《一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810312282.7 (22)申请日 2018.04.09 (71)申请人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安南路199号 (72)发明人 张延妮 李娜 岳宣峰 董敏 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 徐文权 (51)Int.Cl. A61K 36/896(2006.01) (54)发明名称 一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种采用超声提取法提取藜 芦中总生物碱的方法， 属于生。
2、物医药技术领域。 本发明公开的提取藜芦总生物碱的方法， 采用超 声法提取， 通过设计不同因素各水平响应面优化 法考察超声提取藜芦生物碱的最佳提取条件， 采 用酸性染料比色法测定藜芦总生物碱含量。 与传 统提取方法(回流提取法)相比， 超声提取法提取 藜芦总生物碱得率明显高于回流提取法。 本发明 公开的采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的 方法， 以乙醇作为提取溶剂， 乙醇无毒且价格低 廉， 能够显著降低生产成本， 使得本发明具有简 单、 省时、 安全、 简便、 成本低等优势， 能够缩短浸 提时间， 很好的保持生物碱的品质和特性， 满足 工业化大规模的生产需求。 权利要求书1页 说明书9页 附图2。
3、页 CN 108379431 A 2018.08.10 CN 108379431 A 1.一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)按1g： (1020)mL的料液比， 取藜芦粉末和乙醇， 在功率为300400W、 温度为5060 的条件下， 超声提取4055min， 收集提取液， 然后经离心、 减压浓缩回收溶剂， 制得藜芦 提取物； 2)向藜芦提取物中加入10酒石酸溶液， 搅拌均匀后过滤、 洗涤， 再调节溶液pH值至 10， 然后经萃取、 减压浓缩回收溶剂， 蒸干后用甲醇溶解、 过滤， 制得藜芦总生物碱。 2.根据权利要求1所述的采用超声提取法提取藜芦中。
4、总生物碱的方法， 其特征在于， 步 骤1)中， 按1g： 15mL的料液比， 取藜芦粉末和乙醇， 在功率为350W、 温度为60的条件下， 超 声提取50min。 3.根据权利要求1所述的采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 其特征在于， 步 骤1)中， 所用乙醇的浓度为6080。 4.根据权利要求1所述的采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 其特征在于， 步 骤1)中， 所用藜芦粉末是经氨水碱化处理后的粉末。 5.根据权利要求4所述的采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 其特征在于， 所 述氨水碱化处理是将藜芦药材按照1g： 4mL的料液比用氨水浸泡3h后粉碎， 制得藜芦粉末。 。
5、6.根据权利要求1所述的采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 其特征在于， 步 骤2)中， 洗涤采用乙醚进行洗涤， 采用氢氧化钠调节溶液pH值至10。 7.根据权利要求1所述的采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 其特征在于， 步 骤2)中， 萃取采用氯仿， 萃取35次。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108379431 A 2 一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种采用超声提取法提取藜芦中总生物 碱的方法。 背景技术 0002 藜芦(Veratrum nigrum L.)系百合科多年生草本植物藜芦的干燥根。
6、及根状茎。 神农本草经 及 本草纲目 等均有记载。 主要分布于亚洲、 欧洲和北美洲， 我国有二十余 种， 全国大部分省区均有分布。 该属植物有涌吐风痰、 杀虫疗疮的功效， 用于治疗高血压、 中 风、 骨折和疟疾等疾病。 0003 现代研究表明， 藜芦的主要化学成分是生物碱， 且其生物碱种类较多， 母核为异胆 甾烷和胆甾烷生物碱， 还有少量二肽类、 黄酮类以及茋类化合物等成分。 药理研究表明藜芦 具有增强心肌收缩力、 抗肿瘤、 改善脑循环、 抑制血小板凝结和降低血压等作用。 藜芦是最 早被证实具有降压活性的其中一种药物， 藜芦属植物均具有降血压作用， 但不同品种的藜 芦属植物其降压的作用强度和持。
