技术领域
本发明涉及含肽的医药配制品，具体涉及来源于水蛭的提取物制成药物制剂的方 法。
背景技术
宽体金线蛭是水蛭的一种，水蛭是我国长期应用的传统中药之一，最早记载于《神 农本草经》，功能破血逐瘀。水蛭品种繁多，全世界约有400-500种，我国已发现89种 [1]。《中国药典》收载水蛭为水蛭科动物蚂蟥(WhitmaniapigraWhitman)、水蛭(Hirudo nipponicaWhitman)或柳叶蚂蟥(WhitmaniaacranulataWhitman)的干燥体。其中 宽体金线蛭又称蚂蟥，是目前临床上使用最多的水蛭品种，占总量的95％。
水蛭的临床应用方式一直以来都是口服给药为主，可以单方或复方使用，目前市售的含 有水蛭的制剂如通心络胶囊、活血通脉胶囊、逐瘀通脉胶囊、步长脑心通，多是直接将水蛭 原药材粉碎或煎煮后后制备成各种剂型，由于水蛭中的有效成份多为蛋白质、多肽类成分， 难以避免水蛭有效成分被直接破坏或被胃肠道消化酶等降解。不能有效的保障其发挥最佳的 疗效。
国内对于水蛭(科)的研究较多，主要涉及临床应用，抗凝作用，提取、纯化方法，活 性物质组成等方面，多项研究结果证明宽体金线蛭的活性成分与其它水蛭不同，其基本不含 水蛭素，含有相对稳定的多肽类抗凝物；刘文伟等[3]比较了蚂蟥和日本医蛭经不同提取工 艺处理后的抗凝血酶活性，结果发现无论采用何种提取工艺，蚂蟥提取液基本无抗凝血酶活 性；而日本医蛭提取液可抑制凝血酶，煎煮或炮制后活性明显降低。欧兴长等[4]比较了不同 提取方法对菲牛蛭、日本医蛭、天然蚂蟥和人工饲养蚂蟥的抗凝影响，也证明蚂蟥提取液几 乎无抑制凝血酶活性，而日本医蛭和菲牛蛭活性较高，但受热后活性急剧下降。覃树先[5] 比较了冷提、温浸和炮制三种提取工艺对日本医蛭和蚂蟥干体抗凝血酶作用的影响，所得数 据与欧兴长等人的结果一致。吴志军等[6]采用抗凝血酶、抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶3种检测 方法，测定蚂蟥、日本医蛭、欧洲医蛭、菲牛蛭样品的生物活性。结果显示：菲牛蛭的抗凝 血酶活性相当于日本医蛭，而蚂蟥几乎无抗凝血酶活性；我们研究的结果页显示：宽体金线 蛭高中低剂量组均能抑制由角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓形成、抑制由胶原蛋白-肾上腺素 诱导的小鼠偏瘫和死亡、能延长小鼠的凝血时间、能延长小鼠的出血时间。而提取物经胃蛋 白酶和胰蛋白酶水解后，以上活性均消失或明显减弱。
已有的研究结果均表明：菲牛蛭及日本医蛭都含有凝血酶，通过凝血酶发挥作用，但是 凝血酶很不稳定，非常容易降解，无论采用何种制剂手段，都难以制成可口服的稳定制剂； 而宽体金线蛭的活性成分不是凝血酶，其成分虽然是蛋白或多肽(已实验证明)，但是相对 稳定，在提取、制剂过程中可保持基本不会破坏，但是如果采用目前最常规的口服给药方式， 存在易被破坏及吸收困难以等弊端，结肠部位的蛋白水解酶浓度远低于其它肠段，且药物在 此处滞留时间长，结肠壁对大分子穿透的阻力小，有利于药物的吸收，现在很多研究都将多 肽的口服制剂制成结肠给药制剂，结合吸收促进剂等附加剂的使用可适当提高这类药物的稳 定性及生物利用度，但是由于结肠没有绒毛及多肽的肠穿透力较弱导致其吸收仍然较慢。
