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摘要
申请专利号:

CN201780010942.X

申请日:

20170210

公开号:

CN109069669A

公开日:

20181221

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:

IPC分类号:

A61K48/00,C12N15/86

主分类号:

A61K48/00,C12N15/86

申请人:

康贝基因有限公司

发明人:

迈拉卜·库卡亚

地址:

瑞典隆德

优先权:

SE1650192A,EP2017053049W

专利代理机构:

中科专利商标代理有限责任公司

代理人:

张国梁;张莹

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内容摘要

本发明涉及重组腺伴随病毒(rAAV)载体,其包含神经肽Y(NPY)编码序列和神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列。本发明进一步涉及包含所述载体的AAV颗粒,其中所述载体由腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白包封。还涉及包含所述AAV颗粒的药物组合物,用于预防或治疗哺乳动物的神经疾病例如癫痫。

权利要求书

1.一种重组腺伴随病毒(rAAV)载体,其包含神经肽Y(NPY)编码序列和神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列。 2.根据权利要求1所述的载体,其中所述神经肽Y(NPY)编码序列具有对应于SEQIDNO:1的序列或与所述序列具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 3.根据权利要求1或2所述的载体,其中所述神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列具有对应于SEQIDNO:2的序列或与所述序列具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 4.根据权利要求1-3中任一项所述的载体,其中所述载体还包含以下功能元件中的至少一种,优选全部:AAV2倒置末端重复序列(ITR),杂合巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白CAG启动子(CAG),内部核糖体进入位点(IRES),土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化(bGH-polyA)信号序列。 5.根据权利要求4所述的载体,其中所述载体包含杂合巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白CAG启动子(CAG),并且所述CAG启动子序列位于NPY和NPY2R的编码序列的上游。 6.根据权利要求4至5中任一项所述的载体,其中所述载体包含内部核糖体进入位点(IRES),并且所述IRES序列位于NPY和NPY2R的编码序列之间。 7.根据权利要求4至6中任一项所述的载体,其中所述载体包含土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE),并且所述WPRE序列位于NPY和NPY2R的编码序列的下游。 8.根据权利要求4至7中任一项所述的载体,其中所述载体包含牛生长激素多腺苷酸化(BGHpA)信号序列,并且所述(BGHpA)信号序列位于NPY和NPY2R的编码序列的下游。 9.根据权利要求4至8中任一项所述的载体,其中所述载体包含两个ITR序列,第一ITR序列位于所述载体的5′端、NPY和NPY2R的编码序列的上游,和第二ITR序列位于所述载体的3′端、NPY和NPY2R的编码序列的下游。 10.根据权利要求4至9中任一项所述的载体,其中所述序列以如下顺序可操作地连接,5’-ITR,CAG,NPY,IRES,NPY2R,WPRE,BGHpA和ITR-3’,或5’-ITR,CAG,NPY2R,IRES,NPY,WPRE,BGHpA,和ITR-3’。 11.根据权利要求4至10中任一项所述的载体,其中所述5’端ITR具有对应于SEQIDNO:7的序列或与存在于SEQIDNO:7中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列和所述3’端ITR具有对应于SEQIDNO:8的序列或与存在于SEQIDNO:8中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 12.根据权利要求4至11中任一项所述的载体,其中所述CAG具有对应于SEQIDNO:4的序列或与存在于SEQIDNO:4中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 13.根据权利要求4至12中任一项所述的载体,其中所述IRES具有对应于SEQIDNO:3的序列或与存在于SEQIDNO:3中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 14.根据权利要求4至13中任一项所述的载体,其中所述WPRE具有对应于SEQIDNO:5的序列或与存在于SEQIDNO:5中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 15.根据权利要求4至14中任一项所述的载体,其中所述BGHpA具有对应于SEQIDNO:6的序列或与存在于SEQIDNO:6中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 16.根据权利要求4至15中任一项所述的载体,其中所述载体具有对应于SEQIDNO:9的序列或与存在于SEQIDNO:9中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列,或所述载体具有对应于SEQIDNO:10的序列或与存在于SEQIDNO:10中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。 17.根据权利要求4至16中任一项所述的载体,其中所述载体的序列已经过密码子优化以在人中表达。 18.根据权利要求4至16中任一项所述的载体,其中NPY2R编码序列在NPY编码序列的下游。 19.根据权利要求4至15中任一项所述的载体,其中所述CAG启动子序列与在所述CAG启动子序列的下游和所述IRES序列的上游的NPY或NPY2R的编码序列之间的距离在60至0个碱基的范围内,优选40至5个碱基,大多数优选20至10个碱基。 20.根据权利要求4至15中任一项所述的载体,其中所述IRES序列与下游NPY或NPY2R编码序列之间的距离在60至0个碱基的范围内,优选40至2个碱基,最优选10至4个碱基。 21.AAV颗粒,其包含权利要求1至20中任一项的载体,其中所述载体被腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白包封。 22.根据权利要求21所述的AAV颗粒,其中所述AAV衣壳蛋白选自由以下各项组成的组:AAV1,AAV2和AAV8,优选选自AAVl或AAV8,最优选AAV1。 23.根据权利要求21至22中任一项所述的AAV颗粒,其为AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY或AAV8-NPY/Y2。 24.根据权利要求21至23中任一项所述的AAV颗粒,其是AAV1-NPY/Y2。 25.药物组合物,其包含权利要求21至24中任一项的AAV颗粒,应用于预防,抑制,改善或治疗哺乳动物的神经疾病。 26.根据权利要求25的应用的药物组合物,其中所述神经疾病是癫痫或帕金森病。 27.根据权利要求25的应用的药物组合物,其中所述癫痫是药物抗性癫痫。 28.根据权利要求25的应用的药物组合物,其中所述神经疾病是帕金森病。 29.根据权利要求25至28中任一项的应用的药物组合物,其中所述组合物通过位点特异性颅内注射施用。 30.根据权利要求25至29中任一项的应用的药物组合物,其中将所述AAV颗粒配制成单剂量或多剂量,例如两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量施用。 31.根据权利要求25至30中任一项的应用的药物组合物,其中所述功能性AAV的有效剂量范围为0.01至100μg,例如0.1-50μg或0.5至20μg的功能性AAV颗粒。 32.治疗、抑制或改善受试者的神经疾病的方法,其包括:向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统细胞内施用药学有效量的根据权利要求25至31中任一项的组合物。 33.根据权利要求32所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物受试者。 34.根据权利要求32所述的方法,其中所述受试者是人,狗,猫或马受试者。 35.根据权利要求32所述的方法,其中所述受试者是人受试者。 36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法,其中所述神经疾病是癫痫或帕金森病。 37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法,其中通过位点特异性颅内注射递送所述组合物。 38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法,其中所述神经疾病是癫痫,以及将所述组合物递送至一个或多个癫痫病灶的位置。 39.将NPY和Y2基因组递送至哺乳动物细胞的方法,其包括将根据权利要求21或24的AAV颗粒导入细胞。 40.根据权利要求39所述的递送方法,其中所述细胞选自由以下各项组成的组:神经细胞,肺细胞,视网膜细胞,上皮细胞,肌细胞,胰腺细胞,肝细胞,心肌细胞,骨细胞,脾细胞,角质形成细胞,成纤维细胞,内皮细胞,前列腺细胞,生殖细胞,祖细胞和干细胞。 41.向受试者施用NPY和Y2基因组的方法,其包括向所述受试者施用权利要求39或40的细胞。 42.根据权利要求41所述的向受试者施用核酸的方法,其中所述受试者是哺乳动物受试者。 43.根据权利要求41所述的向受试者施用核酸的方法,其中所述受试者是人受试者。 44.向受试者递送NPY和Y2基因组的方法,其包括向受试者的哺乳动物细胞施用根据权利要求21至24中任一项的AAV颗粒,其中将所述病毒颗粒施用于所述受试者的海马。 45.减少NPY具有治疗效果的或由NPY缺乏引起的疾病的方法,其中所述疾病选自癫痫或帕金森病,所述方法包括向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统的细胞施用药学有效量的根据权利要求19至24中任一项的组合物。 46.向有需要的受试者提供NPY的方法,其包括:选择需要NPY的受试者,例如NPY缺乏的受试者;和向所述受试者提供药学有效量的根据权利要求19至24中任一项的组合物。 47.根据权利要求46所述的方法,其中通过临床评估或诊断测试,例如癫痫或帕金森病的EEG和/或临床诊断,选择所述受试者为具有NPY缺乏的受试者。

说明书

发明领域

本发明涉及包含编码NPY及其受体Y2(NPY2R)的某些核酸序列以及特定载体元件的载体。此外,本发明涉及所述载体被包封在来自腺病毒血清型1,2和8的衣壳蛋白中,形成AAV颗粒。最后,本发明涉及所述载体或所述AAV颗粒,其用于制备用于治疗哺乳动物中的神经疾病(例如癫痫)的药物。

发明背景

根据世界卫生组织(WHO),与中枢神经系统有关的疾病构成了一个巨大的社会经济健康问题,目前可用的治疗选择是不够的。这些疾病包括但不限于癫痫和帕金森病。

癫痫是世界上最古老的神经系统疾病之一,其书面记录可追溯到公元前4000年。几个世纪以来,恐惧,误解,歧视和社会耻辱已经包围了癫痫。今天许多国家仍然存在这种耻辱,并可能影响患有该疾病的人及其家人的生活质量。全球约有1%的人患有癫痫,使其成为全球最常见的神经系统疾病之一。

癫痫发作是发生可以从短暂的和几乎不可检测到长时间的剧烈抖动。在癫痫中,发作往往会复发,并且通常没有可识别的潜在原因。

发作是一组同步脑细胞中过度放电的结果。大脑的不同部分可以是这种放电的部位。最常见的癫痫类型,其影响患有该疾病的10名受试者中的6名,被称为特发性癫痫,并且没有可识别的原因。具有已知原因的癫痫称为继发性癫痫或症状性癫痫。继发性(或症状性)癫痫的原因包括:产前或围产期损伤引起的脑损伤,伴有脑畸形的先天性畸形或遗传病,严重的头部损伤,限制脑氧气量的中风,脑感染例如脑膜炎,脑炎,神经型囊尾蚴病,某些遗传综合征或脑肿瘤。

据估计,高达70%的癫痫病例可以用日常药物治疗。然而,对于对治疗应答差的人,他们可能不得不保持不治疗或采取癫痫手术或非药物治疗,如深部脑刺激(DBS),迷走神经刺激(VNS)或饮食。

根据世卫组织的报告,癫痫占全球疾病负担的0.75%,这是一项基于时间的测算,结合了由于过早死亡导致的生命损失年和生活在不完全健康状况的时间。2012年,癫痫导致大约2060万伤残调整生命年(DALYs)丢失。癫痫在保健需求,过早死亡和工作效率损失方面具有重大的经济意义。

因此,需要治疗癫痫的新途径和随后的新方法。在EP 2046394 A1中,描述了用于治疗神经系统疾病的有希望的途径,其中一种或若干种神经肽在神经系统细胞中与其一种或多种相应的受体一起过表达。增加神经递质的释放通常导致介导神经递质作用的受体的代偿性下调,因此相应受体的表达有助于避免限制随时间的治疗效果。使用神经肽和受体过表达概念的改进方法对于癫痫的新治疗是有利的,特别是用于治疗药物抗性癫痫,即当前药物治疗方法不能导致所需治疗效果的癫痫类型。

发明概述

因此,本发明的方面优选地寻求通过提供重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated viral,rAAV)载体来单独或以任何组合缓解,减轻或消除本领域中的一种或多种上述缺陷和缺点并至少解决上述问题,所述载体包含神经肽Y(NPY)编码序列和神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列。

根据本发明的一个方面,载体还包含以下功能元件中的至少一种,优选全部:AAV2倒置末端重复序列(ITR),杂合巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白CAG启动子(CAG),内部核糖体进入位点(IRES),土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)和/或牛生长激素多腺苷酸化(bGH-polyA)信号序列。

在本发明的一个方面,AAV颗粒包含所述载体,其中所述载体由腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白包封。

根据本发明的另一方面,药物组合物包含所述AAV颗粒,用于预防,抑制或治疗哺乳动物的神经疾病,例如癫痫或帕金森病。

在本发明的一个方面,用于治疗,抑制或改善受试者的神经疾病的方法包括向患有神经疾病(例如癫痫或帕金森病)的受试者(例如哺乳动物或人受试者)的中枢神经系统的细胞施用药学有效量的所述组合物。

根据本发明的另一方面,将NPY和Y2基因组递送至哺乳动物细胞的方法包括将所述AAV颗粒引入细胞中。在另一个实施方案中,向受试者(例如哺乳动物或人受试者)施用NPY和Y2基因组的方法包括将所述细胞施用于受试者。

在本发明的一个方面,向受试者递送NPY和Y2基因组的方法包括向受试者的哺乳动物细胞施用所述AAV颗粒,其中将病毒颗粒施用于所述受试者的海马。

根据本发明的另一方面,一种减少NPY具有治疗效果或由NPY缺乏引起的疾病的方法(其中所述疾病选自癫痫或帕金森病)包括向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统的细胞施用药学有效量的所述组合物。

根据本发明的另一个方面,向有需要的受试者(例如通过临床评估或诊断测试(例如癫痫或帕金森病的EEG和/或临床诊断)选择的具有NPY缺乏的受试者)提供NPY的方法包括选择需要NPY的受试者,例如具有NPY缺乏的受试者,并向所述受试者提供药学有效量的所述组合物。

本发明的其他方面还涉及在本申请的权利要求中找到的替代方案。

附图的简要说明

本发明的实施例的这些和其他方面,特征和优点将从以下对本发明的实施例的描述中变得显而易见,参考附图,其中,

图1A和B是本文所述的若干个实施方案中使用的载体的示意图,其中神经肽Y(NPY)和神经肽受体2(NPY2R)的转基因顺序是NPY在NPY2R的上游(图1A)或NPY2R在NPY的上游(图1B)。

图2显示了通过ddPCR总结转染的HEK293细胞中转基因表达的图。通过ddPCR测量的NPY和NPY2R靶序列的数目。作为对照,使用未处理的细胞或不含NPY和NPY2R编码序列(IRES)的AAV表达质粒。配对学生t检验,t3=3.927,*P=0.0294。数据点/条代表平均值±SEM(每次处理n=4)。

