT-874 的经肠制剂， (b) 用于糖尿病性溃 疡的阿达木单抗的局部制剂 ； 和 (c) 用于治疗哮喘的 ABT-308 的肺剂型。此外， 喷雾干燥的 抗体可以与 MELTREX 熔体挤出过程一起使用， 因为掺入玻璃状赋形剂基质 ( 例如， 海藻糖 ) 内的单克隆抗体 (mAb) 显示出针对热解折叠 / 变性的较高稳定性可以是可能的。这可能再 次提供用于开发新固体蛋白质剂型例如用于蛋白质的经口施用的机会。
治疗用途
本发明的方法也可以用于制备具有对于治疗用途有利的特征的药物组合物。 药物 组合物包括液体或固体组合物可以用作药物组合物或制剂以治疗受试者中的病症。
本发明的组合物可以用于治疗对于其治疗蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合部分适 合于治疗的任何病症。 “病症” 是将获益于用抗体的治疗的任何状况。这包括慢性和急性 病症或疾病， 包括使哺乳动物易感染所讨论的病症的那些病理状况。在抗 TNF α 抗体的情 况下， 可以施用治疗有效量的抗体， 以治疗自身免疫疾病例如类风湿性关节炎、 肠病症例如 Crohn 氏病、 脊椎关节病例如强直性脊柱炎、 或皮肤病症例如牛皮癣。在抗 IL-12 抗体的情 况下， 可以施用治疗有效量的抗体， 以治疗神经障碍例如多发性硬化症、 或皮肤病症例如牛 皮癣。其中本发明的组合物可以用于治疗的病症的其他例子包括癌症， 包括乳腺癌、 白血 病、 淋巴瘤和结肠癌。
术语 “受试者” 意欲包括活生物， 例如原核生物和真核生物。受试者的例子包括哺 乳动物， 例如人、 犬、 牛、 马、 猪、 绵羊、 山羊、 猫、 小鼠、 兔、 大鼠和转基因非人动物。在本发明的特定实施方案中， 受试者是人。
术语 “治疗” 指治疗性处理和防范或预防措施。需要治疗的那些包括已具有病症 的那些， 以及其中待预防病症的那些。
水或固体组合物可以依照已知施用方法施用于需要治疗的哺乳动物， 包括人。施 用方法的例子包括静脉内施用例如推注或通过在一段时间期间的连续输注、 肌内、 腹膜内、 脑脊髓内 (intracerobrospinal)、 皮下、 关节内、 滑膜内、 鞘内、 真皮内、 经皮、 经口、 局部或 吸入施用。
在一个实施方案中， 组合物通过皮下施用而施用于哺乳动物。对于此种目的， 组合物可以使用注射器以及其他设备进行注射， 所述其他设备包括注射设备 ( 例如， Inject-eas 和 Genject 设备 ) ； 注射器笔 ( 例如 GenPen) ； 无针设备 ( 例如， MediJector 和 BioJector) ； 和皮下贴片递送系统。
在本发明中还包括的是容纳组合物的递送设备。此种设备的例子包括但不限于， 注射器、 笔、 植入片和贴片。自动注射笔的例子在 2007 年 6 月 29 日提交的美国申请号 11/824,516 中得到描述。
蛋白质、 肽、 抗体或其抗原结合部分的合适剂量 (“治疗有效量” ) 将依赖于例如待 治疗的状况、 状况的严重程度和过程、 它施用是用于预防还是治疗目的、 先前治疗、 患者的 病历和对蛋白质的应答、 使用的蛋白质类型、 和主治医师的判断力。 本发明的组合物一次或 经过一系列治疗适当地施用于患者， 并且可以在从诊断起的任何时间施用于患者。组合物 可以作为单独治疗或与在治疗所讨论的状况中有用的其他药物或治疗结合施用。 在一个实施方案中， 在治疗上采用本发明的组合物例如包括阿非莫单抗和 / 或其 任何其他合适的抗体或其抗原结合部分的那些。在一个实施方案中， 组合物是用于在治疗 脓毒症中使用的药物组合物。
脓毒症、 肿瘤坏死因子 -α(TNF-α) 和阿非莫单抗
脓毒症定义为对感染的全身炎症应答。 感染可以是例如病毒、 细菌、 真菌或寄生物 的。脓毒症最终导致免疫活性细胞的激活和与多种细胞因子 (TNF-α、 IL-1 等 ) 释放相关 的全身性炎症应答。如由 ACCP(American College of Chest Physicians) 定义的， 存在脓 毒症的不同病期 / 种类 ： SIRS( 全身炎症应答综合征 )( 各种起源 ( 感染、 红斑等 ) 的全身 炎症应答 ) ； 脓毒症 ( 由感染引起的 SIRS) ； 严重脓毒症 ( 伴随器官机能障碍 / 机能失常的 脓毒症 ) ； 和脓毒性休克 ( 伴随休克的脓毒症 ))。为了诊断这些种类的脓毒症， 必须满足不 同标准。
初步发生的免疫应答是配合的并且通过多种次级介质扩大。 生物不处于使炎症限 制于其起源场所 ( 主要是肺或血循环 ) 的状态中。不同器官可以受累， 所述器官对几种机 体功能具有强烈影响。 因此， 可能的脓毒症病征包括过过热、 呼吸急促、 心动过速、 低血压和 意识错乱。 因为指示物的多样性， 所以脓毒症非常难以诊断， 这是脓毒症患者中的高死亡率 的促成因素。
治疗脓毒症患者的不同药疗法是已知的， 其中有替加色罗 (drotrecogin)α( 活 化 C 蛋白 ) 和抗凝血酶 III 以阻断血液凝固、 和可的松 ( 以低剂量 ) 以减弱炎症。Bloos 等
人， Aktuelle28 ： 186-190(2003)。因为 TNF-α 是脓毒症的主要介质之一， 所以处理脓毒症的一种方法是封闭 TNF-α 以避免其作用。TNF-α 的局部释放增加血流和血管通透性。 这允许参与宿主防御的流体、 细胞和蛋白质流入受感染的组织内。 为了防止感染蔓延至血液， 小血管随后凝固， 并且流体排出至其中适应性免疫应答起始的 淋巴结。在全身感染过程中， TNF-α 以相似方法工作， 从而导致休克和弥散性血管内凝血。 结果是凝固因子的耗尽， 持续出血和多器官衰竭。Janeway 等人， Immunobiology(Garland Publishing， 1994)。通过抗 TNF-α 抗体的肠胃外施用可以达到封闭 TNF-α。通过设计抗 体片段阿非莫单抗， 应当达到与较低的免疫原性问题组合的较佳组织穿透。
在一些实施方案中， 本发明包括给受试者 ( 例如， 人 ) 施用蛋白质、 肽、 抗体或其 抗原结合部分， 从而使得其一种或多种靶在受试者中的活性被抑制， 并且达到治疗。在一 些实施方案中， 病症选自关节炎， 骨关节炎， 青少年慢性关节炎， 脓毒性关节炎， 莱姆关节 炎， 牛皮癣性关节炎， 反应性关节炎， 脊椎关节病， 系统性红斑狼疮， Crohn 氏病， 溃疡性结 肠炎， 炎性肠病， 胰岛素依赖性糖尿病， 甲状腺炎， 哮喘， 变应性疾病， 牛皮癣， 皮炎硬皮病， 移植物抗宿主病， 器官移植排斥， 与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病， 结节病， 动脉 粥样硬化， 弥散性血管内凝血， Kawasaki 氏病， Grave 氏病， 肾病综合征， 慢性疲劳综合征， 韦格纳肉芽肿病， 过敏性紫癜 (Henoch-Schoenleinpurpurea)， 肾的微观脉管炎， 慢性活动 型肝炎， 葡萄膜炎， 脓毒性休克， 中毒性休克综合征， 脓毒病综合征， 恶病质， 传染病， 寄生物 病， 获得性免疫缺陷综合征， 急性横贯性脊髓炎， 亨廷顿舞蹈症， 帕金森氏病， 阿尔茨海默氏 病， 中风， 原发性胆汁性肝硬变， 溶血性贫血， 恶性肿瘤， 心力衰竭， 心肌梗死， Addison 氏病， 散发的， 多腺性缺乏 I 型和多腺性缺乏 II 型， Schmidt 氏综合征， 成人 ( 急性 ) 呼吸窘迫综 合征， 秃顶， 斑秃 (alopecia greata)， 血清反应阴性关节病 (arthopathy)， 关节病， Reiter 氏病， 牛皮癣性关节病， 溃疡性结肠炎关节病， 肠病滑膜炎， 衣原体、 耶尔森氏菌和沙门氏菌 相关的关节病， 脊椎关节病 (spondyloarthopathy)， 动脉粥样化疾病 / 动脉硬化， 特应性 变态反应， 自身免疫性大疱性疾病， 寻常天疱疮， 落叶状天疱疮， 类天疱疮， 线性 IgA 疾病， 自身免疫性溶血性贫血， Coombs 阳性溶血性贫血， 获得性恶性贫血， 青少年恶性贫血， 肌痛 性脑炎 /Royal Free 病， 慢性粘膜皮肤念珠菌病， 巨细胞性动脉炎， 原发性硬化性肝炎， 隐 原性自身免疫性肝炎， 获得性免疫缺陷病综合征， 获得性免疫缺陷相关疾病， 乙型肝炎， 丙 型肝炎， 常见变异型免疫缺陷病 ( 常见变异型低丙种球蛋白血症 )， 扩张型心肌病， 女性不 育， 卵巢衰竭， 过早卵巢衰竭， 纤维化肺疾病， 隐原性纤维化肺泡炎， 炎症后间质性肺病， 间 质性肺炎， 与间质性肺病相关的结缔组织病， 与肺病相关的混合型结缔组织病， 与间质性肺 病相关的系统性硬化病， 与间质性肺病相关的类风湿性关节炎， 与肺病相关的系统性红斑 狼疮， 与肺病相关的皮肌炎 / 多肌炎， Sjogren 氏病相关的肺病， 强直性脊柱炎相关的肺病， 脉管炎性弥漫性肺病， 含铁血黄素沉着病相关的肺病， 药物诱导的间质性肺病， 纤维症， 放 射性纤维化， 闭塞性细支气管炎， 慢性嗜酸性肺炎， 淋巴细胞浸润性肺病， 传染后间质性肺 病， 痛风性关节炎， 自身免疫性肝炎， 1 型自身免疫性肝炎 ( 常规自身免疫性或类狼疮样肝 炎 )， 2 型自身免疫性肝炎 ( 抗 LKM 抗体肝炎 )， 自身免疫介导的低血糖， 伴随黑棘皮症的 B 型胰岛素抵抗， 甲状旁腺机能减退， 与器官移植相关的急性免疫性疾病， 与器官移植相关的 慢性免疫性疾病， 骨关节病， 原发性硬化性胆管炎， 1 型牛皮癣， 2 型牛皮癣， 特发性白细胞 减少 (leucopaenia)， 自身免疫性嗜中性白细胞减少症 (neutropaenia)， 肾脏病 NOS， 肾小 球肾炎 (glomerulonephritides)， 肾的微观脉管炎 (vasulitis)， 莱姆病， 盘状红斑狼疮， 男性不育症特发性或 NOS， 精液自身免疫， 多发性硬化 ( 所有亚型 )， 交感性眼炎， 结缔组织病继发的肺动脉高压， Goodpasture 氏综合征， 结节性多动脉炎的肺表现， 急性风湿热， 类 风湿性脊椎炎， Still 氏病， 系统性硬化病， Sjorgren 氏综合征， Takayasu 氏病 / 动脉炎， 自身免疫性血小板减少症 (thrombocytopaenia)， 特发性血小板减少症， 自身免疫性甲状腺 病， 甲状腺功能亢进， 甲状腺肿性 (goitrous) 自身免疫性甲状腺功能减退 (Hashimoto 氏 病 )， 萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退， 原发性粘液性水肿， 晶状体原性 (phacogenic) 葡 萄膜炎， 原发性脉管炎， 白癜风性急性肝病， 慢性肝病， 酒精性肝硬化， 酒精诱导的肝损伤， choleosatatis， 特应性肝病， 药物诱导的肝炎， 非酒精性脂肪性肝炎 (steatohepatitis)， 变态反应和哮喘， B 组链球菌 (GBS) 感染， 精神障碍 ( 例如， 抑郁症和精神分裂症 )， Th2 型 和 Th1 型介导的疾病， 急性和慢性疼痛 ( 不同形式的疼痛 )， 以及癌症例如肺癌、 乳腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 结肠癌、 胰癌、 卵巢癌、 前列腺癌和直肠癌以及造血恶性肿瘤 ( 白血病和淋 