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1、(10)申请公布号 CN 103417577 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103417577 A *CN103417577A* (21)申请号 201210162840.9 (22)申请日 2012.05.23 A61K 35/56(2006.01) A61P 19/10(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路 800 号 (72)发明人 秦路平 薛黎明 黄宝康 张巧艳 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 潘诗孟 (54) 发明名称 防治骨质疏松的海洋中药制剂及其制备方法。
2、 (57) 摘要 本发明公开了一种防治骨质疏松的海洋中药 制剂， 由下列重量份的原料药制成 ： 海马 20-100 份 ； 海燕 20-100 份。本发明海洋中药制剂经药效 学研究表明， 能显著改善雌激素缺失骨质疏松大 鼠和老年骨质疏松大鼠骨骼生理状态， 包括提高 骨密度、 改善骨微细结构和提高骨组织的生物力 学等， 同时促进成骨细胞骨形成和抑制破骨细胞 骨吸收能力， 从而具有显著的抗骨质疏松作用。 本 发明还公开了前述防治骨质疏松的中药制剂的制 备方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 。
3、说明书12页 (10)申请公布号 CN 103417577 A CN 103417577 A *CN103417577A* 1/1 页 2 1. 一种防治骨质疏松的海洋中药制剂， 其特征在于， 由下列重量份的原料药制成 ： 海 马 20-100 份 ； 海燕 20-100 份。 2. 根据权利要求 1 所述的防治骨质疏松的海洋中药制剂， 其特征在于， 该中药制剂为 片剂、 胶囊剂或泡腾片剂。 3. 权利要求 1 所述的防治骨质疏松的海洋中药制剂的制备方法， 其特征在于， 包括如 下步骤， 按配比称取海马和海燕， 粉碎， 过 40 目筛， 搅拌均匀 ； 加 10-20 倍重量体积浓度为 20-9。
4、5% 的乙醇提取 1-3 次， 每次 1-2 小时， 过滤， 合并滤液， 减压干燥成固体， 粉碎， 过 60 目 筛 ； 将粉末直接或加入赋形剂制成临床可接受的片剂、 胶囊剂或泡腾片剂。 权 利 要 求 书 CN 103417577 A 2 1/12 页 3 防治骨质疏松的海洋中药制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种防治骨质疏松的海洋中药制剂 ； 此外， 本发明还涉及该中药制剂 的制备方法。 背景技术 0002 骨质疏松是妇女和老年人常见病之一， 是一种以骨量减少， 骨微观结构退化为特 征的一种全身性骨骼疾病， 临床上常表现疼痛、 驼背、 骨折等。 随着世界人口增长和老龄化， 。
5、骨质疏松对人患病率和死亡率不断上升， 给整个社会带来巨大的负担。目前临床治疗骨质 疏松药物多以西药为主， 存在毒副作用大、 价格高等缺点。近 20 年来， 科学家们致力于从海 洋中药开发新药和新产品， 并取得了很好的经济效益和社会效益， 像海带开发出降压药血 海灵， 临床效果很好 ； 珍珠系列 “珍珠片” 、“珍珠胶囊” 等 ；“海参口服液” 等大量的海洋保健 食品。海洋中药资源丰富， 开发潜力很大。 0003 海马收载于 中华人民共和国药典 2010 版 ( 一部 )， 具温肾壮阳、 散结消肿功效。 海燕收载于 中药大辞典 和 中华海洋本草 ， 具祛风湿、 止痛、 补肾， 壮阳， 制酸等功效。