7、续时间都不一样。 所含生物碱中乌苏里藜芦碱对血液粘度 具有明显的降低作用， 乌苏里藜芦碱具有极强的改变血液流变性的作用， 环巴胺能够抑制 Hedgehog信号通路， 同时发现环巴胺在诱导癌症细胞调亡的时候， 不影响正常细胞的生长 情况， 在癌症治疗方面有巨大潜力， 同时抑制信号通路为抗癌药物的设计提供了新思路。 可 见藜芦生物碱有开发应有潜力， 但对优化其生物碱的提取方法未见报道。 0004 目前， 藜芦生物碱提取方法有溶剂浸渍提取法、 回流提取法、 超临界流体萃取法以 及氯仿-甲醇超声提取法等。 溶剂浸渍提取法溶剂消耗量大、 耗时长， 提取率低； 回流提取法 需要对药液多次、 长时间加热， 。
8、这对生物碱具有一定的破坏性， 且加热需要消耗大量能源； 超临界二氧化碳萃取过程中， 由于藜芦生物碱本身的性质， 给萃取造成很大的困难， 同时需 加入夹带剂如甲醇、 氯仿等， 使超临界CO2萃取法失去了无毒， 萃取效率高等优势， 从设备费 用上， 超临界萃取设备一般比较昂贵， 目前已有报道的超临界CO2萃取藜芦生物碱的时间也 较长。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 该方法 操作简单， 对设备要求低， 提取率高， 适合工业化规模生产。 0006 本发明是通过以下技术方案来实现： 0007 本发明公开了一种采用超声提取法提取藜芦中总生物碱的方法，。
9、 包括以下步骤： 0008 1)按1g： (1020)mL的料液比， 取藜芦粉末和乙醇， 在功率为300400W、 温度为50 60的条件下， 超声提取4055min， 收集提取液， 然后经离心、 减压浓缩回收溶剂， 制得 藜芦提取物； 0009 2)向藜芦提取物中加入10酒石酸溶液， 搅拌均匀后过滤、 洗涤， 再调节溶液pH值 至10， 然后经萃取、 减压浓缩回收溶剂， 蒸干后用甲醇溶解、 过滤， 制得藜芦总生物碱。 说 明 书 1/9 页 3 CN 108379431 A 3 0010 优选地， 步骤1)中， 按1g： 15mL的料液比， 取藜芦粉末和乙醇， 在功率为350W、 温度 为6。
10、0的条件下， 超声提取50min。 0011 优选地， 步骤1)中， 所用乙醇的浓度为6080。 0012 优选地， 步骤1)中， 所用藜芦粉末是经氨水碱化处理后的粉末。 0013 优选地， 所述氨水碱化处理是将藜芦药材按照1g： 4mL的料液比用氨水浸泡3h后粉 碎， 制得藜芦粉末。 0014 优选地， 步骤2)中， 洗涤采用乙醚进行洗涤， 采用氢氧化钠调节溶液pH值至10。 0015 优选地， 步骤2)中， 萃取采用氯仿， 萃取35次。 0016 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果： 0017 本发明公开的提取藜芦总生物碱的方法， 采用超声法提取， 超声波通过高频机械 波这种特。
11、殊的物理环境使细胞中的有效成分能够直接与溶剂接触并溶解在其中， 提高了有 效成分的提取率。 本发明通过设计不同因素各水平响应面优化法考察超声提取藜芦生物碱 的最佳提取条件， 采用酸性染料比色法测定藜芦总生物碱含量。 与传统提取方法(回流提取 法)相比， 超声提取法提取藜芦总生物碱得率明显高于回流提取法。 本发明公开的采用超声 提取法提取藜芦中总生物碱的方法， 以乙醇作为提取溶剂， 乙醇无毒且价格低廉， 能够显著 降低生产成本， 使得本发明具有简单、 省时、 安全、 简便、 成本低等优势， 能够缩短浸提时间， 很好的保持生物碱的品质和特性， 满足工业化大规模的生产需求。 附图说明 0018 图1。
12、a为超声时间和提取温度交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线 图； 0019 图1b为超声时间和料液比交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图； 0020 图1c为超声时间和超声功率交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线 图； 0021 图1d为提取温度和料液比交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图； 0022 图1e为提取温度和超声功率交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线 图； 0023 图1f为料液比和超声功率交互作用对藜芦生物碱得率影响的响应面及等高线图。 具体实施方式 0024 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明， 所述是对本发明的解释而 。