图3显示了来自大鼠的海马切片中NPY表达的图。单侧AAV载体处理后3周,背侧海马CA1区的NPY水平。根据观察到的NPY阳性免疫荧光信号评估NPY水平:1(对应于内源水平的NPY水平),2(高于内源水平的低NPY表达),3(高于内源水平的中度NPY表达),和4(高于内源水平的高NPY表达)。数据表示为平均值±s.e.m并使用Mann-Whitney U检验进行分析。与未处理的初始对照动物相比,*P<0.05。

图4显示了在单侧AAV-NPY/Y2载体处理后三周在背侧海马中NPY表达的图像。DAB染色越深,NPY样免疫反应性水平越高。用AAV-Y2/NPY载体(未显示)处理的大鼠的NPY表达对应于图中所见表达的9-17%。

图5A和5B说明来自大鼠的海马切片中的NPY2R功能,其中5A显示说明在单侧AAV载体处理后三周在背侧海马的CA1区域中功能性NPY2R结合水平的图。数据表示为平均值±s.e.m,并使用非配对双尾学生t检验进行分析。与未处理的初始对照动物相比,*P<0.05,***P<0.001。图5B显示了A中所示的功能性NPY2R结合的代表性图像。

图6显示了来自大鼠的海马切片中的NPY2R表达,其中6A显示了说明单侧AAV载体处理后三周在背侧海马中NPY2R结合水平的图。在海马CA1区评估Y2受体结合并给出对应于Y2受体信号的值:1(对应于内源水平的Y2受体表达),2(高于内源水平的低Y2受体表达),3(高于内源水平的中度Y2受体表达)和4(高于内源水平的高Y2受体表达)。数据表示为平均值±s.e.m并使用Mann-Whitney U检验进行分析。与未处理的初始对照动物相比,*P<0.05。图6B显示了6A中所示的功能性NPY2R结合的代表性图像。。

图7显示了在单次红藻氨酸盐注射(s.c.)后2小时期间观察期间与AAV诱导的转基因过表达水平相关的发作发展的图。图7A显示了发作发展和AAV诱导的NPY转基因过表达之间的关系。对照:对应于内源水平的NPY水平(对应于图3中的值1);低:低NPY转基因表达水平(对应于图3中的值2);高:高NPY转基因表达水平(对应于图3中的值3-4)。与NPY表达等于内源水平的大鼠相比,a)第一次运动性发作(motor seizure,MS)的潜伏期,b)癫痫持续状态(status epilepticus,SE)的潜伏期,和c)发作时间(包括抗癫痫效果)在具有高转基因NPY表达的经治疗的大鼠中均显著不同,d)所有类别的发作次数均未受影响。图7B显示了发作和AAV诱导的NPY2R(Y2)转基因过表达之间的关系。对照:对应于内源水平的NPY2R水平(对应于图3中的值1);低:低NPY2R转基因表达水平(对应于图3中的值2);高:高NPY2R转基因表达水平(对应于图3中的值3-4)。a)第一次运动性发作(MS)的潜伏期,b)癫痫持续状态(SE)的潜伏期,c)发作时间和d)发作次数在任何NPY2R表达类别中没有显著改变。然而,观察到强烈倾向,特别是对于c)高NPY2R表达类别中的癫痫发作时间的减少。数据表示为平均值±s.e.m,并使用在显著单向ANOVA后的Bonferroni多重比较事后检验进行分析。*P<0.05,**P<0.01。

图8说明双侧海马内AAV载体注射对KA诱导的癫痫发作的影响:8A显示双侧海马内AAV1载体注射对KA诱导的癫痫发作的影响。与对照(AAV1-空)相比,在AAV1载体介导的NPY和Y2过表达后,a)第一次运动性发作的潜伏期和d)发作总数没有受到影响。与对照(AAV1-空)相比,AAVl-NPY/Y2治疗后b)癫痫持续状态(SE)的潜伏期和c)总癫痫发作时间均显著降低,而AAV1-Y2/NPY无显著影响。数据是平均值±SEM(每组n=7-8)。相对于对照(AAV1-空)*P<0.05,在显著单向ANOVA后的Bonferroni多重事后比较检验。图8B显示双侧海马内AAV2载体注射对KA诱导的发作的影响。在AAV2载体介导的NPY和Y2过表达后未观察到对KA诱导的发作的影响。这包括观察a)第一次运动性发作的潜伏期,b)癫痫持续状态(SE)的潜伏期,c)总发作时间,和d)癫痫发作总次数。数据是平均值±SEM(每组n=8)。在显著单向ANOVA后的Bonferroni多重事后比较检验。图8C显示双侧海马内AAV8载体注射对KA诱导的发作的影响。在AAV8载体介导的NPY和Y2过表达后未观察到对KA诱导的发作的影响。这包括观察a)第一次运动性发作的潜伏期,b)癫痫持续状态(SE)的潜伏期,c)总发作时间,和d)癫痫发作总次数。数据是平均值±SEM(每组n=8-12)。在显著单向ANOVA后的Bonferroni多重事后比较检验。

图9说明了在氟哌啶醇诱导的帕金森病症状的僵住症(catalepsy)中,小鼠双侧纹状体内AAV1-NPY/Y2或AAV-空(对照)载体注射的效果。A)与AAV1-空相比,用AAV1-NPY/Y2载体治疗诱导了在僵住状态下的时间的显著减少。数据表示为平均值±s.e.m并使用双向重复测量ANOVA进行分析。*P<0.05表示AAV1-空和AAV1-NPY/Y2载体处理之间的总体显著治疗效果。B)与AAVl-空相比,用AAVl-NPY/Y2载体治疗诱导以15分钟间隔观察到的在僵住状态下的平均时间显著减少。数据表示为平均值±s.e.m,并使用双向学生t检验进行分析。*P<0.05。

实施方案的描述

以下描述集中于本发明的实施方案,其适用于基因治疗的AAV载体,并且特别是适用于治疗哺乳动物的神经疾病(例如癫痫)的所述载体的AAV颗粒。

神经疾病包括神经系统中的大量疾病,包括但不限于脑,脊髓和其他神经,其具有结构,生物化学和/或信号传导异常等。神经疾病不仅限于人,而且还存在于其他哺乳动物中,例如马,狗和猫,在本文中称为“受试者”。例如,一般狗群中犬癫痫的发病率估计在0.5%和5.7%之间。

神经肽Y(NPY)是36个氨基酸长的肽神经递质,并且是哺乳动物中枢神经系统中最丰富的之一。NPY已被证明可在神经退行性疾病的动物模型中发挥神经保护作用,如阿尔茨海默病(Rose等,2009),亨廷顿病和帕金森病。NPY首次显示减少大鼠海马切片中Schaffer侧支CAl突触的兴奋,随后显示涉及突触前谷氨酸释放的Y2受体依赖性抑制。谷氨酸是脑中的主要兴奋性神经递质,并且因此负责癫痫发活动中看到的引发,扩散和超出规模的突触传递。一致地,NPY缺乏突变小鼠对发作更敏感,并且脑室内施用NPY在大鼠的实验性发作模型中在体内发挥抗癫痫样作用。重要的是,NPY还抑制人癫痫海马中的兴奋性突触传递(Patrylo等,1999;Ledri等,2015)。在海马中,NPY的抗癫痫作用主要通过与Y2或Y5受体的结合介导(Woldbye等,1997,2005;El Bahh等,2005;Benmaamar等,2005),而Y1受体的激活是促进发作(Benmaamar等,2003)。

由于其抗癫痫作用,NPY已应用于靶向基因治疗。因此,rAAV介导的NPY的海马过表达对大鼠的刺激诱导的急性发作和癫痫持续状态损伤后三个月的自发性发作具有抑制作用。为了利用差异性NPY受体亚型特异性参与,还进行了基因治疗,单独过表达Y1,Y2或Y5受体或与NPY组合。因此,与单独的NPY或受体过表达相比,NPY和Y2或Y5的组合对刺激诱导的大鼠急性发作具有优异的发作抑制作用(Woldbye等,2010;等,2012)。

相反,如后续研究所预测的,海马过表达Y1受体导致促进发作的作用(Benmaamar等,2003;Olesen等,2012)。在类似方法中,rAAV载体介导的Y2优选激动剂NPY13-36的过表达也发挥抗癫痫作用(Foti等,2007)。随后,当在临床相关的大鼠癫痫长期慢性模型中进行测试时,NPY和Y2受体rAAV载体介导的过表达的抗癫痫作用的翻译价值得到了进一步的支持(Ledri等,2016)。

本文描述了利用AAV载体在有需要的受试者中治疗或抑制癫痫和/或帕金森病的基因治疗的若干种方法。此外,AAV载体现在被认为可安全地用于治疗神经疾病的治疗性转基因(McCown,2011;Bartus等,2014)。然而,有效地以安全方式表达治疗性转基因的重组病毒载体的开发遇到了若干障碍,这是它们在人类基因治疗中广泛使用的现有障碍。因此,涉及rAAV载体的新基因疗法的设计涉及仔细选择许多不同的元件,为特定组织和基因治疗靶标创建高度定制和独特的构建体。

设想包含由单个rAAV编码的NPY和Y2受体的过表达的新基因疗法当与特定AAV血清型衣壳蛋白一起使用时将鉴于本文所述的载体排列和功能元件的特定选择(例如,构建体重遗传元件的排序和/或某些遗传元件之间的距离)产生有效的体内表达。下面给出的公开内容提供了关于这些组合物以及制备和使用这些组合物治疗和/或抑制受试者的癫痫和/或帕金森病的方法的更多细节,所述受试者需要治疗或改善癫痫或帕金森病或与其相关的失调比如发作活动的试剂。

rAAV NPY和NPY2R载体

通过在同一载体中具有NPY和NPY2R编码序列,NPY2R和NPY将以同源方式扩散,确保效应分子NPY及其靶标发作抑制性受体NPY2R的表达非常接近。此外,通过在同一载体中具有NPY和NPY2R编码序列,NPY和NPY2R在一个细胞中的基因组插入的数量可以是同源的,使得能够控制插入的NPY和NPY2R基因的比率。

因此,在第一实施方案中,重组腺伴随病毒(rAAV)载体包含神经肽Y(NNPY;c.f.SEQ ID NO:15)编码序列和神经肽Y2受体(NPY2R;c.f.SEQ ID NO:16)编码序列。

载体中的神经肽Y(NPY)编码序列可具有对应于SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:1具有至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。神经肽Y(NPY)编码序列可以被截短,只要它编码功能性神经肽Y,例如,该分子可以结合其受体。截短的序列可包含(294个中的)至少255个,例如265,275,285,290碱基,并且与SEQ ID NO:1具有至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI),并且编码功能性神经肽Y,例如,该分子可以结合其受体。

载体中的神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列可具有对应于SEQ ID NO:2的序列或与SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列可以被截短,只要它是功能性神经肽Y2受体,例如,该分子可以结合其配体。截短的序列可包含(1146中的)至少975个,例如1000,1115,1130,1140碱基,并且与SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI),并且编码功能性神经Y2受体,例如,该分子可以结合其配体。

尽管受体丰度是组织特异性表达的一个因素,但AAV载体的其他元件可以影响组织特异性表达。通过控制转基因方向,即NPY和NPY2R基因的顺序和/或与载体中的编码NPY和/或编码NPY2R的基因的启动子元件和/或增强子元件的距离,在载体设计中给出进一步的表达控制。由内源基因启动子引起的或来自启动子元件或增强子元件的转录干扰影响基因座处的转基因表达。因此,与缺乏这些修饰的常规载体设计相比,载体已被修饰以相对于所选择的载体启动子元件和/或增强子元件改善转基因表达。在第一实施方案中,载体中NPY和NPY2R编码基因的转基因方向使得NPY编码基因在接近启动子方面位于NPY2R编码基因之前(例如,NPY编码基因存在于NPY2R编码基因上游的载体上)使得其比NPY2R编码基因更接近启动子。所述神经肽Y(NPY)编码序列可具有对应于SEQ ID NO:1的序列或与所述序列具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。所述神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列可具有对应于SEQ ID NO:2的序列或与所述序列具有至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性的序列(%SI)。通过基因表达,神经肽Y(NPY)编码序列用于合成前神经肽Y前原蛋白(SEQ ID NO:15),神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列用于合成神经肽Y受体2型(SEQ ID NO:16)。如本领域技术人员已知的,备选序列也可以编码相同的肽序列。因此,重组腺伴随病毒(rAAV)载体还可以包含编码根据SEQ ID NO:15的蛋白质的序列,或与所述序列具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列,和编码根据SEQ ID NO:16的蛋白质的序列,或与所述序列具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。NPY编码基因可以与所述启动子并置。NPY编码基因可以在启动子区末端的5-60,5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,NPY编码基因从距启动子区术端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59或60个核苷酸开始,或NPY编码基因在距启动子的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。启动子可以是巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。载体中的CAG启动子序列可以与SEQ ID NO:4共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。CAG启动子序列可以被截短,只要它是功能性的(例如,诱导基因的表达),并且截短的CAG启动子序列可以包含(936个中的)至少850,例如875,900,925,935各碱基,并且与SEQ ID NO:4共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI),并诱导与所述启动子有效连接的基因的表达。CAG启动子可具有对应于SEQ ID NO:4的序列或与SEQ ID NO:4具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。IRES序列可位于载体中NPY和NPY2R编码基因之间。IRES序列可以在NPY编码基因末端的5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,IRES序列从距NPY编码基因末端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个核苷酸开始,或IRES序列在距NPY编码序列的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。IRES序列可以在NPY2R编码基因起始的5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内结束(例如,IRES序列在距NPY2R编码基因起始的5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个核苷酸结束,或IRES序列在距NPY2R编码序列起始的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内结束)。IRES序列可以是A7EMCV IRES序列。载体中的A7EMCV IRES启动子序列可以与SEQ ID NO:3共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。A7EMCV IRES序列可以被截短,只要它是功能性的(例如,诱导基因表达),并且截短的A7EMCV IRES序列可以包含(582个中的)至少525,545,560,570或575个碱基并且与SEQ ID NO:3共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。IRES可具有对应于SEQ ID NO:3的序列或与SEQ ID NO:3具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)可以位于载体中NPY和NPY2R编码基因的下游,并且任选地WPRE与NPY2R编码基因接近和/或并置。WPRE序列可位于载体中NPY2R编码基因的下游。WPRE序列可以在NPY2R编码基因末端的5-80,5-70,5-60,5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,WPRE序列从距NPY2R编码基因末端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80个核苷酸开始,或WPRE序列在距NPY2R编码序列的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。载体中的WPRE序列可以与SEQ ID NO:5共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。该序列与土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV8)基因组的碱基对1093至1684具有100%的同源性。WPRE序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的WPRE序列可以包含(593个中的)至少525,545,555,565,575或585个碱基并且与SEQ ID NO:5共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。WRPE可具有对应于SEQ ID NO:5的序列或与SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。载体可以包含牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA),其位于载体中NPY和NPY2R编码基因的下游,并且任选地接近和/或与WPRE并置。BGHpA序列可位于WPRE序列的下游。BGHpA序列可以在WPRE序列末端的5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,BGHpA序列从距WPRE序列末端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个核苷酸开始,或BGHpA序列在距WPRE序列的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。载体中的BGHpA序列(也称为“BGHpA信号序列”)可以与SEQ ID NO:6共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。BGHpA信号序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的BGHpA信号序列可以包含(269个中的)至少225,235,245,255或265个碱基并且与SEQ ID NO:6共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。BGHpA信号可具有对应于SEQ ID NO:6的序列或与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。载体还可以包含位于载体中启动子上游的第一AAV2反向末端重复(ITR)结构域和/或位于NPY和NPY2R编码基因下游的第二ITR结构域,优选第二ITR结构域位于BGHpA结构域的近端。载体中的5′端ITR序列可以与SEQ ID NO:7共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。5’-末端ITR序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的ITR序列可以包含(183个中的)至少145个例如155,165,175,180个碱基并且与SEQ ID NO:7共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。载体中的3′端ITR序列可以与SEQ ID NO:8共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。3′-末端ITR序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的ITR序列可以包含(183个中的)至少145个例如155,165,175,180个碱基并且与SEQ ID NO:8共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。5’末端ITR具有对应于SEQ ID NO:7的序列,或与SEQ ID NO:7具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列,和3’末端ITR具有对应于SEQ ID NO:8的序列,或与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。可以对上述任何一种或多种基因进行密码子优化以在人体中表达。如下所述,发现三种AAV血清型对本文所述载体的基因递送有效:AAV2,AAVl和AAV8。因此,上述载体可以与AAV衣壳蛋白一起包装,所述AAV衣壳蛋白选自AAV1,AAV2和AAV8组成的组。而且,如下所述,发现用AAV1衣壳蛋白包装的载体在癫痫发作模型的试验中表现更好,因此,载体的优选包装是用AAV1衣壳蛋白。