对于水蛭的口服制剂有些研究报道及专利被公开或授权；如汤沛需等人做了重组水蛙素 口服乳糜微粒的研究；专利CN101584859A公开了一种水蛙素微球制剂及其制备方法，用于口 服给药；专利CN1393266A公开了一种水蛭素缓(控)释制剂的制备方法，目标是维持给药后水 蛭素有效血药浓度，克服其半衰期短的缺点；专利CN1428173A授权了一种重组水蛭素肠溶缓 释制剂的方法，为加入稳定保护剂和胃肠蛋自酶抑制剂的一种肠溶缓释口服制剂；专利 CN01810561A公开了一种水蛭素的聚离子胶束组合物的制备方法；专利CN102362874B授权了 一种水蛭结肠靶向口服制剂及其制备方法。以上的文献及专利主要都是天然或重组水蛭素设 计的，以解决水蛭素口服吸收少，利用度低的问题，但是水蛭素非常不稳定，很难解决其制 剂过程、保存及口服后的稳定性，即使设计了结肠给药，也忽视了结肠吸收较慢、溶出的药 物长时间在结肠中仍会被酶及微生物降解的问题，不能很好地解决水蛭素口服吸收的问题， 且以上专利中选用的pH敏感型结肠释药系统，由于结肠的pH与小肠差异较小，也存在提前 或进入结肠长时间不能溶解而释药的问题；以上专利申请中，有些提及可用水蛭提取物，但 是含水蛭素的医蛭类与不含水蛭素的宽体金线蛭活性成分是完全不同的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是公开一种宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备方法，该方法 所得到的缓释微丸具有生物利用度高的优点。
一种宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)取宽体金线蛭提取物，分别加入宽体金线蛭提取物重量2-10倍的骨架材料、0.1-1 倍的致孔剂、0.05-0.5倍的粘合剂和0.01-0.1倍的口服吸收促进剂，混合均匀后用蒸馏水 润湿制备软材，再经挤出、滚圆、干燥和过24-40目筛的工艺，即得载药微丸；其中，所述 的骨架材料为微晶纤维素和淀粉中一种，或二者的混合物；所述的致孔剂为乳糖、聚乙二醇 或氯化钠；所述的粘合剂为羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；所述的口服吸收促进剂为 SANC或十二烷基硫酸钠；
b)在包衣锅或流化床中，分别加入所述载药微丸重量0.1-0.5倍的溶胀材料和0.01-0.1 倍的粘合剂，用蒸馏水溶解并混匀，然后，往包衣锅或流化床中加入所述的载药微丸，在 25℃-45℃下喷雾包裹溶胀衣膜；其中，所述的溶胀材料为交联聚乙烯吡咯烷酮或低取代羟丙 级纤维素，所述的包衣粘合剂为聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素；
c)按步骤b)所得包衣溶胀衣膜的载药微丸的重量以控释材料中的固含量计取0.033-0.5倍的控释材料,置于包衣锅或流化床中，加入控释材料重量的0.02-0.2倍的增塑剂和控释材料重量的0.01-0.5倍的抗粘剂，用蒸馏水溶解，混合均匀。然后，往包衣锅或流化床中加入步骤b)所得包裹溶胀衣膜的载药微丸，在25℃-45℃下进行喷雾包裹控释衣膜；其中，所述的控释材料是30D、或乙基纤维素中的一种，或者是和的混合物，或者是和的混合物；当所述的控释材料是和的混合物时，与的重量比＝5:1-50:1；当所述的控释材料是和的混合物时，与的重量比＝5:1-50:1；所述的增塑剂是聚乙二醇、柠檬酸三乙酯或癸二酸二丁酯；所述的抗粘剂是单硬脂酸甘油酯或滑石粉；
d)按步骤c)所得包衣溶胀衣膜的载药微丸的重量以肠溶材料中的固含量计取0.033-0.5倍的肠溶释材料，置于包衣锅或流化床中，加入肠溶材料重量0.02-0.2倍的增塑剂和0.01-0.5倍的抗粘剂，用蒸馏水溶解，混合均匀。然后，往包衣锅或流化床中加入步骤c)所得包衣控释衣膜的载药微丸，在25℃-45℃下进行喷雾包裹肠溶衣膜；其中，所述的肠溶材料为邻苯二甲酸醋酸纤维素或羟丙基甲基纤维素酞酸酯；所述的增塑剂为聚乙二醇或柠檬酸三乙酯；所述的抗粘剂为单硬脂酸甘油酯或滑石粉。
上述方法中所述的宽体金线蛭提取物是宽体金线蛭的水提物，该水提物是按常规的方法 水提或水提醇沉得到。
根据宽体金线蛭活性物为蛋白或多肽，其扩散速度较慢的特点，为了使本方法所得到的 缓释微丸中宽体金线蛭提取物在水或人工肠液中约6小时释放完全，本发明所述方法的步骤 a)将所述的载药微丸制成骨架微丸，同时，加入致孔剂调节微丸中蛋白及多肽释放速度，添 加口服吸收促进剂促进微丸中的药物吸收。
