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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810967633.8 (22)申请日 2018.08.23 (71)申请人 江苏师范大学 地址 221000 江苏省徐州市铜山区上海路 101号 (72)发明人 李玉玲 卜乐然 张诃娜 许康 杜百祥 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 周敏 (51)Int.Cl. A61K 47/69(2017.01) A61K 47/59(2017.01) A61K 31/37(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明。
2、名称 一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶 束及其制备方法与应用 (57)摘要 一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶 束， 主链为亲水性pH敏感的聚恶唑啉和疏水性聚 氨酯构成的两亲性三嵌段聚合物， 中间为疏水性 嵌段， 封端为亲水性聚恶唑啉。 疏水段为用5,7- 双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素(DHEMC)和二 异氰酸酯聚合得到的疏水性聚氨酯， 亲水段为具 有pH敏感性的聚合物聚恶唑啉， 三嵌段之间以异 氰酸酯基和羟基缩合形成的氨酯键连接。 两亲性 聚合物自组装成胶束后可以在UV光诱导下交联 得到稳定的pH敏感的交联胶束。 该交联胶束在细 胞外和血液中不易解离， 包封药物稳定， 进入。
3、肿 瘤细胞后， 在细胞内溶酶体的酸性环境内快速解 离， 释放药物。 该交联胶束可改善传统药物释放 系统的不足， 有望成为一种新型的靶向肿瘤的药 物递送平台。 权利要求书1页 说明书6页 CN 108939091 A 2018.12.07 CN 108939091 A 1.一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束， 包括亲水外层和疏水内核， 其特征在 于， 疏水内核由5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素和二异氰酸酯聚合而得的疏水性聚 氨酯交联构成。 2.根据权利要求1所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束， 其特征在于， 所 述亲水外层为聚恶唑啉， 聚恶唑啉分子量为1000100。
4、00Da。 3.根据权利要求1所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束， 其特征在于， 所 述二异氰酸酯为胱胺二异氰酸酯、 L-赖氨酸乙酯二异氰酸酯或六亚甲基二异氰酸酯。 4.根据权利要求1所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束， 其特征在于， 所 述5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素的单元数为550。 5.以上任一权利要求所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束的制备方法， 其特征在于， 包括步骤： S1： 以辛酸亚锡为催化剂， 5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素和二异氰酸酯缩聚得 到疏水性聚氨酯预聚体， 然后用亲水性的端羟基聚恶唑啉对聚氨酯预聚体进行。
5、封端， 得到 含不同5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素单元数的两亲性聚氨酯； S2： 将两亲性聚氨酯溶在有机溶剂中， 在室温搅拌条件下滴入去离子水， 通过自组装形 成纳米胶束； S3： 使用波长为365nm以上的紫外光对纳米胶束进行照射， 形成交联胶束。 6.根据权利要求5所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束的制备方法， 其 特征在于， 所述步骤S3中的紫外光照射的时间为28小时。 7.权利要求1、 2、 3或4所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束作为药物载 体的应用。 8.根据权利要求7所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束作为药物载体的 应用， 其特征。