巴瘤 )， 无 β 脂蛋白血症 (Abetalipoprotemia)， 肢端发绀， 急性和慢性寄生或传染过程， 急性白血病， 急性成淋巴细胞性白血病 (ALL)， 急性髓性白血病 (AML)， 急性或慢性细菌感 染， 急性胰腺炎， 急性肾衰竭， 腺癌， 心房 (aerial) 异位搏动， AIDS 痴呆复征， 酒精诱导的 肝炎， 变应性结膜炎， 变应性接触性皮炎， 变应性鼻炎， 同种异体移植物排斥， α-1 抗胰蛋 白酶缺乏症， 肌萎缩性侧索硬化， 贫血， 心绞痛， 前角细胞变性， 抗 cd3 治疗， 抗磷脂综合征， 抗受体超敏反应， 主动脉瘤和周围性动脉瘤 (aordic and peripheral aneuryism)， 主动脉 壁夹层形成， 动脉高血压， 动脉硬化， 动静脉瘘， 共济失调， 心房颤动 ( 持续性或阵发性 )， 心房扑动， 房室传导阻滞， B 细胞淋巴瘤， 骨移植物排斥， 骨髓移植 (BMT) 排斥， 束支传导阻 滞， Burkitt 氏淋巴瘤， 烧伤， 心律失常， 心脏震晕综合征， 心脏肿瘤， 心肌病， 心肺转流术炎 症应答， 软骨移植排斥， 小脑皮质变性， 小脑病症， 紊乱性或多源性房性心动过速， 化学疗法 相关病症， 慢性 (chromic) 髓细胞性白血病 (CML)， 慢性酒精中毒， 慢性炎性病理状态， 慢性 淋巴细胞性白血病 (CLL)， 慢性阻塞性肺部疾病 (COPD)， 慢性水杨酸盐中毒， 结肠直肠癌， 充血性心力衰竭， 结膜炎， 接触性皮炎， 肺原性心脏病， 冠状动脉疾病， Creutzfeldt-Jakob 病， 培养物阴性脓毒症， 囊性纤维化， 细胞因子治疗相关的病症， 拳击员痴呆 (Dementia pugilistica)， 脱髓鞘病， 登革出血热， 皮炎， 皮肤病学病状， 糖尿病， 糖尿病， 糖尿病性动脉 硬化性疾病， 弥漫性 Lewy 小体疾病， 扩张性充血性心肌病， 基底神经节病症， 中年人中的唐 氏综合征， 由阻断 CNS 多巴胺受体的药物诱导的药物诱导性运动障碍， 药物敏感性， 湿疹， 脑脊髓炎， 心内膜炎， 内分泌病， 会厌炎， EB 病毒感染， 红斑性肢痛病， 锥体束外和小脑病症， 家族性嗜血细胞性 (hematophagocytic) 淋巴组织细胞增多， 胎儿胸腺植入排斥， 弗里德赖 希 (Friedreich ′ s) 共济失调， 功能性外周动脉病症， 真菌性脓毒症， 气性坏疽， 胃溃疡， 肾小球肾炎， 任何器官或组织的移植物排斥， 革兰氏阴性脓毒症， 革兰氏阳性脓毒症， 由于 细胞内生物的肉芽肿， 毛细胞性白血病， HallerVorden-Spatz 病， 桥本甲状腺炎， 枯草热， 心脏移植排斥， 血色素沉着， 血液透析， 溶血性尿毒性综合征 / 血栓溶解性血小板减少性紫 癜， 出血， 肝炎 (A)， His 束心律失常， HIV 感染 /HIV 神经病， Hodgkin 氏病， 运动过度性运 动障碍， 超敏 (hypersensitity) 反应， 超敏感性肺炎， 高血压， 运动机能减退性运动障碍， 下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴评估， 特发性 Addision 氏病， 特发性肺纤维化， 抗体介导的细胞 毒性， 无力， 婴儿脊髓性肌萎缩， 主动脉炎症， A 型流感， 电离辐射照射， 虹膜睫状体炎 / 葡 萄膜炎 / 视神经炎， 缺血 - 再灌注损伤， 缺血性发作， 青少年类风湿性关节炎， 青少年脊髓 性肌萎缩， 卡波西肉瘤， 肾移植排斥， 军团杆菌， 利什曼病， 麻风病， 皮质脊髓系统损伤， 脂肪水肿， 肝移植排斥， 淋巴水肿 (lymphederma)， 疟疾， 恶性淋巴瘤， 恶性组织细胞增多症， 恶 性黑色素瘤， 脑膜炎， 脑膜炎球菌血症， 代谢 / 特发性， 偏头痛， 线粒体多系统病症， 混合型 结缔组织病， 单克隆丙种球蛋白病， 多发性骨髓瘤， 多系统变性 (MencelDejerine-Thomas Shi-Drager 和 Machado-Joseph)， 重症肌无力， 胞内鸟分枝杆菌， 结核分枝杆菌， 脊髓异常 增生 (myelodyplastic) 综合征， 心肌梗死， 心肌缺血性病症， 鼻咽癌， 新生儿慢性肺病， 肾 炎， 肾变病， 神经变性疾病， 神经原性 I 肌肉萎缩， 嗜中性白细胞减少性发热， 非何杰金淋巴 瘤， 腹主动脉及其分支阻塞， 阻塞性动脉病症， okt3 治疗， 睾丸炎 / 附睾炎 (epidydimitis)， 睾丸炎 / 输精管切除术逆转手术， 器官巨大症， 骨质疏松症， 胰移植排斥， 胰癌， 肿瘤相关 病症 / 恶性肿瘤的高钙血综合征， 甲状旁腺移植排斥， 盆腔炎症性疾病， 常年性鼻炎， 心包 疾病， 外周动脉粥样硬化性疾病， 外周血管病症， 腹膜炎， 恶性贫血， 卡氏肺囊虫性肺炎， 肺 炎， POEMS 综合征 ( 多神经病， 器官巨大症， 内分泌病， 单克隆丙种球蛋白病和皮肤改变综合 征 )， 灌注后综合征， 泵后综合征， MI 后心切开术综合征， 先兆子痫， 进行性核上麻痹， 原发 性肺动脉高压， 放射治疗， Raynaud 氏现象和疾病， Raynoud 氏病， Refsum 氏病， 正常狭窄 ORS 心动过速， 肾血管性高血压， 再灌注损伤， 限制型心肌病， 肉瘤， 硬皮病， 老年性舞蹈病， Lewy 小体型老年性痴呆， 血清反应阴性关节病， 中风， 镰状细胞性贫血， 皮肤同种异体移植物排 斥， 皮肤改变综合征， 小肠移植排斥， 实体瘤， 特殊心律失常， 脊髓性共济失调， 脊髓小脑变 性， 链球菌肌炎， 小脑结构损伤， 亚急性硬化性全脑炎， 晕厥， 心血管系统梅毒， 全身性过敏 反应 (anaphalaxis)， 全身性炎症应答综合征， 全身型青少年类风湿性关节炎， T 细胞或 FAB ALL， 毛细血管扩张， 血栓闭塞性脉管炎， 血小板减少症， 中毒， 移植， 外伤 / 出血， III 型超敏 反应， IV 型超敏反应， 不稳定型心绞痛， 尿毒症， 尿脓毒症， 荨麻疹， 心脏瓣膜病， 静脉曲张， 脉管炎， 静脉疾病， 静脉血栓形成， 心室颤动， 病毒和真菌感染， 病毒性 (vital) 脑炎 / 无菌 性脑膜炎， 病毒 (vital) 相关的嗜血细胞性 (hemaphagocytic) 综合征， Wemicke-Korsakoff 综合征， Wilson 氏病， 和任何器官或组织的异种移植物排斥。
非治疗用途
本发明的组合物还可以用于非治疗用途， 即在体外的用途。 例如， 本文描述的蛋白 质粉末和相关组合物可以用于医学和生物技术中的诊断或实验方法， 包括但不限于， 在基 因组学、 蛋白质组学、 生物信息学、 细胞培养、 植物生物学和细胞生物学中的用途。例如， 本 文描述的组合物可以用于提供在标记和检测法中作为分子探针所需的蛋白质。 关于本文描 述的组合物的另外用途是提供用于细胞培养试剂的补充剂， 包括用于制造目的的细胞生长 和蛋白质生产。
包含高浓度例如抗体的组合物可以用作试剂用于实验室用途。 此种高浓缩形式的 抗体将扩大实验室实验的目前限制。
本发明的制剂的另一种可替代用途是提供关于食物产品的添加剂。 在一些实施方 案中， 因为本发明的组合物基本上由蛋白质和糖组成， 所以它们可以用于给食物产品递送 高浓度的所需蛋白质， 例如营养补充剂。本发明的组合物因此可以提供高浓度的蛋白质。
制造物品
在本发明的另一个实施方案中， 提供了包含本发明的蛋白质粉末或相关组合物的 制造物品， 并且提供了关于其使用的说明书。在一个实施方案中， 制造物品包括容器。合适 的容器包括例如一种或多种瓶、 小瓶 ( 例如， 双室小瓶 )、 注射器 ( 包括单和双室注射器 )、包含注射器的自动注射器笔、 和试管。容器可以由多种材料例如玻璃、 塑料或聚碳酸酯形 成。容器保持水制剂， 并且在容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。例如， 标签可 以指示组合物用于或预期用于皮下施用。 标签可以例如指导用户加入液体例如无菌水或盐 水， 以制备组合物用于例如通过注射施用。保持组合物的容器可以是多用途小瓶， 其允许 例如水制剂的重复施用 ( 例如， 2-6 次施用 )。制造物品可以进一步包括第二个容器。制造 物品可以进一步包括从商业和用户观点来看需要的其他材料， 包括其他缓冲剂、 稀释剂、 滤 器、 针、 注射器和具有使用说明书的包装插页。
本发明通过下述实施例进一步举例说明， 所述实施例不应解释为限制性的。
发明例证
在这个实施例中， 使 IgG 分子的 Fab 片段喷雾干燥且进行分析。这项研究的范围 是发现以高得率和良好的贮藏稳定性用于使 Fab 片段喷雾干燥的合适制剂和加工条件， 因 为它预期用作贮藏中间物。 通过加入不同的糖来达到蛋白质在喷雾干燥过程和后续贮藏期 间的稳定作用。对于这项研究， 将海藻糖、 蔗糖和山梨糖醇加入液体蛋白质浓缩物中。蛋白 质稳定性使用来自各种分析法的数据进行分析， 在所述分析法中有尺寸排阻层析、 动态光 散射、 浊度测量和等电点聚焦。
材料
MAK 195F 浓缩物
在这个实施例中使用的蛋白质是由 Abbott Laboratories 作为水溶液提供的阿 非莫单抗 (MAK 195F)， 其包含 ： MAK 195F(12.4mg/mL) ； NaCl(8.77mg/mL) ； Na3PO4(1.64mg/ mL) ； F68(0.1mg/mL) ； 和水 (q.s.)。MAK 195F 浓缩物具有 7.2 的 pH， 并且接 近于等渗 ( ～ 286mosmol/kg)。它具有 0.981mPas 的粘度 ( 用 Schott Ubbelohde 粘度计测 量 ) 和 1.0086g/cm3 的密度 ( 用来自 Chempro 的 DMA 46 测量 )。
阿非莫单抗蛋白质是鼠类抗 TNF-α 抗体 (IgG3) 的 F(ab′ )2 片段， 具有约 100 千 道尔顿 (kDa) 的分子量。它通过 IgG3 单克隆抗体的胃蛋白酶切割产生， 从而导致各自包括 214 个氨基酸的轻链、 和包含 233-241 个氨基酸的重链。约 30％的 Fd′片段在 SerH222 处进 行糖基化。因为不同的糖基化模式， 阿非莫单抗具有在 7.5 至 8.8 的等电 (isolectric) 点 (IEP) 范围内的最高达 7 种同工型。
浓缩物在干冰下在约 400g 的部分中获得。为了避免反复的冻融循环和在液体状 态下的长期贮藏， 使浓缩物解冻且以 40-50mL 部分等分试样， 贮藏于 -80℃并且在使用前新 鲜解冻。
赋形剂
3 种不同的糖用于使蛋白质稳定 ： D- 山 梨 糖 醇 (Sigma， 产品 ： S-7547， 批号 ： 108H01461) ； 蔗糖 (Sigma， 产品 S-7903， 批号 014K0010) ； 和 D-(+) 海藻糖二水合物 (Sigma， 产品 ： T5251， 批号 ： 113K3775)。
所有水溶液用重蒸馏的水 (Fi-stream 4BD ； Fisons) 进行制备， 并且若需要则通 过 0.2μm 膜滤器 (Schleicher&Schuell) 进行过滤。
方法
喷雾干燥
