重组单链可变区抗体片段及其应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN95105582.8

申请日:

1995.06.09

公开号:

CN1117526A

公开日:

1996.02.28

当前法律状态:

终止

有效性:

无权

法律详情:

发明专利公报更正更正卷=12号=9页码=1更正项目=专利代理机构误=中国专利代理(香港)有限公司正=永新专利商标代理有限公司|||公开

IPC分类号:

C12N15/13; C12N15/70; C12P21/00; G01N33/576

主分类号:

C12N15/13; C12N15/70; C12P21/00; G01N33/576

申请人:

遗传和生物工程研究中心;

发明人:

玛尔塔·阿亚拉·阿维拉; 乔格·维克托·加维隆多·考利; 玛利亚·埃琳娜·费尔南德斯·德科索·多尔; 塔-杜凯; 莱昂纳多·米格维尔·卡南-黑登·弗里阿斯; 玛丽亚·德尔·卡门·多明格斯·霍尔特

地址:

古巴哈瓦那

优先权:

1994.06.09 CU 73/94

专利代理机构:

中国专利代理(香港)有限公司

代理人:

刘国平

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内容摘要

一种乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特异性的重组单链Fv(scFv)抗体片段。使用重组DNA技术在大肠杆菌中生产scFv片段。所述的scFv可以用来代替在公知的生产HBsAg的方法中的一个纯化步骤中采用的小鼠单克隆抗体(MAb)CB-Hep.1。利用重组DNA技术,将编码MAbCB-Hep.1的重链和轻链可变区的基因进行克隆和修饰,可以生产该scFv抗体片段。该scFv片段对HBsAg具特异性,并且其分子大小比MAb更小。

权利要求书

1: 单链可变区片段(Fv)型的重组抗体片段, 其特征在于对乙型肝炎病毒表面抗原具有特异性,并且 具有主要包含序列表中序列号为1和2的序列的可变区 序列。
2: 使用权利要求1的scFv免疫纯化HBsAg。
3: 使用权利要求1的scFv进行免疫分析,在 该分析中乙型肝炎病毒表面抗原被识别和检测。
4: 使用含有权利要求1定义的可变区序列或部分 可变区序列的天然的、合成的或重组的任何抗体片段或 多肽进行免疫纯化重组或天然HBsAg。
5: 使用含有权利要求1定义的可变区序列或部分 可变区序列的天然的、合成的或重组的任何抗体片段或 多肽进行免疫分析,在该分析中重组的或天然的HBs Ag被识别和检测。
6: 使用含有权利要求1定义的可变区序列或部分 可变区序列的天然的、合成的或重组的任何抗体片段或 多肽对E.coli中表达的杂合融合蛋白质进行不溶 化。
7: 制备如权利要求1所述的scFv抗体片段的 方法,包括提供一个重组核酸,该重组核酸含有编码所 述的scFv抗体片段的核苷酸序列和允许所述的sc Fv抗体片段在特定的宿主细胞中表达的调节序列;用 所述的重组核酸转化所述的特定宿主细胞;培养转化的 宿主细胞;并从中分离产生的scFv抗体片段。
8: 如权利要求7所述的方法,其中所述的宿主细 胞为原核宿主细胞,如E.coli。
9: 如权利要求7或8所述的方法,其中产生的s cFv抗体片段是从不溶性细胞组分中分离。

说明书


重组单链可变区抗体片段及其应用

    本发明涉及生物工程领域,特别是涉及运用重组DNA技术开发单链可变区抗体片段(scFv),以及该scFv抗体片段在重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的纯化过程的应用,其中所述的重组HBsAg是组成疫苗的活性原料。

    针对乙肝病毒的可商购得到的重组疫苗主要是基于在遗传操作的酵母中生产重组HBsAg

    酿酒酵母被广泛用于大规模生产重组HBsAg(McAleer,W.J.等人,1984,Nature 307:178;Harford,N.等人,1987.Post-graduate.Medical Journal 63 suppl 2:65;Bitter,G.A.等人,1988 Journal of Medical Virology 25:123)。该抗原是在胞内生产的,并且通过不同的细胞破碎方法进行提取并根据不同的理化方法进行纯化,使得纯度高于97%并使产物具有与细胞质衍生的抗原相似的抗原行为,这一点在动物和人中已得到证实(Hauser,P.等人,1987,Postgraduate Medical Journal,63 suppl 2:83)。

    在欧洲专利申请480525中描述了一种纯化在巴斯德毕赤氏酵母中获得的重组HBsAg的方法。该方法涉及一种用特异性小鼠单克隆抗体(MAb)CB-Hep.1进行免疫亲和层析的步骤。这种纯化方法使得HBsAg具有免疫原性,使得其与疫苗“Engerix B”相比作为免疫原更为优越。所述的疫苗“Engerix B”是在酿酒酵母中采用重组DNA技术获得的,可从Smithkline Beecham Biologicals公司购得。

    在天然和重组分子的纯化方法的开发过程中,采用MAb作为配体来制备亲和载体这一点已广为人知(Mattiasson,B.1988.Methodsin Enzymology,vol.137;Avrameas,S.及T.Ternynck,1969,Immunochemistry 6:53-66;Bethell,G.S.等人,1979 J.Biol.Chem.254:2572-2574;Chase,H.A.1984.Chem.Eng.Sci.39:1099-1125;Sada,E.等人,1986,Biotechnol.Bioeng.28:1497-1502)。

