沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子 探针及其应用方法 本发明涉及分子生物学，具体地说就是一种用于检验沙门氏菌的生物探针，它可以直接应用于食品卫生检验，环境检测、海关检疫及医学临床中的沙门氏菌检验。
属沙门氏菌的菌种繁多，迄今已发现2000种以上是常见的致病菌。沙门氏菌检验是食品卫生和环境检疫的必检项目，目前，我国卫生部颁布的沙门氏菌检验方法，主要是根据沙门氏菌的形态，生理生化特征以及血清反应来检验定型，其过程复杂、操作繁烦，周期长，并且易与其相接近的细菌发生交叉反应而影响准确性。在现有沙门氏菌检验方法中甚至还要使用剧毒试剂(氢化钾)，对工作人员健康有危害。
迄今为止，中国尚未有任何有关沙门氏菌核酸分子探针的研究和专利发表，但是国际上发达国家都已投入大量资金和人力开展沙门氏菌新的检验方法和核酸分子探针的研制。在rDNA核酸分子探针中包括rRNA编码区探针和非RNA编码区探针两类不同的探针。在美国专利VS5147778中公开了一种沙门氏菌rDNA探针，它以rRNA或rDNA中rRNA编码区序列为探测的目标基因，虽然它建立了一种快速、无毒的沙门氏菌的检验方法，但是灵敏度仍不够高。而寻找专一性更高的探测目标，难度很大，研制探针的难度就更大。美国、日本等研究人员都正在向这一方向发展。但目前，国内外都没有任何有关的研究报道。
本发明的目地在于克服背景技术存在的不足之处，把以核酸分子探针为基础的基因检测和鉴定技术应用于沙门氏菌的检验，研制出一种专一性更高的核酸分子探针及其应用方法。由此建立一种快速、准确、无毒又具有高灵敏度的沙门氏菌检验新方法。
一种沙门氏菌核酸分子探针，其特征在于以沙门氏菌rDNA中非RNA编码区作探测目标基因，设计沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，其结构是由23个核苷酸组成，它的核苷酸序列如下：5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3′。
rRNA及其基因rDNA是研制沙门氏菌核酸分子探针的一个很好的目标基因，在rDNA中存在着rRNA编码区和非RNA编码区(即间隔区)，rRNA序列和rDNA中rRNA编码区序列可以被用来研制沙门氏菌rRNA探针和rDNA探针，而rDNA中非RNA编码区则可用来研制沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针。
细菌rDNA间隔区是一个高变区，不同细菌类群的rDNA间隔区结构差别很大，这种差别还可以反映不同细菌之间亲缘关系的远近(即亲缘关系越远，差别越大，反之亦然)。在rDNA间隔区中，存在沙门氏菌与其它非沙门氏菌完全不同的核苷酸序列，即沙门氏菌特征核苷酸序列，根据该特征序列建立起的沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，具有极高的沙门氏菌专一性。该探针能与沙门氏菌DNA发生专一性反应，但不与其它的非沙门氏菌DNA发生交叉反应，所以可以用于沙门氏菌的鉴定和样品中沙门氏菌的检验。
建立沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，首先要对沙门氏菌rDNA间隔子进行分子克隆和DNA序列测定，并且对沙门氏菌属中不同的菌种分别加以考察，最后根据DNA序列测定和分析的结果，设计和合成沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，该探针可以分子杂交或者PCR的方式对待测样品加以检验，如存在沙门氏菌，就出现阳性标志，如无沙门氏菌，则出现阴性标志。
根据发明人已测定的沙门氏菌rDNA间隔子核苷酸序列，并与已公开发表的其它非沙门氏菌rDNA序列数据相比较。本发明选择了五组9种沙门氏菌用于研制沙门氏菌rDNA间隔子核苷酸分子探针。这五组9种沙门氏菌，菌种均来源于广州市防疫站致病菌室，它们的中文及拉丁文名称如下：
甲(A)组：
甲型副伤寒沙门氏菌 (Salmonella paratyphi A)
乙(B)组：
乙型副伤寒沙门氏菌 (S.paratyphi B)
鼠伤寒沙门氏菌 (S.typhi murium)
丙(C1)组：
丙型副伤寒沙门氏菌 (S.paratyphi C)
田纳西沙门氏菌 (S.tennessee)
丁(D)组：
伤寒沙门氏菌 (S.typhi)
肠炎沙门氏菌 (S.enteritidis)
戊(E1)组：
鸭沙门氏菌 (S.anatum)
韦太夫雷登沙门氏菌 (S.weltevreden)
本发明设定的由23个核苷酸组成，其核苷酸序列为5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3′的沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，可采用任何一种常规DNA合成方法，进行大批量生产，例如：可使用已商业化的DNA自动合成仪合成。
