背景技术
T淋巴细胞群包括数百万个细胞，其中每个细胞都在表面表达独特的受体(TCR：T细胞受体)。该异质性允许不同的T细胞特异性识别源于不同病原体的抗原。通过自身耐受的诱导避免自身抗原的识别。然而，在病理状态下自身抗原的识别引起自身免疫和自毁的炎性疾病。T淋巴细胞依赖性炎性疾病包括，例如哮喘、过敏症、类风湿关节炎、银屑病关节炎、关节炎、内毒素血症、I型糖尿病、炎性肠道疾病(IBD)、结肠炎、多发性硬化症、移植排斥反应、移植物抗宿主病、肌萎缩性侧索硬化症、脱髓鞘病、硬皮病、干燥综合征、Erdheim-Chester综合征、克罗恩病综合征、高安动脉炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、Werlhof特发性血小板减少综合征和皮肤病，比如银屑病、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤移植物抗宿主病、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、斑秃、白癜风、药物相关的疹、接触性超敏反应、红斑狼疮、苔藓痘疹样糠疹、慢性苔藓性糠疹、湿疹及扁平苔藓。
T细胞活化依赖于钙信号转导。细胞溶质钙升高代表适应性免疫应答调控中的必要线索。B细胞或T细胞受体的引发导致从ER中释放钙(Ca2+)，并进而激活质膜上Ca2+释放相关通道(CRAC)的开放，引起库容性钙进入(CCE)(Putney and Bird，Cell 75：199-201(1993))。磷酸酶钙神经素的活化是对T细胞成功活化关键的Ca2+依赖性事件的一个例证，其能使转录因子NFAT去磷酸并因而决定其核易位(Goldsmith and Weiss，Science 240：1029-1031(1988))。
细胞溶质Ca2+的增加并行于活跃的线粒体Ca2+摄入。线粒体作为高容量的Ca2+库，帮助避免细胞Ca2+过载，并另外有助于在空间限制区域迅速清除Ca2+。线粒体的后一个功能精密地调节Ca2+敏感蛋白的活性。例如，在ER上IP3受体附近的线粒体Ca2+缓冲被证明能增加足于CRAC活化的IP3的动态范围(Gilabert et al.，EMBO J 20：2672-2679(2001))，而CRAC通道附近的Ca2+缓冲降低它们的Ca2+依赖性失活速率(Hoth et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 97：10607-10612；Hoth et al.，J CeU Biol 137：633-648(1997))。最终，线粒体Ca2+摄入通过激活丙酮酸、α-酮戊二酸和异柠檬酸脱氢酶，刺激三磷酸腺苷(ATP)的有氧合成(Jouaville et al.，Proc Natl Acad Sci USA 96：13807-13812(1999)；Hajnoczky et al.，Cell 82：415-424(1995))。Ca2+依赖的ATP的生产不仅满足受激细胞的较高的能量需求，也可能调节其它ATP调节的进程。
事实上，ATP也是一个广泛存在的细胞外信使(Burnstock，Trends Pharmacol Sci 27：166-176(2006))；Burnstock，Novartis Found Symp 276：26-48；discussion 48-57，275-281(2006))，或者通过分泌囊泡的胞吐作用或者通过间隙连接半通道释放到细胞外空间(Coco et al.，JBC 278：1354-1362(2003)；Cotrina et al.，PNAS 95：15735-15740(1998)；Bao et al.，FEBS Letters 572：65-68(2004))。ATP激活细胞外核苷酸的质膜受体(称为P2受体)，其中该受体几乎由所有细胞以不同的组合表达(Burnstock，Novartis Found Symp 276：26-48；discussion 48-57，275-281(2006))。P2受体被分为两亚类，称为P2X和P2Y受体。P2X 1～7受体都结合ATP并无选择性开放，常常使离子通道迅速脱敏。P2Y1、2、4、6、11～14受体优选结合ADP、UDP、UTP或UDP-葡萄糖，它们属于G-蛋白偶联的受体家族，并且它们的活化和CCE相关。
越来越多的证据表明，淋巴细胞上(具体在T细胞上)P2受体的活化，对TCR刺激的结果最为关键(Scrivens and Dickenson，Br J Pharmacol 146：435-444(2005)；Baricordi et al.，Blood 87：682-690(1996)；Loomis et al，.J Biol Chem 278：4590-4596(2003))。细胞外环境中ATP的半衰期相当短，由于其被外切腺苷三磷酸双磷酸酶(CD39)和外切-5’-核苷酸酶(CD73)的联合作用轻易地降解为腺苷酸(Yegutkin et al.，Biochem J 367：121-128(2002))。有趣的是，已经表明Treg细胞能通过这些表面酶活性作用调节T细胞的抑制(Deaglio et al.，J Exp Med 204：1257-1265(2007)；Borsellino et al.，Blood 110(4)：1225-1232(2007))。尽管存在这些关于免疫应答过程中ATP调控作用的证据，但其来源还未被明确鉴定。已有人提出ATP释放于死亡中的细胞或受损的血小板以及机械性刺激(Cotrina et al.，PNAS 95：15735-15740(1998)；Bao et al.，FEBS Letters 572：65-68(2004))。
最近我们已经报道了一个实验模型，其中用源于钙网蛋白(CRT)缺陷胚胎的胎儿肝脏的造血祖细胞重建免疫缺陷小鼠。CRT是一种分子伴侣蛋白，并是ER中最重要的Ca2+缓冲物(Ellgaard and Helenius，Nat Rev Mol Cell Biol 4：181-191(2003))；在基因敲除小鼠中它的缺失在妊娠的12～13天是致死的(Mesaeli et al.，J Cell Biol 144：857-868(1999))。ER中Ca2+结合CRT的量可能显著影响细胞命运，例如，CRT的过表达导致对凋亡刺激的易感性增强(Pinton et al.，EMBO J 20：2690-2701(2001))，而CRT缺陷的细胞对凋亡更加耐受(Nakamura et al.，J Cell Biol 150：731-740(2000))。Crt-/-T细胞对抗原刺激有高反应，并且其紊乱的T细胞反应性决定Crt-/-胎儿肝脏嵌合体(FLC)严重的免疫病理学状况，这类似于移植物抗宿主病表型的某些方面。该严重的免疫病理学状况受对TCR的振荡的Ca2+反应的促进，TCR引发MAPK通路的延长活化并拖延NFAT1的核定位(Porcellini et al.，J Exp Med 203：461-471(2006))。
本文我们表明Crt-/-T细胞特征描述为在CCE过程中有增加的线粒体Ca2+缓冲，导致ATP高速率合成。该活化过程中T细胞释放的ATP引起具有MAPK活化作用的P2X受体的自分泌激活。这代表为必要的用于产生T细胞活化和扩展的共刺激因子。我们表明诱导ATP合成和释放的活性在T细胞依赖性炎症的结果中起关键作用，并且表示为可能的T细胞免疫抑制的药理学靶点。
P2X受体的活化受到ATP拮抗剂的抑制，比如氧化的ATP(oATP)。因此，oATP能通过在涉及炎症和组织损伤的免疫系统的各种细胞(如T细胞)中拮抗ATP的促炎症作用来发挥其抗炎症效用。
本文中我们也表明oATP结合抗CD3抗体和同基因的受照射的脾细胞偏向诱导具有Foxp3高水平表达的调节性T细胞(Treg细胞)。Treg细胞活跃抑制效应子T细胞增殖和细胞因子的产生，并且提供使效应子T细胞脱离发育为无反应状态的T细胞耐受机制(T细胞无反应性)。Treg细胞的抑制作用可以是抗原特异的也可以是抗原非特异的。在具有低量Treg的CD4+幼稚细胞诱导的炎性肠道疾病中(IBD)，用oATP治疗能显著增加Treg中Foxp3的表达，并完全阻止肠中的免疫病理。已经表明Treg能抑制肥大细胞脱颗粒(Gri et al.，Immunity 29：771-781(2008))，并因而能在涉及肥大细胞脱颗粒相关情况(例如，哮喘、过敏和过敏性休克)的免疫抑制反应中起作用。在建立和维持T细胞耐受中Treg细胞的重要性已经产生重要的兴趣，该兴趣在于旨在治疗的体外扩展Treg细胞的方法，例如，继承性Treg细胞治疗。扩展的Treg细胞灌输可被用于，例如，调节免疫应答、诱导细胞耐受、组织和器官移植和治疗自身免疫疾病。然而，这些临床应用已经被延迟，由于成功扩展没有效应子细胞(例如，Th17，其出现于Foxp3+选择)显著污染的Treg亚群的挑战。这些污染细胞可能比Treg细胞生长更快。此外，Treg细胞可能在体外反复刺激后丧失抑制活性。因此，关键在于起初Treg细胞分化和/或扩展具有合适细胞产物，并且在体外选择性地支持Treg细胞而不是污染细胞的生成和扩展。本文中我们表明用oATP治疗抑制体外Treg细胞向Th17细胞系的转化，如通过RORγT表达评分。
如上所述，我们已经发现ATP由活化的T细胞激活释放，并且分泌的ATP和T细胞表面的受体相互作用，用作延长T细胞活化的自分泌及旁分泌刺激。用oATP阻断该相互作用导致接触抗原时T细胞不能激活，并且生成T细胞“无应答性”的状态，这最终引起减少的组织损伤。此外，如上所述，我们也发现包含oATP的组合物也能用于诱导免疫抑制性Treg细胞的分化和显著扩展，维持Treg细胞表型，并增强Treg细胞免疫抑制活性，也能引起减少的组织损伤。因此用oATP治疗可以在器官移植前、期间或后有利于避免T细胞介导的排斥，并且有利于患有在骨髓移植前、期间或后T细胞介导的移植物抗宿主病的患者。
因此，所述本发明旨在治疗免疫或炎性疾病，通过用至少一种调节T细胞依赖性免疫应答的制剂接触T细胞，比如抑制ATP-介导的T细胞活化和/或诱导Treg细胞分化和扩展的制剂，例如，oATP、PX10肽或生胃酮。这些效用可以有多种治疗性应用，例如，免疫耐受、自身免疫、免疫抑制和免疫治疗相关的治疗。
发明概述
本发明可体现为一种用于调节一种或多种T细胞依赖性的免疫应答的方法。
在一实施方式中，本发明提供一种用于抑制至少一种T细胞活性的方法，包含步骤为用抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂接触T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞活性选自：活化、增殖、分化、存活、细胞裂解活性及细胞因子产生。在一优选的实施方式中，用于抑制至少一种T细胞活性的方法在体内进行。
