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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410029298.9 (22)申请日 2014.01.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103877185 A (43)申请公布日 2014.06.25 (73)专利权人 觉念自然有限公司 地址 中国香港新界元朗喜业街812号健 康工房集团中心4楼 (72)发明人 陈剑平 詹华強 吴纪嬅 董婷霞 彭靖淳 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 梁谋 (51)Int.Cl. A61K 36/725(2006.01) A2。
2、3L 33/00(2016.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 25/24(2006.01) (56)对比文件 CN 103417664 A,2013.12.04, 审查员 白雪 (54)发明名称 一种基于两种大枣品种组合的大枣提取物 及其在缓解神经退行性疾病和抗抑郁方面的应 用 (57)摘要 本发明提供了一种大枣提取物， 具体涉及其 制备方法及其在缓解神经退行性疾病、 抗抑郁作 用、 神经生长因子样作用及促进神经营养因子表 达等方面的应用。 所述的大枣提取物以优选的两 种大枣栽培品种组合为原料提取制得。 两种大枣 栽培品种组合原料的质量比为5 11 5。 每克大 枣提取。
3、物含核苷类成分含量为500微克； 含黄酮 类成分含量为60微克。 由于本发明的大枣提取物 采用基于优化的大枣栽培品种组合为原料， 选择 的提取方法能保证核苷类和黄酮类成分的提取， 因此能更好地发挥其在上述神经退行性疾病和 抗抑郁等神经性疾病的预防、 保健及治疗作用。 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 CN 103877185 B 2017.01.04 CN 103877185 B 1.一种大枣提取物， 其特征在于： 以两种大枣栽培品种组合为原料经表面活性剂水溶 液提取制得， 其中大枣提取物以大枣品种A与大枣品种B的质量比为5115的原料组合进 行提取制得， 其中， 在选用大枣提取物原料时，。
4、 任意一种可选用的大枣A的每克生药含核苷 类成分为不低于800微克； 任意一种可选用的大枣B的每克生药含黄酮类成分为不低于80微 克。 2.根据权利要求1所述的大枣提取物， 其中大枣提取物以大枣品种A与大枣品种B的质 量比为3113的原料组合进行提取制得。 3.根据权利要求1所述的大枣提取物， 其中大枣提取物以大枣品种A与大枣品种B的质 量比为11的原料组合进行提取制得。 4.根据权利要求1所述的大枣提取物， 其特征在于： 大枣品种A选自狗头枣、 中宁圆枣、 壶瓶枣、 赞皇大枣和哈密大枣； 大枣品种B选自阜平大枣、 稷山板枣、 灵宝大枣、 官滩枣和临 泽小枣。 5.根据权利要求1-4中任一项所。
5、述的大枣提取物， 其特征在于： 每克大枣提取物含核苷 类成分含量为不低于500微克； 且每克大枣提取物含黄酮类成分含量为不低于60微克。 6.根据权利要求1-4中任一项所述的大枣提取物， 其特征在于： 所述提取物在体外具有 抵御活性氧损伤、 促进神经分化和神经营养因子表达的生物活性。 7.根据权利要求1-4中任一项所述的大枣提取物， 其特征在于： 所述提取物加入辅料用 于制备保健品、 食品或药品的用途的形式。 8.根据权利要求1-4中任一项所述的大枣提取物在制备用于缓解神经退行性疾病、 抗 抑郁作用或具有神经生长因子样作用的保健品、 食品或药物中的用途。 9.一种制备根据权利要求1中所述大枣提。