由于本发明所述方法的步骤b)在载药微丸包裹溶胀衣膜，因此药物进入体内后，消化道 液透过控释层进入微丸即被该溶胀材料吸收，不会进一步进入丸芯溶解药物，直至溶胀层吸 收足够水分，体积胀至使控释层破裂，大量水分进入，丸中药物才开始正常释放。
本发明所述方法的步骤c)所述控释衣膜的作用是控制水分进入微丸的速度，同时阻止微 丸中的药物提前释放，在控释层未被溶胀层胀破前，微丸中药物基本不释放出。所述控释衣 膜的另一作用是在肠溶层溶解后，大约4小时被溶胀层涨破，药物开始释放，此时间设计是 基于人体小肠的转运时间。
本发明所述方法的步骤d)所述肠溶衣膜的作用是使微丸口服后，在胃中阻止胃液进入微 丸，委婉到达小肠后溶解，目的是克服胃排空时间个体差异较大带来的微丸释药位置不准确， 保证微丸中药物在小肠末端或结肠前端释药。
综上所述，本发明所述的宽体金线蛭提取物缓释微丸的设计思路是将宽体金线蛭提取物 通过适宜手段，制成在口服后到达小肠末端或结肠后才开始释放药物的制剂，通过多层包衣， 巧妙的避免了宽体金线蛭有效成分被消化酶破坏，同时利用结肠的高通透性提高其中蛋白及 多肽的生物利用度。
附图说明
图1是实施例2微丸在模拟全消化道内的释药曲线。
图2是实施例2微丸在不同pH值介质中的释药曲线。
图3是实施例2中载药丸芯在模拟全消化道内的释药曲线。
图4为实施例3微丸释药曲线。
图5为实施例4微丸释药曲线。
图6为实施例5微丸释药曲线。
图7为实施例6微丸释药曲线。
图8为实施例7微丸释药曲线。
图9为实施例8微丸释药曲线。
图10为实施例9中速释微丸包迟释衣对照在模拟全消化道内的释药曲线。
具体实施方式
实施例1(宽体金线蛭提取物的制备及蛋白得率和凝血时间的检测)
1、生理盐水提取
取宽体金线蛭干品100g，粉碎后加1L生理盐水，于4℃条件下浸渍4h后，置于70℃条 件下搅拌提取1h后滤过，残渣再加500ml生理盐水，继续在70℃条件下搅拌提取1h，合并 两次提取液，真空干燥。
2、蒸馏水提取
取宽体金线蛭干品100g，粉碎后加1L蒸馏水，于4℃条件下浸渍4h后，置于70℃条件 下搅拌提取1h后滤过，残渣再加500ml蒸馏水，继续在70℃条件下搅拌提取1h，合并两次 提取液，真空干燥。
3、水提醇沉
取宽体金线蛭干品100g，粉碎后加10倍量蒸馏水，于4℃条件下浸渍4h后，置于70℃ 条件下搅拌提取1h后滤过，残渣再加500ml蒸馏水，继续在70℃条件下搅拌提取1h，合并 两次提取液，50℃真空浓缩至500ml，加乙醇至含醇80％，4℃放置10小时，过滤，取滤渣， 真空干燥。
4、不同提取方法的蛋白得率
取各提取液适量，稀释后制备成供试液，精密移取2ml，分别加入1mlBCA工作液，混合 均匀，置60℃恒温箱内孵育30min，冷却至室温后测定562nm处吸光度，将各吸光度带入标 准曲线，计算蛋白含量，结果见表。
不同提取方法的蛋白得率(x±s，n＝3)
5、不同提取方法提取物对小鼠凝血时间的影响
取18-22g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，按水蛭临床剂量20倍折算 提取物剂量给药，连续给药10天，末次给药后1h后，用内径lmm的玻璃毛细管插入小鼠 内眦球后静脉丛取血，自血液流入管中开始计时。血液注满后取出毛细管平放于桌上，每隔 10s折断两端毛细管，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有凝丝，至凝丝出现时停止计时， 所得时间即为小鼠凝血时间，结果见表。
不同提取方法提取物对小鼠凝血时间的影响(x±s，n＝10)
Comparedwithcontrolgroup,*P＜0.05,**P＜0.01.