在一实施方式中，所述抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂是P2X受体拮抗剂，例如，P2X7受体拮抗剂。在一优选的实施方式中，所述制剂是oATP。在另一实施方式中，所述制剂是抑制pannexin hemichannels渗透性的制剂。在一优选的实施方式中，所述制剂是PX10肽(SEQ ID NO：1)或生胃酮。
本发明也提供一种诱导T细胞无反应性的方法，包含步骤为用ATP-介导的T细胞活化的抑制剂接触T细胞。在一优选的实施方式中，所述用于诱导T细胞无反应性的方法在体内进行。在一实施方式中，所述抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂是P2X受体拮抗剂，例如，T细胞P2X7受体拮抗剂。在一优选的实施方式中，所述制剂是oATP。在另一实施方式中，所述制剂是抑制pannexin hemichannels渗透性的制剂。在一优选的实施方式中，所述制剂是PX10肽(SEQ ID NO：1)或生胃酮。
在一实施方式中，所述接触的T细胞是分泌IL-17的T细胞(即TH17细胞)。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于诱导Treg细胞分化和/或扩展的方法，包含步骤为用诱导Treg细胞分化和/或扩展的制剂接触Treg细胞。在一优选的实施方式中，该方法在体内进行。在一例示实施方式中，所述制剂是含有oATP的组合物。所述组合物也优选包含：(1)T细胞初次刺激物；和(2)细胞成分或可溶性介质。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于抑制Treg细胞向非Treg细胞转变的方法，包含步骤为用抑制Treg细胞向非Treg细胞转变的制剂接触Treg细胞。所述非Treg细胞可是病原性T细胞，例如，Th17细胞。在一优选的实施方式中，所述制剂是含有oATP的组合物。所述方法可(例如)在体内或体外进行。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于将非Treg细胞向Treg细胞转变的方法，包含步骤为用增强非Treg细胞向Treg细胞转变的制剂接触非Treg细胞。所述非Treg细胞可是幼稚的或病原性T细胞，例如，Th17细胞。在一优选的实施方式中，所述制剂是含有oATP的组合物。所述方法可(例如)在体内或体外进行。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于增强Treg细胞活性(例如，免疫抑制活性)的方法，通过用增强Treg细胞活性的制剂接触Treg细胞。在一优选的实施方式中，所述制剂是含有oATP的组合物。所述方法可(例如)在体内或体外进行。
本发明也可体现为一种用于治疗细胞死亡或组织损伤的方法，包含用调节一种或多种T细胞-依赖性免疫应答的制剂接触T细胞。在一实施方式中，所述方法可包含一个或多个步骤：(1)用抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂接触T细胞；(2)用抑制Treg细胞转变为非Treg细胞和/或增强其免疫抑制活性的制剂接触Treg细胞；(3)用诱导Treg细胞分化和/或扩展的制剂接触Treg细胞。在一优选的实施方式中，步骤(1)在体内进行。在一优选的实施方式中，步骤(3)优选在体外进行，并且随后在体内施用分化和/或扩展的Treg细胞。在一优选的实施方式中，所述制剂或组合物包含oATP。
本发明也可体现为一种用于治疗自身免疫或炎性疾病的方法，包含步骤为用调节一种或多种T细胞-依赖性免疫应答的制剂接触T细胞。在一实施方式中，所述方法可包含下列步骤中的一个或多个步骤：(1)用抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂接触T细胞；(2)用抑制Treg细胞转变为非Treg细胞和/或增强其免疫抑制活性的制剂接触Treg细胞；(3)用诱导Treg细胞分化和/或扩展的制剂接触Treg细胞。在一优选的实施方式中，步骤(1)在体内进行。在一优选的实施方式中，步骤(3)优选在体外进行，并且随后在体内施用分化和/或扩展的Treg细胞。在一优选的实施方式中，所述制剂包含oATP。在一实施方式中，所述自身免疫或炎性疾病是适应性免疫系统的自身免疫或炎性疾病，例如，T淋巴细胞依赖性炎性疾病。在一优选的实施方式中，所述T淋巴细胞依赖性炎性疾病关于，例如，哮喘、过敏症、类风湿关节炎、银屑病关节炎、关节炎、内毒素血症、I型糖尿病、炎性肠道疾病(IBD)、结肠炎、多发性硬化症、移植排斥反应、移植物抗宿主病、肌萎缩性侧索硬化症、脱髓鞘病、硬皮病、干燥综合征、Erdheim-Chester综合征、克罗恩病综合征、高安动脉炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血及Werlhof特发性血小板减少综合征。在另一个优选的实施方式中，所述T淋巴细胞依赖性炎性疾病关于皮肤病，比如，例如银屑病、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤移植物抗宿主病、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、斑秃、白癜风、药物相关的疹、接触性超敏反应、红斑狼疮、苔藓痘疹样糠疹、慢性苔藓性糠疹、湿疹及扁平苔藓。
在一优选的实施方式中，本发明体现为一种体内治疗受试者自身免疫或炎性疾病的方法。所述方法可包含(例如)给受试者体内施用下列中的至少一种：(1)抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂；(2)调节至少一种Treg细胞活性的制剂，例如Treg细胞分化和/或扩展以及Treg细胞免疫抑制活性；和(3)通过体外接触本发明的制剂而分化和/或扩展的Treg细胞。在一优选的实施方式中，所述步骤(1)和/或步骤(2)的制剂包含oATP。
在一实施方式中，所述调节至少一种T细胞依赖性免疫应答的制剂(例如，抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂和/或调节至少一种Treg细胞活性的制剂)是纳米胶囊化的，例如，形成纳米颗粒。在另一实施方式中，已经通过接触本发明的制剂而分化和/或扩展的Treg细胞是纳米胶囊化的，例如，形成纳米颗粒。在一实施方式中，所述纳米颗粒靶向特异的细胞或组织。在一优选的实施方式中，所述纳米颗粒在体内靶向特异的细胞或组织。
本发明也提供一种方法，其给有需要的受试者施用调节T细胞-依赖性免疫应答的制剂。在一实施方式中，所述制剂结内施用。在另一实施方式中，所述制剂局部施用。在另一实施方式中，所述制剂通过静脉内或注射施用。
本发明也提供一种方法，其调节受试者的T细胞依赖性免疫应答，比如自身免疫疾病或过敏，通过施用用本发明的制剂诱导分化和/或扩展产生的Treg细胞。本方法包含：(a)从受试者获取幼稚的T细胞群(例如，幼稚的CD4+T细胞)；(b)通过分化和扩展从幼稚的T细胞中生成Treg细胞；和(c)将生成的Treg细胞导入受试者来调节，例如，抑制受试者的T细胞依赖性免疫应答。
通过查看下列更详细的本发明的描述以及附图，将更完整地理解和认识这些以及本发明的其它目标和优势。
附图说明
图1：crt-/-T细胞中增加的线粒体Ca2+缓冲
(a)用毒胡萝卜内酯耗尽ER Ca2+后，在crt-/-和crt+/+T细胞克隆中通过添加0.5mM Ca2+到细胞外培养基中诱导CCE(参见实施例1)。在完全冲洗掉细胞外Ca2+后，所述线粒体Ca2+缓冲通过添加离子霉素被可视化。
(b)柱状图表示crt-/-和crt+/+T细胞克隆中，在伴随0.5、1和2mM的细胞外Ca2+CCE后，线粒体的Ca2+含量。
(c)crt-/-T细胞中增加的线粒体的Ca2+缓冲减缓CRAC失活。用毒胡萝卜内酯治疗细胞，随后两次单独地添加Ca2+到细胞外培养基(参见实施例1)(也见图2C)。在第一次和第二次添加Ca2+时计算细胞溶质Ca2+浓度升高的速度。在crt+/+而不是crt-/-T细胞中观测到明显降低。
(d)在线粒体解偶联剂存在(CCCP)下重复相同的实验，在crt+/+和crt-/-T细胞中CRAC的失活相当。(*，P＜0.05，**，P＜0.001，***，P＜0.0001)
图2：crt-/-T细胞中降低的ER中的Ca2+、未改变的线粒体膜电位和减少的CRAC失活。
(a)负载Fura-2的DO11.10TCR转基因T细胞克隆的ER Ca2+含量通过添加SERCA泵抑制剂毒胡萝卜内酯到无Ca2+的培养基中来评估(参见实施例1)。Ca2+从ER被动渗透到细胞溶质被视为能缓慢地短暂地升高细胞溶质Ca2+浓度。和crt+/+细胞相比，Crt-/-T细胞有降低的ER的Ca2+含量，计为曲线下面积。
(b)对分离自crt-/-和crt+/+FLC的分选的幼稚的和效应子/记忆(CD44+CD62L-)CD4细胞进行TMRM染色，显示CRT缺失不能改变线粒体的膜电位。
(c)为了评分CRAC失活，T细胞被负载Fura-2，并被放在覆盖多聚L-赖氨酸的盖玻片上(参见实施例1)。通过在无Ca2+的培养基中添加毒胡萝卜内酯耗尽ER钙储存。ER钙储存完全耗尽后添加两次Ca2+100秒钟。两次添加Ca2+都导致Ca2+流入CRAC。由于这些通道受到Ca2+抑制，所以第二次Ca2+升高具有较慢的速度和幅度。crt-/-细胞显示减弱的CRAC失活。
图3：在T细胞活化期间线粒体的Ca2+摄入引起ATP合成和释放
(a)在crt-/-和crt+/+分选的幼稚的CD4+T细胞中，用CD3抗体激活T细胞后，在不同时刻的ATP合成(参见实施例2)。
(b)在ATP合成酶抑制剂寡霉素的缺失(控制)或存在下，T细胞活化后产生ATP。
(c)在结合CD3和CD28抗体的平板上活化38小时后，分选的幼稚的CD4crt-/-和crt+/+T细胞表面上CD62L表达的FACS图谱。在oATP存在下进行相同的实验。
(d)用核苷酸结合化合物奎纳克林对幼稚的CD4+T细胞染色(参见实施例2)。同类的细胞溶质染色指示含有ATP的分泌囊泡的缺失。
(e)非刺激的和激活的幼稚T细胞在连续蔗糖梯度中的亚细胞分级分离(参见实施例2)。ATP只在包含细胞溶质蛋白Zap-70的级分中检出，而在那些以小囊泡标记物细胞短蛋白聚糖为特征的级分中没有检出。