6、取物的方法， 其特征在于： 取大枣品种A和大 枣品种B混合， 粉碎， 以含0.51.5%(w/v)的表面活性剂水溶液提取两次， 每次1-3小时， 滤 过， 合并滤液， 滤液浓缩， 备用。 10.根据权利要求9中所述的方法， 其中， 表面活性剂水溶液的含量为0.5-1.0%(w/v)。 11.根据权利要求9中所述的方法， 其中大枣提取物以大枣品种A与大枣品种B的质量比 为5115的原料组合进行提取制得。 12.根据权利要求11中所述的方法， 其中大枣提取物以大枣品种A与大枣品种B的质量 比为3113的原料组合进行提取制得。 13.根据权利要求11中所述的方法， 其中大枣提取物以大枣品种A与大枣品。
7、种B的质量 比为11的原料组合进行提取制得。 14.根据权利要求11所述的方法， 其中大枣品种A选自狗头枣、 中宁圆枣、 壶瓶枣、 赞皇 大枣和哈密大枣； 大枣品种B选自阜平大枣、 稷山板枣、 灵宝大枣、 官滩枣和临泽小枣。 15.根据权利要求9中所述的方法， 其特征在于： 表面活性剂为泊洛沙姆188、 十二烷基 硫酸钠、 PEG4000、 吐温-80中的一种或几种。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103877185 B 2 一种基于两种大枣品种组合的大枣提取物及其在缓解神经退 行性疾病和抗抑郁方面的应用 技术领域 0001 本发明涉及中药技术领域， 具体涉及一种基于优化两种大枣品。
8、种组合的提取物， 更具体涉及以优选的两种大枣栽培品种组合为原料制备的大枣提取物， 本发明还包括该大 枣提取物的制备方法及其在缓解神经退行性疾病和抗抑郁方面的应用。 背景技术 0002 神经退行性疾病， 是大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态， 是一种慢性、 进行 性神经系统疾病。 其常见的病症主要包括阿尔茨海默氏病、 帕金森氏病、 肌萎缩性侧索硬化 症和亨廷顿病等。 此类疾病是与年龄相关的疾病， 发病率随老龄人口的增加而逐年增高。 其 对患者生活能力的危害仅次于肿瘤、 心脑血管疾病， 从而被称为中老年人的 “第三杀手” 。 我 国现有超过1000万该类疾病患者， 随着人口老龄化， 50年后将增。
9、至3000万以上， 将成为人口 与健康领域中的重大科学与社会问题 （参见 “发育再生与神经退行性疾病研究， 苏炳银， 成 都医学院学报， 2010， 4:277” ） 。 虽然至今尚不清楚这些疾病的病因和发病机制， 但普遍认为 与神经细胞的氧化损伤和神经营养因子缺失有很大的关系。 目前仅有少数几个药物可用于 治疗神经退行性疾病， 但都存在只能短期改善患者的症状， 且随着应用时间的延长疗效减 弱， 副作用日趋严重等问题， 因此应用有局限性。 此外， 不少研究发现抑郁症史， 特别是老年 期抑郁症史是该类疾病的危险因素。 抑郁病人中常存在脑内神经发生 （neurogenesis） 迟 缓、 神经递质。
10、不足和神经营养因子缺失等症状。 目前治疗抑郁病人的药物主要通过提高脑 内神经递质水平， 但同样存在副作用大和超过50%病人对药物无反应的现象。 因此， 探寻和 研发新的对神经退行性疾病和抑郁病症有预防和辅助治疗作用的药物、 保健品或食物十分 必要。 0003 中医药是我国的一大文化瑰宝， 源远流长， 在几千年人们与疾病抗争过程中发挥 举足轻重的作用。 直至现今， 中医药仍然在我国治病防病中被广泛应用。 枣为鼠李科植物枣 （Ziziphus jujuba Mill.） 的干燥成熟果实。 传统上， 其主要具有养血安神之功效。 枣作为 药食同源物品， 不仅具有丰富的营养成分， 而且在临床上有很好的治。
11、疗效果， 因此广受人们 的青睐。 植物化学研究表明， 大枣中主要含核苷类和黄酮类等活性成分 （参见 “The jujube (Ziziphus jujuba Mill.) fruit: A review of current knowledge of fruit composition and health benefits, Gao et al., Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2013, 61, 3351-3363.” ） 。 据报道核苷类成分具有神经保护、 抗血小板凝聚和 抗心律失常等功效。 近年来， 核苷类成分具有的生物活性被认为。
