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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610163707.3 (22)申请日 2016.03.22 (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92号 (72)发明人 张建珍 何佼 张婷婷 张帅娜 杨喜花 王建斌 (74)专利代理机构 山西五维专利事务所(有限 公司) 14105 代理人 张福增 (51)Int.Cl. A61K 31/711(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 13/10(2006.01) (54)发明名称 BAG3基因在制备抗膀胱癌。
2、药物中的应用 (57)摘要 本发明提供了BAG3基因在制备抗癌药物中 的应用， 特别是BAG3基因在制备抗膀胱癌药物中 的应用。 本发明通过构建BAG3基因的超表达载体 并转染肿瘤细胞， 实验结果表明： 转染后的肿瘤 细胞中BAG3基因的mRNA水平显著上调， 肿瘤细胞 出现形态不规则， 变圆， 贴壁性变差， 细胞活性下 降60.69， 最终出现细胞死亡的现象。 本发明通 过筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因， 为新 药靶的发现及肿瘤药物设计提供依据。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 CN 105769900 A 2016.07.20 CN 105769900 A 1.BAG。
3、3基因在制备抗癌药物中的应用。 2.BAG3基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105769900 A 2 BAG3基因在制备抗膀胱癌药物中的应用 技术领域： 0001 本发明涉及BAG3基因的新用途， 具体是BAG3基因在制备小分子抗癌药物中的应 用， 特别是在制备抗膀胱癌药物中的应用。 背景技术： 0002 BCL2相关的永生基因3(BAG3)是一个74k Da的胞浆蛋白， 它主要位于糙面内质网， 在蛋白交互技术中已被确定为一个BCL2相关蛋白。 有一个约110-124个氨基酸左右的保守 结构域， 它可以与热休克蛋白70(HSP70)上的ATP酶结构。
4、域结合； 同时， 它也可以与包括 BCL2、 类固醇激素受体、 Raf1等结合。 在人类中， BAG家族包括6个成员， BAG1、 BAG2、 BAG3、 BAG4、 BAG5、 BAG6。 BAG3， 也称CAIR-1或Bis， 可以通过一个BAG结构域结合不同的配体， 包括 WW结构域和脯氨酸重复。 作为一个多元化蛋白， BAG3参与调控许多生物学过程并以不同方 式影响肿瘤的发展过程。 0003 BAG3的表达与人类癌细胞的生存、 凋亡、 能动性和附着力血管生成和上皮间质转 化这些过程相关。 BAG3在多种细胞类型中均能被唤起， 它在细胞受到压力的状态下能开启 一种保护机制。 正常细胞中B。
5、AG3的表达量较低， 而在许多肿瘤细胞中， 包括白血病、 淋巴瘤、 骨髓瘤、 黑色素瘤、 胶质母细胞瘤、 胰腺癌和卵巢肿瘤中， BAG3的表达量增加。 BAG3影响肿瘤 细胞的附着力， 迁移和入侵， 进而影响有机体内恶性肿瘤的发生和转移， 但BAG3在膀胱癌中 的表达和作用未有报道。 0004 我们将BAG3在膀胱癌细胞中过表达后， 能引起膀胱癌细胞形态发生改变， 本发明 旨在通过研究BAG3对膀胱癌T24细胞的影响， 发现BAG3在膀胱癌细胞中的作用， 通过过表达 实验， 发现在形态上细胞出现变圆， 形态开始不规则， 贴壁性变差， 进而出现死亡的现象， 因 此对于BAG3基因的深入研究能为膀。
6、胱癌的治疗提供理论依据。 发明内容： 0005 本发明旨在提供BAG3基因的一种新用途。 0006 本发明提供BAG3基因在制备抗癌药物中的应用， 特别是BAG3基因在制备抗膀胱癌 药物中的应用。 BAG3基因的核苷酸序列为SEQ ID NO： 1。 0007 本发明通过构建BAG3基因的超表达载体， 然后转染肿瘤细胞后检测细胞活性及该 基因mRNA表达量， 结果表明： 转染后膀胱癌T24细胞中BAG3基因的mRNA显著上调， 肿瘤细胞 出现变圆， 贴壁性变差， 细胞活性显著降低， 最终出现死亡的现象。 0008 本发明筛选并验证了BAG3基因具有抑制膀胱癌细胞生长的功能， 可以作为膀胱癌 治。
7、疗的新靶标基因， 为基于靶标基因设计小分子药物提供了依据。 附图说明： 0009 图1： pcDNA3.1-BAG3载体图谱 0010 图2： 基因BAG3的PCR结果， 图中： 1、 marker； 2、 基因BAG3的PCR产物 说 明 书 1/4 页 3 CN 105769900 A 3 0011 图3： Hind和BamHI酶切鉴定重组载体pcDNA3.1-BAG3， 图中： 1、 marker； 2、 重组质 粒pcDNA3.1-BAG3； 3、 酶切后的重组载体pcDNA3.1-BAG3 0012 图4： BAG3超表达后mRNA水平表达量变化， 图中： pcDNA3.1为空载体；。
8、 pcDNA3.1- BAG3为带有BAG3基因的超表达载体 0013 图5： BAG3超表达后MTT检测细胞活性变化， 图中： PC3.1为空载体； PC3.1-BAG3为带 有BAG3基因的超表达载体 0014 图6： 超表达BAG3后T24细胞形态变化： A重组质粒pcDNA3.1-BAG3转染到T24细胞 24h后细胞形态； B重组质粒pcDNA3.1-BAG3转染到T24细胞48h后细胞形态 具体实施方式： 0015 实施例1： BAG3基因过表达致死膀胱癌细胞实验 0016 一、 重组表达载体的构建 0017 1、 PCR产物的制备 0018 以生理盐水处理的T24细胞cDNA为模。