喷 雾 干 燥 实 验 在 Büchi Mini-Spray Dryer B-191( 图 1) 上 执 行， 其使用高性 能 旋 风 分 离 器 1 用 于 粉 末 回 收。 在 进 入 加 热 设 备 3 和 干 燥 室 之 前， 干燥空气通过 Luwa Ultrafilter 2( 玻 璃 纤 维 ； filterclass ： HEPA H 13High Efficiency Particle Absorber) 在 800l/ 分钟的气流速度下 (90 ％吸气器力 ) 进行过滤。在通过蠕动泵 5(QLF ＝～ 3mL/ 分钟 ； 硅管 ) 被转运至干燥室 4 之前， 所有液体进料通过 0.22μm 过 滤器单元进行过滤。雾化通过双流体喷嘴 6( 孔直径 ： 0.7mm) 执行， 使用来自内部供应的压 缩空气 (QAA ＝ 700l/ 小时 )。双流体喷嘴配备也使用压缩空气 (4.5 巴 ) 的自动清洗系统 和水冷却系统。在喷雾干燥后， 所得到的粉末从收集容器 7 中回收到干燥空气手套箱 (RH ＜ 2％ ) 中， 填充到玻璃小瓶 ( 氯丁基橡胶塞子 ) 中， 用石蜡膜密封并且贮藏于 -80℃下。 粉 末得率定义为在收集容器内的粉末量除以液体进料中的总固体。 不收集旋风分离器内部上 的粉末沉积。
尺寸排阻层析 (SEC)
尺寸排阻层析用于检测可溶性聚集物。使通过 AmershamBiosciences 购买的 Tricorn Superose 12/300GL 柱 ( 分离范围 1-300kDa) 与 Perkin Elmer High Pressure Liquid Chromatography(HPLC) 系统连接， 包括一系列 200LC 泵、 ISS 200 自动进样器和 235C 二极管阵列检测器。在 Superose 柱之前， 安装 phenomenex 保卫 (security guard) 前 置柱 ( 装载有 AJ0-4489 药液筒 ) 以避免被粗颗粒污染。流动相 ( 缓冲液 A， 流速 ： 0.5mL/ 分钟 ) 是伴随氯化钠 (0.5mol/l) 添加的磷酸钾缓冲液 (pH 6.9)， 通过 0.2μm 膜滤器 (Schleicher&Schuell， FP 30/0.2CA) 过滤， 并且使用氦除气约 10 分钟。所有样品直接测 量 ( 例如， 液体进料 )， 或用缓冲液 A 小心地再溶解至 1mg/mL 的蛋白质浓度 ( 喷雾干燥的 (sd) 粉末 )， 并且在制备后不久进行分析。 注射体积 / 运行是 100μl， 并且一般所有样品测 量 2 次 ( 液体进料 ) 或 3 次 (sd 粉末 ) 以确保再现性结果。所有层析谱使用 Perkin Elmer TotalChrom Navigator 软件， 版本 6.2 进行人工积分。
差示扫描量热法 (DSC) 使用 Mettler Toledo DSC 822e 研究热事件。在干燥空气条件下 ( 手套箱 ) 将 ) 到铝盘内。铝盘进行冷密封且插入热量计5-15mg 粉末称出 (Mettler， AT内， 在其中使它们暴露于依次加热和冷却通过预期 Tg( 加热 / 冷却速率 ： 10℃ / 分钟 ) 的限 定温度程序 ( 依赖于制剂 )。玻璃化转变温度通过 Mettler STARe Software V 6.10 进行 估计， 初步定义为在加热步骤过程中吸热转变的中点。 仅考虑第二个和第三个加热循环， 以 避免其他不可逆吸热事件的干扰。实验自始至终测量池是干燥的并且用 N2 气体清洗。
大角度 X 射线衍射 (WAXD)
在 40kV/40mA 和 25℃下使用具有 Cu Ka 放射 (λ ＝ 0.15418mm) 的 Philips 型号 X`pert MPD， 通过 x 射线粉末衍射研究粉末的结晶度。 将 60-80mg 的粉末量填充到铝样品架 内并且立即扫描。所有扫描在范围 2θ ＝ 0.5° -40°中进行测量， 使用 0.02° /s 的步长。 通过使用基于 Black 和 Lovering 那种的方法， 由衍射图 ( 参见下文 ) 的结晶和无定形区域 计算样品结晶度 ( 结晶性程度 )。 Black， Lovering Journal of Pharmacy andPharmacology 29 ： 684-687(1977)。
C ＝ Ic/(Ic+Ia) ＝ AUC 结晶 /AUC 总数＝ (AUC 总数 -AUC 无定形 )/AUC 总数
C 是结晶性程度 ( 有时也描述为百分比结晶度， 当乘以 100 时 )， Ic 和 Ia 代表由结晶 或无定形区域散射的 X 射线的强度， 这分别等于峰和宽晕圈 (halos) 的曲线下面积 (AUC)。AUC 无定形通过从图中切下结晶峰且使用曲线拟合进行计算。
动态光散射
动态光散射 (DLS) 测量用 Zetasizer Nano ZS(Malvern， 德国， 软件 ： DTS 版本 ： 4.2) 执行， 以检测可溶性以及不溶性聚集物。Zetasizer 使用 633nm 的激光， 并且检测在 173° 处的散射 ( 反向散射检测 )。它对于尺寸测量具有 0.6-6000nm 的测量范围。颗粒 大小通过测量样品中颗粒的布朗运动进行测定。Malvern Instruments ： Zetasizer Nano Series UserManual.MAN 0317， Issue 2.0， March 2004。液体制剂无需任何添加剂进行测 试， 并且粉末用重蒸馏的水 ( 通过 0.2μm 过滤 ) 稀释至原始蛋白质浓度。通过使用低容量 比色杯 ( 一次性低容量比色杯， Malvern)， 仅需要 0.5mL 溶液 / 测量。用 2mL 比色杯的测试 提供相同结果 ( 数据未显示 )。在 2 分钟平衡时间 (25℃ ) 后， 用各 5 次运行执行每种样品 的 3 次测量 ( 运行持续时间 ： 30 秒， 运行之间的延迟 ： 2 秒 )。这个程序对于每种粉末 / 溶 液样品执行 3 次。所得到的图作为得分表输出， 并且经由 MS Excel 转变成图， 从而导致显 示大小 - 体积和大小 - 强度分布的 3 条标绘曲线 / 样品。
扫描电镜术 (SEM)
颗 粒 大 小 和 形 态 经 由 电 镜 术 照 片 进 行 检 查， 使 用 在 20kV 下 的 Amray 1810T Scanning Electron Microscope。 使用自粘薄膜将小粉末样品固定在 A1 样品短柱 (stubs) (G301， Plano) 上。在 20mA/kV 下 (HummerJR Technics) 用金 (Au) 溅射 1.5 分钟后， 将样 品置于显微镜下， 并且获得不同放大率 ( 通常为 1000x、 2000x 和 3000x) 的照片。一般地， 评估在 3000x 的放大率下获得的照片。 卡尔·费歇尔 (Karl Fischer) 滴定
用 Mitsubishi Moisture Meter(CA-06Coulometric) 和 Mitsubishi 水 汽 化 器 (VA-06) 测量喷雾干燥的 (sd) 粉末的水分含量。在干燥空气条件下 ( 手套箱 ) 将约 70mg 粉末样品填充到专门的样品架内。空样品架用 Mettler AT DeltaRange 分析天平进行称 重。通过使样品架与汽化器单元连接， 将粉末填充到被拉到加热的烤箱单元内的玻璃蒸发 皿 (boat) 内。当水被蒸发 (150℃ ) 并且经由氮气流 ( ～ 200mL/ 分钟 ) 定量转移到滴定池 内时， 样品架再次称重以计算实际样品重量。滴定以≤ 0.01μgH2O/ 分钟的滴定速率开始。
在显微镜下才能看到的 (Sub-Visible) 颗粒
用计算机辅助的颗粒计数设备 Syringe(Klotz， 德国， 软件 ： SW-CA 版本 1.2) 观察 到例如再溶解的 sd 粉末的颗粒污染。液体通过流通池吸取， 所述流通池在激光器前面减少 至 250μm 的直径。当颗粒由激光束击中时， 它们检测的强度减少。激光的减弱是颗粒大小 的指示器。用重蒸馏的水 ( 通过 0.2μm 过滤 ) 将所有粉末重构为其原始浓度， 并且通过系 统泵送 0.8mL 溶液 ( 对于冲洗系统 1 次， 对于颗粒计算 3 次 )。结果对于 1mL 溶液进行计 算。对于药学应用， 根据美国药典 (USP) 或欧洲药典 (Ph.Eur.) 的条例， 软件将颗粒分为 8 个不同大小范围 (1-50μm) 的等级。
等电点聚焦 (IEF)
阿非莫单抗的 IEF 分离基于 Fd′片段和轻链变体的电荷差异。它主要充当关于 阿非莫单抗的特性测试， 但它还可以用作用于稳定性测试的仪器。聚焦用与 Serva Blue Power 3000 电源附着的 Pharmacia MultiphorII 室执行。具有 6-9 的 pH 梯度的现成可用
(ready-to-use) 凝胶 (ServalytPr ecotes 6-9， 125x125mm， 厚度 0.3mm ； Serva， 德国 ) 置于冷却板 (4℃， 用一些 Bayol F 作为传热介质包被 ) 上。所有样品稀释至约 4mg/mL 的蛋 白质浓度， 将 10μL 置于凝胶上。聚集程序在 200V 下开始并且花费约 195 分钟 ( 终点电压 2000V)。在固定 20 分钟后， 凝胶用考马斯亮蓝进行染色 (20 分钟 )， 并且随后脱色几次。所 使用的溶液在下表 1 中列出。
表1
用水漂洗且在室温下干燥过夜后， 使用具有 软件 ( 版本 3.20) 的 Desaga CAB UVIS VD 40 工作站检查且扫描凝胶。
浊度
浊度是引起光被散射且吸收而不是以直线透射穿过样品的光学特性的表达。 它可 以由任何悬浮颗粒包括固体、 胶体和气泡引起。 因为浊度不是定义明确的参数， 所以它通过 使样品与乳光标准例如肼凝胶相比较进行测量。Hach Ratio XR 浊度计用于估计样品的比 浊法浊度单位 (NTU)。浊度计用 Hydrazin 标准进行校准。在测量 Nessler 管的空白值后， 样品用重蒸馏的水 ( 通过 0.2μm 过滤 ) 稀释或重构为原始蛋白质浓度， 并且随后置于光束 中。为了排除玻璃不均匀性的影响， 重要的是在空白测量过程中标记管的方向并且使用相 同方向的管用于样品测量。
着色
为 了 检 测 再 溶 解 的 sd 粉 末 的 着 色 中 的 变 化， 使 用 LICO 400(HachLange， 瑞 士 )， 这是用于透明液体的颜色测量的比色计。它测定与样品最接近的参考溶液并且定 量样品和参考之间的颜色变异。在这项研究中， 使用将颜色定义为亮度 (L， 黑色 - 白 色 ) 和颜色 (±a， 红色 - 绿色 ； ±b， 黄色 - 蓝色 ) 的坐标的 CIE-Lab 色空间 (CIE 是关于 CommissionInternationale d`Eclairage 的缩写 )。 使用来自 Ph.Eur. 的标准溶液 (BG5-7， 带褐色 - 黄色， 稀释的 ； B 5-9， 褐色 ) 校准 LICO 400。将所有粉末样品重构为原始浓度， 将 200μl 填充到小容量石英玻璃比色杯内。UV- 光谱学
为了测定浓缩物或超滤的等分试样的蛋白质浓度， 使用 PerkinElmer Lambda