12、与补益类药物的功效存在 一定的关联。 对于黄酮类成分， 除了具有普遍的抗氧化活性外， 黄酮类成分具有雌激素样作 用、 神经保护和补血等生物活性。 然而， 目前针对以上两类成分在大枣中的质量控制研究较 少。 我国现行的2010年版药典中并未收载大枣的含量测定项。 因此， 建立大枣中核苷类和黄 酮类有效成分质控方法， 可有效保证其质量。 0004 在提取工艺方面， 黄酮类和核苷类是工艺优选过程中的主要参考指标。 黄酮类成 说 明 书 1/9 页 3 CN 103877185 B 3 分作为枣中主要成分， 文献上已有枣中黄酮成分的提取工艺报道。 文献上大多采用水或乙 醇水作为溶媒进行提取 （参见 “。
13、红枣芦丁提取工艺的研究， 张宝善等， 陕西师范大学学报 （自 然科学版） ， 2003， 31： 89-93.” ） 。 常见的提取方法有渗漉法、 超声波法、 回流和煎煮法等 （参 见 “渗漉法提取广枣中黄酮类成分的工艺研究， 易跃能等， 中国中药杂志， 2010， 35： 1806- 1806.” 、“超声波法对枣果中总黄酮提取工艺的优化， 宋琳琳等， 贵州农业科学， 2010： 222- 224.” 和 “正交设计研究广枣总黄酮提取工艺， 巴根那等， 中成药， 2000， 22： 253-255.” ） 。 为 了提高黄酮的提取率， 提取过程中还有加入果胶复合酶的报道 （参见 “超声波协同。
14、酶法提取 陕北滩枣总黄酮的研究， 杨芙莲等， 陕西科技大学学报， 2011， 29： 58-61” ） 。 另一方面， 针对 核苷类成分的提取工艺研究， 目前主要集中在以核苷类中cAMP为指标成分优选提取工艺 （参见 “大枣cAMP的大孔树脂分离工艺研究， 潘见等， 安徽大学学报， 2007， 31： 87-90.” ） 。 综 合目前提取工艺， 存在如下问题： 常规的水或者乙醇水都适用于核苷类成分的提取， 未见以 表面活性剂促进水难溶性黄酮提取的报道； 或以水或乙醇水分别提取核苷类或黄酮类， 亦 未见以两类成分为综合指标的考察的提取工艺； 还存在检测手段相对落后， 如采用分光光 度计法测定总。
15、黄酮， 将导致质控指标成分不能与药效成分对应。 因此， 本发明采用多类药效 成分为综合指标来优化提取工艺， 弥补了现有提取工艺优化过程的不足， 具有十分重要的 意义。 根据目前大枣的化学成分报道， 本文选取了大枣中10种核苷类和7种黄酮类成分， 并 对其进行质控。 0005 我国大枣栽培历史悠久， 据统计目前我国约有700多个栽培品种， 广泛分布于黄河 流域周边各省份。 由于生长环境， 如土壤、 海拔和气候等的差异， 不同品种大枣的大小， 甚至 内在化学成分存在较大差异。 由于大枣原料上的差异， 导致在工业生产中出现不同大枣品 种经同一提取工艺制备所得的提取物存在差异。 这种差异可直接影响大枣。
16、提取物在预防和 治疗上的效果。 在本发明中， 我们发现大枣中核苷类和黄酮类成分在不同品种间差异较大。 例如某一品种大枣的核苷类成分含量较高， 但其黄酮类成分含量却较低， 而黄酮类含量较 高的大枣品种， 其核苷类含量未必较高。 因此， 本发明将针对大枣品种繁多、 有效成分分布 差异大等问题提出解决方案。 具体思路为： 建立大枣中核苷类和黄酮类成分的含量测定方 法。 根据测定结果， 将核苷类含量较高的大枣品种与黄酮类含量较高的品种进行组合， 再进 行提取制得提取物。 从而保证了大枣提取物中核苷类和黄酮类成分的含量均较高， 也为不 同品种间大枣的有效组合应用提供参考。 此外， 近年来研究发现， 核苷。
17、类和黄酮类成分在神 经性疾病中起到十分重要的作用， 所以发明人还对基于优化组合后的大枣提取物在该神经 退行性疾病和抗抑郁上的应用进行研究。 发明内容 0006 本发明的一个目的在于提供一种具有缓解神经退行性疾病和抗抑郁的大枣提取 物。 本发明的另一目的在于提供并优化一种基于优化的大枣提取物的制备方法。 本发明表 明该提取物可用于制备具有缓解神经退行性疾病和抗抑郁作用的食品、 保健品和药物的形 式。 0007 本发明的大枣提取物与现有技术相比具有以下优点和积极效果： 0008 本发明的大枣原材料是经过优选配比的， 并给出了合理的质量比例范围， 区别于 一般以一种大枣为原料的常规思路， 提取物制备。