    欧洲专利申请4802525的目的,即在纯化来自巴斯德毕赤氏酵母(Pichia Pastoris)的HBsAg地方法中最重要的步骤之一,事实上是用MAbCB-Hep.1对抗原进行免疫纯化的操作步骤,据称这一步骤有助于对高免疫原性抗原颗粒的选择。分泌MAbCB-Hep.1的杂交瘤(Fontirrochi等人,1993,Biotechnologia Aplicada 10,1:24-30)是通过用重组抗原免疫BALB/c小鼠,而后将其脾细胞与小鼠的骨髓瘤Sp2/0-Ag14融合而得到的。当这种MAb与琼脂糖凝胶偶联后,其可以有效地纯化由重组酵母中制备的抗原。

    生产具有上述用途的MAb即可以在体外进行也可以在体内进行。在体外进行生产是采用生物反应器并收获杂交瘤培养物的上清(Handa-Corrigan,1988.A.Bio-Technology6:784-786);在体内进行生产是在小鼠腹膜内培养杂交瘤,使之产生腹水瘤,其高丰度液体富含MAb(Campbell.A.(编辑).1984.Monoclonal Antibody Technology.Vol.13,Laboratory.Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Pub.Co.出版)。无论何种情况,国际上对于MAb的质量和使用安全性的规定是非常严格的(Office of Biologics Research and Review,Center for Drugs and Biologics,FDA.在生产和试验用于人类的单克隆抗体产品的几点注意事项,备忘录,1993),伴随的还有生产成本上升,并且还要证实和显示当MAb直接作用于人体时或用于生产药物和疫苗时,其中不存在能引起潜在的生物危害的外来因素。

    重组DNA技术的发展已经使得能在微生物中生产Fab、Fv和scFv抗体片段(Pliickthun,A.1991.Bio/Technology9:54 5-551;Whitlow,M.和D.Filpula,1991.IN METHODS:A Companion to Methods in Enzymology.Vol2 No.2 pp97-105)。

    Genex有限公司的美国专利4,946,778(后来由Enzon 公司获得)描述了一种生产scFv片段(也称为SCA:单链抗原结合蛋白)的技术。对于完整的抗体而言,该scFv片段基本上具有与其类似的特异性和亲和性行为。

    Genentech公司的美国专利4,816,567描述了小鼠-人嵌合抗体以及嵌合Fab片段的重组免疫球蛋白的制备方法。

    在第一届“抗体工程:新技术和应用前景”国际会议(1990年在美国加利福尼亚州圣地亚哥召开,由IBC USA Conferences Inc.组织)以及第四届抗体工程国际会议(1993年在美国加利福尼亚州Coronado开幕,同一组织者)的会议记录中,Cytogen公司报告了一种合成肽,其是由人血小板血纤蛋白原受体特异性的小鼠MAb的重链可变区的CDR3互补决定区的氨基酸序列所含信息而得到的。这种合成肽保留着原始抗体的抗原识别性能。

    最近,M.J.Berry等人(Journalof Chromatography,587:161-169,1991)报告了由重组DNA技术生产的Fv抗体片段在多孔硅胶中的固定化,以及其在纯化鸡蛋溶菌酶中的应用,其中以完整抗体为对比物。作者指出了抗体片段适于作免疫亲和层析的原因,其中之一便是与由哺乳动物细胞培养物中制备的完整抗体相比,在E.coli中利用微生物制备抗体片段,降低了成本。另外,基于重量比,抗体片段具有更高的抗原容量(antigen capacity)。再者,抗体片段小到足以固定于硅胶基质的孔内而不需显著降低孔大小。

    M.J.Berry和J.J.Pierce(Journa1 of Chromatography,629:161-168,1993)还证实了采用固定于溴化氰活化琼脂糖凝胶上的Fv和scFv片段免疫纯化鸡蛋溶菌酶的可能性。在他们的研究中,他们证实了在100次纯化循环后,这些免疫吸附剂在其捕获抗原能力方面的稳定性。

    最近,T.M.Spitznagel和D.S.Clark发表了一篇论文,涉及对固定化抗体和抗体片段的表面密度及方向的研究。他们指出,Fv比Fab或完整抗体具有更好的抗原结合能力。在这一方面,他们证实了去掉不必要的蛋白区域(即抗体中的恒定区)能有利于改善免疫吸附剂的总容量(Bio/Technology,11:825-828,1993)。

    本发明涉及MAbCB-Hep.1(欧洲专利申请480525)在疫苗抗原的纯化方法的免疫亲和层析步骤中的另一种应用。采用由编码MAbCB-Hep.1可变区的基因构建的scFv,可以避免使用在培养物和实验动物(BALB/c小鼠)中的真核细胞(杂交瘤)作为MAb的来源。为了符合已有的国际标准,即保证在杂交瘤、培养技术中所用的血清、或者实验小鼠中不含外来因子(Office of Biologics Research and Review,Center for Drugs and Biologics,FDA。在生产和试验用于人类的单克隆抗体产品的几点注意事项,备忘录,1993),采用scFv代替完整抗体可以大大地降低和简化MAb和由其构建的亲和载体所需的制备和证实步骤。这一点同样适用于由免疫亲和纯化的疫苗抗原的最终制备中的证实步骤(Office of Biologics Research and  Review,Center  for Drugs and  Biologics,FDA。在生产和试验由重组DNA技术生产的新药和生物制品中的几点注意事项,草案,1985)。