25UV/VIS 分光计 (Spectrometer)。将样品稀释至约 0.6mg/mL 的蛋白质浓度。使 3 个石英 玻璃比色杯充满样品溶液， 并且其中每一个在波长 (λ) ＝ 280nm 和 λ ＝ 320nm 下测量 3 次。吸光度值 ( 由 UVWinLab 5.0 软件， Perkin Elmer 给出 ) 用于计算蛋白质浓度， 使用下 述等式 ：
c ＝ [(A280-A320) 平均值 /1.37]*F(mg/mL)
1.37 ＝ ε280nm-ε320nm
F ＝ VH2O/Vprot+1
在这些等式中， F 是稀释因子， A 代表所测量的吸光度， ε 是摩尔消光系数 (1mg/ mL 溶液的吸光度， 使用 1cm 比色杯 )， 并且 V 代表第一个稀释步骤中的体积。
交叉流过滤
为了达到更高浓缩的阿非莫单抗溶液， 使用 MilliporeTFF 系统使浓缩物进行超滤。原始阿非莫单抗浓缩物沿具有 30kDa 的分子量截止 (MWCO) 的过滤器设备 进行持续泵送。使除蛋白质外的所有成分经过膜并且收集在外部容器中。蛋白质自身被送 回循环流。目前浓度可以通过体积标度粗略地估计。确切蛋白质浓度通过使用 UV- 光谱学 在终止过滤过程后进行计算。
结果
MAK 浓缩物的表征
新鲜解冻的浓缩物通常显示约 0.9-1％的聚集 ( 等分试样之间的差异是可能的， 因此每个等分试样紧在解冻后经由 SEC 进行检查 ) 且无可检测的断裂。根据用分子量标记 试剂盒 ( 碳酸酐酶， 分子量 (Mr) ＝ 29kDa 和 β- 淀粉酶， Mr ＝ 200kDa) 的实验， 聚集物主要 是二聚体。DLS 图显示单体具有约 10nm 的流体动力学直径。浓缩物显示出相对低的在显微 镜下才能看到的颗粒污染和约 5NTU 的浊度值。可见 5 种同工型的一般 IEF 带型。在所有 进一步的 IEF 实验中， 纯浓缩物用作标记 / 标准， 因此直接检测出任何差异。
在着色测量中， 浓缩物最接近于标准溶液 B9， 这是具有轻微一点褐色的几乎无色 3 溶液。浓缩物具有 1.009g/cm 的密度和 0.981mPas 的粘度 ( 两者都在 20℃下进行测量 )。
MAK 浓缩物的喷雾干燥
第一次喷雾干燥实验用不含任何另外稳定剂的纯浓缩物来进行。 测定在干燥过程 期间的蛋白质损害程度。
MAK 的过程稳定性 为了测定蛋白质在喷雾干燥过程期间如何受损害， 采用来自在 Büchi 191 上的 现有研究的过程参数用于第一次实验， 例如 Maury ： Tin ＝ 130℃， QLF ＝～ 3mL/ 分钟， QAA ＝ 700l/h， QDA ＝ 800l/ 分钟， 导致约 80 ℃的 Tout。Maury 等人， Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(3) ： 565-573(2005)。
所得到的白色粉末 ( 旋风分离器得率 ： ～ 60％ ) 包括具有最高达 13μm 直径的球 形、 环形或凹陷形颗粒。再溶解的粉末 (22.9mg 粉末 /mL 水 ) 具有 12-13mg/mL 的蛋白质浓 度， 暗示粉末的丧失通过喷雾干燥过程和旋风分离器的分离性能引起。由于其在喷雾干燥 后的无定形状态， 无法检测出蛋白质或赋形剂从蛋白质溶液中的优先丧失。sd MAK 浓缩物 的 X 射线衍射图显示由大量药物物质的其他组分 ( 例如磷酸钠和氯化钠 ) 引起的结晶峰。 峰模式非常接近于 sd 氯化钠的那种。粉末的残留水分含量是 1.4-2％， 依赖于在过程期间
的环境条件 ( 干燥空气的 RH， 室温等 )。
在 SEC 中， 再溶解的粉末显示聚集中的独特增加 (2.5-3％ )。然而， 这对于不含稳 定剂的蛋白质溶液不是很多。 Maury 发现对于喷雾干燥、 透析的 IgG 溶液最高达 17％。 Maury 等人， Eur.Journal of Pharm.andBiopharm.59(2) ： 251-261(2005)。这指出片段在喷雾干 燥过程中比全长抗体更不敏感， 尽管对于冻融诱导的聚集并非如此。Wang 等人， Journal of Pharm.Sci.96(1) ： 1-26(2007)。 另一种可能性是存在由氯化钠的存在引起的稳定作用。 Arakawa 等人经历了在溶液中在蛋白质和氯化钠之间的稳定相互作用 ； 然而， 他们仅研究 了比本文使用的那些更高的盐浓度。Arakawa 等人， Biochemistry 21 ： 6545-6551(1982)。 聚集中的增加在 DLS 和 IEF 结果中也可见。
在等电点聚焦过程中， 新条带出现在聚焦的初始点处。它可以归因于无法穿透到 凝胶内且因此无法根据其等电点移动的大聚集物 ( 根据 Serva GmbH， 其 IEF 凝胶的孔具有 约 200-300kDa 的截止 )。DLS 结果显示在 μm 大小处的另外峰。峰在大小 - 体积分布中难 以看出， 但在大小 - 强度分布中很清晰。少数大颗粒散射比许多小颗粒多得多的光， 因为颗 粒散射强度与其直径的六次方成比例。 Malvern Instruments ： ZetasizerNano Series User Manual.MAN 0317， Issue 2.0， 2004 年 3 月。另外的峰明显由蛋白质引起， 因为用安慰剂浓 缩物的 DLS 实验不显示那个流体动力学直径的峰。因为这些大聚集物在 SEC 中不可见， 所 以它们肯定是不溶性的。再溶解的粉末的颗粒污染在所有颗粒级分自始至终是增加的。然 而， 在实验室喷雾干燥器上的过程无法完全排除颗粒污染 ( 尽管入口干燥空气是过滤的 )。 此外， 打开小瓶用于获得样品也可以成为颗粒来源。此外， 与浓缩物相比较， 再溶解的粉末 的浊度显著增加 ( 浓缩物 ： 5NTU ； 浓缩物 sd ： 118NTU)。
发现合适的 Tin
为了找出 130℃的 Tin 是否适合于使阿非莫单抗蛋白质的喷雾干燥， 进行用不同温 度的实验系列。用于这个系列的 Tin 和在 QLF ＝～ 3mL/ 分钟下所得到的 Tout 在表 2 中列出。 意图发现干燥效率和蛋白质过程稳定性之间的满意折衷。
表2
Tin(℃ )
大致 Tout(℃ )100 130 155 180
61 80 95 108在颗粒形态中未观察到差异， 除 180℃颗粒比 100℃的略微多些皱纹外， 但差异非 常轻微。随着逐渐增加的 Tin 含水量趋于减少， 具有在 100℃和 130℃之间的相当大向下步 幅。在可检测的聚集中无相当大差异， 因此聚集看起来不是非常温度依赖性的。粉末得率 显示在更高温度下的小改善。所有这些结果推荐高 Tin 的使用， 但等电点聚焦 (IEF) 和动态光散射 (DLS) 结果指出关于阿非莫单抗的合适 Tin 在中间范围。在 IEF 中聚集条带的强度 线性地依赖于干燥空气入口温度。同样， DLS 图显示在 180℃下的次等结果。单体峰在更高 的流体动力学直径下 ( 约 16nm) 显示出来。聚集物看起来不仅变得更多， 如在 IEF 中假定 的， 而且变得更大。此外， 单体峰在形状 ( 朝向更小的分布 ) 和大小中变化， 指出对于蛋白 质的相当大损害。颗粒污染在 180℃下也更高， 尤其是在小颗粒级分中 ( ＜ 15μm)。根据 这些结果， 仅 130℃和 155℃可以视为对于进一步研究可接受的。因为关于这 2 个入口温度 的结果是相似的， 所以选择 130℃的 Tin。在这个温度下的操作应使对于蛋白质的热应激降 到最低， 同时提供关于产物品质的总体可接受结果。
聚集来源
喷雾干燥过程包括关于蛋白质的许多失活来源。 一些可以通过用赋形剂修饰制剂 得到减少， 而其他的失活来源不受影响。在过程期间聚集中的增加无法明确归因于单一应 激因素。通过此处选择约 130℃的恰当 Tin， 可以将热应激控制至一定程度。为了找出不可 避免的应激的程度， 执行下述实验。
蠕动泵的影响
为了定量蠕动泵的剪切应力对聚集的影响， 使用 SEC。10mL 阿非莫单抗浓缩物用 作液体进料。样品通过 Büchi B-191 的管道系统和蠕动泵进行泵送， 并且紧在进入双流体 喷嘴前进行收集。液体进料在泵送过程前和后进行测试。未注意到聚集中的改变。可以假 定实验室喷雾干燥器的蠕动泵不影响或增加阿非莫单抗蛋白质的聚集。通过 Brennan 等人 (Diabetes34， 353-359(1985)) 观察到的， 泵诱导的胰岛素聚集仅在长期泵送后胰岛素从溶 液中出来时发生。因为在这项研究中经过管道系统最多花费仅数分钟， 所以损害的危险非 常小。
雾化过程的影响
通过使浓缩物的 2 个样品 (2mL) 雾化且然后经由 SEC 和 IEF 测试， 测试在雾化过 程中的剪切应力程度。在 IEF 中， 在样品之间无法观察到差异 ( 无另外的条带或带型中 的改变 )。SEC 结果显示聚集中的轻微增加。这种增加不象它在整个喷雾干燥过程期间 那么高。因此可以得出结论， 小部分聚集由雾化引起， 但如 Maa 等人假定的， 蛋白质损害 可能不仅是剪切力的结果， 而是大空气 / 液体界面的结果。Maa 等人， Biotechnology and Bioengineering 54(6) ： 503-512(1997)。
热应激的影响
蛋白质是热敏感材料， 但并非每种蛋白质对热应激同样敏感。为了测定阿非莫单 抗浓缩物针对温度 ( 热应激 ) 可以忍受多少， 使小量蛋白质溶液暴露于不同温度经过不同 时间段。关于浓缩物稳定性的标准是溶液的 SEC 数据、 IEF 结果和光学表现。在凝结出现 后， 终止试验。结果显示于下表 3 中。
表3
1 小时 40℃ 澄清4 小时 澄清24 小时 澄清37CN 101969929 A说45℃ 50℃ 55℃ 60℃ 65℃ 80℃ 澄清 澄清明书澄清 轻微混浊 混浊 凝结 轻微混浊 混浊 凝结34/50 页轻微混浊 混浊 凝结 凝结浓缩物无法经受住高于约 60℃的温度。在 IEF 凝胶中， 浊度的出现伴随另外条带 在初始点处的出现。原始带型的脱色指示可溶性蛋白质的丧失。可溶性蛋白质的丧失也 在 SEC- 文件 (files) 中检测出。单体峰随着逐渐增加的温度和时间收缩 ( 纵坐标定标 )。 40℃不影响阿非莫单抗浓缩物， 即使在应用经过 24 小时时。蛋白质的热应激损害不通过聚 集的增加表示， 而是通过片段的出现表示。聚集峰保持很大程度未改变的。因此， 应用于浓 缩物的热应激导致断裂和凝结， 而在 sd 过程中应用于雾化浓缩物的热应激主要导致聚集。 阿非莫单抗浓缩物可以短时间段经受住最高达约 50℃的温度。在约 60℃下蛋白质损害快 速发生。在喷雾干燥过程期间， 使小滴暴露于湿球温度 (Twb)， 这通常比 Tout( 在这项研究中
通常为 80 ℃ ) 低 25-30 ℃， 并且暴露时间非常短。Mumenthaler 等人， Pharm.Res.11(1) ： 12-20(1994)。
概括
不认为聚集由泵送程序过程中的剪切力引起。雾化负责在喷雾干燥过程期间的 部分聚集增加。热应激对蛋白质稳定性起主要作用， 但当应用于浓缩物时， 它导致断裂 由 和不溶性聚集物。随着小滴在 sd 过程中达到约 55 ℃的临界温度 ( 比 Tout 低 25-30 ℃， Mumenthaler 等人假定， 但仅对于非常短时间段 )， 聚集增加看起来由温度和雾化的相互作 用引起。Mumenthaler 1994。
用赋形剂的喷雾干燥实验
为了最优化阿非莫单抗蛋白质的稳定作用， 测试不同赋形剂。目的是在干燥过程 和后续贮藏期间的足够稳定性。 10-150mM 山梨糖醇的添加