在第二实施方案中,载体中NPY和NPY2R编码基因的转基因方向使得NPY2R编码基因在NPY编码基因之前,使得它更接近启动子(例如,NPY2R编码基因存在于NPY编码基因上游的载体上),使得它比NPY编码基因更接近启动子。所述神经肽Y(NPY)编码序列可具有对应于SEQ ID NO:1的序列或与所述序列具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。所述神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列可具有对应于SEQ ID NO:2的序列或与所述序列具有至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性的序列(%SI)。通过基因表达,神经肽Y(NPY)编码序列用于合成前神经肽Y前原蛋白(SEQ ID NO:15),神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列用于合成神经肽Y受体2型(SEQ ID NO:16)。如本领域技术人员已知的,备选序列也可以编码相同的肽序列。因此,重组腺伴随病毒(rAAV)载体可以包含编码根据SEQ ID NO:15的蛋白质的序列,或与所述序列具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列,和编码根据SEQ ID NO:16的蛋白质的序列,或与所述序列具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。NPY编码基因可以与所述启动子并置。NPY2R编码基因可以在启动子区末端的5-60,5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,NPY2R编码基因从距启动子区末端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59或60个核苷酸开始,或NPY2R编码基因在距启动子的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始。启动子可以是巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。载体中的CAG启动子序列可以与SEQ ID NO:4共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。CAG启动子序列可以被截短,只要它是功能性的(例如,诱导基因的表达),并且截短的CAG启动子序列可以包含至少850,例如(936个中的)875,900,925,935各碱基,并且与SEQ ID NO:4共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI),并诱导与所述启动子有效连接的基因的表达。CAG启动子可具有对应于SEQ ID NO:4的序列或与SEQ ID NO:4具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。IRES序列可位于载体中NPY和NPY2R编码基因之间。IRES序列可以在NPY2R编码基因末端的5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,IRES序列从距NPY2R编码基因末端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个核苷酸开始,或IRES序列在距NPY2R编码序列的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。IRES序列可以在NPY编码基因起始的5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内结束(例如,IRES序列在距NPY编码基因起始的5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个核苷酸结束,或IRES序列在距NPY编码序列起始的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内结束)。IRES序列可以是A7 EMCV IRES序列。载体中的A7 EMCV IRES启动子序列可以与SEQ ID NO:3共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。A7 EMCV IRES序列可以被截短,只要它是功能性的(例如,诱导基因表达),并且截短的A7 EMCV IRES序列可以包含(582个中的)至少525,545,560,570或575个碱基并且与SEQ ID NO:3共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。IRES可具有对应于SEQ ID NO:3的序列或与SEQ ID NO:3具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)可以位于载体中NPY和NPY2R编码基因的下游,并且任选地WPRE与NPY编码基因接近和/或并置。WPRE序列可位于载体中NPY编码基因的下游。WPRE序列可以在NPY编码基因末端的5-80,5-70,5-60,5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,WPRE序列从距NPY编码基因末端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80个核苷酸开始,或WPRE序列在距NPY编码序列的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。载体中的WPRE序列可以与SEQ ID NO:5共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。该序列与土拨鼠乙型肝炎病毒(WHV8)基因组的碱基对1093至1684具有100%的同源性。WPRE序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的WPRE序列可以包含(593个中的)至少525,545,555,565,575或585个碱基并且与SEQ ID NO:5共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。WRPE可具有对应于SEQ ID NO:5的序列或与SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。载体可以包含牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA),其位于载体中NPY和NPY2R编码基因的下游,并且任选地接近和/或与WPRE并置。BGHpA序列可位于WPRE序列的下游。BGHpA序列可以在WPRE序列末端的5-50,5-40,5-30,5-20,5-15或5-10个核苷酸内开始(例如,BGHpA序列从距WPRE序列末端5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50个核苷酸开始,或BGHpA序列在距WPRE序列的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。载体中的BGHpA序列(也称为“BGHpA信号序列”)可以与SEQ ID NO:6共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。BGHpA信号序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的BGHpA信号序列可以包含(269个中的)至少225,235,245,255或265个碱基并且与SEQ ID NO:6共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。BGHpA信号可具有对应于SEQ ID NO:6的序列或与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。载体还可以包含位于载体中启动子上游的第一AAV2反向末端重复(ITR)结构域和/或位于NPY和NPY2R编码基因下游的第二ITR结构域,优选第二ITR结构域位于BGHpA结构域的近端。载体中的5′端ITR序列可以与SEQ ID NO:7共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。5’-末端ITR序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的ITR序列可以包含(183个中的)至少145个例如155,165,175,180个碱基并且与SEQ ID NO:7共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。载体中的3′端ITR序列可以与SEQ ID NO:8共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。3′-末端ITR序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的ITR序列可以包含(183个中的)至少145个例如155,165,175,180个碱基并且与SEQ ID NO:8共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。5’末端ITR具有对应于SEQ ID NO:7的序列,或与SEQ ID NO:7具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列,和3’末端ITR具有对应于SEQ ID NO:8的序列,或与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。可以对上述任何一种或多种基因进行密码子优化以在人体中表达。如下所述,发现三种AAV血清型对本文所述载体的基因递送有效:AAV2,AAV1和AAV8。因此,上述载体可以与AAV衣壳蛋白一起包装,所述AAV衣壳蛋白选自AAV1,AAV2和AAV8组成的组。而且,如下所述,发现用AAV1衣壳蛋白包装的载体在癫痫发作模型的试验中表现更好,因此,载体的优选包装是用AAV1衣壳蛋白。在以下段落中提供了关于这些载体和包装系统的特定元件的更多公开内容。

腺伴随病毒

腺伴随病毒(AAV)构成一组来自细小病毒科的小的无包膜DNA病毒,已知其感染人类,灵长类动物和非灵长类动物物种(如猫和狗等)。目前知道AAV尚不会引起疾病,并且该病毒会引起非常轻微的免疫应答。使用AAV的基因治疗载体可以转导(即进入)分裂和静止细胞(当细胞不分裂时的状态)和启动转基因表达,并且以染色体外状态持续存在而不整合到的宿主细胞的基因组中(在天然病毒中,一些病毒携带基因确实整合到人类染色体19的特定位点上的宿主基因组中)。这些特征使AAV对于创建用于基因治疗的病毒载体非常有吸引力。

截至2005年,在人类和非人类灵长类动物的组织样本中发现并描述了至少110种非冗余AAV血清型。血清型是细菌或病毒物种内或不同个体的免疫细胞中的不同变异,基于其细胞表面抗原分类在一起,允许将生物体的血清学和流行病学分类到亚种水平。所有已知的AAV血清型都可以感染来自多种不同组织类型的细胞。组织特异性由AAV载体的衣壳血清型决定,这可以通过假型化改变,即改变血清型特异性衣壳蛋白以改变其向性范围,这对于它们在治疗中的使用是重要的。其中,迄今为止对血清型2(AAV2)进行的研究最为广泛。AAV2呈现出对骨骼肌,神经元,血管平滑肌细胞和肝细胞的天然向性。已经描述了AAV2的三种细胞受体:硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG),aVβ5整联蛋白和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1),并且认为第一种作为主要受体起作用。

发现三种AAV血清型对本文所述载体的基因递送有效:AAV2,AAV1和AAV8。在脑中,这些AAV血清型显示神经元向性。

用载体(由以下组成:基于AAV2的基因组结构,用来自AAV血清型1,2或8的衣壳蛋白的伪分型,以及在狨猴,小鼠和猕猴的大脑皮质中的可互换启动子(CMV,CaMKII或Syn I))的比较研究揭示了转导和转基因表达的向性,传播和效率的血清型特异性特征(Watakabe等,2015)。

总体而言,AAV2与其他血清型不同,载体的扩散较小,并且具有天然存在的神经元向性。然而,所有血清型都能够在神经元特异性启动子(CaMKII或Synl)下诱导神经元中的转基因表达,并且除血清型2外,病毒传播在其他血清型中没有差异。所有提出的血清型似乎都适合于AAV载体介导的转基因向脑中的递送。

血清型1和8在扩散和转基因表达方面看起来与血清型2相当且更有效。血清型1,2和8都已被证明能够转导神经胶质和神经元,并且通过不同的启动子选择似乎更好地实现细胞亚型特异性限制。

在一个实施方案中,AAV衣壳蛋白选自AAVl,AAV2和AAV8。

AAV载体基因组元件

为了产生适于诱导转基因表达的AAV载体,已仔细评估和选择AAV表达盒中的元件。这包括用于从一个载体表达多个转基因的ITR序列,启动子,多顺反子表达元件,以及增强子元件。

ITR序列

反向末端重复(ITR)序列是来自所用野生型基因组的唯一保留的遗传元件,并且这些序列对于若干种顺式作用过程是必需的,包括用于第二DNA链合成的自引发和AAV颗粒中DNA的衣壳化。倒置末端重复(ITR)序列以其对称性命名,这似乎是AAV基因组有效增殖所必需的。它们通过形成发夹的能力获得这种性质,这有助于所谓的自引发,其允许第二DNA链的不依赖于引物的合成。已经证明ITR是AAV DNA整合到宿主细胞基因组(人的第19条染色体)中所必需的,以及是AAV DNA的有效衣壳化以及产生完全组装的脱氧核糖核酸酶抗性AAV颗粒所必需的。在可用的ITR序列的选择中,已经选择AAV血清型2用于本文所述的许多载体,这使得能够将载体有效地包装到AAV1,AAV2或AAV8衣壳中以产生病毒粒子,如下所述。作为末端重复,两个ITR序列分别位于载体的5′端和3′端。

在一个实施方案中,两个ITR序列分别位于载体的5′端和3′端,NPY和NPY2R的编码序列的上游和下游。

本发明的载体中的5′端ITR序列可以与SEQ ID NO:7共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。5’-末端ITR序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的ITR序列可以包含(183个中的)至少145个例如155,165,175,180个碱基并且与SEQ ID NO:7共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

载体中的3′端ITR序列可以与SEQ ID NO:8共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。3′-末端ITR序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的ITR序列可以包含(183个中的)至少145个例如155,165,175,180个碱基并且与SEQ ID NO:8共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

在一个实施方案中,5’末端ITR具有对应于SEQ ID NO:7的序列,或与SEQ ID NO:7具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列,和3’末端ITR具有对应于SEQ ID NO:8的序列,或与SEQ ID NO:8具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。

CAG启动子

在遗传学中,启动子是启动特定基因转录的DNA区域。启动子位于基因的转录起始位点附近,与其位于DNA的同一链并且在上游(朝向有义链的5′区域)。通常,启动子长度在100-1000个碱基对之间。通常,启动子已被分为两大类,即TATA和CpG。然而,使用相同的转录因子组合性形成的基因具有不同的基因表达模式。此外,在人类中已发现不同的组织使用不同类别的启动子。

各种启动子序列对转导率和基因表达水平的影响将在细胞类型之间变化。已经检查和评估了广泛的可用启动子以选择最佳启动子。在本发明中,已发现CAG启动子在靶组织中提供合适的基因表达触发。使用AAV载体进行基因治疗的一些先前进行的临床试验在获得足够高的治疗有益效果方面面临问题。因此,选择已知为用于在哺乳动物表达载体中驱动高水平基因表达的强合成启动子的CAG启动子。已经发现,对于许多组织类型,CAG启动子比其他常用的细胞启动子如UBC和PGK启动子产生更高水平的表达。CAG启动子包含以下序列:(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件,(A)启动子,第一外显子和鸡β-肌动蛋白基因的第一个内含子,(G)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。因此,它不是严格意义上的启动子,因为它包括转录序列的一部分(两个外显子和内含子)和增强子元件。