图4：在DO11.10TCR转基因的T细胞克隆中，通过选择性激动剂的P2受体转录和Ca2+反应
(a)P2受体的RT-PCR表明在T细胞克隆中，P2X1、4、7和P2Y1、12、13、14共表达(参见实施例3)。
(b)在正常培养基(第一个图)或无Ca2+的培养基(第二个图)中的Ca2+成像实验证实CD4T细胞克隆上存在离子型和促代谢型P2受体。
(c)优选的P2X受体激动剂(αβMeATP：P2X1，MeSATP：全部P2X，BzATP：P2X7)更具体证实了这些受体的功能能力。
(d)有功能的P2Y受体存在于T细胞克隆上，通过对优选的激动剂(MeSADP：P2Y1、12、13和UDP-葡萄糖：P2Y14)的反应所显示。
图5：TCR刺激后延长的MAPK活化中细胞周围ATP的作用
(a)用生物素化的CD3抗体刺激OVA特异的crt-/-T细胞克隆，之后用亲和素交联(参见实施例3)。刺激30分钟后，细胞或者保持未处理(左边第一个图)，或者用src-类激酶抑制剂PP2单独(第二个图)或组合oATP(第三个图)或ARL(第四个图)处理。PP2有效抑制TCR信号转导，如Zap-70的脱磷酸作用所显示，而延长的Erk活化很少被影响。PP2和oATP联用几乎完全摧毁Erk磷酸化作用，而PP2和外切核酸酶抑制剂ARL联用在往后时刻增强Erk活化。
(b)用交联的CD3抗体刺激crt-/-T细胞克隆16小时(参见实施例3)。左边第一个图表示典型的延长的p38 MAPK和Erk磷酸化作用。这些延长的活化作用被作为线粒体ATP合成抑制剂的寡霉素和两个P2受体拮抗剂oATP及PPADS摧毁。
图6：P2受体的药理学抑制损害T细胞增殖以及IL-2分泌和试剂无反应性
(a)FACS图谱显示在分选的幼稚的CD4+细胞中CFSE荧光的稀释，这些CD4+细胞用平板结合的CD3和CD28(见方法部分)在oATP缺失(上图)或存在(下图)下刺激(参见实施例4)。在IL-2(中图)或PMA(右图)存在下进行相同的实验。在一定时间内获得的具有检测标记物的细胞(增殖的细胞)数量被指示。
(b)一个显示IL-2浓度的典型性实验是在幼稚的CD4+细胞的培养上清液中，以及在oATP或PPADS存在下通过ELISA测量，其中CD4+细胞用平板结合的CD3和CD28抗体刺激48小时。灰色柱表示在样本中添加PMA时的IL-2浓度。
(c)在oATP缺失或存在下，分别在用结合平板的CD3和CD28抗体刺激分选的幼稚的CD4+细胞后2小时和16小时，通过实时RT-PCR定量Egr2和Egr3转录物(参见实施例4)。*，P＜0.05。
(d)单独使用离子霉素、CD3和CD28抗体或联用oATP或oATP和PMA，对OVA-特异的T细胞克隆预培养16小时的CD3刺激后的细胞溶质的Ca2+图谱(参见实施例4)。
图7：在INS-HA转基因的RAG-2-/-小鼠中通过oATP治疗预防糖尿病
(a)在TCR 6.5抗-HA转基因的CD4+T细胞继承转移后12天，表达受鼠胰岛素启动子控制的HA的RAG-2-/-小鼠中的血糖水平(参见实施例5)。小鼠或者保持未处理，或者在转移后1到10天每天静脉内和腹腔内注射两次剂量的PBS或oATP。
(b)苏木素-伊红染色切片的组织学检测(100×)显示用PBS-治疗小鼠的胰腺中有严重有害的胰岛炎，而在oATP-治疗动物的胰腺没有观测到相关病理检查所见。
(c)和(d)柱状图表示获得于PBS-治疗和oATP-治疗的动物的脾(c)和胰腺(d)中的转基因的TCR6.5+细胞的数量。右边柱状图表示获得于指示(n.d.，表示没有可检测的)的小鼠的胰腺的CD69+ TCR 6.5+细胞的百分率。
(e)在体外用HA肽刺激源于PBS-和oATP-治疗的小鼠的脾细胞，并通过流式细胞仪珠阵列测量指示的细胞因子(参见实施例5)。柱状图显示上清中TNF-α、IFN-γ和IL-6的浓度，用每104 TCR6.5+细胞pg/ml表示。(平均值±标准偏差，n＝5)*，P＜0.05；**，P＜0.001；***，P＜0.0001。
图8：通过oATP治疗改善炎性肠病
(a)源于继承性转移CD4+/CD25+和CD4+细胞的cd3ε-/-小鼠的典型的肠系膜淋巴结、脾、结肠照片(参见实施例5)。下图显示源于用CD4细胞重建和用oATP治疗的小鼠的器官。标尺＝1cm
(b)柱状图表示按照指示(见方法部分)治疗的动物的炎性评分。(平均值±标准偏差；n＝5，CD4+/CD25+健康的对照组；n＝7，CD4+未治疗组；n＝8，CD4+oATP治疗组)。
(c)所述指示动物的结肠的苏木素/伊红和Alcian/PAS染色切片(所有方框中的显微图片都具有相同的放大率，比例尺＝50μm)。在用CD4+/CD25+细胞重建的小鼠中，没有明显的炎症变化并且大量具有很多Alcian-PAS-阳性微滴的杯状细胞排列于结肠隐窝(箭头)；在继承性转移CD4+细胞的小鼠和注射oATP的小鼠中，通过炎性细胞浸润固有层被局部扩展(箭)，并且结肠隐窝上皮细胞显示适度增生。部分杯状细胞消失，并且Alcian-PAS-阳性微滴的减少也是明显的(箭头)；在用CD4细胞重建的小鼠和PBS治疗的小鼠中，通过炎性细胞浸润固有层被显著扩展，具有隐窝化脓病灶发现。结肠隐窝也严重发育不良，杯状细胞几乎完全消失。
(d)获得于所述指示动物的肠系膜淋巴结和脾的细胞。
(e)所述指示动物的肠系膜淋巴结中的CD4+T细胞生成的IL-2、TNFα、IFNγ、IL-17的绝对数。(平均值±标准偏差；n＝5，CD4+/CD25+健康组；n＝7，CD4+未治疗组；n＝8，CD4+oATP治疗组)*：P＜0.05；**：P＜0.001；***：P＜0.0001。
(f)所述指示动物组的肠系膜淋巴结和脾中的CD44+CD62L-效应子/记忆细胞和CD69+CD4细胞的绝对数(柱表示平均值)。
图9：pannexin hemichannel组装抑制剂抑制T细胞活化和增殖
(a)用结合平板的抗-CD3/28抗体刺激负载CFSE的人类T细胞，并用FACS分析测量其增殖(参见实施例6)。注意类似于oATP，阻断pannexin的PX10肽抑制T细胞增殖。
(b)源于CD3+/28+刺激的鼠T细胞分泌IL-2到培养基被PX10和oATP强烈抑制。
图10：阻断pannexin的PX10肽在TCR引发期间增加细胞内ATP浓度
TCR引发期间，阻断pannexin的PX10肽的存在增加细胞内ATP浓度(参见实施例6)，表明pannexin hemichannels是T细胞活化过程中ATP分泌的一个重要路径。
图11：oATP诱导Treg细胞分化和扩展
(a)在oATP存在下，幼稚的CD4+T细胞的刺激显著增加CD4+CD25高Foxp3+Treg细胞的百分比。
(b)在oATP存在下，包含天然Treg细胞的分选的CD4+CD25高细胞的刺激诱导具有较高Foxp3表达水平的Treg细胞的扩展。
(c)在抗CD3抗体刺激后第6天，用定量RT-PCR分析Th1(T-bet)、Th17(RORγT)给和Treg(Foxp3)细胞系的主要转录因子，揭示在oATP存在下，存在Foxp3的连续上调，相反，在未治疗的培养物中存在T-bet的连续上调。
图12：oATP治疗抑制Th17分化并促进Foxp3表达
(a)在偏向Th17的条件(TGFβ和IL-6条件培养基)下用抗CD3抗体刺激的T细胞中，oATP逐渐增加Foxp3的表达而抑制RORγT的表达。
(b)通过FACS分析，在偏向Th17的条件下，oATP存在下，表达Foxp3的CD4+CD25高细胞的绝对数是增加的。
(c)分选的CD4+CD25高天然Treg细胞向Th17细胞系的去分化被oATP阻碍。
图13：在动物中通过oATP治疗改善炎性肠病，其中向所述动物继承性转移不足量的Treg细胞
(a)在IBD的小鼠模型中，每日用100μl 3mM oATP静脉内施用治疗增强Treg细胞中Foxp3的表达，其中不足以控制炎症数量的Treg细胞被继承性转移给动物。
(b)oATP治疗的动物没有显示肠炎的迹象，并且脾和肠系膜淋巴结大小没有增加。
(c)oATP治疗的动物在肠系膜淋巴结中表现出效应子/记忆T细胞数量减少。
(d)肠系膜淋巴结中Treg/EM细胞的比例没有通过oATP治疗显著改变。
图14：在炎性肠病的老鼠模型中生成Treg的实验方法
Cd3ε-/-小鼠分别被继承性转移2×105幼稚的CD4+T细胞；2×105幼稚的CD4+T细胞和oATP；2×105在继承性转移16小时后用oATP施用的幼稚的CD4+T细胞；2×105幼稚的CD4+T细胞和105天然的Treg细胞。在第2～5天和8～12天oATP治疗的动物每日接受oATP静脉内施用，而在第6和第7天没有oATP施用。在第28天检测小鼠的CD4+细胞亚群(参见实施例12)。
图15：在炎性肠病的老鼠模型中用oATP治疗生成Treg细胞
(a)在最后一次注射oATP后14天检测动物结肠、脾和肠系膜淋巴结的炎症(参见实施例12)。
(b)FACS检测鉴定的CD4+CD25高Foxp3调节性T细胞。
(c)FACS检测鉴定的效应子记忆T细胞是CD4+CD44+CD62L-或CD4+CD25+CD69+。Treg细胞和效应子记忆T细胞的比例被显示。
图16：在NZB/NZW F1小鼠中通过oATP治疗改善蛋白尿症
图表表示用PBS(对照)或oATP治疗的NZB/NZW F1小鼠的尿的蛋白浓度。对25周龄的雌性NZB/NZW F1小鼠静脉内施用PBS或oATP(100μl 3mM，治疗5天，中断2天)6周(参见实施例14)。10只动物接受PBS，10只动物接受oATP。
图17：在NZB/NZW F1小鼠中通过oATP治疗改善SLE
对25周龄的雌性NZB/NZW F1小鼠静脉内施用PBS或oATP(100μl 3mM，治疗5天，中断2天)6周，并检测其蛋白尿(上图)或其它指示参数(下图)(参见实施例14)。**：P＜0.01；***：P＜0.001。
图18：通过oATP治疗抑制全身性红斑狼疮中的T细胞效应功能
用PBS或oATP(上图)治疗获得于25周龄的雌性NZB/NZW F1小鼠的效应子/记忆(CD44+CD62L-)CD4+细胞，用结合平板的抗CD3和抗CD28抗体刺激CD4+效应子/记忆T细胞48小时，其分泌的IFN-γ和IL-4用ELISA检测(下图)(参见实施例14)。**：P＜0.01；***：P＜0.001。
图19：在胶原蛋白诱导的类风湿关节炎模型中临床评分的偏差
图表表示起初疾病严重程度临床评分的平均偏差，在胶原蛋白诱导的RA小鼠中评估，该小鼠静脉内接受oATP(100μl 3mM)或对照的PBS 12天，用药方案为治疗5天，中断2天，再治疗5天，从第0天开始(参见实施例15)。