    由于scFv是在E.coli中制备的,因此其大大降低和简化了关于MAb的应用的规章步骤,从而降低了成本,增加了疫苗抗原的潜在生产能力,这一点是基于E.coli可以大规模发酵。本发明的目的就在于由本发明获得的这种片段及其在纯化HBsAg抗原中的应用。

    本发明的技术方案得到的一个意外的结果是发现scFv片段与E.coli的内膜相结合,而不是被转移到细菌的周质空间这一特性。这一特性,与MAbCB-Hep.1重链可变区的特定氨基酸序列一起可以被转移至在E.coli表达的其它融合蛋白上,以达到促进纯化的目的。这一方面构成了本发明的另一目的。

    附图的简要说明

    图1为在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的生物量样品的分析,其显示出在这些条件下,一种分子量为32-33千道尔顿(kDa)的新蛋白被表达,其不溶于水并且与细胞结构相结合。其在MM294中的表达水平为约占细菌蛋白总量的15-20%。

    为了构建HBsAg特异性的scFv抗体片段,首先,提取分泌MAbCB-Hep.1的杂交瘤细胞的总RNA;这种RNA被用作模板合成第一链DNA(cDNA);利用后者(cDNA)采用聚合酶链反应(PCR)技术(PCR,Oste,C.1988.Biotechniques 6:162-167)及一系列合成寡核苷酸对编码重链(VH)和轻链(VL)可变区的基因进行特异性扩增反应。这一方法以前已有描述(Ayala,M等人,1992.Biotechniques,13:790-799)。

    扩增过的VH和VL可变区被亚克隆并测序而得到共有核苷酸序列。从这种序列出发,以VH-接头-VL的顺序设计新的合成寡核苷酸以构建scFv。所采用的接头结构为Chaudhary等人所报道的结构(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1066-1070,1990)。用PCR获得的、随后用常用的限制性内切酶酶切的scFv片段被连接到已预先被同类酶酶切过的表达载体pPACIB.1上(J.Gavilondo等人,第四届抗体工程国际会议记录,1993年12月,美国Coronado)。用连接后的材料转化E.coli MC1061感受态细胞,在选择性半固体培养基上得到的菌落用限制性内切酶检测是否存在克隆基因。

    随后,用选定的质粒,命名为pPACIB.1/scFv anti  HBsAg,转化不同的E.coli菌株(MM294、coliB、W3110、BMH71-18)以进行表达研究。采用在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中电泳,在重组MM294和coliB细胞中证实了有分子量大小为32-33kDa的一种新的胞内不溶性蛋白的表达。用特异性抗血清进行的蛋白质印迹分析表明该蛋白为抗HBsAg的scFv。

    为评价这种新蛋白的生物活性,将转化的细菌菌株MM294在300ml摇瓶中培养,并用6M尿素从膜组分中提取scFv。将这种溶解的蛋白对pH8.0的磷酸缓冲液进行透析,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测试,其中的聚苯乙烯板用重组HBsAg覆盖,利用CB-Hep.1辣根过氧化物酶缀合抗体的特异性抗Fab可以看到片段-抗原反应。

    一旦在ELISA中显示出scFv对HBsAg的特异性识别,则立即从上述溶解和透析过的蛋白质中纯化所述的片段。利用由表达质粒pPACIB.1赋于scFv的特点,即生产出的蛋白在氨基末端具有6-组氨酸功能区(6个组氨酸的功能区),采用了固定化金属(离子)亲和层析。

    对纯化后的scFv在溶液中结合重组HBsAg的能力进行了测试。在这些实验中,混合不同浓度的scFv和重组HBsAg,在上述ELISA体系中分析这些样品,并记录信号抑制。这些实验表明scFv和重组HBsAg的预温育将降低scFv与包被在固相上的抗原的结合力。

    最后,将抗HBsAg固定于溴化氰激活的琼脂糖凝胶CL-4B上,并测试该载体对提纯的HBsAg以及重组酵母HBsAg粗提物的吸附和脱附作用。这些测验证实了抗HBsAg的scFv纯化抗原的能力。

    以下将通过实施例阐明本发明,但不限制其范围。实施例1

    用聚合酶链反应(PCR)扩增编码MAbCB-Hep.1的重链和轻链可变区(分别为VH和VL)的基因,克隆以及碱基测序步骤(a)分离RNA

    采用Gough等人建议的方法(Anal.Biochem.173:93-95,1988)从分泌MAbCB-Hep.1的杂交瘤物细胞中分离总RNA。简单地说,离心法收集5×106个培养细胞,用磷酸缓冲盐溶液洗细胞二次。用振荡混合器将细胞悬浮于200μl冷的溶液A(10mM Tris/HCl、150mMNaCl、1.5mMMgCl2、0.65%NP-40,pH7.5)中,在8000rpm将该溶液离心5分钟,将细胞转移至含有200μl溶液B(7M尿素、1%SDS、30mMNaCl、10mM EDTA、10mM Tris/HCl pH7.5)的反应瓶中温和地混合。加入苯酚∶氯仿(1∶1)并振荡混合1分钟。在12000rpm离心5分钟后,水相被转移至新的反应管中,用冷无水乙醇和盐沉淀RNA。步骤(b)cDNA合成