18、时采用以表面活性剂水溶液为溶剂的方 说 明 书 2/9 页 4 CN 103877185 B 4 法， 提高了水溶性差的黄酮成分的溶出， 同时保证了对具有神经活性作用的水溶性核苷类 和较难溶于水的黄酮类成分的共同提取。 0009 本发明的核苷类和黄酮类成分进行了定性定量研究， 因此大枣提取物是经标准化 后的， 从而保证提取物本身的质量稳定可控， 更保证了提取物在神经疾病方面的预防或治 疗效果。 0010 本发明的大枣提取物对神经作用的机理进行了研究， 为今后制备具有此功效的食 品、 保健品或药品提供了详实、 可靠的基础研究数据。 0011 本发明主要是通过以下技术方案完成的： 0012 本发明。
19、内容主要包括大枣提取物制备方法， 大枣提取物核苷类和黄酮类的质量标 准研究， 标准化大枣提取物神经方面作用机理研究。 具体内容如下： 0013 一种基于优化的大枣提取物， 以优选的两种大枣栽培品种组合为原料， 大枣品种A 与大枣品种B的质量比为5115。 0014 进一步地， 上述大枣品种A与大枣品种B的质量比为3113。 0015 更进一步地， 上述大枣品种A与大枣品种B的质量比为11。 0016 上述的大枣品种A可选用狗头枣、 中宁圆枣、 壶瓶枣、 赞皇大枣或哈密大枣中任意 一种， 其中任意一种可选用的大枣A的每克生药含核苷类成分不低于800微克， 例如810， 820， 830， 840。
20、， 850， 900， 950， 1000， 1050， 1100， 1200， 1300微克或更高。 大枣品种B可选用阜 平大枣、 稷山板枣、 灵宝大枣、 官滩枣或临泽小枣中任意一种， 其中任意一种可选用的大枣B 的每克生药含黄酮类成分不低于80微克， 例如为85, 90, 95, 100, 110, 120, 130 ,140, 150, 160, 170, 180, 190, 200微克或更高。 0017 上述大枣提取物制备方法为： 取大枣品种A和大枣品种B混合， 粉碎， 以含0.5 1.5%， 0.51.0%, 或1.0-1.0%(w/v)的表面活性剂水溶液提取两次， 每次1-3小时，。
21、 滤过， 合 并滤液， 滤液浓缩， 备用； 其中表面活性剂为泊洛沙姆188、 十二烷基硫酸钠、 PEG4000、 吐温- 80中的一种或几种； 按上述制备方法所得的每克大枣提取物含核苷类成分含量不低于500 微克， 例如可以是550， 600， 650， 700， 750， 800， 850， 900， 950， 1000微克或更高； 含黄酮类成 分含量不低于60微克， 例如可以是65， 70， 75， 80， 85， 90， 95， 100， 110， 120， 130， 140， 150， 160 微克或更高。 0018 上述的大枣提取物的神经作用机理研究包括如下试验： 对神经的保护作用，。
22、 对神 经细胞内抗氧化调控元件的转录水平的影响， 对神经细胞轴突伸长的影响， 对神经细胞神 经丝蛋白表达水平的影响及对星形胶质细胞中神经营养因子基因表达水平的影响。 具体结 果见附图1-4。 0019 本发明所采用的测定大枣中核苷类和黄酮类成分的方法， 是基于发明人先前建立 的测定方法 （参见 “Chemical and biological assessment of Ziziphus jujuba fruits from China: Different geographical sources and developmental stages, Chen et al., 2013, Jo。
23、urnal of Agriculture and Food Chemistry, 61, 7315-7324.” ） 。 该方法 可以快速达到对大枣原料和提取物中的多类成分进行测定。 附图说明 0020 图1为不同大枣提取物的神经保护作用比较； 说 明 书 3/9 页 5 CN 103877185 B 5 0021 图2为不同大枣提取物对神经细胞内抗氧化调控元的转录水平的影响； 0022 图3为大枣提取物对神经细胞轴突伸长的影响； 0023 图4为大枣提取物对星形胶质细胞中神经营养因子基因表达水平的影响。 0024 大枣中核苷类成分的高效液相色谱测定方法： 0025 1. 色谱条件与系统适用性。