图20：通过oATP治疗降低胶原特异的抗体
在胶原蛋白诱导的类风湿关节炎模型中，对源于oATP治疗和对照小鼠的样品进行二型胶原蛋白ELISA(参见实施例15)。
图21：用crt-/-和crt+/+胎儿肝脏祖细胞重建重组酶缺陷的小鼠
测定源于crt+/-和crt+/-杂交的E13胚胎的基因型，选择crt-/-和crt+/+胚胎，并将肝脏的造血祖细胞注射到重建重组酶缺陷的小鼠中(参见，例如，Porcellini et al.，J.Exp.Med.203：461-471(2006)(参见实施例16)。
图22：钙网蛋白缺陷的胎儿肝脏嵌合体小鼠的移植物抗宿主病类表型
转移造血祖细胞后第12周crt+/+胎儿肝脏嵌合体(FLC)的表型和第8、10、12周产生的crt-/-FLC的表型。crt-/-FLC中发现脱发、睑炎、姿势蜷缩和衰竭综合征的逐渐恶化(参见实施例16)。
图23：在crt-缺陷的胎儿肝脏嵌合体中具有病灶浸润的表面真皮中有表皮增生和丰富的粒细胞
皮肤的苏木精-伊红染色显示在crt-/-FLC中有严重的真皮粒细胞炎性渗透，和crt+/+FLC相反，其中炎症细胞几乎是缺失的。(左图标尺＝50μm，右图标尺＝10μm)(参见实施例16)。
图24：注射oATP改善crt-/-小鼠的睑炎
crt-/-FLC治疗前和用PBS或6mM oATP(100μL)每天静脉内治疗两周后的表型(参见实施例16)。
图25：在crt-/-胎儿肝脏嵌合体中注射oATP两周，睑炎的组织学改善
以盲试法进行皮肤活体组织检查的组织病理学评估。该图表显示为选择的用oATP治疗的有显著结果的例示(参见实施例16)。
发明详述
定义和一般技术
本发明总体涉及调节至少一种T细胞活性的方法，具有用于相关各种治疗的多种治疗应用，例如用于免疫耐受、自身免疫、免疫抑制、和免疫治疗。
除非本文另有定义，使用的与本发明相关的科学和技术术语是本领域内那些技术人员普遍理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语将包括复数含义，并且复述术语将包括单数含义。通常所用术语和技术涉及本文报道的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学和杂交，这些术语在本领域内众所周知并且普遍使用。
本文一般使用的术语“T细胞”或“T淋巴细胞”可以指，例如，辅助性T细胞(如Th1、Th2细胞、Th9和Th17细胞)、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节/抑制性T细胞(Treg细胞)、自然杀伤T细胞、γδT细胞、和/或自身攻击T细胞(例如，TH40细胞)，除非上下文另有指示。在某些实施方式中，所述术语“T细胞”具体是指辅助性T细胞。在某些实施方式中，所述术语“T细胞”更具体是指Th17细胞(如分泌IL-17的T细胞)。在某些实施方式中，所述术语“T细胞”是指Treg细胞。
本文使用的术语“Treg细胞”指CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(如CD25+亮T细胞)。在本发明的方法中也预期使用具有调控能力的其它T细胞(如Tr1细胞和Th3细胞)。
本文使用的“T细胞活性”指一个或多个免疫学进程，比如T细胞活化、增殖、分化和存活，以及相关的免疫效应功能，包括溶解细胞活性(Tc细胞)和细胞因子生成(Th细胞)。在一实施方式中，本文公开的组合物和方法能用于降低辅助性T细胞(Th)反应，例如Th17细胞反应。在另一实施方式中，本文公开的组合物和方法能用于降低细胞毒性T细胞(Tc)反应。在另一实施方式中，本文公开的组合物和方法能用于诱导调节性T(Treg)细胞的分化、扩展、和/或免疫抑制活性。在本发明的一些实施方式中，至少一种T细胞活性被降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在本发明的一些实施方式中，至少一种Treg细胞活性增加了至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。Foxp3作为一个Treg抑制功能的定量调节剂，而不是一个简单的分子开关，它能以剂量依赖的方式抑制反应细胞的效应子作用(Allan et al.Eur.J.Immunol.38：3282-3289(2008))。用于检测和/或监视上述活性的试验有很多并且在本领域内众所周知，例如，用于免疫细胞增殖、细胞因子释放、细胞表面标志物表达、细胞毒性等的试验。
所述术语“ATP-介导的T细胞活化”指ATP结合T细胞上的P2受体，引起T细胞活化和/或扩展。例如，如果使用特异性阻断ATP结合T细胞上P2受体的制剂(如，oATP)，T细胞活化和/或扩展被阻断至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，则T细胞活化是ATP-介导的。ATP-介导的T细胞活化可以被检测，例如，通过分析ATP-刺激的T细胞群的MAPK活化、ERK磷酸化和/或IL-2表达(例如，参见实施例3和4)。在某些实施方式中，经过抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂处理的T细胞群中，MAPK活化、ERK磷酸化和/或IL-2表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。ATP-介导的T细胞活化也可以被检测，例如，通过监视ATP-介导的离子通道的打开，例如，通过电生理学试验来测量钾流出T细胞和钠或钙流入T细胞。在一实施方式中，ATP释放于出于活化过程中的T细胞，并且引起P2受体的自分泌和/或旁分泌活化。
所述术语“ATP-介导的T细胞活化”被理解为包括ATP结合T细胞上的P2X受体，引起T细胞活化和/或扩展。这可以被称为“ATP通过P2X受体介导的T细胞活化”。所述术语“ATP-介导的T细胞活化”被理解为包括ATP结合T细胞上的P2X7受体(即，“ATP通过T细胞上的P2X7受体介导的T细胞活化。例如，如果使用特异性阻断ATP结合T细胞上P2X受体的制剂(如，oATP)，T细胞活化和/或扩展被阻断至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，则通过P2X受体的T细胞活化是ATP-介导的。通过P2X受体ATP-介导的T细胞活化可以被检测，例如，通过分析ATP-刺激的T细胞群的MAPK活化、ERK磷酸化和/或IL-2表达(例如，参见实施例3和4)。在某些实施方式中，经过抑制通过P2X受体ATP-介导的T细胞活化的制剂处理的T细胞群中，MAPK活化、ERK磷酸化和/或IL-2表达降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。通过P2X受体ATP-介导的T细胞活化也可以被检测，例如，通过监视ATP-介导的离子通道的打开，例如，通过电生理学试验来测量钾流出T细胞和钠或钙流入T细胞。如技术人员所理解，类似的试验可用于监视其它P2受体亚型的活化，例如P2Y受体。在一实施方式中，ATP释放于处于活化过程中的T细胞，并且引起P2X受体的自分泌和/或旁分泌活化。
所述术语“T细胞无反应性”指T细胞活性降低的状态，例如，T细胞接触抗原无活性的状态。T细胞无反应性可能源于，例如，缺乏共刺激信号和伴随的IL-2产物不足、T细胞增殖阻碍。
本文使用的关于T细胞的所述术语“分化”指较少特化细胞类型变成更多特化细胞类型的进程。
本文使用的关于T细胞的所述术语“扩展”指细胞数量的增加。
本文使用的所述术语“抑制”或“～的抑制”意为降低可测量的量。抑制可以是部分或完全的。
本文使用的所述术语“诱导”或“～的诱导”意为增加可测量的量。
本领域内那些技术人员理解的所述术语“免疫疾病”包括任何有免疫成分与之相关的疾病，和/或特征为免疫或自身免疫应答的任何疾病。本领域内那些技术人员理解的所述术语“适应性免疫疾病”包括任何有适应性免疫系统成分与之相关的疾病。
本领域内那些技术人员理解的所述术语“炎症”包括任何以局部或全身保护性反应为特征的疾病，这些反应可能由身体创伤、感染、慢性疾病(比如上文所提到的)和/或对外在刺激的化学和/或物理反应(例如，部分过敏反应)引起。任何这些反应，可作用为破坏、稀释或隔离有害的制剂和组织损伤，可以显示为，例如热、肿胀、疼痛、红肿、血管扩张和/或血流量增加、白细胞侵入受影响区域、丧失功能和/或任何已知的和炎性疾病相关的其他症状。
因而所述术语“炎症”也被理解为包括任何炎性疾病、紊乱或疾病本身、任何炎性成分与之相关的疾病、和/或任何以炎症为症状特征的疾病，尤其包括急性、慢性、溃疡性、特异性、过敏性和坏死性炎症、和已知的其他炎症形式。因此，根据本发明的目的，该术语还包括炎性痛和/或发炎引起的发烧。
所述术语“P2受体”指一种细胞外核苷酸的受体，包括，例如P2X和P2Y受体。所述术语“P2X受体”指一个存在于多种细胞类型上的ATP-门控的阳离子通道。P2X 1-7受体都结合ATP并且无选择性打开，通常使离子通道迅速脱敏。例如，所述P2X 7受体主要存在于涉及炎症/免疫进程的细胞类型；特别是巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞(T和B)。P2X 7受体通过细胞外核苷酸(特别是三磷酸腺苷(ATP))活化，在其它事件中，已知该活化引起白介素-1β(IL-1β)的成熟和释放。
本文使用的所述术语“P2X受体拮抗剂”是一个化合物或其他物质，能够阻碍，无论完全还是部分，P2X受体(P2X1～7)的活化，用任何合适的试验测量，比如那些下文报道和参考的试验。例如，一个P2X受体拮抗剂可以是和ATP竞争结合P2X受体的制剂，例如oATP。例如，一个P2X 7受体拮抗剂可以是和ATP竞争结合P2X7受体的制剂。例如，一个T细胞P2X7受体拮抗剂可以是和ATP竞争结合T细胞上P2X7受体的制剂。
检验P2X受体拮抗作用的方法为本领域内所知。例如，美国专利No.6,720,452报道了一个基于观测的试验，当P2X7受体活化时，在溴化乙锭(一个DNA荧光探针)存在下使用受体激动剂，观测到细胞内DNA-结合的溴化乙锭的荧光增强。因此，荧光增强可用作P2X7受体活化的尺度，并且因此定量化合物或物质对P2X7受体的抑制效应。
P2X7受体拮抗剂的实施例包括但不限于，美国专利No.6,492,355；6,720,452；6,881,754和7,129,246报道的化合物，全部内容通过引用并入本文。