6、在于， 所述交联胶束作为药物载体的降解条件为下列条件之一： (1)细胞内的酸性环境； (2)波长300nm以下紫外光照射； (3)细胞内的酸性环境且波长300nm以下紫外光照射。 9.根据权利要求7所述的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束作为药物载体的 应用， 其特征在于， 所述药物为治疗癌症的药物。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108939091 A 2 一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束及其制备方法与 应用 技术领域 0001 本发明属于化学合成及生物医药领域， 具体一种可光交联的pH响应性的纳米胶束 及其制备方法与应用。 背景技术 0002 作为人类健康的最大威。
7、胁之一， 全球癌症发病率持续增长。 目前， 手术切除病变组 织仍是常规临床治疗恶性肿瘤的主要方法， 但患者术后出现易复发， 癌细胞易转移的缺点。 因此， 需要长期和连续施用化疗药物以降低复发风险。 但大多数抗癌药物如紫杉醇， 多柔比 星和氟尿嘧啶等， 均有高毒性、 稳定性差、 溶解性差、 难以在肿瘤部位积累等缺点， 在杀死肿 瘤细胞时对正常细胞造成巨大损害， 从而导致严重的毒副作用。 因此， 提高化学治疗剂在水 中的溶解度和稳定性以及它们的靶向能力是目前研究开发有效的癌症治疗方法的关键。 在 过去的几十年里， 已经出现了多种用于生物医学用途的纳米载体， 如胶束， 纳米粒子， 囊泡 和纳米凝胶。。
8、 在各种载体材料中， 聚氨酯(PU)以其容易合成， 高稳定性和良好的生物相容性 等优点在药物传递领域引起众多关注。 0003 两亲性PU的各种聚合物(Du,X.X,et al.Polym.Chem.2014,5,5300-5309)可以很 容易地自组装成胶束， 并将药物整合到疏水核心内。 因此可以极大地减少常规药物的副作 用， 并且可以增强它们的水溶性， 从而改善它们在肿瘤组织中的功效。 但是两亲聚合物胶束 在体内循环给药时由于被体液大量稀释和与血液的相互作用， 使得载药胶束在到达肿瘤部 位之前就被破坏， 导致过早的释放药物， 从而降低治疗效果并引起一系列副作用。 因此增加 载药胶束稳定性在药。
9、物递送领域是至关重要的。 而开发化学交联胶束便是一种增加载药胶 束稳定性的有效策略。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种可光交联的pH响应性的纳米胶束， 以解决两亲聚合物胶 束在体内循环给药时过早释放药物， 导致药效低及副作用的问题。 0005 为实现上述目的， 本发明的技术方案如下： 0006 一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束， 包括亲水外层和疏水内核， 疏水内 核由5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素和二异氰酸酯聚合而得的疏水性聚氨酯交联构 成。 0007 进一步的， 所述亲水外层为聚恶唑啉， 聚恶唑啉分子量为100010000Da。 0008 进一步的， 所述二异。
10、氰酸酯为胱胺二异氰酸酯、 L-赖氨酸乙酯二异氰酸酯或六亚 甲基二异氰酸酯。 0009 进一步的， 所述5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素的单元数为550。 0010 本发明还提供了可光交联的pH响应性的交联胶束的制备方法， 包括步骤： 0011 S1： 以辛酸亚锡为催化剂， 5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素和二异氰酸酯缩 说 明 书 1/6 页 3 CN 108939091 A 3 聚得到疏水性聚氨酯预聚体， 然后用亲水性的端羟基聚恶唑啉对聚氨酯预聚体进行封端， 得到含不同5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素单元数的两亲性聚氨酯； 0012 S2： 将两亲性聚氨酯。