在一个实施方案中,CAG启动子序列位于NPY和NPY2R的编码序列的上游。

本发明的载体中的CAG启动子序列可以与SEQ ID NO:4共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

CAG启动子序列可以被截短,只要它是功能性的(例如,诱导基因的表达),并且截短的CAG启动子序列可以包含(936个中的)至少850,例如875,900,925,935各碱基,并且与SEQ ID NO:4共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI),并诱导与所述启动子有效连接的基因的表达。

在一个实施方案中,CAG启动子具有对应于SEQ ID NO:4的序列或与SEQ ID NO:4具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。

IRES

内部核糖体进入位点,缩写为IRES,是允许在作为蛋白质合成的更大过程的一部分的信使RNA(mRNA)序列的中间的起始翻译的核苷酸序列。通常,在真核生物中翻译可以仅在mRNA分子的5′端开始,因为起始复合物的装配需要5′帽识别。通过将IRES序列并入到载体中,允许两个基因从单一载体的双顺反子表达,这里第一个基因在正常的5′帽处起始,第二个基因在IRES处起始。

此外,虽然NPY和NPY2R rAAV载体允许NPY和NPY2R在一个细胞中同源插入,但IRES元件的并入允许NPY和NPY2R基因的异源表达。此外,通过选择NPY和NPY2R基因的转基因方向,可以如上所述交替两种转基因之间的表达比例。因此,可以针对靶组织和治疗实现NPY和NPY2R体内表达比例的适当平衡。

在一个实施方案中,IRES序列位于NPY和NPY2R的编码序列之间。

目前已知有若干种不同的病毒IRES序列,例如小RNA病毒IRES,不同的肝炎病毒IRES和棉花病毒IRES。

在可能已知的IRES序列中,发明人发现来自具有修饰的A7序列的脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)最适合于载体。

来自脑心肌炎病毒的IRES通常用于实验和药物应用中以在真核细胞或无细胞提取物中表达蛋白质,并且其赋予适当配置的顺反子的高水平的独立于帽的翻译活性。经修饰的A7序列(Rees等,1996;Bochkov and Palmenberg,2006)已经显示出比未修饰的EMCV IRES更好地实现A7 EMCV IRES的顺反子翻译。

本发明的载体中的A7EMCV IRES序列可以与存在于SEQ ID NO:3中的相应长度的寡核苷酸序列共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

A7EMCV IRES序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的A7EMCV IRES序列可以包含(582个中的)至少525,545,560,570或575个碱基并且与存在于SEQ ID NO:3中的相应长度的寡核苷酸序列共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

在一个实施方案中,IRES具有对应于SEQ ID NO:3的序列或与存在于SEQ ID NO:3中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。

WPRE

为了确保靶细胞中的基因表达,可以优化转录的递送和水平。然而,人们也可以应用转录后方法来改善基因表达。本发明的载体可以并入土拨鼠肝炎转录后调控元件(woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element,WPRE)。WPRE是DNA序列,其通过形成特定的三级结构帮助增加转基因表达,从而增强转录后异源基因的表达。WPRE是具γ,α和β组件的三联调控元件。在本发明的载体中,已经并入了完整的三联WPRE,用于完整的WPRE活性。

在一个实施方案中,WPRE序列位于NPY和NPY2R的编码序列的下游。

本发明的载体中的WPRE序列可以与SEQ ID NO:5共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。该序列与土拨鼠乙型肝炎病毒(Woodchuck hepatitis B virus,WHV8)基因组的碱基对1093至1684具有100%的同源性。

WPRE序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的WPRE序列可以包含(593个中的)至少525,545,555,565,575或585个碱基并且与SEQ ID NO:5共享至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

在一个实施方案中,WRPE具有对应于SEQ ID NO:5的序列或与SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。

牛生长激素多腺苷酸化(BGHpA)信号序列

载体还可以并入牛生长激素多腺苷酸化(BGHpA或bGH-polyA)信号序列。BGHpA信号序列是3′-侧翼序列,确保转基因转录物的有效和准确的多腺苷酸化(Goodwin和Rottman,1992)。两个主要功能是终止DNA转录和除了从细胞核到核糖体的RNA运输之外保护转录的RNA的3′端不被降解。因此,BGHpA信号序列作为载体中的倒数第二个元件位于3′端的ITR序列的上游。

因此,在一个实施方案中,(bGH-polyA)信号序列位于NPY和NPY2R的所述编码序列的下游。

载体中的BGHpA信号序列可以与SEQ ID NO:6共享至少90%的序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

BGHpA信号序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的BGHpA信号序列可以包含(269个中的)至少225,235,245,255或265个碱基并且与SEQ ID NO:6共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

在一个实施方案中,BGHpA信号具有对应于SEQ ID NO:6的序列或与SEQ ID NO:6具有至少90%,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)的序列。

载体总结

总之,关于启动子和增强子元件,顺式作用元件以及转基因方向和双顺反子元件的特定选择,根据示例性实施方案选择两种所得设计:

ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

因此在一个实施方案中,载体包含以下功能元件:AAV2倒置末端重复序列(ITR),杂合巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白CAG启动子(CAG),内部核糖体进入位点(IRES),土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化(BGHpA)信号序列。

在另一个实施方案中,载体的功能元件的序列可操作地连接并且以如下(上游至下游)顺序,

5’-ITR,CAG,NPY,IRES,NPY2R,WPRE,BGHpA,和ITR-3’,或

5’-ITR,CAG,NPY2R,IRES,NPY,WPRE,BGHpA,和ITR-3’。

完整序列载体还将在功能元件之间包含许多碱基,并且根据示例性实施方案将两个这样的完整序列放在一起。在一个实施方案中,载体具有对应于SEQ ID NO:9的序列,或与SEQ ID NO:9具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列,或载体具有对应于SEQ ID NO:10的序列,或与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性例如至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性(%SI)的序列。

载体序列可以被截短,只要它是功能性的,并且截短的载体序列可以包含(4288个中的)至少4200个例如4230,4260,4270,4280个碱基并且与SEQ ID NO:9共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI),或截短的载体序列可以包含(4288个中的)至少4200个例如4230,4260,4270,4280个碱基并且与SEQ ID NO:10共享至少90%序列同一性,例如至少95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性(%SI)。

载体也可以在载体内范围内描述,例如启动子或内部核糖体进入位点序列与NPY和/或NPY2R编码序列之间的距离。载体的总大小也是一个考虑因素,因为AAV的包装容量为~4.7K。

在一个实施方案中,CAG启动子序列与在CAG启动子序列的下游和IRES序列的上游的NPY或NPY2R的编码序列之间的距离在60至0个碱基的范围内,优选40至5个碱基,大多数优选20至10个碱基。

在一个实施方案中,IRES序列与下游NPY或NPY2R编码序列之间的距离为60至0个碱基,优选40至2个碱基,最优选10至4个碱基。

如本领域所知,利用遗传密码的简并性存在若干种用于基因优化的工具。由于简并性,一种蛋白质可由许多替代核酸序列编码。密码子偏好在每种生物体中不同,这可能对在异源表达系统中表达重组蛋白质产生挑战,导致低表达和不可靠表达。对于自体表达也是如此,其中野生型序列可能不是针对表达产量而是针对降解,调节和其他性质进行优化的。因此,可以使用涉及基因表达的不同方面的大量序列相关参数(例如转录,剪接,翻译和mRNA降解)来优化载体以用于人表达。

因此,在一个实施方案中,载体的序列已经过密码子优化以用于人类。

AAV颗粒生成

如实验部分中进一步描述的,载体包装在血清型1,2或8的衣壳蛋白中。因此,从两个载体(上文)中,可以产生六种不同的AAV颗粒,如下所述:

AAV2.1-ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.1-ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.2-ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.2-ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.8-ITR-CAG-NPY-IRES-NPY2R-WPRE-BGHpA-ITR

AAV2.8-ITR-CAG-NPY2R-IRES-NPY-WPRE-BGHpA-ITR

因此,在一个实施方案中,AAV颗粒包含本发明的载体,其被腺伴随病毒(AAV)衣壳蛋白包封,包装在所谓的伪型AAV颗粒中,意味着它们被包被有来自不同AAV血清型的衣壳蛋白。

AAV颗粒递送

NPY和NPY2R基因治疗的递送应优选通过位点特异性颅内注射含有载体的AAV颗粒。包含AAV颗粒的药物组合物在本发明中用于预防,抑制,改善或治疗哺乳动物的神经疾病,例如癫痫或帕金森病。主要目标是药物抗性(顽固性,难治性,医学顽固性,抗药性)癫痫,因为对于这些形式的癫痫,存在很少的有效治疗方法。药物抗性癫痫包括多种类型的癫痫,其中药物治疗没有效果,或者药物治疗结果随时间变化。在非常广泛和一般的术语中,药物抗性可以说是发作未能受到完全控制或响应抗癫痫药物(AED)治疗的可接受的控制。

在一个实施方案中,药物组合物包含在本发明中使用的AAV颗粒,预防,抑制,改善或治疗哺乳动物的神经疾病,例如癫痫或帕金森病。在另一个实施方案中,所述神经疾病是癫痫。在另一个实施方案中,所述癫痫是药物抗性癫痫。在另一个实施方案中,受试者是哺乳动物受试者,例如人,马,狗或猫受试者。在一个进一步的实施方案中,受试者是人受试者。在另一个实施方案中,神经疾病是癫痫,并且组合物包含并且组合物包含AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY,AAV2-NPY/Y2,AAV2-Y2/NPY,AAV8-NPY/Y2或AAV8-Y2/NPY颗粒,例如AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY或AAV8-NPY/Y2颗粒,例如AAV1-NPY/Y2颗粒。在另一个实施方案中,神经疾病是帕金森病,并且组合物包含AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY,AAV2-NPY/Y2,AAV2-Y2/NPY,AAV8-NPY/Y2或AAV8-Y2/NPY颗粒,优选AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY或AAV8-NPY/Y2颗粒,优选AAVl-NPY/Y2颗粒。

帕金森病的一个标志是黑质中伸出到纹状体的多巴胺神经元的丢失,导致纹状体中多巴胺释放的丧失。这导致基底神经节回路内的多巴胺能传递减少和下游刺激异常,这导致僵硬和僵住症状。NPY通过促进Y2受体激活的多巴胺合成和释放来抵消多巴胺能传递的抑制,而Y1受体的激活具有相反的作用(Adewale等,2005,2007)。此外,NPY在体外和体内对多巴胺能神经元发挥Y2介导的神经保护作用抵抗6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的毒性(Decressac等,2011,2012)。此外,与健康对照组相比,来自帕金森病患者的死后脑组织中尾状核和壳核中的NPY阳性细胞数量增加(Cannizzaro等,2003),这可能反映了内源性但依次不足的神经保护应答。这与纹状体和黑质中表达功能性Y2受体的多巴胺能神经元一致(Shaw等,2003),并且在纹状体6-OHDA诱导的多巴胺能神经元丧失后纹状体和伏隔核中NPY阳性神经元数量增加(Kerkerian-Le Goff等,1986;Salin等,1990)。

在一个进一步的实施方案中,所述神经疾病是帕金森病。也可以依靠AAV血清型组织向性系统性地提供基因治疗;然而,通过颅内注射,获得了具有高效力和最小副作用的对患病脑区域的精确靶向。以这种方式,病毒载体将包含在限定的区域内,具有预期的沿着白质束的周围区域最小扩散。根据神经系统疾病的类型,AAV递送方法可以是非常局限的大脑区域,或者如果合适的话,可以是覆盖大脑皮层较大区域的递送。根据癫痫的类型和癫痫一个或多个病灶的位置,AAV递送方法可以是非常局限的大脑区域,或者如果合适的话,可以是覆盖大脑皮层较大区域的递送。因此,存在几种可能的施用方法,例如脑室内,玻璃体内,静脉内,皮下,肌肉内,鼻内,经粘膜,脑内,腹膜内,鞘内,动脉内施用。

在一个实施方案中,通过位点特异性颅内注射递送包含AAV颗粒的药物组合物。

已经证明本发明的所有AAV血清型都能够转导神经胶质细胞和神经元。AAV2血清型显示较小的载体扩散和天然存在的神经元向性,为什么具有AAV2血清型衣壳蛋白的载体可适合递送至较小和更明确的脑区域。类似地,具有AAV1或AAV8血清型衣壳蛋白的载体可以是覆盖大脑皮层较大区域的合适递送。

AAV颗粒的剂量可以由一次或多次给予的一剂或若干剂组成。单剂量具有避免多次颅内注射的优点,而多剂量可以使每次注射使用较低剂量,同时监测注射之间的患者剂量响应。通常,剂量可以在0.01至100μg,例如0.1-50μg或0.5至20μg的功能性AAV颗粒。转导效力还可受到其他因素的影响,例如注射期间和注射后受试者的位置,以促进载体的扩散。

在一个实施方案中,功能性AAV的有效剂量范围为0.01至100μg,例如0.1-50μg或0.5至20μg的功能性AAV颗粒。在另一个实施方案中,将AAV颗粒配制成单剂量或多剂量施用,例如两个剂量,三个剂量,四个剂量,五个剂量。

在一个实施方案中,治疗,抑制或改善受试者的神经疾病的方法包括向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统的细胞施用药学有效量的这种组合物。在另一个实施方案中,受试者是哺乳动物受试者,例如人受试者。此外,神经疾病是癫痫或帕金森病。在该方法中,通过位点特异性颅内注射递送组合物,并且在另一个实施方案中,神经疾病是癫痫,并且将组合物递送至癫痫一个或多个病灶的位置。

通过将含有载体的AAV颗粒递送至细胞,也可以将NPY和NPY2R递送至所述细胞,例如来自受试者的内源性细胞。反过来,如在离体基因治疗方法中所见,在随后移植被AAV载体感染或转导的细胞的情况下,可以施用这样的细胞,例如通过注射或迁移到受试者的部位,用于预防,抑制,改善或治疗哺乳动物中的神经疾病,例如癫痫或帕金森病。这样的受试者可以是哺乳动物,例如人受试者。