6、。两 药均归肾经， 善补肾阳， 适用于肾阳不足之男子阳萎症。 海马和海燕常出现临床常用温肾补 阳方剂中。据 中国食疗本草新编 、山东中草药手册 和 中医补肾壮阳大全 记载 ： 海马 与海燕等量配伍是民间常用的补肾壮阳经验方。我们经过研究发现， 海马与海燕组方具有 很好的抗骨质疏松作用。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题在于提供一种工艺稳定、 质量可控、 疗效确切、 无毒副 作用的治疗骨质疏松症的海洋中药制剂， 并提供其制备方法。 0005 根据实施例， 本发明防治骨质疏松的海洋中药制剂， 由下列重量份的原料药制成 ： 海马 20-100 份， 海燕 20-100 份。 0006 根。
7、据实施例， 本发明前述防治骨质疏松的中药制剂可做成常规口服制剂， 如片剂、 胶囊剂型和泡腾片剂型。 0007 本发明前述防治骨质疏松的中药制剂的制备包括如下步骤 ： 按重量配比称取海马 和海燕， 粉碎， 过40目筛， 搅拌均匀 ； 加10-20倍重量体积浓度为20-95%的乙醇提取1-3次， 每次 1-2 小时， 过滤， 合并滤液， 减压干燥成固体， 粉碎， 过 60 目筛 ； 将粉末直接或加入赋形 剂制成临床可接受的片剂、 胶囊剂和泡腾片剂。 0008 本发明的中药制剂胶囊剂的制备为 ： 将乙醇提取物粉末加淀粉， 混合均匀， 制成颗 粒 ； 将颗粒干燥， 整粒， 制成胶囊。 0009 本发明。
8、的海洋中药方剂 （以下称海马海燕组方） 经药效学研究表明， 能显著改善雌 激素缺失骨质疏松大鼠和老年骨质疏松大鼠骨骼生理状态， 包括提高骨密度、 改善骨微细 结构和提高骨组织的生物力学等， 同时促进成骨细胞骨形成和抑制破骨细胞骨吸收能力， 从而具有显著的抗骨质疏松作用。因此， 本中药组合具有可开发为抗骨质疏松药物的潜力 说 明 书 CN 103417577 A 3 2/12 页 4 和应用前景。 具体实施方式 0010 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动。
9、或修改， 这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范 围。 0011 实施例 1（制备海马海燕总提取物） 0012 分别称取 0.5kg 海马和海燕粗粉， 用 10 倍量 80% 乙醇浸泡， 70回流提取 3 次， 每 次 2 小时， 得到提取液 ； 将所得到的提取液抽滤， 合并滤液， 减压回收乙醇， 继续浓缩至 60 相对密度 0.8-1.2kg/L， 喷雾干燥， 制成颗粒。 0013 实施例 2（制备海马海燕总提取物） 0014 分别称取 0.5kg 海马和海燕粗粉， 用 20 倍量 50% 乙醇浸泡， 80回流提取 2 次， 每 次 2 小时， 得到提取液 ； 将所得到的提取液抽。
10、滤， 合并滤液， 减压回收乙醇， 继续浓缩至 60 相对密度 0.8-1.2kg/L， 喷雾干燥， 制成颗粒。 0015 实施例 3（制备海马海燕总提取物） 0016 分别称取 0.5kg 海马和海燕粗粉， 用 10 倍量 70% 乙醇浸泡， 超声提取 2 次， 每次 1 小时， 得到提取液 ； 将所得到的提取液抽滤， 合并滤液， 减压回收乙醇， 继续浓缩至 60相 对密度 0.8-1.2kg/L， 喷雾干燥， 制成颗粒。 0017 实施例 4（制备胶囊） 0018 准确称取各原料重量如下 ： 海马 500g 和海燕 500g， 按实施例 1、 2 或 3 的制备方法 制备得到海马、 海燕的乙。
11、醇提取物干燥颗粒 ； 加入赋形剂淀粉后， 再将其制成胶囊1000粒。 0019 实施例 5（制备胶囊） 0020 准确称取各原料重量如下 ： 海马 500g 和海燕 500g， 按实施例 1、 2 或 3 的制备方法 制备得到海马、 海燕的乙醇提取物干燥颗粒 ； 加入赋形剂羟基纤维素钠后， 再将其制成胶囊 1000 粒。 0021 以下通过药理实验具体说明本中药组方防治骨质疏松的药效。 0022 实验例 1（海马海燕组方对成骨细胞骨形成的影响） 0023 成骨细胞是负责骨形成的细胞， 对骨组织的生长发育、 骨代谢平衡、 骨量维持和损 伤修复起关键作用。成骨细胞富含碱性磷酸酶 （alkaline。