13、不是限定。 0025 实施例1 0026 一种超声法提取藜芦总生物碱的方法， 包括以下步骤： 0027 1)将药材经氨水碱化， 每1.00g藜芦粉末4.00mL氨水的比例浸泡3h。 0028 2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)， 置于圆底烧瓶中， 以1:15的 料液比加入60乙醇， 以50， 300w超声提取40min， 所得提取液经离心后， 减压浓缩回收溶 剂。 0029 3)所得提取物， 加10的酒石酸溶液溶解、 过滤， 乙醚洗涤， 酸水液经氢氧化钠溶 说 明 书 2/9 页 4 CN 108379431 A 4 液调节pH为10， 用氯仿萃取3次， 15ml/次。 0。
14、030 4)合并三次萃取液， 减压浓缩回收氯仿， 蒸干， 用甲醇溶解， 过滤并定容至10mL容 量瓶待测。 0031 实施例2 0032 一种超声法提取藜芦总生物碱的方法， 包括以下步骤： 0033 1)将药材经氨水碱化， 每1.00g藜芦粉末4.00mL氨水的比例浸泡3h。 0034 2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)， 置于圆底烧瓶中， 以1:15的 料液比加入80乙醇， 以60， 350w超声提取50min， 所得提取液经离心后， 减压浓缩回收溶 剂。 0035 3)所得提取物， 加10的酒石酸溶液溶解、 过滤， 乙醚洗涤， 酸水液经氢氧化钠溶 液调节pH为10， 用。
15、氯仿萃取3次， 15ml/次。 0036 4)合并三次萃取液， 减压浓缩回收氯仿， 蒸干， 用甲醇溶解， 过滤并定容至10mL容 量瓶待测。 0037 实施例3 0038 一种超声法提取藜芦总生物碱的方法， 包括以下步骤： 0039 1)将药材经氨水碱化， 每1.00g藜芦粉末4.00mL氨水的比例浸泡3h。 0040 2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)， 置于圆底烧瓶中， 以1:20的 料液比加入70乙醇， 以55， 400w超声提取55min， 所得提取液经离心后， 减压浓缩回收溶 剂。 0041 3)所得提取物， 加10的酒石酸溶液溶解、 过滤， 乙醚洗涤， 酸水液经。
16、氢氧化钠溶 液调节pH为10， 用氯仿萃取3次， 15ml/次。 0042 4)合并三次萃取液， 减压浓缩回收氯仿， 蒸干， 用甲醇溶解， 过滤并定容至10mL容 量瓶待测。 0043 1、 总生物碱含量测定 0044 1)对照品溶液的配制 0045 称取4.00mg藜芦定对照品， 用甲醇溶解定容于10mL容量瓶， 配制成浓度为0.40mg/ mL的藜芦定对照品溶液。 0046 2)测定条件的选择 0047 取对照品溶液、 供试品溶液各1.00mL， 置于50mL磨口锥形瓶中， 挥干溶剂， 精密加 入邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液5.00mL， 再精密加入pH 4.5溴甲酚绿显色剂溶液 4.0。
17、0mL、 氯仿10.00mL， 密塞， 振摇， 转移至分液漏斗中， 静置1h后分出氯仿层， 用干燥无水硫 酸钠0.20g脱水30min。 用紫外分光光度计在200800nm范围做全波长扫描， 发现其最大吸 收波长均在412nm左右， 故选择412nm为测定波长。 0048 3)样品含量的测定 0049 取1.00mL样品溶液， 置于50mL磨口锥形瓶中， 按2.2.2项下的方法， 于412nm处测 定藜芦样品的吸光度， 平行测定3次， 计算总生物碱含量。 藜芦总生物碱得率的计算公式如 下： 0050 总生物碱得率()(提取物中总生物碱的质量/原料的质量)100 0051 测定结果参见表2。 说。
18、 明 书 3/9 页 5 CN 108379431 A 5 0052 2、 传统回流法、 超声提取法使用的提取对比例： 0053 对比例1 0054 传统回流提取藜芦总生物碱的方法， 包括以下步骤： 0055 1)将药材经氨水碱化， 每1.00g藜芦粉末4.00mL氨水的比例浸泡3h。 0056 2)取经1)碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)， 置于圆底烧瓶中， 用80的乙醇 15.00mL， 60回流提取2次， 每次50min。 0057 3)收集2)中两次提取液， 离心， 减压浓缩回收溶剂。 0058 4)得提取物， 加10的酒石酸溶液溶解、 过滤， 乙醚洗涤， 酸水液经氢氧化钠溶液。