在一个实施方案中,将NPY和Y2基因组递送至哺乳动物细胞的方法包括将所述AAV颗粒引入细胞中。在另一个实施方案中,细胞选自由以下各项组成的组:神经细胞,肺细胞,视网膜细胞,上皮细胞,肌细胞,胰腺细胞,肝细胞,心肌细胞,骨细胞,脾细胞,角质形成细胞,成纤维细胞,内皮细胞,前列腺细胞,生殖细胞,祖细胞和干细胞。在一个实施方案中,向受试者施用NPY和Y2基因组的方法包括向受试者施用(包含NPY和Y2基因组的)所述细胞。在一个实施方案中,受试者是哺乳动物受试者,例如人受试者。

在一个实施方案中,向受试者递送NPY和Y2基因组的方法包括向受试者的哺乳动物细胞施用所述AAV颗粒,其中将病毒颗粒施用于所述受试者的海马。

在一个实施方案中,向受试者递送NPY和Y2基因组的方法包括向受试者的哺乳动物细胞施用所述AAV颗粒,其中将病毒颗粒施用于受试者的纹状体,伏隔核,黑质,腹侧被盖区,或内侧前脑束。

NPY和NPY2R的递送也可以用于减少NPY和/或NPY2R活化具有治疗效果或由NPY缺乏引起的疾病,其中所述疾病选自癫痫和帕金森病。因此,在一个实施方案中,一种减少NPY具有治疗效果或由NPY缺乏引起的疾病的方法(其中所述疾病选自癫痫和帕金森病)包括向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统的细胞施用药学有效量的所述组合物。

在一个实施方案中,向有需要的受试者提供NPY的方法包括选择需要NPY的受试者,例如具有NPY缺乏的受试者,并向所述受试者提供药学有效量的所述组合物。在另一个实施方案中,通过临床评估或诊断测试,例如癫痫或帕金森病的EEG和/或临床诊断,选择所述受试者为具有NPY缺乏的受试者。

转基因表达的评估

测试本发明的载体启动NPY和NPY2R表达的能力。用包含NPY和NPY2R序列的AAV表达质粒瞬时转染HEK293细胞导致编码两种转基因的mRNA转录物水平增加,如通过双链ddPCR反应中NPY和Y2靶序列的升高量所测量的,如可以在图2中所见。对于两种质粒,IRES上游转基因的靶序列的表达水平比下游转基因的靶序列更丰富。

海马中NPY和NPY2R的表达

在实验验证AAV表达质粒(包括NPY和NPY2R序列)的序列后,将质粒包装在AAV血清型1,2或8来源的AAV衣壳颗粒中,产生总共6种独特的AAV载体颗粒,如上所述。将这些颗粒纯化并进行以在大鼠体内测试。在成年雄性Wistar大鼠的背海马中颅内注射三周后,对动物实施安乐死并收集它们的大脑并快速冷冻。随后,使用靶向NPY的免疫组织化学测定以及可视化NPY2R结合和GPCR功能性结合的放射自显影测定,对来自这些脑的脑切片进行NPY和NPY2R的转基因表达的评估。用AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY,AAV2-NPY/Y2或AAV8-NPY/Y2处理都导致NPY水平显著增加(图3和4)。诱导NPY表达的AAV载体的层次顺序如下:AAV1-NPY/Y2=AAVl-Y2/NPY=AAV8-NPY/Y2>AAV-NPY/Y2>AAV8-Y2/NPY=AAV2-Y2/NPY。所有六种载体均导致功能性NPY2R水平增加(图5A和5B),并且在用AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY,AAV2-Y2/NPY或AAV8-Y27NPY处理后也观察到显著增加的NPY2R结合水平(图6A和6B)。诱导NPY2R表达的AAV载体的层次顺序如下:AAV1-Y2/NPY>AAV8-Y2/NPY=AAV1-NPY/Y2>AAV2-Y2/NPY>AAV8-NPY/Y2=AAV2-NPY/Y2。

因此,两种AAV表达质粒(AAV-NPY/Y2和AAV-Y2/NPY)均成功转录并导致NPY和NPY2R蛋白的表达。此外,在所有情况下,转基因表达水平取决于位于IRES序列上游或下游的转基因序列,位于IRES序列上游的转基因以比位于IRES序列下游的转基因相对更高的水平表达。

当用颅内注射到大鼠海马中时,用来自AAV血清型1的衣壳蛋白假型化的AAV载体具有最高的转基因表达功效(AAV1>AAV8>AAV2)。因此,在一个实施方案中,AAV颗粒的AAV衣壳蛋白选自由AAV1,AAV2和AAV8组成的组,优选AAV1和AAV8。

出人意料的是,与用来自AAV血清型2和8的衣壳蛋白假型化的其他AAV载体相比较(其显示下游转基因的相对较低的表达),发现用来自AAV血清型1的衣壳蛋白假型化的AAV载体显示位于IRES元件下游的转基因的非常高的表达(如图4A和4B中可见)。因此,用来自AAV血清型1的衣壳蛋白假型化的AAV载体显示第一和第二转基因(即NPY和NPYR2)的高表达。

临床AAV基因治疗的一个更大障碍是确保安全表达并具有高效率。因此,同源高表达被认为是非常积极的。因此,在一个实施方案中,AAV颗粒的AAV衣壳蛋白选自由AAV1,AAV2和AAV8组成的组,最优选AAV1。在另一个实施方案中,AAV颗粒具有用于两种转基因(NPY和NPY2R)的更多同源物过表达的AAV1衣壳蛋白。

相反,在需要NPY和NPY2R转基因的异源表达功效的情况下,用来自AAV血清型2和8的衣壳蛋白假型化的AAV载体可能是优选的。

根据实施方案,本文使用的序列同一性(%SI)可以通过任何方便的方法评估。通常的做法是使用计算机程序进行这样的计算,并且用于比较和比对序列对的标准程序套件包括ALIGN(Myers and Miller,CABIOS,4:11-17,1988),FASTA(Pearson,Methods in Enzymology,183:63-98,1990)和缺口BLAST(Altschul等,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997)或BLASTP(Devereux等,Nucleic Acids Res.,12:387,1984)。如果没有这样的资源,根据一个实施方案,序列同一性(%SI)可以计算为(%SI)=100%*(成对比对中相同残基的Nr)/(最短序列的长度)。

可以使用评分进一步分析表达结果,如表1至3所示。在表1中,对转基因表达/血清型进行评分。

表1:

表1显示了用过表达NPY和Y2的AAV1,-2和-8载体处理的动物中的NPY和NPY2R蛋白水平。根据观察到的NPY或NPY2R蛋白信号评估蛋白水平:1(对应于内源水平的蛋白水平),2(高于内源水平的低蛋白表达),3(高于内源水平的中度蛋白表达),和4(高于内源水平的高蛋白表达)。数据表示为平均值±s.e.m。随后,不同的AAV载体给出1-3的等级,其中1等同于最高表达水平,3等同于最低。

因此,显然当用颅内注射到大鼠海马中时,用来自AAV血清型1的衣壳蛋白假型化的AAV载体具有最高的转基因表达功效(AAV1>AAV8>AAV2)。

此外,还可以关于两个载体方向(NPY/Y2或Y2/NPY)评估转基因表达,如表2所示。

表2:

表2显示用NPY/Y2或Y2/NPY AAV载体处理的动物中的NPY和NPY2R蛋白水平。根据观察到的NPY或NPY2R蛋白信号评估蛋白水平:1(对应于内源水平的蛋白水平),2(高于内源水平的低蛋白表达),3(高于内源水平的中度蛋白表达),和4(高于内源水平的高蛋白表达)。数据表示为平均值±s.e.m。随后,不同的AAV载体给出1-2的等级,其中1等同于最高表达水平,2等同于最低。

因此,显然转基因表达水平取决于位于IRES序列上游或下游的转基因序列,位于IRES序列上游的转基因以比位于IRES序列下游的转基因相对更高的水平表达。

AAV载体介导的对KA诱导的发作的影响

使用红藻氨酸盐诱导的大鼠发作模型来评估AAV载体介导的NPY及其受体表达的发作抑制作用。该模型被认为反映了颞叶癫痫中的急性发作事件,包括测量第一次运动性发作和癫痫持续状态的潜伏时间以及发作的频率和持续时间以及一般改变的发作严重程度评分。这在图7中说明,其显示了在单次红藻氨酸盐注射(s.c.)后2小时期间观察期间与AAV诱导的转基因过表达水平相关的发作发展的图。与内源性和较低水平的NPY表达相比,高水平的AAV载体诱导的NPY表达水平导致对第一次运动性发作和癫痫持续状态的潜伏期增加以及发作时间减少(图7A)。与内源性和较低水平的NPY2R表达相比,高水平的AAV载体诱导的NPY2R表达水平导致发作时间减少的倾向但是没有达到显著水平(图7B)。

在图8A中,如与AAV1空处理相比可以进一步看出,用AAV1-NPY/Y2治疗增加了癫痫持续状态(SE)发展的潜伏期并减少了总发作时间,而在AAV1-Y2/NPY治疗后观察到的效果没有显示出统计学意义(图8A)。AAV1-NPY/Y2和AAV1-Y2/NPY均未影响第一次运动性发作的潜伏期或发作的总次数(图8A)。

如图8B中可见,与AAV2-空相比,用AAV2-NPY/Y2或AAV2-Y2/NPY处理没有导致发作发展或严重性的任何显著变化(图8B)。

如图8C中可见,与AAV8-空相比,用AAV8-NPY/Y2处理确实显示癫痫持续状态(SE)发展的潜伏期增加和总发作时间减少,而针对AAV8-Y2/NPY没有观察到显著效果(图8C)。然而,观察到AAV8-NPY/Y2诱导的总发作时间减少的强烈但不显著的趋势(图8C)。

在所有载体颗粒中,发现用AAV1-NPY/Y2处理导致抗发作效果,这通过观察到的发作持续时间减少和SE发展的潜伏期时间增加而证实。用AAV1-Y2/NPY,AAV2-NPY/Y2,AAV2-Y2/NPY,AAV8-NPY/Y2或AAV8-Y2/NPY治疗没有导致发作发展或严重程度的统计学显著抑制。发现AAV载体颗粒的扩散和NPY转基因表达功效是血清型依赖性的(AAV1>AAV8>AAV2)。通过NPY免疫染色和功能性Y2受体结合测定分别证实NPY和Y2的转基因表达。在颅内注射和AAV载体处理后,在动物中未观察到异常行为或表观健康问题。

总之,图8显示AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY,AAV8-NPY/Y2显示出明显的抗发作趋势,这通过观察到发作持续时间减少和SE发展潜伏期时间增加而证实,对于AAV1-NPY/Y2具有明显的统计学意义。对于AAV2构建体,结果不太清楚,AAV8-Y2/NPY也未显示出明显的抗发作趋势。对于体内系统而言显而易见的是,尽管表达不等于功效,但表达对于载体功能仍然是必需的。

通过使NPY和NPY2R的转基因从单一构建体表达,本发明的载体在动物模型中给出了前所未见的机会,观察到NPY/NPY2R蛋白两者的表达水平与医学效应相关。所有转导的细胞都被具有相同数量的NPY和NPY2R基因的构建体感染,其中所有转移的基因位于相同位置,并且其中NPY/NPY2R的比例是固定的并且是载体依赖性的(为什么该比率对于所有转化细胞也将是一致的)。NPY和NPY2R基因的扩散和分布也没有差异,但它们将在完全相同的细胞中定位。使用分别含有NPY和NPY2R基因的两种载体不可能实现这些效果。对此的积极影响包括非常一致的治疗结果。从统计学上讲,这也可以更容易地为每个单独的载体的效果进行评分。通过对载体的不同质量(表达和抑制红藻氨酸盐诱导的发作的功效)进行评分,如表3所示,更容易突出哪些载体最适合用于治疗。

表3:

表3显示了在急性红藻氨酸盐诱导的发作模型中基于转基因表达和作为抗癫痫治疗的功效对六种AAV载体的总体排名。排名从1-6给出,1等于最高排名,6等于最低排名。总排名表示表达和疗效排名的平均排名。总体排名显示AAVl-NPY/Y2=AAVl-Y2/NPY=AAV8-NPY/Y2>AAV8-Y2/NPY=AAV2-NPY/Y2>AAV2-Y2/NPY。

因此,在一个实施方案中,AAV颗粒是AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY或AAV8-NPY/Y2。在一个实施方案中,AAV颗粒是AAV1-NPY/Y2。

用AAV1-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY,AAV2-NPY/Y2或AAV8-NPY/Y2处理都导致NPY水平显著增加(图3和4)。用所有6种载体处理导致功能性NPY2R水平增加(图5A和5B),尽管AAVl-Y2/NPY具有最高表达。所有6种载体的NPY2R结合水平均增加,并且在用AAVl-NPY/Y2,AAV1-Y2/NPY,AAV2-Y2/NPY或AAV8-Y2/NPY处理后显著增加(图6A和6B)。

诱导NPY表达的AAV载体的层次顺序如下:AAV1-NPY/Y2=AAV1-Y2/NPY=AAV8-NPY/Y2>AAV-NPY/Y2>AAV8-Y2/NPY=AAV2-Y2/NPY。诱导NPY2R表达的AAV载体的层次顺序如下:AAVl-Y2/NPY>AAV8-Y2/NPY=AAV1-NPY/Y2>AAV2-Y2/NPY>AAV8-NPY/Y2=AAV2-NPY/Y2。这表明具有共定位的NPY2R表达的高NPY表达似乎有利于体内功效。

氟哌啶醇诱导的僵住网格试验

使用氟哌啶醇诱导的小鼠僵住模型来评估AAV载体介导的NPY及其受体表达对僵住状态的影响。该模型使用已知拮抗多巴胺D2受体并降低纹状体多巴胺含量的氟哌啶醇。这导致多巴胺能传递的阻滞和基底神经节回路内的异常下游激活,其表现为僵硬和僵住症的症状,模仿在帕金森病中观察到的运动症状。

如图9A中可见,与AAV1-空相比,小鼠中的AAV1-NPY/Y2载体注射诱导了在僵住状态中花费的时间的显著减少。此外,图9B说明与AAV1-空相比,用AAV1-NPY/Y2载体处理还诱导以15分钟间隔观察到的在僵住状态下的平均时间显著减少。