12、 phosphatase， ALP） ， 并最终可以 矿化形成骨结节， 这为成骨细胞的两个典型特征表型， 一般作为成骨细胞活性指标。 本实验 参照刘祖德的方法培养新生颅盖骨成骨细胞， 考察对 0.5,1.0,2.0， 4.0mg/kg 海马海燕组 方对第三代成骨细胞增殖、 ALP 活性和骨结节形成数目的影响。 0024 1. 实验材料 0025 1.1 药材与试剂 0026 动物 ： 新生 1-2 天的同窝 SD 大鼠 5 只， 雌雄不限， 体重 7-8g， 由第二军医大学实验 动物中心提供 ； 0027 药材 ： 海马海燕组方 ： 按实施例 5 和实施例 4 制备得到， 100 ( 按生药计。
13、 )， 使用 时以蒸馏水溶解稀释 ； 型胶原酶、 特级胎牛血清、 胰蛋白酶、 -MEM 培养基为美国 Gibco 说 明 书 CN 103417577 A 4 3/12 页 5 公司产品 ； 地塞米松购自美国 Sigma 公司。 0028 2. 实验方法 0029 2.1 新生大鼠颅盖骨成骨细胞的培养 0030 取新生 2-3 天的 SD 大鼠 5 只， 置于 75% 的乙醇浸泡 5min 处死， 在无菌条件下取 其颅顶盖骨， 去除骨膜、 血管及结缔组织， 用 D-Hanks 液冲洗 3 次 ； 将骨片剪碎 ( 约 l mml mm)， 转移至灭菌的培养皿中， 0.25%的胰蛋白酶37消化30。
14、min， 弃去上清液， D-Hanks液冲 洗 2 次， 再用 0.05% 胰蛋白酶及 3mg/ml 的 II 型胶原酶 37消化 1h， 收集上清液， 经 140 目 尼龙网过滤， 再用 -MEM 培养液冲洗消化的骨残集， 收集冲洗液， 并与消化液混合转入离 心管， 1000rpm 离心 10min， 弃上清， 收集细胞， 即为新鲜的成骨细胞， 加入 5ml 含 10% 胎牛血 清的 -MEM 培养基， 接种于培养瓶中， 置 37， 5%CO2培养箱中培养。24h 后换液。以后每 3 天换一次培养基。 0031 2.2 成骨细胞增殖能力的测定 0032 将第四代大鼠颅盖骨成骨细胞， 消化分离。
15、出来， 以 -MEM 培养基配制成浓度为 2104/ml的细胞悬液， 以100l/孔接种于96孔培养板， 置于375%CO2培养箱培养。 24h 后， 换含有药物的培养基， 在检测前 4h 时， 每孔加入 20l 用 PBS 缓冲液配制的 5mg/ml 的 MTT 溶液， 放入培养箱中继续孵育 4h， 取出培养板， 弃去上清液， 每孔加入 150l 二甲亚砜 （DMSO） ， 震荡 5-10 分钟， 使形成的甲臜颗粒完全溶解， DMSO 的颜色变成紫色， 于 570nm 处检 测 OD 值。 0033 2.3 成骨细胞 ALP 活性的测定 0034 将第四代大鼠颅盖骨成骨细胞， 消化分离出来，。
16、 以 -MEM 培养基配制成浓度为 2104/ml的细胞悬液， 以100l/孔接种于96孔培养板， 置于375%CO2培养箱培养。 24h 后， 换含有药物的培养基， 加药培养至第 6 天时， 弃去培养液， 加入 PBS 震荡冲洗细胞 3 次。 弃掉 PBS 后， 加 100l 50mmol/L 的二乙醇胺， 50l 2.5mmol/L 的对硝基苯酚磷酸二钠， 37反应30分钟后， 再用0.3mol/L的NaOH终止反应， 于波长405nm处测得吸光度值。 以不 同浓度的对硝基苯酚溶液在405nm处的OD值作标准曲线。 每孔释放的对硝基苯酚的mol 数表示 ALP 的活性。 0035 2.4 。
17、成骨细胞骨结节诱导 0036 成骨细胞第三代细胞， 按每孔 5104的细胞数接种于 24 孔板内， 用含 10% 胎牛血 清的 -MEM 培养基培养 24h， 换含 0.1%BSA 的新鲜培养基， 使细胞适应， 12h 后换骨结节含 药的诱导培养基 （0.1%BSA， 10nM 地塞米松， 10mM- 甘油磷酸钠和 50g/ml 抗坏血酸以及 10%胎牛血清的-MEM培养基） ， 之后每三天换药一次， 连续培养观察14天后即可进行以下 染色。染色前， 用预冷的 10% 中性甲醛缓冲液中固定 10min， PBS 冲洗 3 次。加入 0.1% 茜素 红 -Tris-Hcl 染液 (pH8.3),。