在本实施例中， 将 10、 25、 50、 100 或 150mM 山梨糖醇加入阿非莫单抗浓缩物中， 以 测定稳定剂与蛋白质的最佳摩尔比， 如表 4 中所示。结果显示于图 2 和 3 中。对于 150mM 山梨糖醇溶液， Tg 下降远远超过过程以及甚至室温， 并且不可能使这种混合物正确地喷雾 干燥， 如在非常低得率中所示。 混合物无法在其经过干燥室的过程中得到干燥， 并且当进入 旋风分离器时它仍是粘性的， 因此大部分与旋风分离器壁粘附并且无法收集。Maury 等人， Eur.Journal of Pharm.and Biopharm.59(3) ： 565-573(2005)。
表4
由于小得率， 所以无法执行这些样品的卡尔· 费歇尔滴定 (KF) 和大角度 x 射线衍 射 (WAXD) 分析。聚集中的增加不很依赖于山梨糖醇的量， 除 10mM 是不足的外。不同量的 山梨糖醇不影响颗粒形态 ； 尽管混合物中存在的赋形剂越多， 采用圆形的颗粒也越多 ( 参 见图 4)。尽管不可能使纯山梨糖醇溶液 ( 作为对照 ) 喷雾干燥， 但不同山梨糖醇浓度的安 慰剂粉末全都显示球形颗粒。
结晶性程度随着更高的山梨糖醇净重下降。IEF 结果在很大程度上与纯浓缩物的 结果一致， 因为如果要的话， 另外的条带可以仅模糊检测出。10mM 混合物还显示出乎意料 的 DLS 图。在微米大小处的清晰峰在大小 - 体积分布中难以检测出， 因此大聚集物的量非 常低。然而， 25、 50 和 100mM 加入的山梨糖醇显示几乎等同的图。颗粒污染看起来线性地依 赖于山梨糖醇的量 ( 固体 )， 显示在 10mM 和 25mM 之间的最大步幅。然而， 差异主要局限于 较小的颗粒大小。关于大于 15μm 的颗粒的值大致相等。通过添加 25 或 50mM 山梨糖醇， 阿非莫单抗浓缩物的足够稳定作用因此看起来是可行的。这 2 种混合物不显示很大差异， 除含水量和因此所得到的 Tg 外。
10-100mM 海藻糖的添加
由于用高山梨糖醇量发现的结果， 所以海藻糖测试系列排除 150mM 混合物。海藻 糖作为海藻糖二水合物加入， 因此混合物包括在 15mL 阿非莫单抗浓缩物中的 56.7 至 567mg 海藻糖二水合物， 海藻糖 ： MAK 的质量比在表 5 中可见。如图 5 和 6 中可见， 结果在 25mM 和 100mM 之间是相似的。 与山梨糖醇相比较， 得率平均为略微更高的总体浓度。 用海藻糖获得 极佳稳定作用， 并且得率在所有浓度上也是稳定的。 增加的聚集是最低限度的， 并且仅对于 10mM 混合物， 在 SEC 中可见聚集中的小增加 (0.2％ )。
表5
然而， 不溶性聚集物在所有混合物中都出现， 如 DLS 图中可见。单体的量与山梨糖 醇结果可比较。颗粒的结晶度和球形度直接随海藻糖的量而变化。海藻糖的添加促使颗粒 采取更圆的形状， 因为纯海藻糖的喷雾干燥提供球形颗粒 ( 参见图 7)。如山梨糖醇实验中 可见， 颗粒污染看起来受赋形剂浓度影响， 但它再次局限于小颗粒尺寸 ( ≤ 15μm)。 由于海 藻糖的高 Tg( 关于干燥海藻糖的 Tg 是 115℃ )， 所以海藻糖混合物的 Tg 也高， 这可以是用于 粉末稳定性研究的优点。Adler 等人， Journal ofPharm.Sci.88(2) ： 199-208(1999)。25mM 和 50mM 看起来是产生具有合适过程和贮藏稳定性的粉末的最有希望的海藻糖比例。所得 到的粉末显示比山梨糖醇粉末更少的残留水。由于用这些混合物的满意结果， 所以放弃用 150mM 海藻糖的后续测试选择。
10-100mM 蔗糖的添加
测试了给阿非莫单抗浓缩物添加 25mM 至 100mM 蔗糖 ( 参见表 6)。从 25mM 到 100mM， 蔗糖的添加提供了 70 至 80％的高粉末得率 ( 图 8 和 9)。Tg 在 25mM 下达到最佳值。 聚集增加在所有浓度自始至终无相当大不同。再次结晶性程度 (C) 随着蔗糖的量线性减 少。不同粉末的残留含水量平均略微高于对于海藻糖混合物观察到的那种。颗粒的球形度 受蔗糖量的影响。蛋白质趋于形成凹陷球形， 而蔗糖趋于形成球形颗粒。
表6
在 DLS 文件中， 与 10mM 相比较， 用 100mM 蔗糖单体的量更低， 但这个印象局限于强 度 - 大小分布图。在关于 100mM 蔗糖的体积 - 大小分布中， 聚集峰难以检测出。在 10mM 混 合物中， 可以看见更大的聚集物 ( ＞ 1μm)。 这些另外的峰在蔗糖混合物的其余部分中未显 示出来。IEF 凝胶未显示任何相当大的不规则。另外的条带仅对于 50 和 100mM 模糊可检 测， 并且浓缩物的原始带型可以清晰地看出。颗粒污染从 10mM 到 100mM 下降， 显示在 10mM 和 25mM 之间的最大步幅。随着更大的颗粒大小， 差异变得更小， 因此对于大于 15μm 的颗 粒， 所有混合物显示相似的颗粒量。考虑所有这些结果， 给阿非莫单抗浓缩物添加 10mM 蔗 糖是不足的 ； 最佳结果用 25mM 和 50mM 获得。
概括
比较关于不同量的 3 种赋形剂的结果， 显而易见的是 10mM 的赋形剂不足以提供在 喷雾干燥过程期间的蛋白质保存。 因此用 25mM 和 50mM 获得对于所有赋形剂最有利的结果 ； 100mM 或甚至 150mM 未改善结果 ( 对于 150mM 山梨糖醇完全相反 )。关于聚集增加的结果 对于山梨糖醇略微更高 ； 结果的其余部分 ( 蔗糖和海藻糖 ) 大致相似。海藻糖和蔗糖保护 阿非莫单抗蛋白质至相同程度并且优于山梨糖醇。
贮藏稳定性研究
使喷雾干燥粉末暴露于不同温度和残留湿度条件 3 个月。 测试条件是 ： 冰箱 (5℃， 无湿度 ) ； 在 60％相对湿度下 25℃ ( 类似于中欧、 北美 ) ； 和在 75％相对湿度下 40℃ ( 类似 于东南亚 )。
制备和检查计划
贮藏纯浓缩物以及喷雾干燥的安慰剂。安慰剂粉末包括与真药 (verum) 粉末 ( 喷 雾干燥的蛋白质 - 赋形剂混合物 ) 相同的固体， 除阿非莫单抗蛋白质外。预先计算分析测 试所需的粉末量， 以估计液体进料的批大小。3 或 4 批 50mL 液体进料在相同条件下进行喷 雾干燥 ； 使所得到的粉末混合为一堆， 用 密封含氟弹性体和 螺旋盖从其中将所计算的量填充到小 Al 小瓶内。选择具有密封含氟弹性体的 Al 小瓶， 因为它们在初步实验中仅显示小水蒸气通透性 ( 当在室温下在 65％ RH 下在 10 天期间贮藏时， 未观察到喷雾干燥的乳糖的含水量中的改变 )。在每次检查时间 (t ＝ 1、 2 和 3 个月 )， 从 不同空调室中取出每种混合物的 2 个等同样品 (Al 小瓶 )。一个用于分析 ； 另一个转移至 冷冻机且贮藏于 -80℃ ( 作为用于可能的另外测试的储备 )。这得到总共 152 个小瓶， 48 个 用于每个月从室中取出 ( 对于每个温度， 4 个真药、 4 个真药储备、 4 个安慰剂、 4 个安慰剂储 备 ) 加上无任何另外的热处理贮藏于 -80℃下的 8 个小瓶 ( 纯浓缩物或新鲜的喷雾干燥的 粉末 )。
阿非莫单抗浓缩物
SEC 结果 ( 参见表 7)。SEC 层析谱指示在 5℃下浓缩物仅遭受经由聚集的微小损 害， 但看起来这些聚集物不主要是二聚体。聚集物峰的宽平台指示三聚体 / 寡聚体的存在。 更高的温度和更长的贮藏期导致严重降解， 通过断裂的出现和层析谱减少的 AUC 可见。
表7
研究了不同级分的贮藏稳定性动力学。虽然单体的量在所有温度下都不断下降， 但聚集看起来在 25℃和 40℃下约 2 个月后转换成断裂。 在 40℃下， 聚集不再作为层析谱中 的分开峰可检测， 并且在 3 个月后， 峰模式由断裂峰占优势。 在 40℃下的严重损害可以通过 肉眼分析样品进行观察。 在 1 个月后， 贮藏于 40℃下的浓缩物显示浊度， 而 5℃和 25℃样品 显示仅在着色中的小变化， 用肉眼不可见。浊度测量显示可比较的结果。 浊度中的清晰变化仅在 40℃下在真药 ( 包含蛋白质 的样品 ) 中以及在安慰剂浓缩物中可检测。在 1 个月后， 浓缩物显示超过 150NTU 的值， 在 随后月份中仍增加。由于光学浊度， 对于 40℃样品终止 DLS 测量。在较低温度下， 未检测出 改变。颗粒测量提供关于断裂和聚集的另外信息。细小颗粒级分减少 ( 颗粒＜ 25μm)， 而 大颗粒数目不断增长， 推测代表通过 SEC 未检测出的不溶性聚集物 ( 如通过层析谱逐渐减 少的 AUC 假定的 )。这些应该也是负责样品的可见浊度的颗粒。
迄今为止， 在 25℃下损害看起来不是非常严重。然而， 当分析 IEF 凝胶时， 这个印 象被证明是错误的。 在 1 个月后， 已可以看出条带强度中的小变化， 并且在 3 个月后， 带型与 原始明确不同。关于具有最高等电点 (IEP)(pH 8.6-8.7) 的同工型的条带完全消失。40℃ 贮藏在 1 个月后引起严重损害， 在稳定性测试过程中变得甚至更糟。
因此在冷却温度下贮藏时， 阿非莫单抗浓缩物是相对稳定的。但只要浓缩物置于 较高温度下， 降解就经由不同途径发生。当在长时间段期间贮藏时， 甚至室温 (25℃ ) 也成 为应激因素。
喷雾干燥粉末的稳定性
为了经由喷雾干燥提供长期稳定作用， 具有另外赋形剂的阿非莫单抗浓缩物应显 示不比关于在 25℃贮藏的浓缩物结果更糟的降解。作为另外的测试， 紧在喷雾干燥过程后 和在 3 个月贮藏后进行卡尔· 费歇尔滴定， 以检查 Al 小瓶的密封 ( 到目前为止仅对于短时 间段进行测试 ) 和 / 或水分对喷雾干燥粉末的稳定性的影响。
浓缩物 +25mM 山梨糖醇
在 5℃和 25℃下贮藏的样品在 3 个月期间显示良好的稳定性 ( 如表 8 中所示 )。 在 SEC 结果中， 无法发现清楚的变异 (Δ 聚集低于 1％ )。在 40℃下发生相当大降解， 聚集 显示强烈增加， 并且除二聚体峰外还出现大的多聚体。在 3 个月后， 可以检测出清楚的片段 峰。
表8
尽管贮藏于 5 ℃和 25 ℃下的样品未显示着色中的任何变化， 但 40 ℃样品 ( 再溶 解 ) 的颜色在 1 个月后轻微改变， 并且在时间过程中甚至显示可见浊度。这种浊度由蛋白 质引起， 因为安慰剂样品在任何时间或温度下未改变着色。在浊度测量过程中最显著的结
果也在 40℃下获得。直接在喷雾干燥后在约 20NTU 下开始， 40℃样品在 3 个月后达到超过 120NTU 的值。然而， 20NTU 显著超过纯浓缩物显示的。40℃是关于山梨糖醇混合物的临界 参数， 因为它超过 Tg， 因此无法再维持玻璃态。
颗粒污染显示相似结果。在 5℃和 25℃仅可检测出小改变。贮藏于 40℃ /75％ RH 下的样品显示显著增加， 尤其是对于小颗粒。 这是由于粉末无法再溶解的事实， 未观察到轻 微浊度。在安慰剂样品中， 颗粒数目比真药样品中少得多， 不局限于特定颗粒大小。用于贮 藏粉末的 Al 小瓶不确保绝对的水蒸气不通透性， 即使初步研究暗示如此。
直接在喷雾干燥过程后和在 3 个月贮藏后进行卡尔· 费歇尔滴定。吸水不是蛋白 质依赖性的， 因为安慰剂样品显示相等结果， 除略微更高的初始值外。因为 5℃粉末仅显示 湿度中的小增加， 所以吸水依赖于空调室的 RH。 山梨糖醇和 MAK 的组合比纯赋形剂更吸湿， 因为关于安慰剂样品的值略微高于关于真药样品的。温度、 残留湿度和小瓶的水蒸气通透 性对 x 射线衍射图无任何影响。在 3 个月后， 与初始图 (t ＝ 0) 相比较， 衍射图模式中仍无 差异。