尽管上面已经参考(a)具体实施方案描述了本发明,但是并不意图将本发明限于这里阐述的特定形式。相反,本发明仅受所附权利要求的限制,并且除了上述具体实施方案之外的其他实施方案(例如,与上述不同的实施方案)同样可以在这些所附权利要求的范围内。

在权利要求中,术语“包括/包含”不排除存在其他元素或步骤。此外,尽管单独列出,但是多个装置,元件或方法步骤可以通过例如单个单元或处理器实现。另外,尽管各个特征可以包括在不同的权利要求中,但是这些特征可以有利地组合,并且包含在不同的权利要求中并不意味着特征的组合是不可行和/或不利的。另外,单数引用不排除复数。术语“一种”,“一个”,“第一”,“第二”等不排除复数。权利要求中的附图标记仅作为说明性示例提供,并且不应被解释为以任何方式限制权利要求的范围。

实验

以下实施例仅仅是实施例,并不应解释为限制本发明的范围。相反,本发明仅受所附权利要求的限制。

载体

将人NPY(NM_000905.3)和NPY2R(NM_000910.2)开放阅读框(ORF)以及内部核糖体进入位点(IRES序列,A7版)克隆到AAV表达质粒中,所述AAV表达质粒在0.9kb杂合的巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子控制下并含有土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)和侧翼为AAV2反向末端重复序列的牛生长激素多腺苷酸化(bGH)信号。得到的载体在图1A和1B中示意性地总结。

将AAV载体基因组包装到AAV颗粒中

在互补的AAV基因组(例如pAV2(ATCC))或重组AAV-质粒的存在下,将载体DNA转染到允许的真核细胞(例如人293细胞)中。将细胞培养2至4天(在37℃下在加氨苄青霉素的LB中),然后通过多次冷冻/解冻循环释放病毒颗粒,之后通过加热至60℃使腺病毒辅助病毒失活。得到的细胞裂解物含有AAV颗粒,其具有包装在AAV颗粒中的AAV载体。使用上述两种载体和AAV1、AAV2、AAV8辅助病毒,可以获得6种不同的AAV颗粒。所有产生的载体由上述AAV质粒构建体组成,其具有来自AAV血清型2的ITR,包装在所谓的假型AAV颗粒中,意味着它们用来自AAV血清型1、2和8的衣壳蛋白包被。

AAV载体注射到大鼠海马中

在成年雄性Wistar大鼠中,将AAV载体麻醉并单侧注射到背侧海马中(坐标组1:距离硬脑膜前-后-3.3mm,内侧-外侧1.8mm,背侧-腹侧-2.6mm或坐标组2:距颅骨表面前-后-4.0mm,内侧-外侧-2.1mm,背侧-腹侧-4.3mm)或双侧进入背腹侧海马(前-后-3.3mm,内侧-外侧+/-1.8mm,背侧-腹侧-2.6mm,AP-4.8mm,ML±5.2mm,DV-6.4和-3.8mm)。参考点是前-后轴的前囟,内侧-外侧轴的中线。每个半球输注1或3μl病毒载体悬浮液(1.1x 1012基因组颗粒/ml)。

红藻氨酸盐诱导大鼠发作

AAV载体注射后3周,给大鼠皮下注射红藻氨酸盐(KA;10mg/kg;在0.9%等渗盐水中稀释;pH 7.4),并置于单独的Plexiglas盒(30×19×29cm)中并录像2小时。随后,不知道处理条件的观察者对第一次运动性发作和癫痫持续状态的潜伏期、运动性发作时间以及发作次数进行评估。运动性发作定义为前肢和/或后肢的阵挛运动持续至少15s。

大鼠的安乐死和组织收集

KA注射后3小时,将动物深度麻醉并断头处死。快速收集脑并在干冰上快速冷冻,随后储存在-80℃直至进一步加工。

在大鼠中评估AAV载体介导的转基因表达

将AAV载体处理后的表达水平与相应的初始对照大鼠的表达水平进行比较。使用ddPCR,免疫组织化学和放射自显影测定法对来自处理动物的细胞或海马脑切片评估两种转基因NPY和NPY2R的表达水平和分布模式。

液滴数字PCR(ddPCR)测定:从用AAV-NPY/Y2或AAV-Y2/NPY载体转染的人胚胎肾293细胞中分离RNA。使用iScript Advanced cDNASynthesis试剂盒合成cDNA用于RT-qPCR(Bio-Rad)。使用Integrated DNA Technologies RealTime qPCR Assay设计工具设计用于ddPCR的引物和探针测定(IntegratedDNA Technologies):NPY(正向:CTCATCACCAGGCAGAGATATG(SEQ ID NO:11);反向:ACCACATTGCAGGGTCTTC(SEQ ID NO:12)),NPY2R(正向:CTGGACCTGAAGGAGTACAAAC(SEQ ID NO:13);反向:GTTCATCCAGCCATAGAGAAGG(SEQ ID NO:14))。使用Bio-Rad QX200平台进行测量FAM标记的NPY靶序列和HEX标记的NPY2R靶序列的双重ddPCR测定。20μ1反应,包括1x ddPCR Supermixfor Probes(无dUTP)(Bio-Rad),NPY引物/FAM探针(900nM/250nM),NPY2R引物/HEX探针(900nM/250nM)和2μ l稀释1:5000的cDNA用于液滴生成和PCR。使用Droplet Digital PCR(BioRad C1000Touch热循环仪)的标准循环条件,退火/延伸温度为60℃。使用QuantaSoftTM软件(BioRad)在QX200液滴读数器(BioRad)上分析样品。

NPY免疫组织化学分析:用兔抗NPY抗体(1:500/1:10,000;Sigma-Aldrich)孵育,然后与Cy3-缀合的驴抗兔抗体(1:200,Jackson Immunoresearch,USA)或生物素化的驴抗兔二抗和3,3-二氨基联苯胺(DAB)孵育用于观察海马切片中的NPY表达。使用Olympus BX61显微镜和CellSens软件获得数字化图像。定性评估后,评定背侧海马CAl(锥体层和起层和辐射层)中的NPY水平,并给出对应于NPY阳性信号的值:1(对应于内源水平的NPY水平),2(高于内源水平的低NPY表达),3(高于内源水平的中度NPY表达),和4(高于内源水平的高NPY表达)。数据表示为平均值±s.em并使用Mann-Whitney U检验进行分析。与未处理的初始对照动物相比,*P<0.05。

NPY Y2受体结合放射自显影测定:将海马切片与0.1nM[125I][Tyr36]单碘-PYY(4000Ci/mmol;#IM259;Amersham Biosciences)和10nM Leu31,Pro34-神经肽Y(Y1/Y4/Y5优选激动剂;#H-3306,Bachem AG,Switzerland)一起孵育以使Y2结合可视化。加入1μ M未标记的NPY(人/大鼠的合成的,Schafer-N,Denmark)以使非特异性结合可视化。随后,将切片暴露于125I敏感的Kodak Biomax MS膜(Amersham Biosciences)并显影。定性评估后,评定背侧海马CAl(锥体层和起层和辐射层)中的Y2受体结合,并给出对应于Y2受体信号的值:1(对应于内源水平的Y2受体表达),2(高于内源水平的低Y2受体表达),3(高于内源水平的中度Y2受体表达),和4(高于内源水平的高Y2受体表达)。数据表示为平均值±s.e.m并使用Mann-Whitney U检验进行分析。与未处理的初始对照动物相比,*P<0.05。

NPY Y2功能性受体结合放射自显影测定:将海马切片与40pM[35S]-GTPγS(1250Ci/mmol;NEG030H250UC;PerkinElmer,DK),1μM NPY(Schafer-N,Copenhagen,DK),1μ M Y1受体拮抗剂BIBP3226(#E3620,BachemAG,Switzerland)和10μM Y5受体拮抗剂L-152,804(#1382,Tocris Cookson,UK)孵育用于使Y2受体功能性结合可视化。为了证实Y2受体结合,将1μ M Y2受体拮抗剂BIIE0246(#1700,Tocris Cookson,UK)与BIBP3226和L-152,804一起加入NPY中。通过在缓冲液B中与40pM[35S]-GTP γS和10μM未标记的GTPγS(#89378;Sigma-Aldrich)一起孵育来测定非特异性结合。随后,将切片暴露于Kodak BioMax MR膜并显影。使用ImageJ软件(National Institute of Health,USA)评定背侧海马CA1(锥体层和起层和辐射层)中的Y2受体功能性结合。数据表示为平均值±s.e.m,并使用双尾学生t检验进行分析。与未处理的初始对照动物相比,*P<0.05,***P<0.001。

AAV载体注射到小鼠纹状体中

将小鼠麻醉并在三个部位注射病毒载体(1.1x 1012基因组颗粒/ml),这些部位相对于前囟的坐标如下:前-后:+0.85mm;内侧-外侧:±1.85mm;背侧-腹侧:-3.00mm(1μl),-3.4mm(0.5μl),-3.85mm(1μl),使用外颅骨作为参考点)。

氟哌啶醇诱导的小鼠僵住网格试验

这种常用于帕金森病症状的药理学模型采用施用已知拮抗多巴胺D2受体并减少纹状体多巴胺含量的氟哌啶醇(Duty和Jenner,2011)。这导致多巴胺能传递的阻滞和基底神经节回路内的异常下游激活,其表现为僵硬和僵住症的症状,模仿在帕金森病中观察到的运动症状。

给小鼠注射氟哌啶醇(1.0mg/kg,腹膜内)并通过将小鼠置于金属网格上60秒的时间进行测试并记录固定时间。注射氟哌啶醇后,这由不知道处理条件的观察者在2小时观察期间每30分钟进行60秒观察来完成。

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201780010942.X (22)申请日 2017.02.10 (30)优先权数据 1650192-6 2016.02.12 SE (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2018.08.10 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2017/053049 2017.02.10 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2017/137585 EN 2017.08.17 (71)申请人 康贝基因有限公司 地址 瑞典隆德 (72)发明人 迈拉 卜库卡亚 (74)专利代理机构 中。

2、科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 张国梁 张莹 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) C12N 15/86(2006.01) (54)发明名称 载体 (57)摘要 本发明涉及重组腺伴随病毒(rAAV)载体, 其 包含神经肽Y(NPY)编码序列和神经肽Y2受体 (NPY2R)编码序列。 本发明进一步涉及包含所述 载体的AAV颗粒, 其中所述载体由腺伴随病毒 (AAV)衣壳蛋白包封。 还涉及包含所述AAV颗粒的 药物组合物, 用于预防或治疗哺乳动物的神经疾 病例如癫痫。 权利要求书3页 说明书26页 序列表10页 附图10页 CN 109069669 A 。

3、2018.12.21 CN 109069669 A 1.一种重组腺伴随病毒(rAAV)载体, 其包含神经肽Y(NPY)编码序列和神经肽Y2受体 (NPY2R)编码序列。 2.根据权利要求1所述的载体, 其中所述神经肽Y(NPY)编码序列具有对应于SEQ ID NO: 1的序列或与所述序列具有至少90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或 99序列同一性(SI)的序列。 3.根据权利要求1或2所述的载体, 其中所述神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列具有对应 于SEQ ID NO: 2的序列或与所述序列具有至少90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(。

4、SI)的序列。 4.根据权利要求1-3中任一项所述的载体, 其中所述载体还包含以下功能元件中的至 少一种, 优选全部: AAV2倒置末端重复序列(ITR), 杂合巨细胞病毒增强子/鸡 -肌动蛋白 CAG启动子(CAG), 内部核糖体进入位点(IRES), 土拨鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)和牛生 长激素多腺苷酸化(bGH-polyA)信号序列。 5.根据权利要求4所述的载体, 其中所述载体包含杂合巨细胞病毒增强子/鸡 -肌动蛋 白CAG启动子(CAG), 并且所述CAG启动子序列位于NPY和NPY2R的编码序列的上游。 6.根据权利要求4至5中任一项所述的载体, 其中所述载体包含内部核糖体进。

5、入位点 (IRES), 并且所述IRES序列位于NPY和NPY2R的编码序列之间。 7.根据权利要求4至6中任一项所述的载体, 其中所述载体包含土拨鼠肝炎翻译后调控 元件(WPRE), 并且所述WPRE序列位于NPY和NPY2R的编码序列的下游。 8.根据权利要求4至7中任一项所述的载体, 其中所述载体包含牛生长激素多腺苷酸化 (BGHpA)信号序列, 并且所述(BGHpA)信号序列位于NPY和NPY2R的编码序列的下游。 9.根据权利要求4至8中任一项所述的载体, 其中所述载体包含两个ITR序列, 第一ITR 序列位于所述载体的5 端、 NPY和NPY2R的编码序列的上游, 和第二ITR序列。

6、位于所述载体的 3 端、 NPY和NPY2R的编码序列的下游。 10.根据权利要求4至9中任一项所述的载体, 其中所述序列以如下顺序可操作地连接, 5 -ITR, CAG, NPY, IRES, NPY2R, WPRE, BGHpA和ITR-3 , 或 5 -ITR, CAG, NPY2R, IRES, NPY, WPRE, BGHpA, 和ITR-3 。 11.根据权利要求4至10中任一项所述的载体, 其中所述5 端ITR具有对应于SEQ ID NO: 7的序列或与存在于SEQ ID NO: 7中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90序列同一 性, 例如至少95, 96, 97, 98或99序。

7、列同一性(SI)的序列和所述3 端ITR具有对 应于SEQ ID NO: 8的序列或与存在于SEQ ID NO: 8中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少 90, 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(SI)的序列。 12.根据权利要求4至11中任一项所述的载体, 其中所述CAG具有对应于SEQ ID NO: 4的 序列或与存在于SEQ ID NO: 4中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90序列同一性, 例 如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(SI)的序列。 13.根据权利要求4至12中任一项所述的载体, 其中所述IRES具有对应于SEQ ID NO: 3 的序列或。

8、与存在于SEQ ID NO: 3中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(SI)的序列。 14.根据权利要求4至13中任一项所述的载体, 其中所述WPRE具有对应于SEQ ID NO: 5 的序列或与存在于SEQ ID NO: 5中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90序列同一性, 权 利 要 求 书 1/3 页 2 CN 109069669 A 2 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(SI)的序列。 15.根据权利要求4至14中任一项所述的载体, 其中所述BGHpA具有对应于SEQ ID NO: 6 的序列或与存。