11、溶在有机溶剂中， 在室温搅拌条件下滴入去离子水， 通过自组 装形成纳米胶束； 0013 S3： 使用波长为365nm以上的紫外光对纳米胶束进行照射， 形成交联胶束。 0014 进一步的， 所述步骤S3中的紫外光照射的时间为28小时。 0015 本发明还提供了可光交联的pH响应性的交联胶束作为药物载体的应用。 0016 进一步的， 所述交联胶束作为药物载体的降解条件为下列条件之一： 0017 (1)细胞内的酸性环境； 0018 (2)波长300nm以下紫外光照射； 0019 (3)细胞内的酸性环境且波长300nm以下紫外光照射。 0020 进一步的， 所述药物为治疗癌症的药物。 0021 与现有。
12、技术相比， 本发明的有益效果： 0022 本发明的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束， 疏水部分含有5,7-双(2- 羟基乙氧基)-4-甲基香豆素， 可通过紫外光照射使两亲聚合物自组装形成的胶束交联， 得 到稳定交联的pH敏感的聚合物胶束， 该胶束在细胞外和血液中不易解离， 从而保证胶束包 封的药物稳定； 克服了药物在体内易被泄漏、 运载效率低等不足， 可作为理想的药物载体； 交联胶束进入肿瘤细胞后， 载药胶束的pH敏感性使得胶束快速解离， 药物快速释放出来， 从 而改善药物的治疗作用； 本发明的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束具有良好的 pH和光响应性， 可在300nm以下紫外。
13、光照射时降解， 在治疗癌症方面具有潜在的应用前景； 本发明的一种含有香豆素单元的pH响应性的交联胶束的制备方法， 制备过程简单， 条件温 和， 成本低， 适于规模化生产。 具体实施方式： 0023 实施例一： 5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素(DHEMC)的合成 0024 0025 DHEMC是合成疏水聚氨酯的单体， 由两步合成： 0026 (1)首先合成5,7-二羟基-4-甲基香豆素(DHMC)， 将间苯三酚(NA， 12.6g， 0.1mol) 和乙酰乙酸乙酯(ACE， 13.0g， 0.1mol)加入到60mL的1,4-二恶烷中， 然后在混合物中缓慢加 说 明 书 2/6 页。
14、 4 CN 108939091 A 4 入3mL浓硫酸， 在65下加热1h， 放至室温。 将反应液加入300mL的冰水中沉淀得到微黄色的 沉淀， 过滤， 真空干燥粗产品， 用乙酸乙酯进行两次重结晶， 最终得到白色晶体DHMC。 0027 (2)在持续搅拌下， 将DHMC(0.86g,4.47mmol)溶解于10mL DMF中， 向其中加入K2CO3 (6.30g,0.0456mol)。 将2-溴乙醇(1.67g,13.4mmol)溶解于5mL DMF中， 在15min内缓慢滴加 到上述混合液中。 使反应液在有氮气保护的条件下， 在85中反应18h， 然后冷至室温。 向混 合液中加入20mL无水。
15、乙醇， 并将无机盐过滤掉， 浓缩得到褐色油状液体。 用硅胶柱层析法纯 化粗产品， 得到白色晶体5,7-双(2-羟基乙氧基)-4-甲基-2H-1-苯并吡喃-2-酮(DHEMC)。 产 率： 79。 0028 实施例二： 聚合物PEtOz-OH的合成(Mn5000Da) 0029 0030 亲水段聚合物， 封端聚恶唑啉PEtOz-OH的制备， 其合成是在氮气保护下， 对甲苯磺 酸甲酯开环聚合2-乙基-2-恶唑啉。 具体操作如下： 0031 在干燥的乙腈中加入对甲苯磺酸甲酯(0.34g,1.83mmol)和2-乙基-2-恶唑啉 (10.00g,100.90mmol)， 把混合物加热至100并搅拌反应。
16、24h。 反应结束后冷却至室温， 加 入0.10mL KOH(1N)室温搅拌4h， 用冰乙醚沉降分离。 将聚合物PEOZ-OH用去离子水透析 (MWCO:3500g/mol)纯化， 最终经冷冻干燥得到产物PEtOz-OH。 产率： 87.6。 0032 实施例三： 合成聚合物(PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz)(Mn14.7kDa) 0033 说 明 书 3/6 页 5 CN 108939091 A 5 0034 氩气保护下， 将DHEMC(0.14g， 0.50mmol)溶解在10mL DMF中， 加入到50mL的三口烧 瓶中， 通氮气条件下， 依次将LDI(0.12g， 。