24、试验 0026 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq （4.6 250 mm, 5 m） ； 检测波长： 260 nm； 柱 温： 室温； 进样量： 8 l； 理论板数按鸟苷峰计算应不低于2000。 色谱洗脱程序如下表1。 0027 表1： 梯度洗脱程序表 0028 0029 2. 对照品溶液的制备 0030 分别取尿嘧啶、 黄嘌呤、 次黄嘌呤、 鸟嘌呤、 腺嘌呤、 胞苷、 尿苷、 鸟苷、 环磷酸鸟苷 和环磷酸腺苷对照品适量， 精确称定， 分别制得溶度为156.25 ng/ml、 312.5 ng/ml、 625.0 ng/ml、 1250.0 ng/ml、 2500 ng/ml、。
25、 5000 ng/ml的溶液。 0031 3. 测试品溶液的制备 0032 取大枣粉末或提取物粉末1 g， 精密称定， 置50 ml 试管中， 精密加入水20 ml， 提 取1小时， 滤过， 残渣重复提取1次， 合并滤液， 定容至50 ml， 用微孔滤膜 （0.45 m） 滤过， 取 续滤液， 即得。 0033 4. 样品的含量测定 0034 分别取大枣不同品种样品， 按测试品溶液制备项下方法制备样品溶液， 在上述色 谱条件下分别测定10种核苷类成分的峰面积， 根据其线性回归方程， 计算其含量， 结果见下 表2。 0035 表2： 不同大枣品种中核苷类成分的含量 0036 大枣品种总核苷含量 。
26、（ g/g） 金丝小枣719.8708 灵宝大枣407.4343 木枣414.7199 临泽小枣587.9168 中宁圆枣1052.302 官滩枣478.6763 马牙枣356.2541 说 明 书 4/9 页 6 CN 103877185 B 6 稷山板枣545.0594 阜平大枣504.7652 若羌大枣590.2015 交城骏枣742.4268 柳林团枣555.3802 狗头枣1131.236 相枣542.415 灵武长枣628.164 赞皇大枣955.9526 元红大枣553.06 壶瓶枣982.4242 哈密大枣830.35 和田大枣768.3518 鸣山大枣721.834 0037。
27、 根据测定结果， 含核苷类含量较高的品种有狗头枣、 中宁圆枣、 壶瓶枣、 赞皇大枣 和哈密大枣。 考虑到各种大枣的核苷类含量会因为不同的年份、 气候等外在条件变化， 大枣 内含核苷类成分在不低于800 g/g的条件下， 例如上述测得的1052、 1131、 955、 982、 830 g/g 所对应的大枣， 均可作为大枣品种A的优选原料。 0038 大枣中黄酮类成分的高效液相色谱测定方法： 0039 1. 色谱条件与系统适用性试验 0040 色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD 1.8 m, 2.1 50 mm； 检测波长： 260 nm； 柱温： 室温； 进样量。
28、： 5 l； 理论板数按芦丁峰计算应不低于2000。 色谱洗脱程序如 下表3： 0041 表3： 梯度洗脱程序表 0042 0043 2. 质谱条件 说 明 书 5/9 页 7 CN 103877185 B 7 0044 1200 液相系统和装备喷射流技术的Agilent 6460 三重四级杆液质联用系统。 离 子源为电喷雾离子化(ESI)源： 喷雾电压45 psi； 干燥气温度325 oC； 干燥气流速10 L/min； 毛细管电压4000 V； Delta EMV: 400 V。 检测方式为负离子多离子反应监测(MRM)。 0045 3. 对照品溶液制备 0046 分别取儿茶素、 原花青素。
29、B2、 表儿茶素、 槲皮素-3-半乳糖苷、 芦丁、 槲皮素-3-O-葡 萄糖苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品适量， 精密称定， 加甲醇充分溶解， 分别制得溶度为 0.05 ng/ml、 6.25 ng/ml、 12.5 ng/ml、 25 ng/ml、 50 ng/ml、 100 ng/ml的溶液。 0047 4. 测试品溶液的制备 0048 取大枣粉末或提取物粉末1 g， 精密称定， 置50 ml 试管中， 精密加入水20 ml， 超 声提取1小时， 滤过， 残渣重复提取1次， 合并滤液， 定容至50 ml， 用微孔滤膜 （0.45 m） 滤 过， 取续滤液。 0049 5. 样品的含量测。