本文使用的所述术语“pannexin”指形成和无脊椎动物innexin蛋白家族同源的蛋白的hemichannel。已知在红细胞和味觉感受器细胞中Pannexin hemichannels允许ATP通过，并在巨噬细胞中决定IL1-β的分泌。除非明确指示，“pannexin”或者指pannexin-1或者指pannexin-2。在某些实施方式中，所述术语“pannexin”指pannexin-1。
本文使用的所述术语“oATP”指氧化的ATP，其可能源于在核糖2、3位羟基氧化生成二醛的ATP。该氧化物可用高碘酸盐生成，报道于P.N.Lowe et al.，“Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds”，Biochemical Society Transactions 7：1131-1133(1979)。oATP被认为用作P2z/P2X7嘌呤受体拮抗剂(Ferrari et al.，J Exp Med 185(3)：579-582(1997))。
本文使用的所述术语“pannexin抑制剂”指抑制Pannexin hemichannels功能的制剂。例如，pannexin抑制剂可以是小分子、抗体、肽、或任何其他干扰Pannexin hemichannels功能的物质。在一实施方式中，所述pannexin抑制剂是肽。在一优选的实施方式中，所述pannexin抑制剂是PX10肽，或者是至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同于PX10肽的肽，PX10肽的序列是WRQAAFVDSY(SEQ ID NO：1)，其中在某些实施方式中，N-端和C-端是游离的且无修饰。
本文使用的20种常规氨基酸和它们的缩写遵循惯例。参见Immunology-A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，通过引用并入本文。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然的氨基酸，比如α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可是本发明的肽的合适成分。非常规氨基酸的实施例包括4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸及亚氨基酸(如4-羟脯氨酸)。本文使用的肽符号，左边方向是氨基端方向，右边方向是羧基端方向，符合标准的使用和惯例。
应用于肽的术语“实质等同”意为当最优比对时，比如使用具有默认空位权重的程序GAP或BESTFIT，两个肽序列共享至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，最好优选至少99％的序列同一性。不相同的残基位置优选氨基酸保守性置换。氨基酸保守性置换指具有相似侧链残基的互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有包含氨基侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；一组具有碱基侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的氨基酸保守性置换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天门冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所述，肽氨基酸序列的小变异被预期包含在本发明中，只要氨基酸序列的变异维持至少75％，更优选至少80％、90％或95％，最优选96％、97％、98％或99％的无变异序列。保守性氨基酸的置换也具体被考虑。保守性置换是那些具有相关侧链的氨基酸家族内发生的置换。遗传上编码的氨基酸通常分为几个家族：(1)酸性＝天门冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸(4)不带电荷的极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸的脂肪族羟基家族；天门冬酰胺和谷氨酰胺含氨基的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族家族；苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的芳香族家族。例如，对于单独的亮氨酸和异亮氨酸或缬氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸、苏氨酸和丝氨酸的置换，或类似的具有相关氨基酸结构的氨基酸置换，有理由预期这些置换不会对结果分子的结合或性能有重要影响，尤其在如果所述置换不涉及框架位点内的氨基酸时。一个氨基酸的改变是否会产生功能肽可以容易地通过检测所述肽衍生物的特异活性(例如，抑制至少一种T细胞活性)来测定。
优选的氨基酸置换是这些：(1)降低蛋白酶解的敏感性，(2)降低氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合体的结合能力，(4)改变结合亲和力，和(5)给予或修改这些类似物的其它理化或功能属性。类似物包括各种突变蛋白序列，而不仅是天然存在的肽序列。例如，天然存在的肽序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的肽部分)上可能发生单个或多个氨基酸置换(优选氨基酸保守性置换)。一个氨基酸保守性置换不应该实质改变亲代序列的结构特征(例如，一个取代的氨基酸不应易于打破亲代序列中的螺旋，或者破坏亲代序列的其他二级结构特征的类型。人工-识别的肽二级和三级结构的实施例报道于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton et at.Nature 354：105(1991)，每个都通过引用并入本文。
在制药业中肽类似物通常用作具有类似于那些模版肽的属性的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“类肽物”。Fauchere，J Adv Drug Res 15：29(1986)；Veber and Freidinger，TINS p.392(1985)；和Evans et al.，J Med Chem 30：1229(1987)，通过引用并入本文。这些化合物通常用计算机化的分子模型辅助研发。结构类似于有用治疗肽的肽模拟物可用于产生相同的治疗或预防效应。类肽物通常结构类似于范例肽(例如，具有生物化学性质或药理学活性的肽)，比如人类抗体，但有一个或多个肽键被这些连接选择性取代，这些连接选自：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--，所用方法在本领内众所周知。用相同类型的D-氨基酸对共有序列进行一个或多个氨基酸系统性置换(例如，D-赖氨酸取代L-赖氨酸)可用于生成更稳定的肽。此外，含有一个共有序列或实质等同的共有序列变异体的约束肽可用本领域内已知的方法生成(Rizo and Gierasch，Ann Rev Biochem 61：387(1992)，通过引用并入本文)；例如，通过添加能形成使肽环化的分子内二硫键的半胱氨酸残基。
本文使用的所述术语“受试者”指治疗处理的受体，包括所有动物。在一例示实施方式中，所述受试者是人。
本文使用的所述术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)通常指降低、减轻或改善病症或疾病，或其中至少一种临床症状。当在这些症状或病症是可测量的之前施用，治疗可被认为是“预防”。
本文提及的所述术语“制剂”指分子、化合物或组合物。在某些实施方式中，“制剂”可含有细胞，如Treg细胞。
本文提及的所述术语“治疗性制剂”指递送治疗效应的分子、化合物或组合物。
所述术语“有效量”指治疗性制剂在对患者单独施用或和其他治疗性制剂联用时起到治疗效应的剂量。所述效应可以是客观的(即，通过一些试验或标记物测量)或者是主观的(即，主观给出的对效应的指示或感觉)。
所述术语“调节T细胞依赖性免疫应答的制剂”指(例如)ATP-介导的T细胞活化的抑制剂和至少一种Treg细胞活性(例如，T细胞分化和/或扩展及T细胞免疫抑制活性)的调节剂。在某些实施方式中，“调节T细胞依赖性免疫应答的制剂”是含有具有T细胞免疫抑制活性的Treg细胞的组合物。
ATP介导的T细胞活化的抑制
本发明提供方法通过使用ATP介导的T细胞活化的抑制剂抑制至少一种辅助性T细胞活性，例如，T细胞活化、增殖和/或效应功能。在一实施方式中，这些抑制剂包含是P2X受体拮抗剂的制剂，例如，T细胞P2X7受体拮抗剂。在一优选的实施方式中，所述抑制剂是oATP。在另一实施方式中，这些抑制剂包含抑制pannexin hemichannel通透性的制剂。在另一优选的实施方式中，所述抑制剂是PX10肽(包括其类似物或化学修饰衍生物)或生胃酮。在一例示实施方式中，所述本发明的方法在体内进行。
在一实施方式中，提供治疗以ATP介导的T细胞活化为特征的免疫疾病的方法。在一实施方式中，这些方法包含对哺乳动物受试者施用至少一种本文所公开的ATP介导的T细胞活化的抑制剂，或者单独施用或者和另一个免疫治疗或免疫抑制方案联用。在一优选的实施方式中，给受试者施用至少一种ATP介导的T细胞活化的抑制剂，其中所述抑制剂能干扰ATP和P2受体(如P2X受体，如T细胞P2X7受体)的相互作用，并抑制ATP信号转导。在一例示实施方式中，所述ATP介导的T细胞活化的抑制剂是oATP。
Treg细胞分化和/或扩展的诱导
本发明提供用于治疗受益于Treg细胞分化和/或扩展的治疗免疫疾病的方法。在一实施方式中，这些方法包含对哺乳动物受试者施用Treg细胞，这些Treg细胞通过接触至少一种本文所公开的制剂而已分化和/或扩展，或者单独使用或者和另一个免疫治疗或免疫抑制方案联用。在一优选的实施方式中，所述Treg细胞根据本发明的方法在体外分化和/或扩展，并随后施用给受试者。
在一优选的实施方式中，所述诱导Treg细胞分化和/或扩展的制剂是包含oATP的组合物。所述组合物也优选包含(1)T细胞初次刺激物；和(2)细胞成分及可溶性介质。