本发明研制的沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针，可以用核酸分子杂交法或常规PCR法对于食品、医学、环境等各种样品中的沙门氏菌进行检验，该探针仅与沙门氏菌DNA发生专一性反应，而与非沙门氏菌DNA无交叉反应。另外还建立了一种本发明特有的参照引物PCR法。
下面分别介绍上述应用方法：
(一)、核酸分子杂交法
沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针可以用各种核酸分子杂交的方式(例如点杂交方式)对样品中的沙门氏菌进行检验或者对某一已知细菌加以鉴定。
核酸分子杂交的过程(包括探针的标记和待测样品的预处理)，按常规的分子生物学方法进行。
以核酸杂交法可以对食品、医学、环境中的样品直接检验，也可以先将样品中的沙门氏菌DNA扩增，再加以检验，样品中有非沙门氏菌并不干扰沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针对沙门氏菌的专一性检出。
(二)、常规PCR方法
沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针可以作为一种PCR引物与另一PCR引物配对，例如细菌rDNA通用引物的PCR方式，快速、准确地检验样品中微量的沙门氏菌DNA，样品中存在其它非沙门氏菌DNA并不干扰沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针对沙门氏菌专一性检出。
以沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针对沙门氏菌进行PCR检验的过程可按照常规PCR操作规程进行。
(三)、参照引物PCR方法
采用一对以上专一性不同的引物在同一试管中对同一样品进行PCR反应，不同的引物扩增放大的目标序列不同，其PCR产物的分子量也按设计有显着差异。根据一支试管中最终PCR产物的种类，可以判别样品中是否含沙门氏菌，或其它细菌以及是否无菌。由于不同引物对的PCR产物可以互为参照，所以称其为参照引物PCR方法。PCR法结果可以琼脂糖凝胶电泳检验。
参照引物PCR法用于沙门氏菌检验，其PCR引物选择设置如下：
①以细菌rDNA 16S rRNA编码区3′未端保守区设置一个细菌通用PCR引物，在rDNA中的间隔子设置具有沙门氏菌专一性的另一个引物即沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针与引物之间的距离为207个核苷酸。
②在细菌rDNA 16S rRNA编码区5′未端保守区另设置一对细菌类rDNA通用引物，它们之间的距离为950个核苷酸。
图1为实施例1即采用常规PCR法用沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针检验鼠伤、寒沙门氏菌等五种沙门氏菌的电泳结果。
图2为实例例2即采用参照引物PCR法用沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针检验的甲型副伤寒沙氏门菌等五种沙门氏菌的电泳结果。
发明效果：
沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针及其应用方法的发明，代表了一种对沙门氏菌进行基因鉴定和检测的新方法，该方法与现行常规方法基于完全不同的原理。新的方法具有简便快速、准确、灵敏、无毒等优点。可以用来加强或取代我国卫生部颁布的常规沙门氏菌检验方法。
与现行沙门氏菌检验方法相比，新方法优点如下：
1、简便快速：常规检验操作繁烦，实验周期长(有时要长达一个星期)，新方法只需要几个小时(如需要进行菌的扩增，扩增时间除外)。
2、准确：沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针只与沙门氏菌rDNA杂交反应，而不与非沙门氏菌DNA发生交叉反应。
3、灵敏度高：沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针可以与PCR方法联合使用，沙门氏菌的理论检出值可达一个细菌。
4、不使用有毒试剂。
实施例1
1、核酸分子探针和PCR引物的制备
①按核苷酸序列为5′CGAAGCATACATCAGTATGTTAG 3，选用DNA自动合成仪，采用常规DNA合成法，合成沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针。
②沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针(沙门氏菌专一性)和另三种细菌rDNA PCR通用引物P1486(20个核苷酸长)，P16+(22个核苷酸长)，P16-(22个核苷酸长)，均用DNA自动合成仪合成，溶于TE(Tris-Hcl Tomm，EDTA 1mmPH7.6)溶液，浓度为0.5微克/微升。