30、定 0050 分别取大枣不同品种样品， 按供试品溶液制备项下方法制备样品溶液， 在上述色 谱条件下分别测定7种黄酮类成分的峰面积， 根据其线性回归方程， 计算其含量， 结果见下: 4。 0051 表4： 不同大枣品种中黄酮类成分的含量 0052 大枣品种总黄酮含量 （ g/g） 金丝小枣41.69857 灵宝大枣167.5365 木枣76.73738 临泽小枣106.2125 中宁圆枣79.04974 官滩枣121.9684 马牙枣78.37984 稷山板枣188.1753 阜平大枣392.2393 若羌大枣25.52249 交城骏枣65.55117 柳林团枣40.84982 狗头枣63.23。
31、989 相枣40.63279 灵武长枣56.41783 赞皇大枣59.72036 元红大枣15.15214 壶瓶枣34.85982 哈密大枣61.28965 和田大枣49.65121 鸣山大枣85.58839 说 明 书 6/9 页 8 CN 103877185 B 8 0053 根据测定结果， 含总黄酮类含量较高的品种有阜平大枣、 稷山板枣、 灵宝大枣、 官 滩枣和临泽小枣。 考虑到各种大枣的总核苷含量会因为不同的年份， 气候等外在条件变化， 大枣内含黄酮类成分在不低于80 g/g的条件下， 例如上述测得的167、 106、 121、 188、 392、 85 g/g所对应的大枣， 均可作为。
32、大枣品种B的优选原料。 具体实施方式 0054 以下结合具体实施例的描述并参照附图来进一步说明本发明。 但这些实施例仅是 范例性的， 并非对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员根据本发明的基本思想， 在 不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换， 但这 些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0055 实施例1 0056 大枣提取物制备方法： 取赞皇大枣和稷山板枣按质量比3:1混合， 粉碎， 以含表面 活性剂泊洛沙姆188为0.5%(w/v)的水溶液提取2次， 每次3小时， 滤过， 合并滤液， 冻干干燥。 经测定， 每克大枣提取物中核苷类和黄酮类成分的含量。
33、分别为830微克和90微克。 0057 实施例2 0058 大枣提取物制备方法： 取狗头枣和阜平大枣按质量比1:1混合， 粉碎， 以含表面活 性剂吐温-80为1.0%(w/v)的水溶液提取2次， 每次1小时， 滤过， 合并滤液， 滤液浓缩， 备用。 经测定， 每克大枣提取物中核苷类和黄酮类成分的含量分别为800微克和200微克。 0059 实施例3 0060 大枣提取物制备方法： 取狗头枣和阜平大枣按质量比1:1混合， 粉碎， 以含表面活 性剂吐温-80为0.5%(w/v)的水溶液提取2次， 每次1小时， 滤过， 合并滤液， 滤液浓缩， 备用。 经测定， 每克大枣提取物中核苷类和黄酮类成分的含。
34、量分别为805微克和190微克。 0061 实施例4 0062 取中宁圆枣和临泽小枣按质量比1:3混合， 粉碎， 以含表面活性剂PEG4000为1.0% (w/v)的水溶液提取2次， 每次2小时， 滤过， 合并滤液， 滤液浓缩， 备用。 经测定， 每克大枣提 取物中核苷类和黄酮类成分的含量分别为700微克和90微克。 0063 实施例5 0064 取壶瓶枣和官滩枣按质量比1:5混合， 粉碎， 以含表面活性剂十二烷基硫酸钠为 1.0%(w/v)的水溶液煎煮提取2次， 每次2小时， 滤过， 合并滤液， 滤液浓缩， 备用。 经测定， 每 克大枣提取物中核苷类和黄酮类成分的含量分别为560微克和100。