    用得到的RNA作模板,以寡dT为引物,用不同的脱氧核苷酸和反转录酶合成第一链互补DNA(cDNA)(Gavilondo,J.V.等人,1990.Hybridoma,9:407-417)。步骤(c)PCR扩增

    采用PCR对CB-Hep.1的重链和轻链编码基因,即从前导区(信号肽)至CH1或Ck,进行特异性扩增。根据购得的免疫球蛋白可变区碱基序列数据库设计合成寡核苷酸。PCR条件在其它文献中有描述(GavilondoJ.V.等人,1990Hybridoma 9:407-417)。

    表1    用于对编码VH和VL区的基因的特异性PCR扩增的合成寡核苷酸重链可变区Oligo    No.15′末端:EcoRV-VH信号序列5′...GCGGGATATCATG(AG)AA(CG)A(CG)CTGGGT(CT)(AT)T(CT)CTCT...3′Oligo    No.25′末端:EcoRV-VH信号序列5′...GCGGGATATCATG(AG)A(CG)TT(CG)(TG)GG(CT)T(AC)A(AG)CT(TG)G(AG)TT...3′Oligo    No.33′末端:SalI-CH1(来自于小鼠的IgG1、2、3)5′...CCCGTCGACA(TC)CTCACACACAGG(AG)CCAGTGGATAGAC...3′轻链可变区Oligo    No.45′末端:ECoRV-VL信号序列5′...GGGATATCATGGA(GA)(AT)CACA(GT)(AT)C(CT)CAGGTCTT(TC)(AG)TAT(TA)(CT)ACTG...3′Oligo    No.53′末端:SalI-Ck小鼠5′...CCGTCGACAC TGGATGGTGGGAAGATGGA...3′注释:在括号中显示的是所产生的一些引物具有简并位点。

    用苯酚抽提将扩增序列由低熔点熔脂糖中纯化出来,并用EcoRV和SalI酶切克隆到测序载体中(分子克隆实验手册,第2版,作者:Sambrook,Fritsch和Maniatis)。步骤(d)将扩增的VH和VL区克隆到Bluescript(pBS)IIks+/-质粒上进行测序

    用上述限制性内切酶酶切pBs,通过两个不同反应连接该载体和PCR插入物:(1)pBS+VH以及(2)pBS+VL。用连接产物转化E.coli感受态细胞(菌株MC1061),随后涂布在半固体选择性培养基上于37℃培养(分子克隆实验手册,第2版,1989,作者Sambrook,Fritsch及Maniatis)。

    在从数个细菌菌落中提纯质粒后,用限制性内切酶酶切以检测预期的连接产物(分子克隆实验手册,第2版,1989,作者Sambrook,Fritsch及Maniatis),也就是分别对应于pBS(约2.7Kb)和插入的可变区(约500bp)的两条电泳带,这样就选择到重组载体。对每个区(VH和VL)至少选择5个克隆用于测序。步骤(e)编码MAbCB-Hep.1的VH和VL区的基因的核苷酸序列测定。

    测序是根据Sanger法(分子克隆实验手册,第2版,作者:Sambrook,Fritsch及Maniatis)在质粒双螺旋的变性链(用10NNaOH处理)上进行的,采用的是通用引物(其在质粒的多克隆位点区之外与质粒杂交,并允许从两个方向对克隆基因进行测序)。

    运用载止至1991年已报道的免疫球蛋白可变区序列数据库(Kabat等人(Kabat,E.A.,T.T.Wu,H.M.Peery,K.S.Gottesman,C.Foeller),1991,Sequences of proteins of immunological interest. Vol.11,第5版,U.S.Dept.Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242),使得任何新测序的可变区分布在几个规定的亚组中的一个中。VH区分在亚组IIIC中,VL分在亚组I中。

    VH碱基序列(小写字母)和氨基酸序列(大写字母):MAb    CB-Hep.1:(序列识别号1) atgaaatggagctgggtttttctcttaaaaggtgtccagtgt------------前导区  M  K  W  S  W  V  F  L  L  K  G  V  Q  C-14                                     -1 gaggtgaagctggatgaaactggaggaggcttggtgcaacctgggaggcccatg  E  V  K  L  D  E  T  G  G  G  L  V  Q  P  G  R  P  M +1 aaactctcctgtgttgcctctggattcacttttagt----------------FR1  K  L  S  C  V  A  S  G  F  T  F  S

                                  30 gacttctggatgaac-------------------------------------CDR1  E  F  W  M  N

             35 tgggtccgccagtctccggagaaaggactggagtgggtagca----------FR2  W  V  R  Q  s  P  E  K  G  L  E  W  V  A

                                        49 caaatcagagacaaacctgataattatgcaatatattattcagaatctgtgaaa  Q  I  R  D  K  P  D  N  Y  A  I  Y  Y  S  E  S  V  K