18、37下染色 30min。蒸馏水冲洗 , 干燥 , 封片。倒置相差显微 镜 200 倍下进行观察并拍照， 随机选 20 个视野， 用 image-Pro Plus(IPP 6.0) 分析图片， 得 出每张图片骨结节数目。 0037 3. 实验结果 0038 以新生大鼠颅盖骨成骨细胞为模型， 考察了海马海燕组方 ( 相当于原药材 0.5， 1， 2， 4mg/mL)对成骨细胞增殖、 碱性磷酸酶(ALP)活性和骨结节生成数目的影响， 如表1所示。 表 1 结果显示药物作用于成骨细胞 24h 后， 0.5mg/mL 和 1mg/mL 药物组显著促进 OB 增殖 (P 说 明 书 CN 10341757。
19、7 A 5 4/12 页 6 0.01)。0.5-2mg/mL 药物浓度干预 48h 后， 均表现出显著的促进细胞增殖作用。药物干 预48h后， 0.5mg/mL对ALP的刺激 作用最为显著， 在0.5-2mg/mL范围内均可显著的提高碱 性磷酸酶 (ALP) 的活性 (P 0.05)， 4mg/mL 呈现抑制 ALP 活性的趋势。0.5-4mg/mL 干预后 能显著提高骨钙结节数目 (P 0.05)。 0039 表 1. 海马海燕组方对新生大鼠颅盖骨成骨细胞的影响 0040 （n=10， ） 0041 0042 *P 0.05,*P 0.01vs Control 0043 实验例 2（海马海。
20、燕组方对破骨细胞骨吸收的影响） 0044 破骨细胞表达丰富的胞浆内酶系统， 在破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞分化的 过程中有一系列的标志性蛋白质产生， 可以作为破骨细胞的识别及其分化阶段的标志。其 中， 分化后的破骨细胞前体细胞所表达的抗酒石酸酸性磷酸酶 （tartrate-resistant acid phosphatase， TRAP） 被认为是破骨细胞的标志酶。本实验采用骨髓细胞与成骨细胞共培养 诱导破骨细胞模型， 考察对海马海燕组方对破骨细胞分化， TRAP 活性的影响。 0045 1. 实验材料 0046 1.1 药材与试剂 0047 动物 ： 新生 1-2 天的同窝 SD 大鼠 5。
21、 只， 雌雄不限， 体重 7-8g， 由第二军医大学实验 动物中心提供 ； 0048 药材 ： 海马海燕组方 ： 按实施例 5 和实施例 4 制备得到， 100 ( 按生药计 )， 使用 时以蒸馏水溶解稀释 ； 1,25- 双羟基维生素 D3（1,25-(OH)2Vitamin D3） 、 地 塞米松、 购自美 国 Sigma 公司。 0049 2. 实验方法 0050 2.1 新生大鼠颅盖骨成骨细胞的培养 （实验例 1， 2.1） 0051 2.2 骨髓源性破骨细胞的诱导分化 0052 选取新生 3d 的 SD 大鼠 5 只， 脱颈椎处死， 75% 的乙醇浸泡 5min， 在无菌条件下分 离。
22、胫骨， 用 5mL 含 10-8mol/L 1,25-(OH)2-VD3、 10-7mol/L 地塞米松及 10% 胎牛血清的 -MEM 培养基冲洗骨髓腔， 将骨髓内的细胞冲出， 用 PBS 缓冲液洗细胞 2 次， 即得新鲜的骨髓细胞 23,24。 0053 将 第 4 代 成 骨 细 胞 和 新 鲜 收 集 的 骨 髓 细 胞 共 同 悬 浮 于 含 10-8mol/L 的 1,25-(OH)2-VD3、 10-7mol/L 地塞米松和 10% 胎牛血清的 -MEM 含药培养基中， 使成骨细胞 说 明 书 CN 103417577 A 6 5/12 页 7 的浓度为1105细胞/mL， 骨髓。
23、单核细胞为1106细胞/mL， 将细胞悬液接种于预先放置灭 菌的玻片或骨片的96孔培养板中， 每孔100， 于37， 5%CO2培养箱中培养， 之后每3天 换液一次， 8 天后， 破骨细胞分化成熟。对成熟细胞数目计数 （细胞核数目 3） 。 0054 2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶活性 0055 将 第 4 代 成 骨 细 胞 和 新 鲜 收 集 的 骨 髓 细 胞 共 同 悬 浮 于 含 10-8mol/L 的 1,25-(OH)2-VD3、 10-7mol/L 地塞米松和 10% 胎牛血清的 -MEM 培养基中， 使成骨细胞的浓 度为 1105细胞 /ml， 骨髓单核细胞为 1106细胞 /m。