35、微克。 0065 实施例6 0066 取狗头枣和灵宝大枣按质量比5:1混合， 粉碎， 以含表面活性剂吐温-80为1.5%(w/ v)的水溶液煎煮提取2次， 每次2小时， 滤过， 合并滤液， 滤液浓缩， 备用。 经测定， 每克大枣提 取物中核苷类和黄酮类成分的含量分别为1000微克和80微克。 0067 实施例7 0068 本发明人进一步发现： 当将含核苷类成分较高的大枣品种， 如狗头枣、 中宁圆枣、 壶瓶枣、 赞皇大枣或哈密大枣中任意一种； 与将含黄酮类成分较高的大枣品种， 如阜平大 枣、 稷山板枣、 灵宝大枣、 官滩枣或临泽小枣中任意一种， 进行组合提取， 并且优选提取后每 克大枣提取物含核。
36、苷类成分含量在不低于500微克， 例如560、 700、 800、 805、 830、 1000微克， 说 明 书 7/9 页 9 CN 103877185 B 9 和含黄酮类成分含量在不低于60微克， 例如80、 90、 100、 190、 200微克的条件下， 所得组合物 对于神经细胞的作用效果均优于其单独的提取物效果。 0069 实施例8 0070 在大脑中， 两种常见的神经退行性疾病帕金森和阿尔茨海默病， 其病理过程中的 氧化应激被认为是其中的主要因素之一。 因此本试验设计了大枣提取物抵御活性氧对神经 细胞损伤的作用的研究。 此外， 本发明人通过实验发现： 当将两种不同品种大枣进行组合。
37、 时， 所得到的组合物显示出了出人意料的作用， 所得到的组合物在抵御活性氧对神经细胞 损伤的效果优于各组分单独使用的效果。 0071 1. 材料与仪器 0072 pGL4.37luc2P/ARE/Hygro 载体包含4个重复的抗氧化调控元件(ARE, 5 - TAGCTTGGAA ATGACATTGC TAATGGTGAC AAAGCAACTT T -3 ) ， 而其中抗氧化调控元件可以 激活萤光素酶报告基因luc2P的转录 (Promega Corporation, Madison, WI, USA)。 0073 2. 细胞培养条件 0074 PC12细胞培养在DMEM培养基， 其含6% 胎。
38、牛血清、 含6% 马血清、 100 U/ml的青霉素 以及100 U/ml的链霉素， 培养箱温度37 oC, 含7.5% CO2空气和一定的湿度。 0075 3. 神经细胞的活性测定 0076 PC12细胞种在96孔板， 每孔细胞密度约2104 个细胞， 过夜让细胞贴壁， 第二天开 始加不同大枣提取物 （狗头枣提取物、 阜平大枣提取物、 狗头枣与阜平大枣1:1配比提取物， 工作浓度均为1 .5 mg/ml） 。 加药后24小时 ， 加入叔丁基过氧化氢 （tert-butyl hydroperoxide, tBHP）（150 M） 3小时， 再加入3- （4， 5-二甲基噻唑-2） -2， 5-。
39、二苯基四氮唑 溴盐 （MTT） 溶液 （工作溶度0.5 mg/ml） ， 继续培养1小时。 终止培养， 小心吸去孔内培养液。 每 孔加入150 l DMSO， 置摇床上低速振荡15分钟， 使结晶充分溶解。 在酶联免疫检测仪OD570 nm处测量各孔的吸光值。 实验结果以三次实验的平均值， 每次平行做三个孔。 依据以上结 果， 当将两种大枣不同品种进行组合时， 所得到的组合物的作用效果优于各组分单独使用 的效果， VitC为阳性对照 （图1） 。 0077 4. 抗氧化反应元-萤光素酶活性测定 （ARE-luciferase） 0078 通过Lipofectamine 2000转染技术， 将pA。
40、RE-Luc基因转染到培养的PC12细胞中， 接着转染后的PC12种在24孔板， 每孔细胞密度约 5 105 个细胞， 过夜让细胞贴壁， 从第 二天开始加不同大枣提取物 （狗头枣提取物、 阜平大枣提取物、 狗头枣与阜平大枣1:1配比 提取物， 工作浓度均为1.5 mg/ml） ， 加药24 小时后取样， 样品进行萤光素酶活性测定 （Fluostar Optima, BMG Labtechnology） ， 实验结果为三次实验的平均值， 每次平行做三 个孔。 依据以上结果， 当将两种大枣不同品种进行组合时， 所得到的组合物的作用效果优于 各组分单独使用的效果， 特丁基对苯二酚 （tert-but。