9、在于SEQ ID NO: 6中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(SI)的序列。 16.根据权利要求4至15中任一项所述的载体, 其中所述载体具有对应于SEQ ID NO: 9 的序列或与存在于SEQ ID NO: 9中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(SI)的序列, 或所述载体具有对应于 SEQ ID NO: 10的序列或与存在于SEQ ID NO: 10中的相应长度的寡核苷酸片段具有至少 90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同。

10、一性(SI)的序列。 17.根据权利要求4至16中任一项所述的载体, 其中所述载体的序列已经过密码子优化 以在人中表达。 18.根据权利要求4至16中任一项所述的载体, 其中NPY2R编码序列在NPY编码序列的下 游。 19.根据权利要求4至15中任一项所述的载体, 其中所述CAG启动子序列与在所述CAG启 动子序列的下游和所述IRES序列的上游的NPY或NPY2R的编码序列之间的距离在60至0个碱 基的范围内, 优选40至5个碱基, 大多数优选20至10个碱基。 20.根据权利要求4至15中任一项所述的载体, 其中所述IRES序列与下游NPY或NPY2R编 码序列之间的距离在60至0个碱基的。

11、范围内, 优选40至2个碱基, 最优选10至4个碱基。 21.AAV颗粒, 其包含权利要求1至20中任一项的载体, 其中所述载体被腺伴随病毒 (AAV)衣壳蛋白包封。 22.根据权利要求21所述的AAV颗粒, 其中所述AAV衣壳蛋白选自由以下各项组成的组: AAV1, AAV2和AAV8, 优选选自AAVl或AAV8, 最优选AAV1。 23.根据权利要求21至22中任一项所述的AAV颗粒, 其为AAV1-NPY/Y2, AAV1-Y2/NPY或 AAV8-NPY/Y2。 24.根据权利要求21至23中任一项所述的AAV颗粒, 其是AAV1-NPY/Y2。 25.药物组合物, 其包含权利要求2。

12、1至24中任一项的AAV颗粒, 应用于预防, 抑制, 改善 或治疗哺乳动物的神经疾病。 26.根据权利要求25的应用的药物组合物, 其中所述神经疾病是癫痫或帕金森病。 27.根据权利要求25的应用的药物组合物, 其中所述癫痫是药物抗性癫痫。 28.根据权利要求25的应用的药物组合物, 其中所述神经疾病是帕金森病。 29.根据权利要求25至28中任一项的应用的药物组合物, 其中所述组合物通过位点特 异性颅内注射施用。 30.根据权利要求25至29中任一项的应用的药物组合物, 其中将所述AAV颗粒配制成单 剂量或多剂量, 例如两个剂量、 三个剂量、 四个剂量、 五个剂量施用。 31.根据权利要求2。

13、5至30中任一项的应用的药物组合物, 其中所述功能性AAV的有效剂 量范围为0.01至100 g, 例如0.1-50 g或0.5至20 g的功能性AAV颗粒。 32.治疗、 抑制或改善受试者的神经疾病的方法, 其包括: 向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统细胞内施用药学有效量的根据权利要求25 至31中任一项的组合物。 权 利 要 求 书 2/3 页 3 CN 109069669 A 3 33.根据权利要求32所述的方法, 其中所述受试者是哺乳动物受试者。 34.根据权利要求32所述的方法, 其中所述受试者是人, 狗, 猫或马受试者。 35.根据权利要求32所述的方法, 其中所述受试者是人受试。

14、者。 36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法, 其中所述神经疾病是癫痫或帕金森病。 37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法, 其中通过位点特异性颅内注射递送所 述组合物。 38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法, 其中所述神经疾病是癫痫, 以及将所述 组合物递送至一个或多个癫痫病灶的位置。 39.将NPY和Y2基因组递送至哺乳动物细胞的方法, 其包括将根据权利要求21或24的 AAV颗粒导入细胞。 40.根据权利要求39所述的递送方法, 其中所述细胞选自由以下各项组成的组: 神经细 胞, 肺细胞, 视网膜细胞, 上皮细胞, 肌细胞, 胰腺细胞, 肝细胞, 心肌细胞, 骨。

15、细胞, 脾细胞, 角质形成细胞, 成纤维细胞, 内皮细胞, 前列腺细胞, 生殖细胞, 祖细胞和干细胞。 41.向受试者施用NPY和Y2基因组的方法, 其包括向所述受试者施用权利要求39或40的 细胞。 42.根据权利要求41所述的向受试者施用核酸的方法, 其中所述受试者是哺乳动物受 试者。 43.根据权利要求41所述的向受试者施用核酸的方法, 其中所述受试者是人受试者。 44.向受试者递送NPY和Y2基因组的方法, 其包括向受试者的哺乳动物细胞施用根据权 利要求21至24中任一项的AAV颗粒, 其中将所述病毒颗粒施用于所述受试者的海马。 45.减少NPY具有治疗效果的或由NPY缺乏引起的疾病的。

16、方法, 其中所述疾病选自癫痫 或帕金森病, 所述方法包括向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统的细胞施用药学有效 量的根据权利要求19至24中任一项的组合物。 46.向有需要的受试者提供NPY的方法, 其包括: 选择需要NPY的受试者, 例如NPY缺乏的受试者; 和 向所述受试者提供药学有效量的根据权利要求19至24中任一项的组合物。 47.根据权利要求46所述的方法, 其中通过临床评估或诊断测试, 例如癫痫或帕金森病 的EEG和/或临床诊断, 选择所述受试者为具有NPY缺乏的受试者。 权 利 要 求 书 3/3 页 4 CN 109069669 A 4 载体 发明领域 0001 本发明涉及包含。

17、编码NPY及其受体Y2(NPY2R)的某些核酸序列以及特定载体元件 的载体。 此外, 本发明涉及所述载体被包封在来自腺病毒血清型1, 2和8的衣壳蛋白中, 形成 AAV颗粒。 最后, 本发明涉及所述载体或所述AAV颗粒, 其用于制备用于治疗哺乳动物中的神 经疾病(例如癫痫)的药物。 0002 发明背景 0003 根据世界卫生组织(WHO), 与中枢神经系统有关的疾病构成了一个巨大的社会经 济健康问题, 目前可用的治疗选择是不够的。 这些疾病包括但不限于癫痫和帕金森病。 0004 癫痫是世界上最古老的神经系统疾病之一, 其书面记录可追溯到公元前4000年。 几个世纪以来, 恐惧, 误解, 歧视和。

18、社会耻辱已经包围了癫痫。 今天许多国家仍然存在这种 耻辱, 并可能影响患有该疾病的人及其家人的生活质量。 全球约有1的人患有癫痫, 使其 成为全球最常见的神经系统疾病之一。 0005 癫痫发作是发生可以从短暂的和几乎不可检测到长时间的剧烈抖动。 在癫痫中, 发作往往会复发, 并且通常没有可识别的潜在原因。 0006 发作是一组同步脑细胞中过度放电的结果。 大脑的不同部分可以是这种放电的部 位。 最常见的癫痫类型, 其影响患有该疾病的10名受试者中的6名, 被称为特发性癫痫, 并且 没有可识别的原因。 具有已知原因的癫痫称为继发性癫痫或症状性癫痫。 继发性(或症状 性)癫痫的原因包括: 产前或围。

19、产期损伤引起的脑损伤, 伴有脑畸形的先天性畸形或遗传 病, 严重的头部损伤, 限制脑氧气量的中风, 脑感染例如脑膜炎, 脑炎, 神经型囊尾蚴病, 某 些遗传综合征或脑肿瘤。 0007 据估计, 高达70的癫痫病例可以用日常药物治疗。 然而, 对于对治疗应答差的 人, 他们可能不得不保持不治疗或采取癫痫手术或非药物治疗, 如深部脑刺激(DBS), 迷走 神经刺激(VNS)或饮食。 0008 根据世卫组织的报告, 癫痫占全球疾病负担的0.75, 这是一项基于时间的测算, 结合了由于过早死亡导致的生命损失年和生活在不完全健康状况的时间。 2012年, 癫痫导 致大约2060万伤残调整生命年(DALY。

20、s)丢失。 癫痫在保健需求, 过早死亡和工作效率损失方 面具有重大的经济意义。 0009 因此, 需要治疗癫痫的新途径和随后的新方法。 在EP 2046394 A1中, 描述了用于 治疗神经系统疾病的有希望的途径, 其中一种或若干种神经肽在神经系统细胞中与其一种 或多种相应的受体一起过表达。 增加神经递质的释放通常导致介导神经递质作用的受体的 代偿性下调, 因此相应受体的表达有助于避免限制随时间的治疗效果。 使用神经肽和受体 过表达概念的改进方法对于癫痫的新治疗是有利的, 特别是用于治疗药物抗性癫痫, 即当 前药物治疗方法不能导致所需治疗效果的癫痫类型。 0010 发明概述 0011 因此, 。

21、本发明的方面优选地寻求通过提供重组腺伴随病毒(recombinant adeno- associated viral, rAAV)载体来单独或以任何组合缓解, 减轻或消除本领域中的一种或多 说 明 书 1/26 页 5 CN 109069669 A 5 种上述缺陷和缺点并至少解决上述问题, 所述载体包含神经肽Y(NPY)编码序列和神经肽Y2 受体(NPY2R)编码序列。 0012 根据本发明的一个方面, 载体还包含以下功能元件中的至少一种, 优选全部: AAV2 倒置末端重复序列(ITR), 杂合巨细胞病毒增强子/鸡 -肌动蛋白CAG启动子(CAG), 内部核 糖体进入位点(IRES), 土拨。

22、鼠肝炎翻译后调控元件(WPRE)和/或牛生长激素多腺苷酸化 (bGH-polyA)信号序列。 0013 在本发明的一个方面, AAV颗粒包含所述载体, 其中所述载体由腺伴随病毒(AAV) 衣壳蛋白包封。 0014 根据本发明的另一方面, 药物组合物包含所述AAV颗粒, 用于预防, 抑制或治疗哺 乳动物的神经疾病, 例如癫痫或帕金森病。 0015 在本发明的一个方面, 用于治疗, 抑制或改善受试者的神经疾病的方法包括向患 有神经疾病(例如癫痫或帕金森病)的受试者(例如哺乳动物或人受试者)的中枢神经系统 的细胞施用药学有效量的所述组合物。 0016 根据本发明的另一方面, 将NPY和Y2基因组递送。

23、至哺乳动物细胞的方法包括将所 述AAV颗粒引入细胞中。 在另一个实施方案中, 向受试者(例如哺乳动物或人受试者)施用 NPY和Y2基因组的方法包括将所述细胞施用于受试者。 0017 在本发明的一个方面, 向受试者递送NPY和Y2基因组的方法包括向受试者的哺乳 动物细胞施用所述AAV颗粒, 其中将病毒颗粒施用于所述受试者的海马。 0018 根据本发明的另一方面, 一种减少NPY具有治疗效果或由NPY缺乏引起的疾病的方 法(其中所述疾病选自癫痫或帕金森病)包括向患有神经疾病的受试者的中枢神经系统的 细胞施用药学有效量的所述组合物。 0019 根据本发明的另一个方面, 向有需要的受试者(例如通过临床。

24、评估或诊断测试(例 如癫痫或帕金森病的EEG和/或临床诊断)选择的具有NPY缺乏的受试者)提供NPY的方法包 括选择需要NPY的受试者, 例如具有NPY缺乏的受试者, 并向所述受试者提供药学有效量的 所述组合物。 0020 本发明的其他方面还涉及在本申请的权利要求中找到的替代方案。 0021 附图的简要说明 0022 本发明的实施例的这些和其他方面, 特征和优点将从以下对本发明的实施例的描 述中变得显而易见, 参考附图, 其中, 0023 图1A和B是本文所述的若干个实施方案中使用的载体的示意图, 其中神经肽Y (NPY)和神经肽受体2(NPY2R)的转基因顺序是NPY在NPY2R的上游(图1。

25、A)或NPY2R在NPY的上 游(图1B)。 0024 图2显示了通过ddPCR总结转染的HEK293细胞中转基因表达的图。 通过ddPCR测量 的NPY和NPY2R靶序列的数目。 作为对照, 使用未处理的细胞或不含NPY和NPY2R编码序列 (IRES)的AAV表达质粒。 配对学生t检验, t33.927, *P0.0294。 数据点/条代表平均值 SEM(每次处理n4)。 0025 图3显示了来自大鼠的海马切片中NPY表达的图。 单侧AAV载体处理后3周, 背侧海 马CA1区的NPY水平。 根据观察到的NPY阳性免疫荧光信号评估NPY水平: 1(对应于内源水平 的NPY水平), 2(高于内。

26、源水平的低NPY表达), 3(高于内源水平的中度NPY表达), 和4(高于内 说 明 书 2/26 页 6 CN 109069669 A 6 源水平的高NPY表达)。 数据表示为平均值s.e.m并使用Mann-Whitney U检验进行分析。 与 未处理的初始对照动物相比, *P0.05。 0026 图4显示了在单侧AAV-NPY/Y2载体处理后三周在背侧海马中NPY表达的图像。 DAB 染色越深, NPY样免疫反应性水平越高。 用AAV-Y2/NPY载体(未显示)处理的大鼠的NPY表达 对应于图中所见表达的9-17。 0027 图5A和5B说明来自大鼠的海马切片中的NPY2R功能, 其中5A。

27、显示说明在单侧AAV载 体处理后三周在背侧海马的CA1区域中功能性NPY2R结合水平的图。 数据表示为平均值 s .e .m, 并使用非配对双尾学生t检验进行分析。 与未处理的初始对照动物相比, *P 0.05, *P0.001。 图5B显示了A中所示的功能性NPY2R结合的代表性图像。 0028 图6显示了来自大鼠的海马切片中的NPY2R表达, 其中6A显示了说明单侧AAV载体 处理后三周在背侧海马中NPY2R结合水平的图。 在海马CA1区评估Y2受体结合并给出对应于 Y2受体信号的值: 1(对应于内源水平的Y2受体表达), 2(高于内源水平的低Y2受体表达), 3 (高于内源水平的中度Y2。