       52  a  b  c ggc-------------------------------------------------CDR2  G 65 agattcaccatctcaagagatgattccagaagtagtgtcttcctgcaaatgaac  R  F  T  I  S  R  D  D  S  R  S  S  V  F  L  Q  M  N

                                                 82  a  agtttaagacctgaagatacgggtatctattactgtacggcc----------FR3  S  L  R  P  E  D  T  G  I  Y  Y  C  T  A  b  c                                  94 ggttttgactat----------------------------------------CDR3  G  F  D  Y 95      102 tggggccaaggcaccactctcacagtctcctca-------------------FR4  W  G  Q  G  T  T  L  T  V  S  S103                           113

    VL碱基序列(小写字母)和氨基酸序列(大写字母)MAb    CB-Hep.1:(序列识另号2) atggattcacaggcccaggttcttatgttactgctgctatgggtatctggtacc  M  D  S  Q  A  Q  V  L  M  L  L  L  L  W  V  S  G  T-20 tgtggg-----------------------------------------------前导区  C  G

    -1 gacattgtgatgtcacagtctccatcctccctagctgtgtcagttggagagaag  D  I  V  M  S  Q  S  P  S  S  L  A  V  S  V  G  E  K +1 gttgctttgagctgc--------------------------------------FR1  V  A  L  S  C

             23 aagtccagtcagagtcttttatatcttaacaatcacaagaactacttggcc--CDR1  K  S  S  Q  S  L  L  Y  L  N  N  H  K  N  Y  L  A

          27  a  b  c  d  e  f                   34 tggttccagcagaaacctgggcagtctcctaaactgctgatttac--------FR2  W  F  Q  Q  K  P  G  Q  S  P  K  L  L  I  Y

                                           49 tgggcatccactagggattct--------------------------------CDR2  W  A  S  T  R  D  S

                   56 ggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcatg  G  V  P  D  R  F  T  G  S  G  S  G  T  D  F  T  L  M atcagcagtgtgaaggctgaagacctggcagtttattactgt-----------FR3  I  S  S  V  K  A  E  D  L  A  V  Y  Y  C

                                        88 caacaatattataattatccgtacacg--------------------------CDR3  Q  Q  Y  Y  N  Y  P  Y  T

                         97 ttcggaggggggaccaagctggaaataaaa-----------------------FR4  F  G  G  G  T  K  L  E  I  K

                           107实施例2

    由VH和VL区出发构建scFv抗体片段(VH-接头-VL),克隆于E.coli表达载体步骤(a)scFv的构建

    构建策略为进行第一次PCR扩增以修饰测序过的VH和VL区,包括加入编码一半引物的多余的碱基(Chaudhary等人,1990,Proc Natl Acad. Sci,USA 87:1066-1070)以及能使修饰过的VH和VL连接的限制性内切酶位点,然后将scFv基因插入片段克隆在表达载体中。表2描述了以VH和VL的精确序列为基础设计的用于PCR扩增的合成寡核苷酸。

    表2  在构建scFv基因的第一次PCR反应中使用的合成寡核苷酸重链可变区5′末端:Oligo No.5:EcoRI-FR1-VH.-5′...GG/GAATTC/TGAGGTGAAGCTGGATGAAACTGG...3′3′末端:Oligo No.6:BamHI-接头-FR4-VH:5′..CCC/GGATCC/AGATCCTGAGGATTTACCCTCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCC..3 ′轻链可变区5′末端:Oligo No.7:BamHI-接头-FR1-Vk5′...GGG/GGATCC/GAATCCAAAGTCGACGACATTGAGCTCACCCAGTCT...3′3′末端:Oligo No.8:EcoRV-FR4-/小鼠Vk5′...CC/GATATC/CTATTATTTTATTTCCAGCTTGGTCC...3′

    在扩增后,经修饰的VH和VL区被提纯,用BamHI酶切并用T4DNA连接酶等比例连接(分子克隆实验手册,第2版,1989,作者Sambrook,Fritsch及Maniatis)。随后,这一连接产物(约720bp的基因片段)用寡核苷酸5和8(表2)进行第二次PCR扩增,以富集scFv材料。然后提纯scFv,用EcoRI和EcoRV酶切,连接到预先由相同的限制性内切酶酶切的pPACIB.1载体上。pPACIB.1为一个设计用来在Ecoli的周质空间表达异源蛋白质的质粒。该质粒有一些调节序列:启动子(色氨酸)、用于蛋白质分泌的ompA信号肽编码区、以及一个6-组氨酸编码功能区,该功能区会使成熟表达蛋白的氨基末端出现6-组氨酸,以用于采用固定金属离子亲和层析的纯化过程。(Gavilondo,J.V.等人,第4届抗体工程年会会议记录,IBC Conferences Inc.美国加利福尼亚州Coronado,1993年12月8-10E)。

    用载体和scFv基因插入片段的连接产物转化E.coli MC1061感受态细胞,转化后将细胞涂布在半固体选择性培养基上,37℃培养。为了选择重组载体,将细菌菌落在液体培养基中培养,而后进行质粒DNA提取(分子克隆实验手册,第2版,1989,作者Sambrook,Fritsch及Maniatis)。随后将质粒DNA用内切酶EcoRI和EcoRV酶切,用琼脂糖凝胶电泳并用紫外灯观察。重组克隆选自那些具有两条带酶切图谱的克隆,其中一条带对应于线性pPACIB.1(约2.9Kb),第二条带对应于scFv(约720kp)。步骤(b)scFv在E.coli中的表达