实验结果显示：用新鲜或干燥宽体金线蛭加水、生理盐水或低浓度乙醇提取，提取温度在20 ℃～100℃，可采用温浸、搅拌、超声、回流等提取方式，提取液可以采用真空干燥、80％以 上醇沉、冷冻干燥制成浸膏或将提取液浓缩后均可使用。
实施例2
1、宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备
载药丸芯：取实施例1中所述生理盐水提取的宽体金线蛭提取物30g，62g微晶纤维素， 2gHPMCE50，5g乳糖，1g癸酸钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以下条 件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间：5min，微丸在 40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。
溶胀层包衣：取4g聚乙烯吡咯烷酮，16g交联聚乙烯吡咯烷酮，用200ml蒸馏水混合均 匀即为溶胀层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣 温度30℃-35℃。喷液速率1ml/min。
控释层包衣：取3.2g柠檬酸三乙酯、0.09g吐温-80，0.8g单硬脂酸甘油酯加入至48ml蒸馏水中，均质乳化使其分散均匀，临用前加入50g和混匀即得控释层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
肠溶层包衣：取1.75g柠檬酸三乙酯，0.37g吐温-80，0.9g单硬脂酸甘油酯加至37ml蒸馏水中，均质匀化使其分散均匀。临用前加入混合均匀。即得肠溶层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
2、控释效果的研究
依照释放度测定法(《中华人民共和国药典》2010版二部附录XD第二法)，取实验药 品1g，于250ml释放介质中，转速为100rpm，温度为37±0.5℃，释放介质在0-2h，2-6h， 6-14h分别为人工胃液、pH6.8人工肠液、pH7.4人工结肠液，分别于设定的时间点取样3ml， 并补充同温等体积释放介质。用BCA法测定释放介质中的蛋白浓度，计算实验药品的释放度， 结果如图1-3所示。
由图1-3可见，本例制备的宽体金线蛭提取物缓释制剂的中蛋白及多肽在人工胃液中2 小时释放不超过5％，在人工肠液中4小时不超过15％、10小时内释放不少于80％。由于食物 或药物在结肠内滞留时间较长，并在制剂中加入口服吸收促进剂，可保证药物的充分吸收。 从而提高了药物的生物利用度。
实施例3
1、宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备
载药丸芯：取实施例1中所述生理盐水提取的宽体金线蛭提取物30g，62.4g微晶纤维 素，2gHPMCE50，5g乳糖，0.6gSANC用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以下 条件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间：5min，微丸 在40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。
溶胀层包衣：取4g聚乙烯吡咯烷酮，16g交联聚乙烯吡咯烷酮，用200ml蒸馏水混合均 匀即为溶胀层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣 温度30℃-35℃。喷液速率1ml/min。
控释层包衣：取3.2g柠檬酸三乙酯，3.12g滑石粉，加至48ml蒸馏水中，持续搅拌使其分散均匀。将此溶液与聚合物溶液混匀即得控释层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
肠溶层包衣：取1.75g柠檬酸三乙酯，3.48g滑石粉，58g加至37ml蒸馏水中，即得肠溶层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
2、控释效果的研究
采用实施例2同样的方法进行检测，本实施例微丸释药曲线见附图4
实施例4
1、宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备
载药丸芯：取实施例1中所述生理盐水提取的宽体金线蛭提取物30g，62g微晶纤维素， 2gHPMCE50，5g乳糖，1g癸酸钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以下条 件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间：5min，微丸在 40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。
溶胀层包衣：取4g聚乙烯吡咯烷酮，16g交联聚乙烯吡咯烷酮，用200ml蒸馏水混合均 匀即为溶胀层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣 温度30℃-35℃。喷液速率1ml/min。包衣过程中需持续搅拌包衣液。
控释层包衣：取50g3.2g柠檬酸三乙酯，3.12g滑石粉，加至48ml蒸馏水中，持续搅拌使其分散均匀。将此溶液与聚合物溶液混匀即得控释层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