28、受体表达)和4(高于内源水平的高Y2受体表达)。 数据表示为平均 值s.e.m并使用Mann-Whitney U检验进行分析。 与未处理的初始对照动物相比, *P 0.05。 图6B显示了6A中所示的功能性NPY2R结合的代表性图像。 。 0029 图7显示了在单次红藻氨酸盐注射(s.c.)后2小时期间观察期间与AAV诱导的转基 因过表达水平相关的发作发展的图。 图7A显示了发作发展和AAV诱导的NPY转基因过表达之 间的关系。 对照: 对应于内源水平的NPY水平(对应于图3中的值1); 低: 低NPY转基因表达水 平(对应于图3中的值2); 高: 高NPY转基因表达水平(对应于图3中的值3-。

29、4)。 与NPY表达等于 内源水平的大鼠相比, a)第一次运动性发作(motor seizure, MS)的潜伏期, b)癫痫持续状 态(status epilepticus, SE)的潜伏期, 和c)发作时间(包括抗癫痫效果)在具有高转基因 NPY表达的经治疗的大鼠中均显著不同, d)所有类别的发作次数均未受影响。 图7B显示了发 作和AAV诱导的NPY2R(Y2)转基因过表达之间的关系。 对照: 对应于内源水平的NPY2R水平 (对应于图3中的值1); 低: 低NPY2R转基因表达水平(对应于图3中的值2); 高: 高NPY2R转基 因表达水平(对应于图3中的值3-4)。 a)第一次运动性。

30、发作(MS)的潜伏期, b)癫痫持续状态 (SE)的潜伏期, c)发作时间和d)发作次数在任何NPY2R表达类别中没有显著改变。 然而, 观 察到强烈倾向, 特别是对于c)高NPY2R表达类别中的癫痫发作时间的减少。 数据表示为平均 值s.e.m, 并使用在显著单向ANOVA后的Bonferroni多重比较事后检验进行分析。 *P 0.05, *P0.01。 0030 图8说明双侧海马内AAV载体注射对KA诱导的癫痫发作的影响: 8A显示双侧海马内 AAV1载体注射对KA诱导的癫痫发作的影响。 与对照(AAV1-空)相比, 在AAV1载体介导的NPY 和Y2过表达后, a)第一次运动性发作的潜。

31、伏期和d)发作总数没有受到影响。 与对照(AAV1- 空)相比, AAVl-NPY/Y2治疗后b)癫痫持续状态(SE)的潜伏期和c)总癫痫发作时间均显著降 低, 而AAV1-Y2/NPY无显著影响。 数据是平均值SEM(每组n7-8)。 相对于对照(AAV1-空)* P0.05, 在显著单向ANOVA后的Bonferroni多重事后比较检验。 图8B显示双侧海马内AAV2 载体注射对KA诱导的发作的影响。 在AAV2载体介导的NPY和Y2过表达后未观察到对KA诱导 的发作的影响。 这包括观察a)第一次运动性发作的潜伏期, b)癫痫持续状态(SE)的潜伏期, c)总发作时间, 和d)癫痫发作总次。

32、数。 数据是平均值SEM(每组n8)。 在显著单向ANOVA后 的Bonferroni多重事后比较检验。 图8C显示双侧海马内AAV8载体注射对KA诱导的发作的影 说 明 书 3/26 页 7 CN 109069669 A 7 响。 在AAV8载体介导的NPY和Y2过表达后未观察到对KA诱导的发作的影响。 这包括观察a)第 一次运动性发作的潜伏期, b)癫痫持续状态(SE)的潜伏期, c)总发作时间, 和d)癫痫发作总 次数。 数据是平均值SEM(每组n8-12)。 在显著单向ANOVA后的Bonferroni多重事后比较 检验。 0031 图9说明了在氟哌啶醇诱导的帕金森病症状的僵住症(ca。

33、talepsy)中, 小鼠双侧纹 状体内AAV1-NPY/Y2或AAV-空(对照)载体注射的效果。 A)与AAV1-空相比, 用AAV1-NPY/Y2载 体治疗诱导了在僵住状态下的时间的显著减少。 数据表示为平均值s.e.m并使用双向重 复测量ANOVA进行分析。 *P0.05表示AAV1-空和AAV1-NPY/Y2载体处理之间的总体显著治 疗效果。 B)与AAVl-空相比, 用AAVl-NPY/Y2载体治疗诱导以15分钟间隔观察到的在僵住状 态下的平均时间显著减少。 数据表示为平均值s.e.m, 并使用双向学生t检验进行分析。 *P 0.05。 0032 实施方案的描述 0033 以下描述集。

34、中于本发明的实施方案, 其适用于基因治疗的AAV载体, 并且特别是适 用于治疗哺乳动物的神经疾病(例如癫痫)的所述载体的AAV颗粒。 0034 神经疾病包括神经系统中的大量疾病, 包括但不限于脑, 脊髓和其他神经, 其具有 结构, 生物化学和/或信号传导异常等。 神经疾病不仅限于人, 而且还存在于其他哺乳动物 中, 例如马, 狗和猫, 在本文中称为 “受试者” 。 例如, 一般狗群中犬癫痫的发病率估计在 0.5和5.7之间。 0035 神经肽Y(NPY)是36个氨基酸长的肽神经递质, 并且是哺乳动物中枢神经系统中最 丰富的之一。 NPY已被证明可在神经退行性疾病的动物模型中发挥神经保护作用, 。

35、如阿尔茨 海默病(Rose等, 2009), 亨廷顿病和帕金森病。 NPY首次显示减少大鼠海马切片中Schaffer 侧支CAl突触的兴奋, 随后显示涉及突触前谷氨酸释放的Y2受体依赖性抑制。 谷氨酸是脑中 的主要兴奋性神经递质, 并且因此负责癫痫发活动中看到的引发, 扩散和超出规模的突触 传递。 一致地, NPY缺乏突变小鼠对发作更敏感, 并且脑室内施用NPY在大鼠的实验性发作模 型中在体内发挥抗癫痫样作用。 重要的是, NPY还抑制人癫痫海马中的兴奋性突触传递 (Patrylo等, 1999; Ledri等, 2015)。 在海马中, NPY的抗癫痫作用主要通过与Y2或Y5受体的 结合介导。

36、(Woldbye等, 1997, 2005; El Bahh等, 2005; Benmaamar等, 2005), 而Y1受体的激活 是促进发作(Benmaamar等, 2003)。 0036 由于其抗癫痫作用, NPY已应用于靶向基因治疗。 因此, rAAV介导的NPY的海马过表 达对大鼠的刺激诱导的急性发作和癫痫持续状态损伤后三个月的自发性发作具有抑制作 用。 为了利用差异性NPY受体亚型特异性参与, 还进行了基因治疗, 单独过表达Y1, Y2或Y5受 体或与NPY组合。 因此, 与单独的NPY或受体过表达相比, NPY和Y2或Y5的组合对刺激诱导的 大鼠急性发作具有优异的发作抑制作用(W。

37、oldbye等, 2010;等, 2012)。 0037 相反, 如后续研究所预测的, 海马过表达Y1受体导致促进发作的作用(Benmaamar 等, 2003; Olesen等, 2012)。 在类似方法中, rAAV载体介导的Y2优选激动剂NPY13-36的过表 达也发挥抗癫痫作用(Foti等, 2007)。 随后, 当在临床相关的大鼠癫痫长期慢性模型中进行 测试时, NPY和Y2受体rAAV载体介导的过表达的抗癫痫作用的翻译价值得到了进一步的支 持(Ledri等, 2016)。 0038 本文描述了利用AAV载体在有需要的受试者中治疗或抑制癫痫和/或帕金森病的 说 明 书 4/26 页 。

38、8 CN 109069669 A 8 基因治疗的若干种方法。 此外, AAV载体现在被认为可安全地用于治疗神经疾病的治疗性转 基因(McCown, 2011; Bartus等, 2014)。 然而, 有效地以安全方式表达治疗性转基因的重组病 毒载体的开发遇到了若干障碍, 这是它们在人类基因治疗中广泛使用的现有障碍。 因此, 涉 及rAAV载体的新基因疗法的设计涉及仔细选择许多不同的元件, 为特定组织和基因治疗靶 标创建高度定制和独特的构建体。 0039 设想包含由单个rAAV编码的NPY和Y2受体的过表达的新基因疗法当与特定AAV血 清型衣壳蛋白一起使用时将鉴于本文所述的载体排列和功能元件的特。

39、定选择(例如, 构建 体重遗传元件的排序和/或某些遗传元件之间的距离)产生有效的体内表达。 下面给出的公 开内容提供了关于这些组合物以及制备和使用这些组合物治疗和/或抑制受试者的癫痫 和/或帕金森病的方法的更多细节, 所述受试者需要治疗或改善癫痫或帕金森病或与其相 关的失调比如发作活动的试剂。 0040 rAAV NPY和NPY2R载体 0041 通过在同一载体中具有NPY和NPY2R编码序列, NPY2R和NPY将以同源方式扩散, 确 保效应分子NPY及其靶标发作抑制性受体NPY2R的表达非常接近。 此外, 通过在同一载体中 具有NPY和NPY2R编码序列, NPY和NPY2R在一个细胞中的。

40、基因组插入的数量可以是同源的, 使得能够控制插入的NPY和NPY2R基因的比率。 0042 因此, 在第一实施方案中, 重组腺伴随病毒(rAAV)载体包含神经肽Y(NNPY; c.f.SEQ ID NO: 15)编码序列和神经肽Y2受体(NPY2R; c.f.SEQ ID NO: 16)编码序列。 0043 载体中的神经肽Y(NPY)编码序列可具有对应于SEQ ID NO: 1的序列或与SEQ ID NO: 1具有至少90的序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99的序列同一性( SI)。 神经肽Y(NPY)编码序列可以被截短, 只要它编码功能性神经肽Y, 例如, 该分子可以结 。

41、合其受体。 截短的序列可包含(294个中的)至少255个, 例如265, 275, 285, 290碱基, 并且与 SEQ ID NO: 1具有至少90的序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99的序列同 一性(SI), 并且编码功能性神经肽Y, 例如, 该分子可以结合其受体。 0044 载体中的神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列可具有对应于SEQ ID NO: 2的序列或与 SEQ ID NO: 2具有至少90的序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99的序列同 一性(SI)。 神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列可以被截短, 只要它是功能性神经肽Y2受体, 例。

42、如, 该分子可以结合其配体。 截短的序列可包含(1146中的)至少975个, 例如1000, 1115, 1130, 1140碱基, 并且与SEQ ID NO: 2具有至少90的序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99的序列同一性(SI), 并且编码功能性神经Y2受体, 例如, 该分子可以结 合其配体。 0045 尽管受体丰度是组织特异性表达的一个因素, 但AAV载体的其他元件可以影响组 织特异性表达。 通过控制转基因方向, 即NPY和NPY2R基因的顺序和/或与载体中的编码NPY 和/或编码NPY2R的基因的启动子元件和/或增强子元件的距离, 在载体设计中给出进一步 的表达控。

43、制。 由内源基因启动子引起的或来自启动子元件或增强子元件的转录干扰影响基 因座处的转基因表达。 因此, 与缺乏这些修饰的常规载体设计相比, 载体已被修饰以相对于 所选择的载体启动子元件和/或增强子元件改善转基因表达。 在第一实施方案中, 载体中 NPY和NPY2R编码基因的转基因方向使得NPY编码基因在接近启动子方面位于NPY2R编码基 因之前(例如, NPY编码基因存在于NPY2R编码基因上游的载体上)使得其比NPY2R编码基因 说 明 书 5/26 页 9 CN 109069669 A 9 更接近启动子。 所述神经肽Y(NPY)编码序列可具有对应于SEQ ID NO: 1的序列或与所述序 。

44、列具有至少90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99的序列同一性(SI) 的序列。 所述神经肽Y2受体(NPY2R)编码序列可具有对应于SEQ ID NO: 2的序列或与所述序 列具有至少90, 例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性的序列(SI)。 通过基 因表达, 神经肽Y(NPY)编码序列用于合成前神经肽Y前原蛋白(SEQ ID NO: 15), 神经肽Y2受 体(NPY2R)编码序列用于合成神经肽Y受体2型(SEQ ID NO: 16)。 如本领域技术人员已知的, 备选序列也可以编码相同的肽序列。 因此, 重组腺伴随病毒(rAAV)载体还可以包含编码根 。

45、据SEQ ID NO: 15的蛋白质的序列, 或与所述序列具有至少90序列同一性例如至少95, 96, 97, 98或99序列同一性(SI)的序列, 和编码根据SEQ ID NO: 16的蛋白质的序 列, 或与所述序列具有至少90序列同一性例如至少95, 96, 97, 98或99序列同 一性(SI)的序列。 NPY编码基因可以与所述启动子并置。 NPY编码基因可以在启动子区末 端的5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15或5-10个核苷酸内开始(例如, NPY编码基因从距启 动子区术端5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1。

46、6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59或60个核苷酸开始, 或NPY编码基因在距启动子的上述数目的核苷酸位 置的任何两个限定的范围内开始)。 启动子可以是巨细胞病毒增强子/鸡 -肌动蛋白(CAG) 启动子。 载体中的CAG启动子序列可以与SEQ ID NO: 4共享至少90的序列同一性, 例。

47、如至 少95, 96, 97, 98或99的序列同一性(SI)。 CAG启动子序列可以被截短, 只要它 是功能性的(例如, 诱导基因的表达), 并且截短的CAG启动子序列可以包含(936个中的)至 少850, 例如875, 900, 925, 935各碱基, 并且与SEQ ID NO: 4共享至少90的序列同一性, 例 如至少95, 96, 97, 98或99的序列同一性(SI), 并诱导与所述启动子有效连接 的基因的表达。 CAG启动子可具有对应于SEQ ID NO: 4的序列或与SEQ ID NO: 4具有至少 90序列同一性, 例如至少95, 96, 97, 98或99的序列同一性(SI。

48、)的序列。 IRES 序列可位于载体中NPY和NPY2R编码基因之间。 IRES序列可以在NPY编码基因末端的5-50, 5- 40, 5-30, 5-20, 5-15或5-10个核苷酸内开始(例如, IRES序列从距NPY编码基因末端5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49或50个核苷酸开始, 或IRES序列在 距NPY编码序列的上述数目的核苷酸位置的任何两个限定的范围内开始)。 IRES序列可以在 NPY2R编码基因起始的5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15或5-10个核苷酸内结束(例如, IRES序列 在距NPY2R编码基因起始的5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29。

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