在某些实施方式中，所述T细胞初次刺激物是结合T细胞受体(TCR)的配体(例如，CD3或抗-CD3)，并且起始初刺激信号。T细胞初次刺激物包括其他天然和合成的配体。一个天然的配体可包括具有或没有递呈肽的MHC。其他配体可包括但不限于：肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、如PHA的促细胞分裂剂、其他超抗原、肽-MHC复合体和可溶性MHC复合体。在其他实施方式中，所述T细胞刺激物通过另一个机制起作用。这些刺激物包括，例如蛋白激酶C激活剂，比如佛波酯(例如，佛波酯乙酸盐)、和亲离子钙(例如，离子霉素，其能升高细胞溶质钙浓度)。这些制剂的绕过TCR/CD3复合体但能递送刺激信号给T细胞。
在某些实施方式中，所述细胞成分或可溶性介质包含一个或多个细胞产物，这些产物选自，例如抗原递呈细胞(例如，自体、同系、同种异体、异种照射的脾细胞)、移动的细胞产物，包括但不限于白细胞去除术的细胞产物和/或骨髓细胞产物，比如，例如，髂嵴细胞产物和/或椎体，以及其他淋巴组织来源(比如淋巴结和脾)的细胞产物。在其他实施方式中，所述细胞成分或可溶性介质包含一个或多个可溶性制剂，这些制剂选自：视黄酸(参见，例如，Hill et al.，Immunity 29：758-770(2008))、雷帕霉素、DNA甲基化抑制剂(例如，5-氮胞苷；参见，例如，Kim and Leonard，J.Exp.Med.204(7)：1543-1551(2007))、细胞因子(例如，TGF-β和白介素(IL)-2)、组蛋白脱乙酰酶抑制剂HDAC)(比如，曲古抑菌素A(Taoet al.，Nature Medicine 13：1299(2007)))和α1-抗胰蛋白酶(Lewis et al，PNAS 105：16236(2008))。
所述组合物也可包含其他制剂，包括但不限于CD80、4-1BB、CD52激动剂、CD28抗体、淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)、CD2、CD40、CD80/B7-1、CD86/B7-2、OX-2、CD70和CD82。
在一例示实施方式中，所述组合物包含oATP、抗-CD3抗体、同基因受照射的脾细胞。所述组合物还可包含IL-2。
在一实施方式中，所述组合物比包含oATP、抗-CD3抗体、抗-CD28抗体的组合物更有效地诱导Treg细胞分化和/或扩展。
分化和/或扩展的T细胞获得于，例如，哺乳动物来源，比如人、狗、猫、小鼠、大鼠或它们的转基因品种。T细胞，例如幼稚的T细胞或Treg细胞，能分离自，例如，外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、感染部位组织、脾组织、肿瘤或T细胞系。
能分化为Treg细胞的细胞包括哺乳动物细胞祖细胞，比如幼稚的T细胞，例如，幼稚的CD4+T细胞。本发明也预期使用本发明的制剂和方法来逆转其他T细胞类型(例如，Th17细胞)为Treg细胞系。因此提供使用本发明的制剂逆转病原性T细胞表型为保护性T细胞表型的方法。本发明也提供使用本发明的制剂维持Treg细胞表型的方法，例如，通过抑制Treg细胞向非Treg细胞类型(例如，诸如Th17细胞的病原性T细胞类型)的转变。
从上述来源获取T细胞的方法在本领内是已知的。例如，T细胞能通过FICOLLTM分离从血中提取获得。或者，T细胞能通过血浆分离置换术或白细胞去除术从循环的血液中获得。特化的T细胞亚群(例如幼稚的CD4+细胞和/或Treg细胞)的富集和/或分离可用本领域内已知的阳性和阴性选择技术进行，这些技术包括但不限于：荧光激活的细胞分选(流式细胞仪)、使用抗体覆盖的磁珠的磁性分离、亲和层析、细胞毒性制剂连接到单克隆抗体或和单克隆抗体联用，例如：补充和细胞毒素，具有附着于固体基质的抗体的“淘洗”(例如平板)，或其他传统技术。阳性选择可以和针对于包含非期望的T细胞类型特异的表面标记物的T细胞的阴性选择联用。
在一些实施方式中，幼稚的CD4+细胞被纯化，用于随后向Treg细胞分化。例如，幼稚的CD4+细胞能用阴性选择以去除CD8+T细胞和效应子记忆T细胞(CD54R0)、B细胞(CD19)、巨噬细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞而分离出来。在优选的实施方式中，源于上述选择技术的组合物的细胞中至少有55％、65％、75％、85％、90％、95％、98％或100％的细胞是幼稚的CD4+细胞。
Treg细胞含有是CD4+CD25+的细胞，并且也特征表达细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA)-4、糖皮质激素-诱导的TNF受体(GITR)和叉头/翼-螺旋转录因子Foxp3。能使用本领域内已知的方法，根据CD25、GITR、CTLA-4和Foxp3的表达将Treg细胞从混合的细胞群(例如，从包含外周血单核细胞群，或从包含分化的Treg细胞和幼稚的CD4+细胞群)中分离出来。在一些实施方式中，调节性T细胞将通过去除表达CD127(其在调节性T细胞中下调)的细胞而从其他细胞中分离出来。在一实施方式中，所述调节性T细胞可被从死细胞中挑选出来，通过使用和死细胞特异相关的染料(例如，碘化丙锭、单跌氮化乙锭)。在其他实施方式中，所述调节性T细胞用本领域内已知的其他方法获得，例如，美国专利公开No.20060063256，20060233751，20060240024和20080279834报道的方法，都通过引用整体并入本文。在优选的实施方式中，源于上述选择和分离技术的组合物的细胞中至少有55％、65％、75％、85％、90％、95％、98％或100％的细胞是调节性T细胞。
在一实施方式中，CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞用两步法直接分离自外周血样本。第一步涉及使用RosetteSep技术非期望的细胞的阴性选择来富集CD4+T细胞，其中在样本中红细胞和非期望的细胞交联。然后交联的细胞通过中等密度离心形成颗粒并丢弃。第二步涉及从所述富集的CD4+T细胞群中通过无柱(column-free)免疫磁性选择进行CD25+亮细胞的阳性选择。该步骤可以是自动化的，例如使用RoboSept一个具有准确走离(walk-away)能力的移液机器人。该两步处理法显著缩短从全血中获得高纯度的Treg样本所需要的时间。该方法详细报道于美国专利No.7,135,335，通过引用整体并入本文。本领域内已知的任何能分离高纯度的Treg细胞群的许多其他方法可根据本发明使用。
在一实施方式中，使用具有高剂量IL-2和雷帕霉素的CD3/CD28扩展磁珠来扩展Treg细胞。该扩展方案详细报道于(例如)美国专利公开No.20050196386，通过引用整体并入本文。本领域内已知的任何扩展Treg细胞的许多其他方法可根据本发明使用。
Treg细胞的刺激和扩展能在任何细胞培养环境中完成，例如培养瓶、培养袋，或任何容纳细胞的容器(如，生物反应器)，优选在无菌环境中。诱导Treg细胞分化和/或扩展的制剂的一个或多个成分可以是溶解形式或固定在固体支持物(比如磁珠(例如，顺磁性磁珠))、或组织培养皿上。所述固相表面可以是塑料、玻璃、或任何其他合适的物质。所述刺激和扩展能在细胞培养的一个或多个阶段发生(参见，例如，美国专利公开No.20060286067)。所述Treg细胞优选扩展至少2倍，更优选扩展至少10、50、100、200、300、500、800、或1000倍。
一旦分离、分化和/或扩展，Treg细胞可被特征描述，基于Foxp3的表达及TGF-β产物，并且不能生成IL-2、IL-10、IL-4、IL-5和IFN-γ。所述分离的Treg细胞的抑制活性可以被检测，例如通过和应答性T细胞共培养。本发明也直接使用所述扩展的细胞，例如在给受试者施用之前，通过细胞因子刺激或通过添加目的基因，比如治疗性基因或基因敲除。例如，Treg细胞可作为“特洛伊木马”来递送抑制性或其他生物因子到炎症位点，例如IL-4、干细胞生长因子、血管生成调节剂，遗传缺陷物等，此外，已显示的Foxp3过表达能使病原性T细胞逆转为调节性T细胞，并且能将编码抗原特异的TCRFoxp3+的基因转导进多克隆扩展的T细胞，以很高的数量生成蛋白抗原特异的调节性T细胞。这些抗原-特异的方法降低了高初始细胞数目的需求，而使调节性T细胞特异性和功能最大化。
调节T细胞依赖性免疫应答的方法
本发明总体涉及调节T细胞活性的方法和组合物。对免疫耐受、自身免疫、免疫抑制、免疫治疗有多种治疗性应用。本发明具体提供方法(1)抑制至少一种T细胞活性，包括用抑制ATP-介导的T细胞活化的制剂接触T细胞的步骤；和(2)调节至少一种Treg细胞活性，例如Treg细胞分化、扩展和/或免疫抑制活性，包含用调节至少一种Treg细胞活性的制剂接触Treg细胞的步骤。在某些实施方式中，方法(1)在体内进行；方法(2)在体外进行，并且随后在体内施用具有调节活性的Treg细胞(例如，分化和/或扩展的Treg细胞，或具有增强的免疫抑制活性的Treg细胞)。
作为本文首次公开，活化过程中T细胞释放的ATP引起具有MAPK活性的P2X受体的自分泌活化。这是一个用于产生T细胞活化和扩展的必要的共刺激因子。
同样作为本文首次公开，pannexin在T细胞上表达并作为T细胞活性的正调价剂，其中ATP介导的信号转导引起pannexin hemichannel形成，导致T细胞活化。
因此，ATP信号转导负责促进T细胞反应，比如细胞周期进程、分化、存活、细胞因子生成和细胞溶解激活。这些发现确保使用能干扰ATP介导的T细胞活化的制剂(例如P2X受体拮抗剂或阻碍pannexin hemichannel形成的制剂，或阻碍和ATP介导的T细胞活化相关通道的制剂)，来调节T细胞活性(例如辅助性T细胞活性)，旨在治疗(连同其他疾病)、自身免疫病和移植相关的免疫应答。
作为本文首次公开，所述Th17细胞(分泌IL-17的T细胞)的分化受制于oATP。现在该T细胞亚型被认作是T淋巴细胞-依赖性炎症反应的一个主要成分。因此，本发明提供方法通过用至少一种ATP介导的T细胞活化的抑制剂接触Th17细胞来抑制Th17细胞的活化和/或IL-17的分泌。本发明也提供方法用于抑制保护性T细胞(例如，Treg细胞)向Th17细胞的转化，并用于促进Th17细胞向保护性T细胞(例如，Treg细胞)的转化。所述本发明的方法可(例如)在体外或体内进行。
此外，作为本文首次公开，oATP结合抗CD3抗体、IL-2和同基因受照射的脾细胞使用能诱导分化和活化的具有Foxp3高表达水平的调节性T细胞(Treg细胞)显著扩展。因此，oATP，具体是包含某些其他制剂的组合物中的oATP，能诱导Treg细胞分化和/或扩展。这些发现确保使用包含oATP的组合物来调节T细胞活性(例如调节性T细胞活性)，旨在治疗(连同其他疾病)自身免疫病和移植相关的免疫应答(例如，移植物抗宿主病)。