24、l， 接种于 96 孔板内， 每孔 100l， 于 37， 5%CO2培养箱中培养， 24h 后换新鲜的破骨细胞诱导培养基， 以后每 3 天换液一次， 培 养8天后破骨细胞分化成熟， 换加含药物培养基， 培养48h后测定TRAP的活性 ： 弃上清， PBS 冲洗 2 次， 20 0.1%Triton X-100 室温破碎细胞 15min， 加入 100l 反应液 （0.4g 对硝 基苯基磷酸二钠， 去离子水溶解后加入 2.0g 酒石酸钾钠， 加水溶解至 150ml， HCl 调节 pH 至 3.5， 再加水定容至200ml） ， 于37反应30min， 迅速加入100l 1mol/L的NaOH。
25、终止反应， 于波长 405nm 处测定其 OD 值。 0056 3. 实验结果 0057 本实验采用骨髓细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞模型， 考察对海马海燕组方 原料 ( 相当于原药材 0.5， 1， 2， 4mg/mL) 对破骨细胞分化和 TRAP 活性的作用， 如表 2 所示。 表2的结果显示0.5-4mg/mL药物干预后破骨细胞分化数目受到明显的抑制(P0.05)， 且 呈现明显剂量依赖性。骨髓细胞经诱导培养 8 天后发育为成熟的破骨细胞， 经 1-4mg/mL 的 药物作用 48h 后， 抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 活性被明显抑制 (P 0.05)。 0058 表 2. 海马海。
26、燕组方对骨髓源性破骨细胞的影响 0059 （n=10， ） 0060 0061 *P 0.05,*P 0.01,*P 0.001vs Control 0062 实验例 3（海马海燕组方对去卵巢骨质疏松大鼠的影响） 0063 1. 实验材料 0064 动 物 ： SD 大 鼠 由 上 海 斯 莱 克 实 验 动 物 有 限 公 司 提 供。 许 可 证 号 ： SCXK( 沪 )2007-0005 ； 动物分笼饲养于空调温室内， 温度 211 C， 湿度 50 60% ； 用颗粒 饲料喂养， 自由饮水。 0065 药材及试剂 ： 尼尔雌醇， 上海华联制药有限公司 （批号 ： 960301） ； 。
27、药材 ： 海马海燕 组方 ： 按实施例 5 和实施例 4 制备得到， 100 ( 按生药计 )， 使用时以蒸馏水溶解稀释。 说 明 书 CN 103417577 A 7 6/12 页 8 0066 2. 实验方法 0067 动物分组 ： 将雌性 SD 大鼠 60 只 （180-220g） ， 按体重随机分为 6 组， 每组 10 只， 一 组作为给生理盐水的假手术组 (SHAM,10ml/kg)， 其它 5 组大鼠进行卵巢切除手术， 为骨质 疏松模型组 (OVX, 给生理盐水 10ml/kg)， 尼尔雌醇阳性对照组 (Nyl,1mg/kg/w) 和海马海 燕组方 (0.5g/kg/d、 1.0。
28、g/kg/d、 2.0g/kg/d)3 个剂量组。后恢复 5 天后， 连续灌胃给药 3 个 月。 0068 造模方法 ： 各组大鼠用 10% 水合氯醛 350mg/kg 腹腔注射麻醉， 在腹部切开 1.5cm 大小的切口， 分离腹部肌肉， 暴漏腹膜， 剪开腹膜后取出双侧卵巢。假手术组切开腹部后将 不做任何处理， 缝合创口， 消毒 ； 手术组将双侧卵巢结扎后切除， 缝合创口， 消毒。 0069 观察指标 ： 0070 （1） 体重 ： 每周称量大鼠一次体重。 0071 （2） 脏器系数 ： 大鼠处死后， 迅速剥离其心、 肝、 脾、 肺、 肾和子宫的附属组织及脂 肪， 随即进行称重。脏器系数公式 。