41、yl hydroquinone, tBHQ） 为阳性对照 （图2） 。 0079 实施例9 0080 大枣提取物的神经生成因子样作用研究 0081 神经细胞轴突伸长的测定 0082 将PC12细胞种在6孔板， 每孔细胞密度约为5104 个细胞， 细胞培养在DMEM培养 基， 含6% 胎牛血清、 含6% 马血清、 100 U/ml的青霉素以及100 g/ml的链霉素， 培养箱温度 说 明 书 8/9 页 10 CN 103877185 B 10 37 oC, 含7.5% CO2空气和一定的湿度。 过夜让细胞贴壁。 加药前3个小时， 将培养液换为含 1% 胎牛血清和1% 马血清的培养基。 三小时后。
42、加大枣提取物 （狗头枣提取物、 阜平大枣提取 物、 狗头枣与阜平大枣1:1配比提取物， 工作浓度均为1.5 mg/ml） 培养72小时， 其中每24小 时更换新鲜培养液或含红枣提取物的培养液。 三天后， 6孔板培养的细胞先用PBS洗一次， 然 后用4%多聚甲醛室溫固定15 min， 之后用倒置相差显微镜对细胞形态进行观察 （20） ， 并 用匹配的数码相机获取显微镜下图像。 然后用图像分析软件进行数字化定量分析。 依据以 上结果， 当将两种大枣不同品种进行组合时， 所得到的组合物的作用效果优于各组分单独 使用的效果， 神经生长因子 （nerve growth factor, NGF） 为阳性对。
43、照 （图3） 。 0083 实施例10 0084 大枣提取物促进星形胶质细胞中神经营养因子表达的研究 0085 1. 材料与仪器 0086 神经营养因子基因的引物： 5 -AAG GAC GCA GCT TTC TAT CCT GGC -3 和 5 - TTT GGG GTC CAC AGT GAT GGT GCG-3 针对大鼠 NGF (270 bp; XP_001067130.2); 5 - GAA GAA AAC CAT AAG GAC GCG GAC TTG T -3 和 5 - TTG GCC TTT TGA TAC CGG GAC TTT CTC-3 针对大鼠 BDNF (288 。
44、bp; BC087634); 5 - GCG CTG ACC AGT GAC TCC AAT ATG -3 和 5 - CTC GGA CCT TTC CCT CTG GAA TTC T-3 针对大鼠GDNF (191 bp; AF497634)。 本实验中GAPDH 用于内标， 其引物序列为： 5 - AAC GGA TTT GGC CGT ATT GG-3 和 5 - CTT CCC GTT CAG CTC TGG G-3 (657 bp; NR_0215885)。 0087 2. 细胞培养条件 0088 原代培养的大鼠星形胶质细胞细胞培养在MEM培养基， 含10% 马血清、 100 U/。
45、ml的 青霉素以及100 g/ml的链霉素， 培养箱温度37 oC, 含5% CO2空气和一定的湿度。 0089 3. 神经营养因子表达的测定 0090 原代培养的大鼠星形胶质细胞培养种在60 mm板上， 加药前3个小时， 将培养液换 为含0.5% 马血清的培养基。 三小时后加大枣提取物 （狗头枣提取物、 阜平大枣提取物、 狗头 枣与阜平大枣1:1配比提取物， 工作浓度均为1.5 mg/ml） 培养24小时， 加药24 小时后取样， 样品中的总RNA用RNAzol试剂提取后反转录成cDNA， 最后采用实时聚合酶链反应仪测定样 品中的NGF, BDNF和GDNF的mRNA表达的变化。 实验结果为三次实验的平均值， 每次平行做三 个孔。 依据以上结果， 当将两种大枣不同品种进行组合时， 所得到的组合物的作用效果优于 各组分单独使用的效果， 佛司可林 （Forskolin） 为阳性对照 （图4） 。 说 明 书 9/9 页 11 CN 103877185 B 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 1/2 页 12 CN 103877185 B 12 图 4 说 明 书 附 图 2/2 页 13 CN 103877185 B 13 。