肠溶层包衣：取2.0g柠檬酸三乙酯，5.0g滑石粉，20g加至300ml95％乙醇中，即得肠溶层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
2、控释效果的研究
采用实施例2同样的方法进行检测，本实施例的释药曲线见附图5
实施例5
1、宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备
载药丸芯：取实施例1中所述生理盐水提取的宽体金线蛭提取物30g，62.5g微晶纤维 素，2gHPMCE50，5g乳糖，0.5g十二烷基硫酸钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微 丸机上按以下条件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间： 5min，微丸在40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。
溶胀层包衣：取4g聚乙烯吡咯烷酮，16g交联聚乙烯吡咯烷酮，用200ml蒸馏水混合均 匀即为溶胀层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣 温度30℃-35℃。喷液速率1ml/min。
控释层包衣：取42g6.25g滑石粉，加入46ml蒸馏水中，混匀即得控释层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃。喷液速率0.5ml/min。
肠溶层包衣：取1.75g柠檬酸三乙酯，0.37g吐温-80，0.9g单硬脂酸甘油酯加至37ml蒸馏水中，均质匀化使其分散均匀。临用前加入58g混合均匀。即得肠溶层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
采用实施例2同样的方法进行检测，本实施例的释药曲线见附图6.
实施例6
1、宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备
载药丸芯：取实施例1中所述生理盐水提取的宽体金线蛭提取物30g，62g微晶纤维素， 2gHPMCE50，5g乳糖，1g癸酸钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以下条 件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间：5min，微丸在 40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。
溶胀层包衣：取4g聚乙烯吡咯烷酮，16g低取代羟丙基纤维素，用200ml蒸馏水混合均 匀即为溶胀层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣 温度30℃-35℃。喷液速率1ml/min。
控释层包衣：取50g和2g混匀。另取48ml蒸馏水、3.2g柠檬酸三乙酯、0.09g吐温-80经均质乳化后加入0.8g单硬脂酸甘油酯，继续均质匀化使其分散均匀。将此溶液与聚合物溶液混匀即得控释层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
肠溶层包衣：取1.75g柠檬酸三乙酯，0.37g吐温-80，0.9g单硬脂酸甘油酯加至37ml蒸馏水中，继续均质匀化使其分散均匀。临用前与58g混合均匀。即得肠溶层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
采用实施例2同样的方法进行检测，本实施例的释药曲线见附图7.
实施例7
1、宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备
载药丸芯：取实施例1中所述生理盐水提取的宽体金线蛭提取物30g，62g微晶纤维素， 2gHPMCE50，5g乳糖，1g癸酸钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以下条 件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间：5min，微丸在 40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。
溶胀层包衣：取4g聚乙烯吡咯烷酮，16g低取代羟丙基纤维素，用200ml蒸馏水混合均 匀即为溶胀层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣 温度30℃-35℃。喷液速率1ml/min。
控释层包衣：取22g和1g2.3柠檬酸三乙酯、4.6g滑石粉加入至460ml95％乙醇，均质匀化使其分散均匀。即得控释层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
肠溶层包衣：取1.75g柠檬酸三乙酯，0.37g吐温-80，0.9g单硬脂酸甘油酯加至37ml蒸馏水中，均质匀化使其分散均匀。临用前与58g混合均匀。即得肠溶层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
采用实施例2同样的方法进行检测，本实施例的释药曲线见附图8.