29、： 脏器系数 = 脏器重量 (mg)/ 体重 (g) 0072 （3） 血钙、 血磷、 血清雌二醇及碱性磷酸酶 0073 眼眶取血， 置于抗凝剂肝素钠管中， 以 3000 转离心 10 分钟， 分离血清， 冻 于 -80 C 备用。依据试剂盒方法检测。 0074 （4） 骨密度 0075 大鼠处死后， 剥离左侧股骨， 剔除骨周围附属组织， 用生理盐水擦洗干净， 用锡箔 纸包好， -80 C 冻存， 用于检测骨密度。 0076 （5） 骨组织形态计量学 0077 取胫骨近心端， 沿胫骨粗隆行额状面切开暴露骨髓腔 , 置于 10% 的磷酸福尔马林 缓冲液中固定 24h, 乙醇逐级脱水 , 二甲苯脱。
30、脂， 用甲基丙烯酸甲酯进行不脱钙骨包埋。 4m 切片经 Goldner s Trichrome 染色， 考察骨组织形态计量 学静态参数 . 0078 （6） 骨力学指标 0079 大鼠处死后， 剥离右侧股骨， 剔除骨周围附属组织， 用生理盐水擦洗干净， 用于三 点力学弯曲实验检测。将股骨置于 WD-1 型电子万能实验机作三点弯曲力学实验， 跨距 25mm， 加载速度 2mm/min, 记录载荷 - 变形曲线。从曲线上计算最大载荷、 最大桡度、 抗弯刚 度、 能量吸收。 0080 3. 实验结果 0081 3.1 对体重和脏器系数的影响 0082 表 3. 海马海燕组方对去卵巢大鼠体重变化的影响。
31、 0083 说 明 书 CN 103417577 A 8 7/12 页 9 0084 P0.01vs.sham group;*P0.05,*P0.01vs.OVX group. 0085 如表 3 所示， 去卵巢模型组大鼠体重增加值明显高于 Sham 组， 阳性药尼尔雌醇组 与空白组接近， 显著改善去卵巢模型组增加的体重重量， 海马海燕组方的体重增加量与模 型组相比较无显著性差异。 0086 表 4. 海马海燕组方对去卵巢大鼠主要脏器系数的影响 0087 0088 P0.01vs.sham group;*P0.05,*P0.01vs.OVX group. 0089 如表 4 所示， 去卵巢模型。
32、组大鼠各主要脏器系数 （心、 肝、 脾、 肺、 肾） 明显低于 Sham 组， 阳性药尼尔雌醇组能使降低的脏器系数基本恢复到 Sham 组水平， 海马海燕组方组与模 型组相比较主要脏器系数 （心、 肝、 脾、 肺、 肾） 无显著性变化。子宫系数在 NYL 干预下基本恢 复正常水平， 显示了明显的子宫增生副作用， 海马海燕组方没有出现这样的现象。 0090 3.3 对骨密度和骨计量学指标影响 （如表 5-6） 0091 表 5. 海马海燕组方对去卵巢胫骨骨组织静态参数的影响 0092 说 明 书 CN 103417577 A 9 8/12 页 10 0093 P0.01vs.sham group。
33、;*P0.05,*P0.01vs.OVX group. 0094 表5和6的结果显示， 相对于去卵巢模型组(OVX)， 海马海燕组方高、 中剂量组大鼠 骨密度显著升高 (P 0.05) ； 高剂量组骨小梁面积显著增大、 骨小梁厚度增大、 骨小梁数目 减少 (P 0.05)、 骨矿化率显著降低 (P 0.05) 及破骨细胞数目显著减少 (P 0.05) ； 中 剂量骨小梁面积、 骨小梁数目、 骨矿化率较 OVX 组有显著的恢复作用 (P 0.05)。 0095 表 6. 海马海燕组方对去卵巢胫骨骨组织动态参数的影响 0096 0097 P0.01vs.sham group;*P0.05,P0.0。
34、1vs.OVX group.%Label ： ( 股骨标记 周长百分数 ) 0098 3.3 对骨力学指标的影响 （如表 7） 0099 表 7. 海马海燕组方对老年性骨质疏松大鼠骨力学参数的影响 0100 说 明 书 CN 103417577 A 10 9/12 页 11 0101 P0.01vs.sham group;*P0.05,*P0.01vs.OVX group. 0102 表 7 结果显示 ： 高剂量组能促进股骨最大载荷能力、 屈服载荷能力和刚度的显著 增高 (P 0.05)。中剂量能促进最大载荷能力和刚度。 0103 3.3 对血清生化指标的影响 （如表 8） 0104 表 8.。