本发明提供ATP介导的T细胞活化的抑制剂的新用途，并提供Treg细胞分化和/或扩展的诱导物，用于治疗炎症和自身免疫病。所述本发明的抑制剂和诱导物能在特定的疾病治疗中用于调节、扰乱、阻碍、增加、抑制、减少、拮抗或中和T细胞活性，这些疾病比如，哮喘、过敏症、类风湿关节炎、银屑病关节炎、关节炎、内毒素血症、I型糖尿病、炎性肠道疾病(IBD)、结肠炎、多发性硬化症、移植排斥反应、移植物抗宿主病、肌萎缩性侧索硬化症、脱髓鞘病、硬皮病、干燥综合征、Erdheim-Chester综合征、克罗恩病综合征、大动脉炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、Werlhof特发性血小板减少综合征、银屑病、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤移植物抗宿主病、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、斑秃、白癜风、药物相关的疹、接触性超敏反应、红斑狼疮、苔藓痘疹样糠疹、慢性苔藓性糠疹、湿疹及扁平苔藓，以及任何本文公开或本领域内已知的其他免疫疾病。这些抑制剂和诱导物将有利于现在已知的或后面公开的任何T细胞-介导的免疫疾病。在一优选的实施方式中，所述抑制剂和诱导物包含oATP。
在一实施方式中，所述本发明的方法用于治疗炎性疾病其中所述炎性疾病不是天然免疫系统的炎性疾病，或者其中所述炎性疾病不完全是天然免疫系统的炎性疾病。在某些实施方式中，所述本发明的方法用于治疗炎性疾病其中所述炎性疾病部分或完全是适应性免疫系统的炎性疾病。天然免疫系统包含以非特异性方式应答病原体的细胞和机制。由天然免疫系统的细胞引起的炎症生成使疼痛受体敏感的介质(例如，组胺、缓激肽、血清素、白三烯及前列腺素)，引起血管舒张和攻击性吞噬细胞。这些反应不直接涉及自身免疫病的致病反应。相反，适应性免疫系统，包含T淋巴细胞-依赖性炎症反应，以抗原特异的方式应答病原体，并且能直接涉及自身免疫病的调节。天然免疫系统的细胞和进程不同于适应性免疫系统的细胞和进程。在某些实施方式中，所述本发明的方法用于治疗适应性免疫系统炎症和/或自身免疫病。在一实施方式中，所述本发明的方法用于治疗炎症和/或自身免疫进程的T细胞活化相关的起始阶段。在一例示实施方式中，所述本发明的方法在体内进行。
在一优选的实施方式中，提供用于抑制宿主对抗原刺激的免疫应答的方法，包含给宿主施用至少一种上述ATP介导的T细胞活化的抑制剂、一种诱导Treg细胞分化和/或扩展的上述制剂、和/或通过接触上述制剂而分化和/或扩展的Treg细胞。例如，抗原刺激在自身免疫病中来自自身抗原，在器官和组织移植中来自供体抗原。在一例示实施方式中，所述方法在体内进行。
本发明也提供用于治疗炎症或免疫疾病的方法，使用的药物组合物包含药学可接受载体和至少一种ATP介导的T细胞活化的抑制剂和/或一种Treg细胞分化和/或扩展的诱导物。在某些实施方式中，所述药物组合物包含用上述诱导物分化和/或扩展的Treg细胞。在一例示实施方式中，所述治疗方法在体内进行。
本发明的方法可用于治疗，例如：炎性疾病(如克罗恩病和乳糜泻)、肠易激综合征、偏头痛、头痛、腰背疼痛、纤维肌痛、肌筋膜疾病、病毒感染(如丙型肝炎、特别是流感、普通感冒、带状疱疹、艾滋病)、自身免疫性肝炎、细菌感染、真菌感染、痛经、烧伤、外科或牙科手术、恶性肿瘤(如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌)、动脉粥样硬化、肠源性脊柱关节病、痛风、关节炎、骨关节炎、幼年性关节炎、类风湿关节炎、银屑病关节炎、发热(如风湿热)、强直性脊柱炎sodalities、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎、胰腺炎、肾炎、滑囊炎、结膜炎、虹膜炎、巩膜炎、葡萄膜炎、伤口愈合、皮肤病(例如银屑病、皮肤性T细胞淋巴瘤、皮肤移植物抗宿主病、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、斑秃、白癜风、与药物有关的出疹、接触过敏、红斑狼疮、苔藓痘状糠疹、慢性苔藓糠疹、湿疹、扁平苔癣)、中风、糖尿病、神经退行性疾病、如阿尔茨海默氏症和多发性硬化症、自身免疫病(如肌萎缩性侧索硬化症、脱髓鞘病、硬皮病、干燥综合征、Erdheim-切斯特综合征、克罗恩病综合征、大动脉炎、自身免疫性溶血性贫血和Werlhof特发性血小板减少综合征)、骨质疏松症、哮喘、慢性阻断性肺病、肺纤维化、过敏性疾病、鼻炎、溃疡、冠心病、结节病、移植排斥反应、移植物抗宿主病，以及任何具有免疫或炎症成分的其他疾病。在某些实施方式中，所述本发明的方法用于治疗具有适应性免疫成分的疾病。
另一方面，提供治疗T淋巴细胞依赖性炎性或免疫疾病的方法。在一优选的实施方式中，所述T淋巴细胞依赖性炎性或免疫疾病选自，例如：哮喘、过敏症、类风湿关节炎、银屑病关节炎、关节炎、内毒素血症、I型糖尿病、炎性肠道疾病(IBD)、结肠炎、多发性硬化症、移植排斥反应、移植物抗宿主病、肌萎缩性侧索硬化症、脱髓鞘病、硬皮病、干燥综合征、Erdheim-Chester综合征、克罗恩病综合征、高安动脉炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、Werlhof特发性血小板减少综合征和皮肤病、(比如银屑病、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤移植物抗宿主病、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、斑秃、白癜风、药物相关的疹、接触性超敏反应、红斑狼疮、苔藓痘疹样糠疹、慢性苔藓性糠疹、湿疹及扁平苔藓)。在某些实施方式中，所述炎症或免疫疾病和肥大细胞的脱颗粒作用有关。在一优选的实施方式中，所述方式在体内进行。在一实施方式中，所述方法包含给受试者(例如，哺乳动物受试者)施用至少一种上述ATP介导的T细胞活化的抑制剂、一种诱导Treg细胞分化和/或扩展的上述制剂、和/或通过接触上述制剂而分化和/或扩展的Treg细胞，或者单独使用或者结合另一个免疫治疗和/或免疫抑制制剂和/或方案使用。
在一实施方式中，提供改善器官和组织移植结果和延长移植存活的方法。在一实施方式中，这些方法包含给移植受体施用至少一种上述ATP介导的T细胞活化的抑制剂、一种诱导Treg细胞分化和/或扩展的上述制剂、和/或通过接触上述制剂而分化和/或扩展的Treg细胞，或者单独使用或者结合另一个免疫治疗和/或免疫抑制制剂和/或方案使用。在一优选的实施方式中，给移植受体施用至少一种ATP介导的T细胞活化的抑制剂，其中所述抑制剂的施用能有效降低受体的免疫应答，例如，T细胞活性，移植中针对供体抗原的递呈。在另一优选的实施方式中，给移植受体施用至少一种诱导Treg细胞分化和/或扩展的制剂，其中所述Treg细胞的施用能有效抑制移植中针对供体抗原递呈的受体免疫应答。参见，例如，Taylor et al.，Blood 99：3493-3499(2002)。在一实施方式中，所述移植是同种异体移植。在另一实施方式中，所述移植是异种移植。
在一具体优选的实施方式中，所述本发明的方法可用于延长移植组织的存活。用于预防急性和/或慢性移植排斥的优选的组合物包括ATP拮抗剂(例如oATP)和/或阻断pannexin hemichannel组装的制剂(例如PX10)。特别优选的制剂包括模拟ATP和ATP受体天然相互作用的小分子化学组合物。诱导Treg细胞分化和/或扩展的组合物也优选包含(1)T细胞初刺激物；和(2)细胞成分或可溶性介质。所述本发明的方法可在体内或体外进行。
在一实施方式中，至少一种调节T细胞依赖性免疫应答的制剂被施用给包含容纳于一个装置中的生物材料的移植物受体，来降低受体免疫应答和/或延长移植的组织的存活。所述装置可以是任何用于在患者中移植生物材料的装置，例如所述装置报道于美国专利公开No.2006/0024276，美国专利No.6,716,246或PCT专利公开No.WO 08/097498，每个都通过引用整体并入本文。在一实施方式中，至少一种调节T细胞依赖性免疫应答的制剂被施用给所述局部装置的受体，即在装置移植位点或其附近。本文所述的制剂在位点“附近”施用指施用制剂给和所述位点有细胞通讯的细胞或组织。在一实施方式中，至少一种调节T细胞依赖性免疫应答的制剂，在一个或多个淋巴节附近或装置移植位点周围，被施用给所述装置的受体。
在一实施方式中，至少一种调节T细胞依赖性免疫应答的制剂被施用给(包含用于物质施用的装置的)移植物受体(例如)来降低受体免疫或炎症反应。所述装置可以是任何用于在患者中移植生物材料的装置，例如所述装置报道于美国专利公开No.2006/0024276，美国专利No.5,324,518，美国专利No.6,716,246或PCT专利公开No.WO 08/097498，每个都通过引用整体并入本文。在一实施方式中，至少一种调节T细胞依赖性免疫应答的制剂被施用给所述局部装置的受体，即穿过装置或在装置移植位点或其附近。在一实施方式中，至少一种调节T细胞依赖性免疫应答的制剂，在一个或多个淋巴节附近或装置移植位点周围，被施用给所述装置的受体。
也提供抑制T细胞活性(例如T细胞活化、增殖和效应功能)的方法，使用包含ATP介导的T细胞活化的抑制剂和至少一种其他免疫抑制或抗炎症制剂的药物组合物。在一例示实施方式中，所述本发明的方法在体内进行。
也提供增强Treg细胞免疫抑制活性的方法，使用包含oATP和至少一种其他免疫抑制或抗炎症制剂的的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物也包含包含(1)T细胞初刺激物；和(2)细胞成分或可溶性介质。在一例示实施方式中，T细胞(如，幼稚的T细胞)通过体外接触上述组合物而分化，并且产生的Treg细胞扩展为Treg细胞群，然后在药物组合物中施用，该组合物可包含至少一种其他免疫抑制剂或消炎药、或至少一种以抗原特异的方式利于促进和维持Treg细胞表型的制剂，用于在需要时体内施用给受试者。在另一实施方式中，在需要时oATP(单独或结合其他制剂)被施用给受试者以增强体内的Treg细胞免疫抑制活性。