17、0.53mmol)和Sn(Oct)2(12mg)加入反应瓶中， 在65 的油浴中反应24小时， 反应结束后冷却至室温。 0035 在氮气保护条件下向上面得到的聚氨酯溶液中滴入溶解在5mL DMF中的PEtOz-OH (0.25g， 0.05mmol)溶液， 之后在室温下搅拌反应48小时后， 沉淀到冷的乙醚中， 沉淀物用乙 醚-甲醇溶液洗涤多次。 真空干燥48小时， 产率63。 核磁结果表明其结构为(PEtOz-PU (DHEMC-LDI)-PEtOz)， 其中DHEMC单元数为14个。 0036 实施例四： 对照组聚乙二醇-聚氨酯-聚乙二醇PEG-PU(DHEMC-LDI)-PEG的合成。 0。
18、037 作为对照组的聚合物PEG-PU(DHEMC-LDI)-PEG的合成方法与聚合物PEtOz-PU (DHEMC-LDI)-PEtOz的相同， 但用了无pH敏感的端羟基聚乙二醇PEG-OH代替PEtOz-OH作为 亲水段。 0038 实施例五： (PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz)(Mn14.7kDa)胶束的制备 0039 聚合物PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz的胶束通过透析方法制备。 具体过程是： 将 2mg聚合物PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz溶在1mL二甲亚砜中， 在25搅拌条件下， 向其中滴 加1.5mL去离子水。 得到的溶液搅。
19、拌1h后， 装入透析袋(SPECTRA/POR， MWCO： 3500)中， 用去离 子水透析24h。 0040 实施例六： PEG-PU(DHEMC-LDI)-PEG胶束的制备 0041 聚合物PEG-PU(DHEMC-LDI)-PEG胶束通过透析方法制备。 具体过程是： 将2mg聚合 物PEG-PU(DHEMC-LDI)-PEG溶在1mL二甲亚砜中， 在25搅拌条件下， 向其中滴加1.5mL去离 子水。 得到的溶液装入透析袋(SPECTRA/POR， MWCO： 3500)， 用去离子水透析24h。 0042 按照实施例三和例四制备不同亲水段的聚合物， 并测试所得聚合物在形成的纳米 粒子的。
20、尺寸和分布， 结果如表1所示： 0043 表1不同亲水段的含有香豆素单元的聚氨酯胶束表征 0044 0045 实施例七： PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz(Mn14.7kDa)胶束的交联 0046 为了得到交联的聚合物胶束， 将实施例四中形成的聚合物纳米胶束(0.1毫克/毫 升)在365nm的紫外光下照射6小时， 得到交联的纳米胶束。 交联的纳米粒子尺寸为168纳米， 粒径分布为0.16， 对高度稀释(模拟静脉注射)， 生理盐度(150mM)， 有机溶剂(DMSO)有显著 的稳定性。 0047 实施例八： PEG-PU(DHEMC-LDI)-PEG胶束的交联 说 明 书 4/。
21、6 页 6 CN 108939091 A 6 0048 为了得到交联的聚合物胶束， 将实施例五中形成的聚合物纳米胶束(0.1mg/mL)在 365nm的紫外光下照射6小时。 得到交联的胶束。 交联的胶束尺寸为184.0纳米， 粒径分布为 0.08， 对高度稀释(模拟静脉注射)， 生理盐度(150mM)， 有机溶剂(DMSO)有显著的稳定性。 0049 按照实施例七制备不同亲水段的聚合物的交联胶束， 并测试形成的交联胶束的尺 寸和分布， 结果如表2所示： 0050 表2不同亲水段的含有DHEMC的聚氨酯交联胶束 0051 0052 0053 实施例九： 酸性环境下PEtOz-PU(DHEMC-L。
22、DI)-PEtOz胶束的降解 0054 将聚合物PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz胶束(0.1mg/mL)分为两份， 其中一份的pH 值用醋酸缓冲液调节到5.0， 另一份作为对照。 然后将两份胶束置于样品池中， 于37恒温 摇床(200rpm)中摇匀， 在选定时间、 37下通过DLS来测胶束粒径的变化。 DLS结果显示， pH 5.0条件下， PEtOz-PU(DHEMC-LDI)PEtOz胶束在4h后粒径由168nm增大到266nm， 8h后达到 913nm。 而对照组胶束在24h后粒径基本不变， 说明此聚氨酯胶束有良好的pH响应性， 在pH 5.0的条件下， 胶束发生溶胀，。