19、 调节pH为10， 用氯仿萃取3次， 15ml/次。 0059 5)合并三次萃取液， 减压浓缩回收氯仿， 蒸干， 用甲醇溶解， 过滤并定容至10mL容 量瓶待测。 0060 3、 本发明的提取方法各因素优化实验 0061 超声法提取藜芦总生物碱的方法， 包括以下步骤： 0062 1)将药材经氨水碱化， 每1.00g藜芦粉末4.00mL氨水的比例浸泡3h。 0063 2)称取经氨水碱化后的藜芦粉末1.00g(原药材质量)， 置于圆底烧瓶中， 加入一定 料液比的某浓度乙醇， 以一定条件超声提取， 所得提取液经离心后， 减压浓缩回收溶剂。 0064 3)在步骤2)中加入乙醇浓度为20， 40， 60。
20、， 80， 100， 超声时间设为20， 30， 40， 50， 60min， 超声温度分别为30， 40， 50， 60， 70， 料液比分别为1:5， 1:10， 1:15， 1:20， 1:25， 超声 功率分别为200， 250， 300， 350， 400， 450W。 0065 4)经3)中个单因素水平得提取物， 加10的酒石酸溶液溶解、 过滤， 乙醚洗涤， 酸 水液经氢氧化钠溶液调节pH为10， 用氯仿萃取3次， 15ml/次。 0066 5)合并三次萃取液， 减压浓缩回收氯仿， 蒸干， 用甲醇溶解， 过滤并定容至10mL容 量瓶待测。 0067 6)根据以上得不同条件水平下藜芦。
21、生物碱的得率， 选出影响较大的单因素条件， 在此基础上， 采用4因素3水平的响应面实验做进一步的优化， 见表1。 运用Design-Expert软 件对实验数据进行回归分析， 预测提取藜芦生物碱的最佳工艺参数。 具体的因素水平及结 果见表2， 3。 0068 响应面等高线图能清晰的反映各因素之间的交互作用， 等高线图呈椭圆形表示两 因素交互作用显著， 呈圆形表示两因素交互作用不显著。 在其他因素固定的情况下， 考察各 个交互项对藜芦得率的影响， 利用Design-Expert 8.0.6软件对回归方程进行运算， 作出交 互项的响应面图及等高线图， 见图1a图1f。 从各因素之间两两相互作用的响。
22、应面图形观 察曲线走势越平滑， 其影响越小， 图形曲线走势较陡， 说明其影响最为显著。 结合表3和图1a 图1f可知， A、 C、 AB、 AC、 BD、 CD、 C2均呈显著影响， B、 D、 AD、 BC、 A2、 B2、 D2之间的交互作用均不 显著。 从单因素水平观察， 其影响顺序为： C(料液比)A(超声时间)B(提取温度)D(超声 功率)。 在有交互作用存在下， 对藜芦生物碱得率的影响顺序为： CDABACBDADBC。 0069 7)以藜芦生物碱得率(R)为响应值， 模拟得到二次多元回归方程如下： R0.95 0.15A0.032B0.16C0.032D0.18AB+0.17AC。
23、+0.050AD+0.033BC0.16BD+0.30CD 0.029A20.031B2+0.11C2O.035D2 0070 8)回归模型验证： 由Design-Expert 8.0.6软件分析， 模拟得到藜芦中总生物碱提 说 明 书 4/9 页 6 CN 108379431 A 6 取的最佳工艺条件为： 乙醇浓度80， 超声时间50min， 提取温度60， 料液比1:15， 超声功 率350W， 此时总生物碱得率估计值为1.59。 为验证模型准确性， 按软件预测的最佳工艺条 件进行3组平行验证试验， 得其平均值为1.540.04， 与其理论值偏差为3.14， 证明响 应面法优化超声提取藜芦。
24、中生物碱提取工艺是可行的。 0071 9)不同提取方法提取总生物碱得率的对比参见表4， 结果表明， 本发明采用的超声 提取法与回流提取法相比， 超声提取法提取藜芦总生物碱得率明显高于回流提取法。 0072 表1响应面设计因素与水平 0073 0074 表2中心组合实验设计及结果 说 明 书 5/9 页 7 CN 108379431 A 7 0075 说 明 书 6/9 页 8 CN 108379431 A 8 0076 0077 表3模型回归方差分析 0078 说 明 书 7/9 页 9 CN 108379431 A 9 0079 0080表4不同提取方法提取总生物碱得率的对比 0081 说 明 书 8/9 页 10 CN 108379431 A 10 0082。 说 明 书 9/9 页 11 CN 108379431 A 11 图1a 图1b 图1c 说 明 书 附 图 1/2 页 12 CN 108379431 A 12 图1d 图1e 图1f 说 明 书 附 图 2/2 页 13 CN 108379431 A 13 。