即使粉末的肉眼可见外观也受湿度影响。大多数样品仍是可流动的疏松材料， 但 40℃样品融合 ( 尤其是安慰剂样品 )。在 40℃样品中可见的聚集中的增加用 DLS 结果加以 证实。尽管 5℃和 25℃仍显示一般模式 ( 单体峰在 10nm 处和小聚集峰在 μm 大小处 )， 但 对于 40℃样品可见独特模式。即使在大小 - 体积分布中， 小肩也在单体峰处出现， 代表在 3 个月后甚至更独特的多聚体峰。 在 IEF 凝胶中， 在 40℃下贮藏 2 个月后可以检测出改变， 另 外条带出现在初始点处， 在较低温度下不可见。 浓缩物 +25mM 海藻糖
海藻糖混合物显示良好稳定性 ( 表 9)。在 5℃和 25℃ /60％ RH 下的贮藏过程中， 整个分析自始至终无法检测出相当大改变。仅在 40℃ /75％ RH 下， 粉末的确显示略微不同 的结果。聚集仅在 40℃下增加。在 3 个月后， 检测出总体聚集中约 2％的增加。较低的温 度不导致对蛋白质的显著损害。但即使在 40℃下， 在 3 个月后单体的量仍超过 95％。对于 海藻糖用作稳定剂， 未观察到片段的形成， 至少在层析谱中不存在独特的峰。IgG 片段可能 比完整抗体对在贮藏过程中温度诱导的聚集更不易感。
表9
在浊度测量过程中获得相似结果。在 5℃和 25℃下的贮藏过程中无法看出浊度中 的改变， 并且甚至 40℃样品也仅显示浊度中的小增加。 大多数浊度再次由蛋白质引起， 因为安慰剂样品具有接近于零的 NTU 值。颗粒污染不受较高温度或较高残留湿度的影响。除真 药和安慰剂样品之间的差异外， 颗粒数目在 3 个月的贮藏期间在很大程度上保持在相同水 平上。这也通过再溶解粉末的光学表现加以证实。所有样品都导致澄清溶液， 并且甚至着 色测量也未显示在贮藏过程中的任何差异。
用于稳定性测试的 Al 小瓶无法从粉末中完全排除湿度。在 25℃和 40℃下的高湿 度条件因此导致粉末湿度中的增加。贮藏于 5℃下的粉末显示未改变的含水量。两种应激 因素——温度和增加的 RH， 对粉末样品的结晶度无任何影响。衍射图保持不变。氯化钠峰 模式仍在 WAXD 图中占支配地位。SEC 和浊度测量结果用经由 DLS 获得的结果加以证实。低 温和低残留湿度不伤害蛋白质装载的粉末。所有样品都显示相同模式， 并且甚至在 40℃下 贮藏的混合物也未显示异常峰或峰肩。显示用在约 10nm 处的大峰和在 μm 大小处的另外 峰可见的通常模式。
在 IEF 结果中， 在聚焦的初始点处显示另外条带的唯一凝胶是具有 40℃ /75％ RH 样品的那种。即使那样， 在 3 个月后仅可见微小的蓝色斑点 ( 紧在 “40℃” 下 )。经过所有 的温度和湿度条件， 海藻糖证实对于阿非莫单抗蛋白质有极佳的稳定作用能力。
浓缩物 +25mM 蔗糖
溶于阿非莫单抗浓缩物中的蔗糖溶液显示良好的贮藏稳定性， 尤其是在 5 ℃和 25℃ /60％ RH 下 ( 表 10)。在这些条件下未观察到聚集中的改变。关于 5℃和 25℃的所有 层析谱都是相似的。独特结果仅对于 40℃ /75％ RH 样品可见， 其中检测出在 3 个月期间聚 集中约 2.5％的增加。当即使如此， 在这个时间单体的量也是约 95％。
表 10
所有再溶解粉末看起来都是光学澄清且无色的， 与阿非莫单抗浓缩的或液体进料 无法区分。 着色测量未显示在 3 个月期间在颜色中的任何改变， 即使在高温贮藏 (40℃ ) 后。 溶液仍最接近于参考溶液 R6 或 B5， 这是高度稀释的液体， 具有仅用助视器 (visual aid) 可 鉴定的一点红色或褐色。借助于浊度计的帮助， 未观察到广泛改变。尽管在 40℃ /75％ RH 下贮藏后存在浊度中从最初 12NTU 到 20NTU 的增加， 但浊度结果比对于山梨糖醇和海藻糖 更佳， 后者紧在喷雾干燥后已显示 20NTU。安慰剂样品仅显示非常低浊度， 在整个稳定性测 试时间段期间无显著改变。
如对于浊度那样， 关于真药样品的在显微镜下才能看到的颗粒污染大大高于关于 安慰剂样品。然而， 在大颗粒级分中 ( 大于 10μm 的颗粒 )， 仅观察到小改变。大于 40μm
的颗粒数目通常接近于零， 关于大于 10μm 的颗粒计数低于 100 或在 100 附近 ( 每 mL 溶 液 )， 并且因此总体颗粒污染不是非常高。在高温贮藏下的所有降解与卡尔· 费歇尔分析结 果一致。条件性贮藏室中的残留湿度越高， 由粉末吸收的水量也越高。蔗糖样品未显示真 药和安慰剂粉末之间的大差异。
尽管含水量在更高的残留湿度条件下增加， 但水的吸收对粉末的结晶度无任何影 响。在 3 个月后的 WAXD 图显示对于所有温度相同的衍射模式， 等同于紧在喷雾干燥后获 得的 WAXD 图 (t ＝ 0)。在 DLS 图和 IEF 凝胶中仅检测出最低限度的降解。在 40℃和 75％ RH 下 3 个月后， 蔗糖样品显示非常类似于紧在喷雾干燥后的那种的光散射图。清晰的单体 峰在 10nm 流体动力学直径处， 并且非常小的峰在 μm 大小处 ( 在图像放大部分中可见 )。 40℃和 75％ RH 也是引起 IEF 带型不同于浓缩物那种的唯一条件。在聚焦的初始点处的轻 微条带指示一些大聚集物， 但如 DLS 图中可见的， 它们的数目无相当大的重要性。
比较和概括
稳定性实验证实不同稳定剂导致不同结果。 改变赋形剂或贮藏条件看起来对颗粒 形态没有影响。sd 山梨糖醇混合物紧在喷雾干燥后的 SEM 图像与在 40℃和 75％ RH 下贮藏 3 个月的海藻糖样品难以区分。5℃不导致严重蛋白质损害 ； 即使阿非莫单抗浓缩物也未显 示在这些条件下在 3 个月期间的相当大降解。当在 25℃ 60％ RH 下或在 40℃ 75％ RH 下贮 藏时， 纯浓缩物通过显示聚集和断裂响应。
海藻糖和蔗糖显示广泛一致的结果。 粉末具有非常良好的稳定性。 即使在 40℃和 75％ RH 下， 也仅检测出小改变。然而， 吸湿性是显示关于海藻糖和蔗糖的不同结果的参数 之一。与蔗糖混合物相比较， 在喷雾干燥后包括海藻糖的 sd 粉末总体显示更低的含水量。 因为用于稳定性测试的 Al 小瓶对于水蒸气不是完全不透的， 所以蔗糖粉末在 3 个月后也具 有更高的含水量， 这是由于 sd 蔗糖比海藻糖更吸湿的事实。
蔗糖和海藻糖之间的另一个差异在浊度测量中可见。 蔗糖混合物显示紧在喷雾干 燥后比海藻糖粉末更少的 NTU。浊度测量也公开了另一个出乎意料的特征。喷雾干燥过程 看起来对于蛋白质 - 赋形剂混合物比在升高温度下贮藏更是产生应激的。当喷雾干燥时， 至少当在低于 sd 粉末的 Tg 下贮藏时， 粉末显示足够的稳定性。
山梨糖醇也具有稳定潜力。它在 5℃和 25℃下显示良好结果。然而， 包括山梨糖 醇的 sd 粉末经受不住在长时间段期间的更高温度。关于这些结果的临界参数看起来是山 梨糖醇的低 Tg。超过这个温度 ( 如关于 40℃贮藏的结果中可见 )， 使玻璃状制剂转化成粘 性液体， 增强其流动性， 打开各种降解途径。
减少在喷雾干燥 . 过程期间的浊度增加的尝试
因为发现浊度是显示在喷雾干燥过程期间的变异性的参数， 所以在使干燥过程后 的浊度值减少至最低限度水平的尝试中再次改变过程参数。对于这些实验， 使用来自先 前干燥实验的过程参数， 其已证明导致对阿非莫单抗蛋白质的最低限度损害。为此， 使用 130℃和 100℃的 TIn， 进行伴随赋形剂海藻糖和蔗糖的 25mM 和 50mM 添加的喷雾干燥实验。 如上所述， 100℃的 TIn 显示接近于用 130℃的 TIn 获得的那些的分析结果。降低 TIn 减少对 于蛋白质的热应激， 并且因此可以导致更低的 NTU 值。类似考虑应用于 50mM 和 25mM 赋形 剂的添加。2 种制剂在先前测试中都显示相似结果。增加赋形剂的量可以导致更佳的 NTU 值。因为过程设置中的 2 种改变都不显示先前测试中的相当大改变， 所以用于这些实验的唯一分析法是浊度测量。
海藻糖的添加
包括 25mM 和 50mM 海藻糖的阿非莫单抗浓缩物在 100℃和 130℃的 TIn 下进行喷雾 干燥。每种制剂进行多倍喷雾干燥， 从而使得来自每次实验的至少 3 种 sd 粉末可以就浊度 进行测试。根据 TIn 和赋形剂的量， 粉末得率都未显示相当大差异。平均得率是约 70％， 显 示对于 130℃ TIn 和赋形剂的 25mM 添加更高的值。浊度测量的结果更可变。
赋形剂的量对浊度没有很大影响， 这是因为关于 25mM 和 50mM 海藻糖的 NTU 值没 有很大不同。然而， 不同的 TIn 导致不同的浊度。130℃的 TIn 导致更低的 NTU 值和标准差。 在 100℃的 TIn 下， 一般而言的 NTU 值更高并且也显示更大的变异性。关于 130℃和 25mM 海 藻糖添加的值也与在稳定性测试过程中获得的浊度结果一致。
蔗糖的添加
具有 25mM 和 50mM 蔗糖添加的阿非莫单抗浓缩物的混合物在 100℃和 130℃的 TIn 下进行喷雾干燥。不同浓度的蔗糖看起来对喷雾干燥过程的粉末得率没有很大影响。所 有混合物都提供约 70％的粉末得率， 对于 130℃粉末显示略微更小的标准差。更加不同的 是来自浊度测量的结果。关于 25mM 和 50mM 的 NTU 值非常接近， 在 100℃的 TIn 下略微趋向 50mM 蔗糖 ( 显示更低的浊度 )， 并且对于 130℃的 TIn 趋于蔗糖的 25mM 添加。因为这些趋势 不大， 所以赋形剂的量对喷雾干燥粉末的浊度没有很大影响。更明确的是关于 TIn 的决定。 100℃提供基本上更高的 NTU 值， 有时超过 50NTU， 这对于 130℃粉末即使在 40℃下贮藏 3 个 月也达不到。此外， 在 100℃的 TIn 下获得的大标准差不预示重现性结果。当在 130℃的 TIn 下喷雾干燥时， 再溶解粉末显示约 20NTU 的重现性低浊度。这些值也符合在稳定性测试过 程中获得的结果。
概括
在喷雾干燥过程期间的浊度增加无法通过降低 TIn 而减少。包含海藻糖的粉末以 及蔗糖混合物显示在 100℃下更高的 NTU 值。当使用 130℃作为 TIn 时， 25mM 赋形剂的添加 提供比 50mM 略微更低的浊度值。从先前实验得出结论的过程参数 (130℃和 25mM 添加剂 ) 因此看起来对于阿非莫单抗蛋白质的喷雾干燥是最佳的。关于浊度， 蔗糖表现比海藻糖略 微更佳。由包含 25mM 蔗糖的阿非莫单抗浓缩物喷雾干燥的粉末显示 15NTU 的平均值， 而类 似的海藻糖混合物显示 17NTU 的平均值。
更浓缩的 MAK 195F 溶液的喷雾干燥
使用海藻糖、 蔗糖或山梨糖醇， 包括 12.4mg/mL MAK 195F 的阿非莫单抗浓缩物 在实验室规模中成功地进行喷雾干燥， 从而导致稳定粉末。对于按比例增加的干燥过程， 过程时间是非常重要的因素。Masters， Spray Drying in Practice.SprayDryConsult International ApS ； Charlottenlund(2002)。为了减少关于更大批次的过程时间， 在液 体进料中更高的蛋白质浓度增强喷雾干燥器的蛋白质通量， 而对其他过程参数无相当大影 响。 为了达到更高浓缩的 MAK 195F 溶液， 使阿非莫单抗浓缩物超滤。 在这个过滤过程期间， 水、 盐和表面活性剂减少， 而蛋白质无法越过膜。这导致蛋白质浓度中的增加， 但不改变其 他溶质的浓度。