9、板， 基于BAG3基因的全长cDNA序列(Gene ID： 9531)设计用带有酶切位点HindIII、 BamHI的表达引物进行PCR扩增。 反应条件为： 94预变 性2min， 98变性10s， 55退火30s， 68延伸2min， 共35个循环， 68保温5min， 引物序列 见表1。 PCR产物回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。 0019 表1 BAG3基因表达引物 0020 0021 2、 目的基因全长验证 0022 将PCR获得的目的基因连接到Zero Vector上， 送往华大公司进行测序。 经测序发 现BAG3基因成功连接到Zer。
10、o载体上。 0023 3、 PCR产物及表达载体的双酶切反应 0024 选取测序成功的质粒， 分别在在0 .2ulEP管中对BAG3基因片段和载体骨架 pcDNA3.1进行双酶切， 反应体系参照Hind III、 BamH I说明书(NEB)进行。 0025 4、 胶回收酶切产物 0026 将上述双酶切产物用1的琼脂糖凝胶电泳进行检测并胶回收， 回收过程严格按 照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。 0027 5、 目的基因BAG3与pcDNA3.1的连接 0028 将含目的基因BAG3的胶回收产物连接到pcDNA3.1上， 在离心管中建立如下反应体 系： 002。
11、9 表2目的基因与载体骨架连接体系 说 明 书 2/4 页 4 CN 105769900 A 4 0030 0031 轻轻混匀， 瞬时离心收集液体于管底， 置于16过夜连接。 0032 二、 重组表达载体的转化 0033 1、 将Trans-1T1感受态细胞置于冰上进行化冻； 0034 2、 在离心管中依次加入100 L感受态细胞核8 L的连接产物， 轻轻混匀， 置于冰上 30min； 0035 3、 42水浴热激60s， 然后快速将管置于冰上， 冰浴5min； 0036 4、 加入300 L不含抗生素的LB液体培养基， 混匀后置于37150rpm振荡培养1h使 细菌复苏； 0037 5、 取。
12、150 L重悬菌液， 均匀涂布于提前放置在37培养箱中氨苄抗性的平板上， 过 夜培养。 0038 三、 重组表达载体的验证 0039 1、 用灭菌的枪头小心挑取白色单菌落， 将枪头置于3mL LB液体培养基(含有0.1 Amp)中， 在37、 200rpm的振荡培养箱中培养12-16h。 0040 2、 采用离心法收集菌液， 采用Omega公司质粒提取试剂盒提取对应的质粒。 操作严 格按照说明书进行。 0041 3.用Hind III和BamHI对所提取质粒进行酶切， 酶切体系和程序按照NEB说明书进 行， 见表3。 反应条件为37， 2h。 之后， 用1的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段， 结果显。
13、示酶 切后切下来的片段长度大概在1700bp左右， 接近目的基因的长度， 将检测到目的片段的对 应质粒送往华大公司进行测序， 结果显示测序成功， BAG3基因成功连接到了表达载体 pcDNA3.1上。 0042 表3重组载体检测的双酶切体系 0043 说 明 书 3/4 页 5 CN 105769900 A 5 0044 四、 重组质粒转染T24细胞 0045 取对数生长期细胞， 重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中， 接种于6孔板中。 实 验分为2组， 对照组： pcDNA3.1空质粒及pEGFP-N1， 实验组： pc DNA3.1-BAG3及pEGFP-N1， 每 组3个重复。 采。
14、用太阳马公司的so-fast转染试剂将构建好的质粒pcDNA3.1-BAG3与pEGFP- N1共转染到T24细胞， 具体操作参照说明书。 0046 五、 Real-time PCR检测转染后BAG3mRNA表达水平 0047 将pcDNA3.1-BAG3与pEGFP-N1共转染到T24细胞48h后， Trizol法提取总RNA， 步骤 按照RNAiso Plus(TaKaRa)说明书进行。 反转录后Real-time PCR检测BAG3mRNA表达水平。 结果显示： 过表达BAG3基因后， 其mRNA表达水平显著升高。 0048 六、 形态学观察 0049 重组质粒转入T24细胞24h及48。
15、h后显微镜(OLYMPUS 1X71)观察细胞形态。 结果显 示： 转染pcDNA3.1-BAG3质粒到T24细胞中后， 发现肿瘤细胞出现形态不规则， 变圆， 贴壁性 变差的现象。 0050 七、 MTT检测转染后细胞活性 0051 转染24h后， 对照组和处理组分别接种于96孔板中。 每组设置3个复孔， 继续培养。 培养24h后， 弃去培养液， 加入180 L新鲜培养基， 再加入20 L5mg/mL MTT(终浓度为0.5mg/ mL)， 继续培养4h。 待到时间后， 终止培养， 小心吸去孔内培养液， 每孔加入150 LDMSO， 摇床 低速振摇10min， 使蓝紫色结晶充分溶解， 在酶标仪。
16、490nm处和570nm处读取吸光度值。 处理 数据， 计算巴西苏木素对细胞的抑制率， 绘制细胞生长曲线。 每个样本均设置6个重复， 取平 均值为最终结果。 MTT结果显示： 转染pcDNA3.1-BAG3质粒到T24细胞中后， 细胞活性下降达 60.69。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105769900 A 6 0001 序 列 表 1/2 页 7 CN 105769900 A 7 0002 序 列 表 2/2 页 8 CN 105769900 A 8 图1 图2 图3 图4图5 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 105769900 A 9 图6 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 105769900 A 10 。