2、沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针检验沙门氏菌操作过程(常规PCR方法)
①沙门氏菌样品预处理：
取1毫升含沙门氏菌(105菌)的培养液放入1.5毫升小指管中，离心(5000转/分)2分钟，倾去上清，在小管中加入0.2M氢氧化钠适量(以溶解菌力度)，立即加入500微升TE溶液(PH7.0)再根据菌数稀释至1000菌/微升。
②100微升I号PCR混合液中成份：
沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针 0.5微克
P1486核酸分子探针 0.5微克
10倍Tap DNA聚合酶缓冲剂 10微升
2mmdNTP溶液 10微升
Tap DNA聚合酶 2.5单位
以无菌水定容为100微升
③100微升II号PCR混合液中成份
以细菌rDNA PCR通用引物P16s+，P16s-分别代替沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针和P1486，其它成份同I号PCR混合液。
④PCR操作
取9个0.5毫升小指管，1～8管中分别加入1号PCR混合液20微升，然后分别加入鼠伤沙门氏菌等5种沙门氏菌样以及大肠杆菌样(对照)。在第9管中加入II号PCR混合液20微升，然后加入大肠杆菌样(对照)。在各管中加50微升矿物油，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：
94℃5分钟，94℃、50℃和72℃各1分钟，并且连续循环30次，然后72℃5分钟。
反应完后，每管加入5微升载样液(30％Ficol 0.25％溴酚兰)。
取4微升点样于2％的琼脂糖凝胶中，电泳结果如图1所示。
图1表明：
1、2、12：1Kb分子量梯度
3、鼠伤寒沙门氏菌 (相当于40个菌量)
4、田纳西沙门氏菌 (相当于40个菌量)
5、无菌水
6、肠炎沙门氏菌 (相当于40个菌量)
7、鸭沙门氏菌 (相当于40个菌量)
8、韦太夫雷登沙门氏菌 (相当于40个菌量)
9、大肠杆菌 (相当于400个菌量)
10、大肠杆菌 (相当于40个菌量)
11、大肠杆菌 (相当于40个菌量)
采用沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针和P1486组成PCR引物对，鼠伤寒等五种不同的沙门氏菌(3、4、6、7、8号)都可准确检出(出现207个核苷酸的阳性标志)而与大肠杆菌(9、10号)无交叉反应。采用P16s+和P16s-组成的PCR引物对，对与10号样相同的大肠杆菌DNA样(11号)进行检验，作为对照，出现950个核苷酸的阳性标志，说明有细菌DNA存在。
实施例2
1、核酸分子探针和PCR引物的制备同实施例1
2、以沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针检验沙门氏菌操作(参照引物PCR方法)
①沙门氏菌样品预处理同实施例1
②100微升III号PCR混合液成份：
沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针 0.5微克
P1486核酸分子探针 0.5微克
P16+核酸分子探针 0.5微克
P16-核酸分子探针 0.5微克
10倍Tap DNA聚合酶缓冲剂 10微升
2mmdNTP溶液 10微升
Tap DNA聚合酶 2.5单位
以水定容为100微升
③PCR操作
取9个0.5毫升小指管，各加入20微升上述PCR混合液，然后分别加入甲型副伤寒沙门氏菌等各种沙门氏菌样以及大肠杆菌样或无菌水，每管以50微升矿油盖面，操作程序同实施例1。电泳结果如图2所示。
图2表明：
1、伤寒沙门氏菌 (相当于40个菌量)
2、丙型副伤寒沙门氏菌 (相当于40个菌量)
3、伤寒沙门氏菌 (相当于1 00个菌量)
4、丙型副伤寒沙门氏菌 (相当于100个菌量)
5、乙型副伤寒沙门氏菌 (相当于100个菌量)
6、甲型副伤寒沙门氏菌 (相当于100个菌量)
7、鼠伤寒沙门氏菌 (相当于40个菌量)
8、大肠杆菌 (相当于40个菌量)
11、1Kb分子量梯度
采用两对引物即沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针/P1486和P16+/P16-的参照引物PCR方法，①含沙门氏菌的样品至少可出现一条207个核苷酸的沙门氏菌阳性标志，此外，还可以出现另一条950个核苷酸的细菌阳性标志，但在有的样品中，950个核苷酸的细菌阳性标志较弱。②在不含沙门氏菌，但含大肠杆菌的样品(8号)，仅出现950个核苷酸的细菌阳性标志。③在无菌样品中，无任何DNA带(9号)。