阿非莫单抗浓缩物 50.6mg/mL
在第一个超滤过程中， 浓缩物达到 50.6mg/mL 蛋白质 /mL 的浓度 ( 通过使用 UV- 光谱学估计 )。溶液是光学透明的并且几乎无色的 ( 轻微带褐色 )， 与原始阿非莫单抗浓缩物 (12.4mg/mL) 难以肉眼区分。SEC 和 DLS 未显示与原始浓缩物的改变。
聚集仍接近于原始浓缩物 ( ～ 1％ )， 并且 DLS 概况确切匹配原始浓缩物的那种， 仅显示在约 10nm 处的单重峰。蛋白质不受增加其浓度伤害。对于更高的蛋白质浓度， 一些 3 可测量的物理性质可以改变。 浓缩物 50.6mg/mL 显示 1.017g/cm 的密度和 1.375mPas 的粘 度 ( 两者都在 20℃下进行测量 )， 与原始浓缩物相比较两者都略微更高。同样， 关于浓缩物 50.6mg/mL 的浊度值高于关于原始溶液的 ： 分别为 118NTU 和约 5NTU。这个增加是预期的， 因为溶液中的大分子 ( 蛋白质 ) 量增加， 因此存在可以散射或吸收光以减少光强度的更多 大分子。
颗粒测量未显示超滤过程期间的显著改变。浓缩物 50.6mg/mL 的所有颗粒级分都 显示与浓缩物 12.4mg/mL 相等或比浓缩物 12.4mg/mL 更少的颗粒污染。同样， IEF 凝胶未 显示另外条带。可以假定溶液中的 MAK 195F 浓度增加至 50.6mg/mL 不导致相当大损害或 关于蛋白质及其功能的其他改变。
使不含赋形剂的浓缩物 50.6mg/mL sd 喷雾干燥
当喷雾干燥时， 浓缩物 50.6mg/mL 正如浓缩物 12.4mg/mL 一样对损害易感。在 喷雾干燥过程期间， 聚集增加至约 2％， 1％的增加。粉末得率是约 55％， 但含水量相对高 (3.5％ )。此外， 由于其高静电荷， 粉末显示在处理方面 ( 填充等 ) 的一些困难。
DLS 图显示明确的单体峰和代表小聚集物 ( 寡聚体 ) 的小肩。与喷雾干燥的原始 浓缩物 (12.4mg/mL) 相反， 未检测出在 μm 大小处峰形式的大聚集物。因为仅存在可检测 的小聚集物， 所以在喷雾干燥过程期间看不出 IEF 凝胶中的相当大改变。
在超滤过程期间， 蛋白质浓度增加， 而所有其他溶质 (NaCl、 Na3PO4 和 F68) 维持其原始浓度。这种改变的一个影响可以在喷雾干燥制剂的 X 射线衍射模式中看 出。蛋白质在喷雾干燥后是完全无定形的， 因此由氯化钠引起的结晶峰相当大地减小。对 于颗粒形态的任何影响都是无法检测出的， 除由小滴中更高量的固体引起的朝向更大颗粒 的趋势外。
使不含任何赋形剂的浓缩物 50.6mg/mL 喷雾干燥也导致非常高的颗粒污染。与浓 缩物 12.4mg/mL sd 相比较， 低于 25μm 的所有颗粒级分包含更高量的颗粒。
通过在喷雾干燥前加入赋形剂， 这些结果应该是可改善的。如在稳定性测试中那 样， 赋形剂以等于关于浓缩物 12.4mg/mL 的 25mM 混合物的质量比加入。
山梨糖醇的添加
根 据 对 于 浓 缩 物 12.4mg/mL 的 25mM 混 合 物， 山 梨 糖 醇 以 0.35 ∶ 1 的 山 梨 糖 醇∶ MAK 195F 质量比加入。 喷雾干燥混合物的粉末得率是约 60％。 粉末具有 20℃的 Tg 和 2.3％的含水量。 这些值与对于具有浓缩物 12.4mg/mL 的类似混合物获得的结果 (67％粉末 得率， 2.0％ RH， Tg ＝ 19℃ ) 广泛一致。使 sd 粉末再溶解导致澄清的、 几乎无色的溶液， 具 有最接近于参考溶液 B2( 轻微带褐色 ) 的着色， 正如起始 MAK 195F 浓缩物 50.6mg/mL。
在喷雾干燥后， 再溶解粉末显示聚集中的小增加。与对于纯浓缩物 50.6mg/mL 的 约 1％相比较， SEC 显示 1.3％的聚集水平。再次， 与具有山梨糖醇的 25mM 添加的喷雾干燥 浓缩物 12.4mg/mL 相比较， 这没有相当大改变。
不溶性聚集物的量未相当大增加， 如 DLS 结果中可见的。在 10nm 的流体动力学直径处检测出明确的单体峰， 以及在 μm 大小处的聚集峰。因为液体进料的固体含量增 加 2.8 倍， 所以再溶解粉末的在显微镜下才能看到的颗粒污染增加。特别地， 小颗粒级分 ( ＜ 10μm) 显示非常高的污染水平， 而大颗粒 ( ＞ 10μm) 数目保持在类似于更低浓缩的溶 液那种的水平上。
改变液体进料中的蛋白质浓度对颗粒形态仅具有小影响。 颗粒显示凹陷球形的一 般形状， 但看起来存在朝向更大颗粒的趋势。因为关于包含 12.4mg 阿非莫单抗 /mL 的溶液 的颗粒直径是约 2.5 至 13μm， 所以使更高浓缩的溶液喷雾干燥部分导致大于 15μm 的颗 粒。
海藻糖的添加
根据稳定性测试系列采用 0.7 ∶ 1 的赋形剂∶ MAK 105F 比， 使用用于浓缩物 12.4mg/mL 的 25mM 赋形剂添加。赋形剂的量在这个实验中高于山梨糖醇实验中， 这是因为 海藻糖作为二糖具有约为山梨糖醇单糖 2 倍的分子量。液体进料溶液中固体含量的这种增 加使得难以获得与先前喷雾干燥实验中一样高的粉末得率。 使具有高固体含量的溶液喷雾 干燥冒着堵塞高性能旋风分离器的粉末出口的危险， 并且得率减少在 50％下 ( 在这个实验 中约 45％ )。由于高静电荷， 粉末难以处理。它具有 3.6％的含水量和约 66℃的 Tg， 略微与 类似的低浓度混合物一致 (3.3％ RH， Tg ＝ 56℃ )。再溶解 sd 粉末具有最接近于参考溶液 B2 的着色， 所述参考溶液 B2 是轻微带褐色的。
海藻糖的稳定作用潜力是良好的。可溶性聚集物中的增加在 SEC 层析谱中无法检 测出 ； 聚集维持在 1％的水平上， 与原始浓缩物 50.6mg/mL 无法区分。不溶性聚集物的量也 非常低， 如 DLS 文件中可见， 显示单体峰和由在 μm 大小处的峰代表的少量大聚集物。
在显微镜下才能看到的颗粒污染高于对于较低浓度混合物 ( 具有海藻糖的浓缩 物 12.4mg/mL)。 这可以通过高固体含量加以解释， 所述高固体含量为使用 MAK 195K 浓缩物 12.4mg/mL 的混合物中的约 3 倍。
液体进料中的蛋白质浓度和固体含量中的改变对颗粒形态没有很大影响。 颗粒形 状不显示任何相当大改变， 除在更浓缩的粉末中分离的更大颗粒的出现外。
蔗糖的添加
为了维持 0.7 ∶ 1 的蔗糖∶ MAK 195F 质量比 ( 类似于浓缩物 12.4mg/mL 和 25mM 赋形剂 )， 关于每次喷雾干燥实验的蔗糖量必须增加 4.08 倍 (50.6/12.4)。 如上文使用这个 质量比可见的， 在喷雾干燥过程期间达到几乎完全的蛋白质保存。包括这个高量固体的溶 液的喷雾干燥冒着堵塞旋风分离器的粉末出口的危险， 所述粉末出口具有非常小的直径， 尤其是对于高性能旋风分离器。因此粉末得率有时减少在 50％下， 对过程稳定性无任何影 响。
因为浓缩物 50.6mg/mL 具有不同于原始浓缩物 12.4mg/mL 的着色， 所以预期基于 更高浓缩的蛋白质溶液的再溶解 sd 粉末也显示着色。海藻糖混合物具有最接近于参考溶 液 B 1 的着色， 所述参考溶液 B 1 轻微带褐色。
聚集保持在 1％的水平上， 与液体浓缩物 50.6mg/mL 或甚至原始浓缩物 12.4mg/mL 无实际不同。
DLS 分析显示在约 10nm 流体动力学直径处的单体峰， 和代表少量大聚集物的在 μm 大小处的众所周知的小聚集峰。在显微镜下才能看到的颗粒污染在所有颗粒大小级分自始至终比对于低浓缩的混合物略微更高。
颗粒形态与在包括相同赋形剂∶ MAK 195F 比的先前实验中获得的结果无不同。 由于液体进料中更高的固体含量， 可见一些分离的更大颗粒， 这不存在于更低浓缩的制剂 中。粉末的残留水分是 2.6％， 制剂的 Tg 是约 60℃。两个值都与对于类似低浓度制剂在稳 定性测试中获得的那些可比较 (2.6％ RH， Tg ＝ 63℃ )。
概括
液体进料的蛋白质浓度增加至 50.6mg/mL 对所得到的粉末没有任何相当大影 响。几乎所有分析测试都导致与使用具有关于赋形剂∶ MAK195F 的相等质量比的浓缩 物 12.4mg/mL 的喷雾干燥实验可比较的结果。因此赋形剂的稳定潜力依赖于质量比赋形 剂∶ MAK 195F， 而不是摩尔比。
与在使用低浓度液体进料 (12.4mg/mL) 的实验中一样， 海藻糖和蔗糖导致就阿非 莫单抗的喷雾干燥期间的过程稳定性而言几乎等同的结果。 使用山梨糖醇使抗体片段稳定 显示略微次等的结果， 尤其是在聚集中。高浓缩粉末的 IEF 比较未显示相当大差异， 所有混 合物都显示原始阿非莫单抗带型， 无另外条带 ( 大聚集物 )。
根据赋形剂的不同量， 在 WAXD 图中存在显著差异。因为所使用的所有糖 ( 以及蛋 白质 ) 在喷雾干燥后是完全无定形的， 所以作为占优势的结晶成分的氯化钠的量控制结晶 峰的出现。阿非莫单抗浓缩物 12.4mg/mL 具有 38％ w/w 的氯化钠浓度 ( 就固体而言 )， 显 示在 32 的° 2θ 的明确氯化钠峰。在喷雾干燥浓缩物中， 氯化钠浓度是约 14％ w/w， 导致 结晶峰高度中的减少。 通过添加海藻糖和蔗糖作为赋形剂， 氯化钠浓度减少至 9％的值。 因 此， 结晶峰不再遮蔽 (over-shadowed) 由蛋白质和稳定剂引起的无定形晕圈。因为山梨糖 醇的质量比低于二糖的那种， 所以在山梨糖醇混合物的 WAXD 图中仍可见氯化钠的结晶峰。
张力计算
因为阿非莫单抗浓缩物最初开发且配制用于肠胃外施用， 所以等渗性是主要因 素。Reinhart 等人， Crit Care Medicine29(4) ： 765-769(2001)。用于静脉内应用的溶 液应具有与血液 (286mosmol/kg) 大约相同的渗透压。Kommentar zum Arzneibuch， Wiss.Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH， Band 2(5.2)(2006)。渗透压 可 以 经 由 冰 点 降 低 进 行 计 算， 使 用 来 自 Deutscher Arzneimittelcodex， dt.Apotheker Verlag Stuttgart， Band 1(Anlage B)， 1-6(2006) 的下述等式 ：
1％ (w/V) 溶液的冰点降低的计算 ：
混合物的 ΔT 的计算 ： ΔTmix ＝∑ ΔT 混合物的渗透压的计算 ：
在上述等式中， ΔT 代表与纯水相比较物质的 1％ (w/V) 溶液的冰点降低， Liso 是在等渗浓度下的冰点降低， 并且 Mr 是分子量。Liso 值对于不同电解质不同 ( 参见表 11)。因 为血清的冰点降低是 0.52℃ ( 等于 286mosmol/kg 的渗透压 )， 所以与纯水相比较混合物的 1％溶液的冰点降低值 (ΔTmix) 应不超过 0.52℃。具有其高分子量的阿非莫单抗对制剂的 冰点降低不具有相当大影响， 因此它不包括在计算中。
表 11
物质 非电解质 单 - 单价电解质 单 - 三价电解质