35、 海马海燕组方对去卵巢胫骨骨组织动态参数的影响 0105 0106 P0.01vs.sham group;*P0.05, P0.01vs.OVX group. 0107 表 8 结果显示， 海马海燕组方三个剂量组中血清钙 (Ca) 和磷 (P) 水平与 OVX 组比 较无显著差异。三个剂量组血清雌激素含量显著升高 (P 0.05)， 高剂量组血清碱性磷酸 酶 (ALP) 的含量显著降低 (P 0.05)。 0108 实验例 4（海马海燕组方对地塞米松诱导老年骨质疏松大鼠的影响） 0109 1. 实验材料 （同实验例 3） 0110 购买 11 个月龄 SD 雄性大鼠， 由上海斯莱克实验动物有限。
36、公司提供。许可证号 ： SCXK( 沪 )2007-0005 ； 0111 2. 实验方法 0112 分组 ： 将 SD 大鼠 60 只 （11 月龄） ， 按体重随机分为 6 组， 分组同 （实验例 3， 2.1） 模 型组为地塞米松诱导骨质疏松模型。 0113 造模方法 ： 除正常组外， 其余各组均给予地塞米松磷酸钠注射液， 后肢臀部肌肉注 射， 剂量为 2.5m g/kg， 每周 2 次， 连续 9 周。各组大鼠每周称重 1 次， 根据体质量变化调整 说 明 书 CN 103417577 A 11 10/12 页 12 地塞米松给药剂量。 0114 观察指标 ： 0115 （1） 骨密度。
37、 （同实验例 3） 0116 （2） 骨组织形态计量学 （同实验例 3） 0117 （3） 骨力学强度 （同实验例 3） 0118 （4） 血钙、 血磷、 血清雌二醇及碱性磷酸酶 （同实验例 3） 0119 3. 实验结果 0120 3.1 对骨密度和骨计量学指标的影响 （如表 9-10） 0121 表 9. 海马海燕组方对老年性骨质疏松大鼠静态参数的影响 0122 0123 P0.01vs.sham group;*P0.05,*P0.01vs.OVX group. 0124 表 10. 药物对老年性骨质疏松大鼠胫骨骨组织动态参数的影响 0125 0126 P0.01vs.sham group。
38、;*P0.05,P0.01vs.OVX group.%Label ： ( 股骨标记 周长百分数 ) 0127 表 9 和表 10 显示， 高剂量组能显著抑制老龄大鼠骨密度的降低。相对于模型组， 高、 中剂量组促使骨小梁面积显著增大 (P 0.05)、 骨小梁数目显著增多 (P 0.05)， 骨小 梁厚度增大， 骨小梁间距缩短。 高剂量组能显著降低大鼠骨矿化率(P0.05)， 显著减少骨 股骨破骨细胞数目 (P 0.05)， 显著降低股骨标记周长百分数 (%Label)(P 0.01) 0128 3.2 对骨力学指标的影响 （如表 11） 说 明 书 CN 103417577 A 12 11/1。
39、2 页 13 0129 表 11. 药物对老年性骨质疏松大鼠骨力学参数的影响 0130 0131 P0.01vs.sham group;*P0.05,*P0.01vs.OVX group. 0132 表 11 结果显示 ： 高、 中剂量组能促进股骨最大载荷能力、 屈服载荷能力和刚度的 显著增高 (P 0.05)。 0133 3.3 对血清生化指标的影响 （如表 12） 0134 表 12. 药物对去卵巢大鼠血清生化指标的影响 0135 0136 表12结果显示， 海马海燕组方三个剂量组中血清钙(Ca)和磷(P)水平与OVX组比 较无显著差异。高剂量组和中剂量组血清碱性磷酸酶 (ALP) 的含量。
40、显著降低 (P 0.05)， 雌激素含量显著升高 (P 0.05)。 0137 结论 0138 本发明考察了海马海燕组方的骨形成活性 （成骨细胞增殖、 ALP 活性骨结节生成数 量） 和骨吸收活性 （破骨细胞生长数量和 TRAP 活性） ， 结果发现海马海燕组方在体外具有较 好的抗骨质疏松作用。同时， 本发明采用去卵巢大鼠模型和地塞米松诱导两种不同类型骨 质疏松大鼠模型来考察海马海燕组方作用， 结果显示海马海燕组方对雌激素缺失骨质疏松 和老年骨质疏松都有较好的活性。结合实验室前期对海马海燕组方的临床观察， 海马海燕 说 明 书 CN 103417577 A 13 12/12 页 14 组方具有进一步开发为抗骨质疏松药物的潜力和应用前景。 说 明 书 CN 103417577 A 14 。