    用在步骤(a)中选择的2个重组质粒转化四株E.coli菌株(BMH71-18,coliB,W3110和MM294)以进行表达研究重组细菌在含有氨苄青霉素的液体培养基(LB)中于37℃培养过夜。在含有LB和氨苄青霉素的新鲜培养液中接种并在37℃培养3小时。通过向培养液中加入β-吲哚丙烯酸来诱导质白质的表达。对在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的生物量样品的分析显示,在这些条件下有一个分子量为32-33kDa的新蛋白表达,其不溶于水并与细胞结构相结合。该蛋白在MM294中的表达水平为约占细菌总蛋白的15-20%(图1)。

    通过蛋白质印迹法分析(分子克隆实验手册,第2版,1989,作者Sambrook,Fristch及Maniatis)显示这一蛋白为抗HBsAg的scFv,在该印迹分析中采用了抗CB-Hep.1的Fab片段(木瓜蛋白酶酶切)培养的、吸附E.coli蛋白以防止背景、并用重组抗原进行免疫纯化的大鼠多克隆抗体。在周质空间内用蛋白质即迹法或特异性ELISA检测均末发现scFv蛋白(见下文)。实施例3

    从细菌培养物中制备scFv,复性并进行抗原特异性分析步骤(a)抗HBsAg的scFv的提取和复性

    在通过这样一种方法,即超声波破碎、可溶性和不溶性细胞组分的分离、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移至硝酸纤维素上并进行蛋白质印迹分析,从重组细菌中提取scFv蛋白质后,发现所述的scFv蛋白还与不溶性细胞组分结合在一起。透射电镜研究显示并无包涵体存在,这意味着所述的scFv蛋白质可能还与细菌内膜结合在一起。编码VH的前24个残基的碱基诱变实验表明,在VH中存在的特定的碱性氨基酸与scFv与细菌内膜的结合有关,其阻止了scFv向细菌周质空间的转运。由于这一末预料到的情形,通过下述方法分离的蛋白质的纯度为70%,所述的方法包括下述步骤:(a)通过超声波和离心将不溶性和可溶性细胞材料分离,(b)用低摩尔浓度的尿素(2M)洗涤,(c)在高摩尔浓度的尿素(6M)中溶解(图1)。由此溶解的材料出发,可以通过对PBS,pH8.0在低温下透析使蛋白质复性,随后将透析过的材料离心,含有复性scFv的可溶相用作进一步分析。步骤(b)scFv对固定化抗原(EIA聚苯乙烯板)的识别

    通过蛋白质印迹法免疫鉴定的E.coli scFv蛋白被送去进行上述的复性过程,并分析其对复盖在EIA板上的HBsAg抗原的识别能力。简单地说,在聚苯乙烯板Costar)上涂覆5μg/ml的重组HBsAg纯化制剂的碳酸盐-碳酸氢盐溶液(pH9.6),于4℃过夜。所述的板用含有2%脱脂乳的PBS(pH7.2)在37℃封闭2小时。加入不同的样品:(a)在PBS-1%脱脂乳中从1∶2稀释至1∶32的复性scFv,(b)不同浓度的由酶切MAb CB-Hep.1而获得的Fa b,(c)用来作为阴性对照的抗癌胚抗原的scFv,浓度为1μg/ml(Ayala等人,1992,BioTechniques 13:790-799)。在室温下温育这些样品2小时,随后加入浓度为4μg/ml溶于PBS-1%脱脂乳中的CB-Hep.1 Fab特异性大鼠抗体,在37℃,1小时后,加入在PBS-1%脱脂乳中稀释为1∶3000的A蛋白-辣根过氧化物酶,最终的反应是与OPD-过氧化氢进行的。用自动读板机(Multiscan mc 340,flow Laboratories)读取492nm的吸收值。在每一步骤后均要充分洗板(10次)。

    表3    在ELISA中scFv对重组HBsAg的识别样品                     在492nm处吸收值MAb CB-Hep.1的Fab(1μg/m1)   0.95抗-HBsAg scFv(复性)          1.54抗-HBsAg scFv(复性/纯化)     0.68抗-CEA scFv(周质空间)        0.014MM294(重组体)的周质空间      0.09MM294(非重组体)的周质空间    0.003注释:表中结果显示复性的scFv特异性地识别重组HBsAg。步骤(c)用固定金属离子亲和层析(IMAC)纯化scFv

    将步骤(a)中获得的scFv对0.1M磷酸钠、0.5MNaCl,pH8.0(偶联溶液)进行透析,并加到Sepharose-IDA-Ni+2中进行纯化,这种纯化利用的是在scFv蛋白中存在6-组氨酸功能区。已有报告指出,这种特点的功能区赋予蛋白质对于上述类型的层析载体有非常高的亲和性,提供了一种简单的、可再现的纯化方法(Skerra等人,1991.BioTechnology 9:273-278;J.Porath,1992 Protein Expression and Purification 3:263-281).