Liso 1.9 3.4 5.2例子 蔗糖、 海藻糖、 山梨糖醇 NaCl Na3P04使用这些等式， 不同浓缩物和混合物导致表 12 中给出的渗透压的计算值。 表 12制剂 浓缩物 12.4mg/mL 浓缩物 12.4mg/mL+25mM 山梨糖醇 浓缩物 12.4mg/mL+25mM 海藻糖 浓缩物 12.4mg/mL+25mM 蔗糖 浓缩物 50.6mg/mL 浓缩物 50.6mg/mL+ 山梨糖醇 浓缩物 50.6mg/mL+ 海藻糖 浓缩物 50.6mg/mL+ 蔗糖 浓缩物 100mg/mL 浓缩物 100mg/mL+ 山梨糖醇 浓缩物 100mg/mL+ 海藻糖 浓缩物 100mg/mL+ 蔗糖 计算的渗透压 [mosmol/kg] 306 320 332 332 306 361 412 412 307 504 517 517
为了维持生理学渗透压， 当使用更高浓缩的 MAK 195F 溶液时， 氯化钠的量需要减少。 原始氯化钠浓度为 8.8mg/mL。 使用在这项研究中估计的赋形剂∶ MAK 195F 质量比 ( 在 浓缩物 12.4mg/mL 中的 25mM 赋形剂 )， 蛋白质浓度可以升高至约 130mg/mL， 条件是所有氯 化钠从制剂中去除。这导致约 300mosmol/kg 的渗透压。
概括
这项研究用实验说明了包括喷雾干燥的用于制备抗体粉末的示例性方法。具体 地， 在这个实施例中， 将 IgG 片段 ； 阿非莫单抗＝ MAK 195F 溶液转变成干燥疏松材料。通 过筛选各种赋形剂和过程条件， 开发了提供与贮藏稳定性组合的过程稳定性的喷雾干燥过 程。
稳定性通过使用各种方法进行分析， 所述各种方法可以检测蛋白质的物理或化学 降解， 例如经由 SEC 和 DLS 的可溶性和不溶性聚集， 经由 DSC 的热事件、 和经由卡尔·费歇 尔滴定的 sd 粉末湿度。降解在干燥过程期间如由几种应激因素引起的而发生， 或者是在升 高温度下长期贮藏的结果。 IgG 片段通过将糖加入蛋白质中得到稳定。 海藻糖、 蔗糖和山梨 糖醇就其在干燥和后续贮藏期间的稳定作用潜力进行研究。
在研究的第一个部分， 蛋白质浓缩物进行表征并且随后无需任何赋形剂进行喷雾 干燥， 以检查浓缩物在干燥过程期间的易感性。此外， 进行发现恰当的过程参数的测试系 列。使纯浓缩物喷雾干燥导致对蛋白质的损害。聚集中的增加是相当大的 ( 约 2％ )， 特别 是当计划后续贮藏时。改变 TIn 应帮助减少聚集， 或发现其中发生最少聚集的过程参数。
在喷雾干燥过程期间的蛋白质损害看起来由不同应激因素 ( 例如， 热、 雾化、 剪切 力 ) 的相互作用引起。这些应激因素无一能够单独引起与喷雾干燥过程可比较的蛋白质变 质。
以 10mM 至 150mM 的各种浓度将稳定化糖加入蛋白质浓缩物中。 150mM 看起来是不 合适的， 因为液体进料的固体含量如此高， 从而使得旋风分离器趋于堵塞， 这导致低粉末得 率。赋形剂的 10mM 添加对于所有测试的糖是不足的。最佳结果通过 25mM 的添加获得， 等 于对于海藻糖和蔗糖赋形剂∶ MAK 195F ＝ 0.7 ∶ 1 的质量比以及对于山梨糖醇 0.35 ∶ 1 的质量比。50mM 导致可比较的结果， 但目的是使添加剂的量降低至最低可能的程度。比较 关于喷雾干燥过程的稳定作用潜力， 海藻糖和蔗糖导致相似结果。山梨糖醇看起来略微次 于二糖。但这在小质量比中未发现， 其中更多山梨糖醇的添加不改善结果。就过程稳定性 而言， 推荐优选海藻糖或蔗糖的 25mM 添加。
因为 25mM 混合物对于过程稳定性最有效， 所以它们用于短期稳定性测试 (3 个 月 )。连同类似的安慰剂混合物和液体浓缩物， 使 sd 粉末暴露于 3 种不同的常用气候 ( 冰 箱： 5℃， 中欧 ： 25℃ /60％ RH， 东南亚 ： 45℃ /75％ RH)。 如预期的， 液体浓缩物无法经受住任 何升高的温度， 这导致在 1 个月后的严重蛋白质损害 ( 聚集、 断裂和光学浊度 )。具有赋形 剂的 sd 粉末显示在 3 个月期间的良好稳定性。 海藻糖以及蔗糖制剂仅当贮藏于 40℃ /75％ RH 下时遭受相当大损害 (2％的聚集增加 )。即使 25℃ /60％ RH 对粉末也没有影响， 除关于 聚集中的小增加 (0.5％ ) 外。如关于过程稳定性的结果暗示的， 山梨糖醇也是贮藏过程中 最弱的稳定剂。在 5℃和 25℃下贮藏的混合物对于其他赋形剂类似地稳定， 但 40℃是关于 山梨糖醇 - 蛋白质混合物的临界参数。40℃超过混合物的 Tg， 因此由蛋白质固定化引起的 贮藏稳定性无法再得到保证。这导致约 12％的聚集增加， 这在这项研究的任何初步测试中 都未观察到。在显微镜下才能看到的颗粒和浊度测量导致不满意结果。这些样品大多数显示可见浊度或甚至凝结。稳定性研究的主要问题是用于贮藏粉末的 Al 小瓶。它们不显示 完全的水蒸气不通透性， 因此吸湿粉末的残留含水量无法保持恒定。
通过审慎配制， 几乎所有蛋白质改变都可以减少至最低限度水平。仍显示相当大 改变的唯一参数是浊度。不是贮藏而是喷雾干燥过程导致浊度中的增加。通过添加更多赋 形剂或使用更低的干燥温度降低这种增加的尝试失败。无法避免浊度中从约 5NTU( 浓缩 物 ) 到 15-20NTU(sd 混合物 ) 的增加。其他分析法也不显示在蛋白质 - 糖制剂的喷雾干燥 过程中的相当大改变。
在这项研究的最后一个部分， 液体进料中的蛋白质浓度增加， 目的是达到喷雾干 燥器的更高通量。进行用 50.6mg/mL 的蛋白质浓度的实验。超滤以及使更浓缩的蛋白质 溶液喷雾干燥 ( 使用鉴定的最佳糖添加剂的质量比 ) 的过程对阿非莫单抗蛋白质的稳定 性无相当大影响。大多数结果 ( 除颗粒污染或浊度外， 根据更高的固体含量 ) 与用浓缩物 12.4mg/mL 的类似实验可比较。如果可以预防旋风分离器出口的堵塞， 那么 100mg/mL 浓度 的喷雾干燥应是可行的。 即使更浓缩的粉末也可以肠胃外施用而不冒着张力过低或张力过 高的危险， 这是因为原始缓冲液包含足够的氯化钠， 所述氯化钠可以在关于稳定剂的交换 中去除。最高达 130mg/mL 的蛋白质浓度可以是可能的。
抗体制剂的组合物
如先前所述， 喷雾干燥实验在 Büchi Mini-Spray Dryer B-191 上进行。 简言之， 在 进入加热设备和干燥室之前， 干燥空气通过 LuwaUltrafilter 2( 玻璃纤维 ； filterclass ： HEPA H13) 进行过滤。在通过蠕动泵 (QLF ＝～ 3mL/ 分钟 ； 硅管 ) 被转运至干燥 室之前， 所有液体进料都通过 0.22μm 过滤器单元进行过滤。雾化通过双流体喷嘴使用干 燥氮 (QAA ＝ 700l/ 小时 ) 执行。在喷雾干燥后， 所得到的粉末从收集容器中回收且填充到 玻璃小瓶 ( 溴丁基橡胶塞子 ) 中， 用石蜡膜密封。组合物概括于表 13 中。蛋白质表征通过 使用 UV/VIS、 SEC、 IEC、 PCS、 DSC、 XRD 和卡尔·费歇尔法来进行。
表 13
如上所述， 使用 MAK 195F 作为模型化合物使用 12mg/mL 的浓度， 评估制剂和过程 参数。 图 10 包括描绘关于喷雾干燥的 MAK 195F 制剂的 SEC 物理稳定性数据的 2 个直方图 ： 在 40℃ /75％ RH 下的 3 个月贮藏后， 山梨糖醇、 海藻糖和蔗糖 (c ＝ 25mM) 对蛋白质聚集量 的作用 (A) 和稳定剂浓度对蛋白质聚集量的作用 (B)。图 10A 中给出的数据揭示海藻糖和 蔗糖提供最稳定的产物， 而山梨糖醇未提供足够的长期蛋白质稳定性。稳定剂的最低限度
量测定为 25mM， 等于赋形剂∶蛋白质＝ 0.7 ∶ 1 的质量比 ( 参见图 10B)。在图 10A 中， 从 左到右每个分组中的条分别代表 MAK 195F( 大批 )、 MAK 195F+ 山梨糖醇、 MAK 195F+ 海藻 糖、 和 MAK 195F+ 蔗糖。在图 10B 中， 从左到右每个分组中的条分别代表山梨糖醇、 海藻糖 和蔗糖。
这些参数通过使用范围从 12、 50 到 100mg/mL 的蛋白质浓度再现。所有配制提供 可接受的粉末。表 14 中显示的平均残留水分为 4.6wt.％ (MAK 195F) 至 5.5wt.％ ( 阿达 木单抗 )， 并且因此与具有低于 1％的一般值的冻干制剂相比较， 显著更高。然而， 玻璃化转 变温度对于 MAK 195F 为在 60℃下测量， 并且对于 2 种完全抗体为在约 70℃测量， 暗示至少 在 5℃贮藏温度下的合适稳定性。这些高浓度 (100mg/mL) 喷雾干燥 MAK 195F、 阿达木单抗 和 ABT-325 制剂的初步分析数据呈现于图 11 中。图 11 具有描绘对于溶于 200mM 海藻糖溶 液中的喷雾干燥的高浓度 MAK 195F、 阿达木单抗和 ABT-325， 通过使用 SEC 法的加工和在 40℃ /75％ RH 下的 3 个月贮藏对物理稳定性的作用 (A)， 和 (B) 通过 IEC 法测定的加工和在 40℃ /75％ RH 下的 3 个月贮藏对化学稳定性 ( 在加工后标准化 100％ ) 的作用的 2 个直方 图。在图 11A 中， 从左到右每个分组中的条分别代表 MAK 195F(95mg/mL， 喷雾干燥的 )、 阿 达木单抗 (100mg/mL， 喷雾干燥的 ) ； ABT-325(100mg/mL， 喷雾干燥的 ) ； 和 ABT-325(100mg/ mL， 冻干的 )( 除不存在关于 ABT-325(100mg/mL， 冻干的 ) 的一个月贮藏数据， 和关于 MAK 195F(95mg/mL， 喷雾干燥的 ) 的 3 个月贮藏数据外 )。
表 14
关于所有测试的制剂的数据证实蛋白质在加工和在 40℃最高达 3 个月的贮藏过 程中可接受的物理稳定性， 等价于 ABT-325 冻干产物。然而， 相应 PCS- 数据 ( 未显示 ) 暗 示对蛋白质特征的作用， 这必须更详细地进行分析。就化学稳定性而言， 图 11B 中的数据证 实与标准冷冻干燥制剂相比较， 关于喷雾干燥制剂可比较的结果。在图 11B 中， 从左到右每 个分组中的条分别代表 ABT-325(100mg/mL， 喷雾干燥的 )， ABT-325(100mg/mL， 冻干的 )， 和 阿达木单抗 (100mg/mL， 喷雾干燥的 )。概括
这证实了由具有最高达 100mg/mL 浓度的 mAb 溶液成功制造喷雾干燥的抗体粉末 的一般可行性。关于 MAK 195F、 阿达木单抗和 ABT-325 呈现的数据未显示在加工过程中以
及在加速稳定性研究过程中就蛋白质的物理或化学稳定性而言的显著作用。然而， 所观察 到的喷雾干燥蛋白质的多分散性应更详细地进行分析。
此外， 在制剂内需要足够量的稳定剂以达到长期贮藏。 然而， 由于这种技术的通用 性， 它提供就大量药物物质制剂而言以及针对新剂型和施用途径的令人感兴趣的前景。
引入作为参考
本申请自始至终可以引用的所有引用参考文献的内容 ( 包括文献来源、 专利、 专 利申请和网站站点 ) 在此特别引入作为参考。除非另有说明， 否则本发明的实践将采用本 领域众所周知的喷雾干燥和蛋白质配制的常规技术。
等同方案
本领域技术人员将认识到或使用不超过常规试验能够确定对本文描述的本发明 具体实施方案的许多等同方案。此种等同方案预期由下述权利要求包括。本申请自始至终 引用的所有参考文献、 专利和公开的专利申请的内容引入本文作为参考。