实施例8
1、宽体金线蛭提取物缓释微丸的制备
载药丸芯：取实施例1中所述生理盐水提取的宽体金线蛭提取物30g，62g微晶纤维素， 2gHPMCE50，5g乳糖，1g癸酸钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以下条 件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间：5min，微丸在 40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。
溶胀层包衣：取4g聚乙烯吡咯烷酮，16g低取代羟丙基纤维素，用200ml蒸馏水混合均 匀即为溶胀层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣 温度30℃-35℃。喷液速率1ml/min。
控释层包衣：取60g乙基纤维素水分散体，加至40ml蒸馏水中，混匀后即得控释层包衣 液。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
肠溶层包衣：取3.48g聚乙二醇6000，3.48g滑石粉，58g加至37ml蒸馏水中，即得肠溶层包衣液。包衣液经雾化包覆于载药微丸表面。包衣工艺：喷嘴直径1mm，包衣温度30℃-35℃。喷液速率0.5ml/min。
采用实施例2同样的方法进行检测，本实施例的释药曲线见附图9.
实施例9(抗凝血效果对比实验)
一、试验原理
凝血时间是指血液离体至凝固所需的时间。血液离体后，接触带阴电荷的表面(玻璃器材) 时，XII因子被激活，其后一系列凝血因子相继活化，最后使纤维蛋白原转变为纤维蛋白而 凝血。其时间的长短主要与各种凝血因子的含量和功能有关。测定凝血时间是观察受试品对 凝血作用有无影响而必须进行的第一个试验，然后再考虑进行其他实验。
二、试验材料与方法
1.试验动物
12只新西兰兔，约2-2.5kg，购于广州中医药大学实验动物中心，动物许可证号： SCXK(粤)2008-0002。
2.试验试剂
(1)受试品：实施例2宽体金线蛭提取物缓释微丸；用法：每日1.67g宽体金线蛭迟 释微丸(相当于1g宽体金线蛭干粉)，分两次给药。
(2)普通制剂对照品：未包衣宽体金线蛭微丸，取30g水蛭提取物，62g微晶纤维素， 2gHPMCE50，5g乳糖，1g癸酸钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以 下条件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间5min， 微丸在40℃干燥3h。过24-40目筛，即得载药微丸。用法：每日1.14g未包衣宽体金线 蛭微丸(相当于1g宽体金线蛭干粉)，分两次给药。
(3)迟释对照制剂：速释微丸包迟释衣，取30g水蛭提取物，17g微晶纤维素，52g乳糖，1g癸酸 钠，用100ml蒸馏水制成软材，在多功能微丸机上按以下条件制备微丸：挤出速度28rpm，滚圆速度 560rpm，鼓风温度35℃，滚圆时间5min，微丸在40℃干燥3h。过24-40目筛，得载药微丸，按实施 例1中条件分别包溶胀层、控释层及肠溶层。
采用实施例2同样的方法进行检测，速释微丸包迟释衣微丸释药曲线见附图10。
用法：每日1.65g未包衣宽体金线蛭微丸(相当于1g宽体金线蛭干粉)，分两次给药。
(4)阴性对照品：蒸馏水，由RO-DIWaterPurificationSystem(ResearchScientific InstrumentsCo.)制备。
3.试验器材
兔灌胃开口器、药匙、50ml注射器以及20号灌胃针、毛细管、秒表、表面皿、剃毛刀、 10ml注射器针头(绿色)、棉球和酒精棉球。
4.试验方法
4.1分组
将检疫合格的16只新西兰兔随机分为溶剂对照组、普通制剂对照品组、迟释对照制剂组、 受试品组，每组4只动物。