    当偶联完成后,首先用10倍于胶体积的偶联溶液(pH调为6.3)洗胶,然后用pH调至5.0的溶液进行相似的洗涤(洗脱E.coli杂蛋白)。用同样的溶液在pH4.0洗脱scFv。

    在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的电泳结果显示纯度约为90%。相关的组分立即用Tris碱中和。在ELISA中抗原的特异性识别测试显示洗脱的scFv保持了其活性(表3)。步骤(d)scFv在溶液中结合抗原的能力

    用上述方法确定了纯化的scFv和Fab(由酶切MAbCB-Hep.1获得并经纯化)对复盖在聚苯乙烯板上的重组抗原的最佳结合浓度(饱和)。它们分别是37μg/ml和1μg/ml。将处于最佳结合浓度的每种类型抗体片段以不同的摩尔比与抗原在溶液中于室温下温育2小时(用scFv,其摩尔比以1∶3.5开始;用Fab,其摩尔比以1∶10开始)。这段时间过后,各自独立地将所述的混合物加到复盖有抗原的板上。按前述进行ELISA程序。由吸收值计算抗体片段与包被的抗原结合的抑制百分数(这一百分数为在溶液中抗体片段与抗原的结合能力的一个指数)。

    表4    在与抗原在溶液中温育后,对抗HBsAg的scFv与包被的抗原的结合的抑制样品                        摩尔比(片段∶抗原)MAb CB-Hep.1的Fab(1μg/ml)  1∶10   1∶5   1∶2.5    1∶0抑制百分数                  96      85.9   65.7      0抗-HBsAg scFv(37μg/ml)     11∶3.5 1∶0.7 1∶0.14   1∶0抑制百分数                  95.1    76.4   12 .8     0实施例4

    用scFv免疫纯化重组HBsAg的分析步骤(a)将抗HBsAg的scFv固定于琼脂糖凝胶CL-4B,研究其对纯抗原的结合和洗脱

    为了将scFv固定于溴化氰激活的琼脂糖凝胶,将提纯的片段对含有NaCl的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液(pH8.6)进行透析。将浓度为0.3mg/ml的scFv溶液迅速加到已预先用碳酸盐-碳酸氢盐/NaCl缓冲液水合并洗涤的凝胶中。经室温温育过夜后,去掉末偶联的片段。作为阴性对照,以相同的方法制备不含配体的凝胶。为进行结合-洗脱分析,将饱和量的重组HBsAg加到含有20mMTrisHCl(pH8.0)及NaCl的溶液中。在洗涤后,用3M硫氰酸钾在20mM Tris HCl(pH8.0)中的溶液洗脱抗原。表5所示结果表明固定化的scFv具有结合和洗脱重组HBsAg的能力。

    表5用固定于Sepharose CL-4B的scFv结合和洗脱重组抗原

               洗脱的HBsAg量(mg)Sepharose-scFv      0.126Sepharose-无配体    0.012步骤(b)用重组scFv片段从粗提物中免疫纯化乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。

    按照厂商建议(Pharmacia,Sweden),将提纯的重组scFv片段偶联到Sepharose CL-4B凝胶上,该凝胶被溴化氰活化。偶联配体密度约为每ml活化凝胶5mg蛋白质。作为实验对照,将单克隆抗体CB-Hep.1用相同方法偶联到相同的基质上。以线性流速为50cm/h将胶填充到一个1.2ml柱中(直径为0.7cm)。

    实验是通过将从转化的巴斯德毕赤酵母获得的半提纯的HBsAg制品装入所述的柱来进行。所述的HBsAg是由胞内获得的,通过破碎细胞、进一步酸沉淀以及硅藻土吸附而提取出来(欧洲专利申请480525)。这一制品含有15-20%的纯HBsAg。采用高纯度的HBs Ag(纯度>95%)作为本实验的对照。

    在所有的层析过程中,含有2mg HBsAg的起始材料用20mM Tris-HCl,1M NaCl,3mM EDTA,pH7.2稀释后以线性速率为25cm/h加入。这一步骤后,以50cm/h泵入5倍柱体积的相同缓冲液洗柱子。洗脱步骤是用相同的缓冲液+3MKSCN。通过柱出口测量280nm吸收值来监测层析过程。结果证明偶联的scFv确实以很高的特异性来识别表面抗原。洗脱下来的HBsAg经SDS-PAGE检测具高于90%的纯度,其性能与用完全单克隆抗体获得的HbsAg一样好。另外吸附能力与用CB-Hep.1一样高(见表6)。表6 采用Seph.CL-4B-scFv和Seph.CL-4B-CB.Hep.1免疫纯化HBsAg实验的结果实验配体起始材料   洗脱的HBSAg 洗脱物纯度*

                     毫克数1.scFv HBsAg,纯      0.54       >90%2.scFv HBsAg,纯      0.34       >90%3.scFv HBsAg,纯      0.51       >90%4.scFv粗提物,半纯    0.45       >90%5.scFv粗提物,半纯    0.26       >90%6.scFv粗提物,半纯    0.42       >90%7.CB-Hep.1粗提物,半纯0.52       >90%8.CB-Hep.1粗提物,半纯0.51       >90%9.CB-Hep.1粗提物,半纯0.37       >90%*由SDS-PAGE估算纯度。实施例5