23、 导致粒径增大。 0055 实施例十： 254nm紫外光照射下下PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz胶束的解交联 0056 将交联后的PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz胶束(0.1mg/mL)分为两份， 其中一份用 254nm紫外光照射6h， 另一份作为对照。 然后将两份胶束分别稀释100倍后置于样品池中， 摇 匀后在37下通过DLS来测胶束粒径的变化。 DLS结果显示， 用254nm紫外光照射6h的PEtOz- PU(DHEMC-LDI)PEtOz胶束在稀释后后粒径由168nm增大到319nm， 而对照组粒径在稀释前 后几乎不变。 说明此聚氨酯胶束有良好的光响应。
24、性， 在254nm紫外光照射6h后， 胶束交联破 坏， 稀释后发生溶胀， 导致粒径增大。 0057 实施例十一： 254nm紫外光照后， PEtOz-PU(DHEMC-LDI-PEtOz胶束在酸性环境下的 降解 0058 将交联后的PEtOz-PUDHEMC-LDI-PEtOz胶束(0.1mg/mL)用254nm紫外光照射6h， 之 后将其pH值用醋酸缓冲液调节到5.0。 然后将胶束置于样品池中， 于37恒温摇床(200rpm) 中摇匀， 在选定时间、 37下通过DLS来测胶束粒径的变化。 DLS结果显示， pH 5.0条件下， PEtOz-PU(DHEMC-LDIPEtOz胶束在2h后粒径由。
25、168nm增大到442nm， 5h后粒径不仅增大且分 裂为两个峰。 与实施例九及实施例十中的实验组相比， 在光和酸的双重作用下胶束的变化 更快也更剧烈， 说明此聚氨酯胶束有良好的pH和光响应性， 254nm紫外光照射6h后， 胶束交 联破坏， 之后在pH 5.0的条件下， 胶束发生溶胀并裂解， 导致粒径增大且发生峰的分裂。 0059 实施例十二： 包裹模型小分子抗癌药物阿霉素及其pH触发释放 0060 包裹模型小分子抗癌药物阿霉素： 2mg聚合物PEtOz-PU(DHEMC-LDI)PEtOz(Mn 14.7kDa)和0.2mg阿霉素溶解在二甲亚砜中， 在25搅拌条件下， 向其中滴加1.5mL。
26、去离子 水。 得到的溶液搅拌1h后， 装入透析袋中(SPECTRA/POR， MWCO： 3500)用去离子水透析24小 说 明 书 5/6 页 7 CN 108939091 A 7 时。 0061 DOX在聚合物纳米粒子中的包封率的确定： 取一定量的交联和未交联的载药胶束 溶液进行冷冻干燥， 然后加入0.5mLDMSO溶解， 取一定量该溶液稀释后进行荧光测试， 结合 阿霉素的标准曲线计算包封率。 0062 包封率(胶束中阿霉素的质量/投入的阿霉素的质量)100 0063 制备不同的载药量的两种聚合物的纳米胶束， 并测试所得纳米胶束的尺寸、 分布 以及包封率等， 结果如表3所示： 0064 表。
27、3两种聚合物不同的载药量的纳米胶束表征 0065 0066 pH触发释放： 把载有DOX的纳米胶束分成两份， 装入相应的透析袋中， 前者浸入 40mL的醋酸缓冲液(10mM， pH 5.0)中， 后者被浸入40mL的PB(10mM， pH 7.4)中， 置于37恒 温摇床(200rpm)中。 隔一定时间取设定体积的透析袋外的透析液， 并补充相应体积的新鲜 液体， 持续实验24小时。 测定透析液的荧光强度， 计算DOX的累积释放量。 0067 结果表明， 载有DOX的聚合物PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz载药胶束在PB(10mM， pH 7.4)中24h内仅仅释放出10的药物。 而在模拟细胞内溶酶体的醋酸缓冲液(10mM， pH 5.0) 环境下， 载药胶束能够快速地释放出高达63的DOX。 而作为对照的非pH敏感PEtOz-PU (DHEMC-LDI)-PEtOz载药胶束即使在醋酸缓冲液中(10mM， pH5.0)， 在24h内也仅仅释放出 8的DOX。 实验结果表明， PEtOz-PU(DHEMC-LDI)-PEtOz载药胶束对细胞内环境有响应性， 可以在体内环境中更快地释放药物， 从而提高药物疗效。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108939091 A 8 。