(1)溶剂对照组：灌胃给予50ml蒸馏水；
(2)受试品组：给予临床用量，即64mg/kg(相当于宽体金线蛭干粉38.3mg/kg)，以 兔子平均体重为2.5kg计，给药量为160mg/只，并以50ml蒸馏水送服。人的宽体金线蛭 迟释微丸的给药剂量为1.67g/天(相当于宽体金线蛭干粉1g/天)，根据等效剂量换算得到 新西兰兔的宽体金线蛭迟释微丸的给药剂量为64mg/kg(相当于宽体金线蛭干粉38.3mg/kg/ 天)。
(3)普通制剂对照品组：给予临床用量，即43.7mg/kg(相当于宽体金线蛭干粉38.3 mg/kg)，以兔子平均体重为2.5kg计，给药量为109.2mg/只，并以50ml蒸馏水送服。人 的宽体金线蛭普通微丸的给药剂量为1.14g/人/天(相当于宽体金线蛭干粉1g/人/天)，根 据等效剂量换算得到新西兰兔的未包衣微丸的给药剂量为43.7mg/kg/天(相当于宽体金线 蛭干粉38.3mg/kg/天)。
(4)迟释对照制剂：给予临床用量，即64mg/kg(相当于宽体金线蛭干粉38.3mg/kg)， 以兔子平均体重为2.5kg计，给药量为160mg/只，并以50ml蒸馏水送服。人的宽体金线 蛭迟释微丸的给药剂量为1.67g/天(相当于宽体金线蛭干粉1g/天)，根据等效剂量换算得 到新西兰兔的宽体金线蛭迟释微丸的给药剂量为64mg/kg(相当于宽体金线蛭干粉38.3 mg/kg/天)。
4.2试验步骤
(1)16只兔子禁食(6月16日晚)，给药后放回笼子并喂食
(2)给药
一人坐抱兔子，一人使用开口器使兔子张开嘴巴，另一人灌药以及灌水。
(3)检测凝血时间
在给药前、给药后0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、10h， 耳缘中动脉采血。各时间点在新西兰兔左右耳交替采血，采血点前5min固定兔子。采血前 新西兰兔耳缘中动脉以及动脉周围组织剃毛，酒精棉球反复擦血管使血管充盈，采血时先用 注射器针头扎破血管，再将毛细管放至血管破口处接血，使毛细管迅速被血充盈，血液流至 毛细管开始计时。30s后开始折断一端的毛细管(接血的另一端开始折)，50s后每隔10s 折一次，当一端出现血丝时，折另一端的毛细管，两端均出现血丝的时间即为凝血时间。
5.动物处理
试验结束后空气栓塞法将动物处死，动物尸体移交至广州中医药大学动物中心，由 动物中心将动物尸体送到广州市卫生处理厂进行无害化处理。
三、试验结果
与溶剂对照组比较，受试品组在给药后4、5、6、7、8h处的凝血时间均有显著延长， 抗凝作用可维持4h，给药后6h达到抗凝血作用的最大值；而普通制剂对照组与溶剂对照 组比较，在给药后0.5、1、1.5h凝血时间显著延长，抗凝作用可维持1h，凝血时间在给 药后1.5h达到最大值；迟释制剂组(速释微丸包衣)组给药后5h达到抗凝血作用的最大值， 但持续时间较短，结果见表1。
表1新西兰兔宽体金线蛭微丸单次给药的凝血时间
与溶剂对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。
四、实验结论
宽体金线蛭迟释微丸为宽体金线蛭提取物制备的迟释微丸制剂。本实验对新西兰兔灌胃 给予宽体金线蛭微丸，比较宽体金线蛭迟释微丸与未包衣宽体金线蛭微丸及只延迟释药(开 始释药后快速释放)单次给药抗凝血的时效关系。结果发现：与溶剂对照组比较，受试品(宽 体金线蛭迟释微丸)组给药后4、5、6、7、8h的凝血时间显著延长，抗凝作用可维持4h， 给药后6h达到抗凝血作用的最大值；而普通制剂对照组(未包衣宽体金线蛭微丸)与溶剂 对照组比较，在给药后0.5、1、1.5h凝血时间显著延长，抗凝作用可维持1h，给药后1.5 h达到抗凝血作用的最大值；迟释制剂组(速释微丸包衣)组给药后5h达到抗凝血作用的最 大值，但持续时间较受试品短，抗凝作用可维持2h。结果表明，本实验条件下，受试品比 普通制剂及只延迟释放制剂对照品对新西兰兔的抗凝血作用维持时间显著延长。