    由MAb CB-Hep.1的重链可变区的前24个氨基酸与梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)膜抗原组成的不溶性融合蛋白在E.coli中的表达和纯化。

    采用一个病人的样本和PCR将梅毒密螺旋体膜抗原(TmpA)克隆于E.coli中。TmpA是以可溶性胞质蛋白形式表达的,其表达水平约为细菌蛋白质总量的30%。采用不同的层析方法和其联合使用(凝胶中的尺寸排阻、离子交换)使得由SDS-PAGE测得的纯度不超过60%。最重要的污染物是细菌的可溶性胞质蛋白。

    为清除这些污染物以及促进所述抗原的纯化过程,通过使蛋白的氨基末端与MAbCB-Hep.1的重链可变区的前24个氨基酸融合而使该蛋白不溶化。为达到这一目的,采用由PCR克隆的TmpA碱基序列,以及加在TmpA碱基序列5’端的编码上述24个氨基酸残基的合成衔接头构建一个融合基因,并插入到表达载体pPACIB.1中。

    该新的融合蛋白在E.coli W3110中以高于占细菌蛋白总量的10%的水平表达,并且现为不溶性蛋白。用病人的血清通过蛋白质印迹法显示,所述的新蛋白质因含有TmpA抗原而被识别。为纯化所述的新融合蛋白质,用尿素和盐酸胍处理超声波破碎的重组细菌的不溶组分,加样到Sepharose-IDA-Cu+2凝胶中(固定金属离子亲和层析),选择性洗脱融合蛋白质,其最终纯度高于90%(由SDS-PAGE测得)。关于图1的文字说明:15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。抗HBsAg在菌株MM294中表达。重组蛋白抽提方法。泳道1:重组MM294的总蛋白泳道2:细菌沉淀与PBS-溶菌酶温育后的上清液泳道3:泳道2的沉淀物泳道4:泳道3的沉淀物超声破碎后的上清液泳道5:破碎后的沉淀物泳道6:用PBS-2M尿素洗涤泳道5的沉淀物的上

       清液泳道7:用PBS-2M尿素洗后的沉淀物泳道8:用6M尿素加溶后的上清液泳道9:加溶后的沉淀物注:箭头所指为32-33KDa scFv的位置。

    表7scFv的核苷酸和氨基酸序列gag gtg aag ctg gat gaa act gga gga ggc ttg gtg caa cct E   V   K   L   D   E   T   G   G   C   L   V   Q   Pggg agg ccc atg aaa ctc tcc tgt gtt gcc tct gga ttc act G   R   P   M   K   L   S   C   V   A   S   G   F    Tttt agt gac ttc tgg atg aac tgg gtc cgc cag tct ccg gag F   S   E   F   W   M   N   W   V   R   Q   S   P   E

        ------VH.CDR1------aaa gga ctg gag tgg gta gca caa atc aga gac aaa cct gat K   G   L   E   W   V   A   Q   I   R   D   K   P   Daat tat gca ata tat tat tca gaa tct gtg aaa ggc aga ttc N   Y   A   I   Y   Y   S   E   S   V   K   G   R   F----VH.CDR2------------------------------------acc atc tca aga gat gat tcc aga agt agt gtc ttc ctg caa T   I   S   R   D   D   S   R   S   S   V   F   L   Qatg aac agt tta aga cct gaa gat acg ggt atc tat tac tgt M   N   S   L   R   P   E   D   T   G   I   Y   Y   Cacg gcc ggt ttt gac tat tgg ggc caa ggc acc act ctc aca T   A   G   F   D   Y   W   G   Q   G   T   T   L   T

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           -------------------------------接头----------aaa gtc gac gac att gtg atg tca cag tct cca tcc tcc cta K   V   D   D   I   V   M   S   Q   S   P   S   S   Lgct gtg tca gtt gga gag aag gtt gct ttg agc tgc aag tcc A   V   S   V   G   E   K   V   A   L   S   C   K   Sagt cag agt ctt tta tat ctt aac aat cac aag aac tac ttg S   Q   S   L   L   Y   L   N   N   H   K   N   Y   L---------------------VL.CDR1---------------------------gcc tgg ttc cag cag aaa cct ggg cag tct cct aaa ctg ctg A   W   F   Q   Q   K   P   G   Q   S   P   K   L   Latt tac tgg gca tcc act agg gat tct ggg gtc cct gat cgc I   Y   W   A   S   T   R   D   S   G   V   P   D   R

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                                  30     gacttctggatgaac-------------------------------------CDR1  E  F  W  M  N

             35 tgggtccgccagtctccggagaaaggactggagtgggtagca----------FR2  W  V  R  Q  S  P  E  K  G  L  E  W  V  A

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一种乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特异性的重组单链Fv(scFv)抗体片段。使用重组DNA技术在大肠杆菌中生产scFv片段。所述的scFv可以用来代替在公知的生产HBsAg的方法中的一个纯化步骤中采用的小鼠单克隆抗体(MAb)CB-Hep.1。利用重组DNA技术,将编码MAbCB-Hep.1的重链和轻链可变区的基因进行克隆和修饰,可以生产该scFv抗体片段。该scFv片段对HBsAg具特异性,。

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