免疫抑制剂可包含一个或多个，例如：环孢素、雷帕霉素、campath-1H、ATG、普乐可复、抗IL-2R、MMF、FTY、LEA、干扰素、白细胞介素-2、环孢素A、diftitox、地尼白介素、左旋咪唑、硫唑嘌呤、布喹那、胍立莫司、6-巯嘌呤、咪唑立宾、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、叶酸类似物(如二甲叶酸、依达曲沙、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶罗呤、TomudexRTM和三甲曲沙)、嘌呤类似物(如克拉屈滨、氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤)嘧啶类似物(如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、氟尿苷、乙嘧替氟、依诺他滨、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、喃氟啶)氟轻松、氟羟氢化泼尼松、醋酸阿奈可他、氟米龙、甲羟松、强的松等。
消炎药可包含一个或多个，例如：NSAIDs、白细胞介素1拮抗剂、二氢乳清酸合酶抑制剂、p38 MAP激酶抑制剂、肿瘤坏死因子-α抑制剂、肿瘤坏死因子-α隔离剂和甲氨蝶呤。消炎药可更具体包含一个或多个，例如：抗TNF-α、lysophylline、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、白细胞介素-10(IL-10)、己酮可可碱、COX-2抑制剂、21-乙酰氧孕烯醇酮、阿氯米松、阿尔孕酮、安西奈德、氯地米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、氯倍他索、丁酸氯氟美松酮、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、羟泼尼缩松、去羟米松、地塞米松、双氟拉松、双氟米松、双氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、氟尼缩松、氟轻松安奈德、氟轻松醋酸酯、氟可丁丁酯、氟可龙、氟米龙、氟培龙醋酸盐、氟泼尼定醋酸盐、氟泼尼龙、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、福莫可他、哈西缩松、卤倍他索丙酸酯、卤米松、卤泼尼松醋酸、氢可他酯、氢化可的松、氯替泼诺、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、类固醇、类固醇25-二乙氨基乙酸、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松、泼尼松龙戊酸酯、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安奈德、去炎舒松、苯曲安缩松、己酸丙炎松、氨基芳基羧酸衍生物(如苯乙氨茴酸、依托芬那酯、氟芬那酸、异尼辛、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟灭酸、他尼氟酯、特罗芬那酯、托芬那酸)、芳基乙酸衍生物(如醋氯芬酸、阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、呱氨托美丁、溴芬、丁苯羟酸、桂美辛、氯吡酸、双氯芬酸钠、依托度酸、联苯乙酸、芬克洛酸、芬替酸、葡美辛、异丁芬酸、消炎痛、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、甲嗪酸、莫苯唑酸、奥沙美辛、吡拉唑酸、丙谷美辛、舒林酸、噻拉米特、托美丁、tropesin、佐美酸)、芳基丁酸衍生物(如布马地宗、异丁苯丁酸、芬布芬、联苯丁酸)、芳基羧酸(如环氯茚酸、酮咯酸、替诺立定)、芳基丙酸衍生物(如阿明洛芬、苯恶洛芬、柏莫洛芬、布氯酸、卡洛芬、非诺洛芬、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生、吲哚洛芬、酮洛芬、洛索洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡酮洛芬、吡咯洛、普拉洛芬、丙替嗪酸、舒洛芬、噻洛芬酸、希莫洛芬、扎托洛芬)、吡唑(如二苯米唑、依匹唑)、吡唑酮(如阿扎丙宗、苄哌立隆、非普拉宗、莫非保松、吗拉宗、羟基得泰松、苯、哌保松、异丙安替比林、雷米那酮、琥保松、噻唑丁炎酮)、水杨酸衍生物(如醋氨沙洛、阿司匹林、扑炎痛、溴水杨醇、钙乙酰水杨酸、二氟尼柳、依特柳酯、芬度柳、龙胆酸、乙二醇水杨酸、水杨酸咪唑、赖氨酸乙酰水杨酸、美沙拉嗪、吗啉、水杨酸1-萘基水杨酸、奥沙拉嗪、帕沙米特、苯基乙酰水杨酸、水杨酸苯、醋水杨胺、水杨酰胺邻乙酸、水杨基硫酸、双水杨酯、柳氮磺胺吡啶)、噻嗪羰酰胺(如安吡昔康、屈恶昔康、伊索昔康、氯诺昔康、吡罗昔康、替诺昔康)、ε-乙酰胺基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟丁酸、阿米西群、苄达、苄达明、α-红没药醇、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、非普地醇、愈创木薁、萘丁美酮、尼美舒利、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、普罗喹宗、超氧化物歧化酶、替尼达普、齐留通、小烛树蜡、α没药醇、芦荟、Manjistha、穆库尔、科拉提取物、甘菊、海鞭提取物、甘草次酸、甘草酸、油溶性甘草提取物、甘草酸单铵、磷酸二氢钾甘草酸、甘草酸二钾、1-β-甘草次酸、甘草酸硬脂酯、和3-硬脂酰氧基-甘草次酸、3-琥珀酰氧基-β-甘草亭酸二钠等。
利于促进和维持Treg表型的试剂可包含一个或多个，例如：oATP、TGF-β、视黄酸、雷帕霉素、5氮胞苷和曲古菌素A。
还预计所述受试组合物和方法可协同结合基于调节其他T细胞共刺激通路的免疫治疗，比如，例如CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4和/或BTLA的调节。
药物制剂
本发明的方法可包含单独施用治疗性制剂，但优选包含施用已知的药物配方，包括口服片剂、胶囊或酏剂、直肠给药的栓剂、肠胃外或肌肉注射的无菌溶液或悬浮液、脂质体制剂或胶囊化制剂，其中所述治疗性制剂的配置成分是单独的或结合递送制剂或媒介等。
这些制剂可根据标准和/或公认的药物实践制备。
认为本发明的治疗实体能结合合适的载体、赋形剂、和/或其他试剂施用，这些试剂被并入到制剂中以提供改善的转移、递送、耐受等。所有药物化学家所知的配方中有多种合适的制剂：Remington’s Pharmaceutical Sciences(15th ed，Mack Publishing Company，Easton，PA(1975))，具体是其中Blaug、Seymour的第87章。例如，这些制剂包括粉剂、糊剂、药膏、凝胶剂、蜡、油类、脂类、含有囊泡的脂类(阳离子或阴离子)(比如LipofectinTM)、DNA轭合物、无水吸收膏、油包水和水包油型乳剂、聚乙二醇乳剂(不同分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶、含聚乙二醇的半固态混合物。根据本发明任何上述混合物在处理和治疗中是合适的，只要所述制剂的有效成分在制备中不是失活的，并且所述制剂是生理可接受的并且对施用途径耐受。也参见Powell et al.“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol 52：238-311(1998)，和本文关于药物化学家所知的赋形剂和载体的附加信息的引文。
在一实施方式中，所述治疗性制剂是局部制剂施用。施用的局部制剂可包含，例如：含水和无水的凝胶、乳膏剂、复合乳剂、微乳剂、脂质体、药膏、含水和无水溶液、洗剂、气雾剂、皮肤斑块、碳氢化合物基质和粉剂、并包含赋形剂、比如增溶剂、渗透促进剂(如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和亲水性聚合物(如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。
本发明的局部制剂可包含一个皮肤可接受的载体，比如，能递送其他制剂成分到皮肤，并且这些成分被皮肤敷用接受或吸收的物质。所述载体通常包括溶解或使治疗性制剂分散的溶剂或者一个或多个赋形剂或其他载体成分。符合本发明通常制剂的有用的载体可包括(作为非限制性示例)水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1，3-二醇、丙烯酸酯共聚物、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、黄油、芦荟、滑石粉、植物油、植物汁液、植物提取物、植物粉、其他植物衍生物、羊毛脂、尿素、石油制剂、焦油制剂、植物或动物脂肪、植物或动物油、肥皂、甘油三酸脂和角蛋白。根据本领域内众所周知的方法，例如报道于标准参考书(例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，1577-1591，1672-1673，866-885(Alfonso R.Gennaro ed.19th ed.1995)；和Ghosh et al.，Transdermal and Topical Drug Delivery Systems(1997))的方法，通过混合本发明的化合物和典型载体制备本发明的局部制剂。
此外，保湿剂或湿润剂、防晒剂、芳香剂、染料和/或增稠剂(如石蜡、霍霍巴油、对氨基苯甲酸、蜡)、表面活性剂、闭塞剂、吸湿剂、乳化剂、润肤剂、无脂清洁剂、抗氧化剂和亲脂剂，需要时可被添加到所述本发明的典型制剂中。
本发明的典型制剂可被设计在短暂敷用后保持在皮肤上并且不被洗掉。或者，所述典型制剂可被设计在敷用一定时间后被洗掉。
递送方法
本发明的方法包含治疗性制剂的施用，单独或以组合物的形式，通过任何期望的方式，比如：经口、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、经消化道、脊柱内、关节内(intra-articularly)、关节内(intra-joint)、皮下、颊部、阴道、经直肠、皮肤、透皮、眼部、经耳、粘膜、经鼻、经气管、经支气管、舌下、结内、通过任何肠胃外途径或通过吸入，以药物可接受的剂型。
在一实施方式中，所述治疗性制剂被直接施用到其治疗活性位点，例如，淋巴结。例如，所述治疗性制剂被直接注射到淋巴结。用于T细胞依赖性活化抑制剂结内注射的优选的淋巴结是位于腹股沟、腋下和颈部区域的主要淋巴结。在另一实施方式中，所述治疗性制剂被施用到其治疗活性位点的远端。
在一实施方式中，所述治疗性制剂被局部施用。在某些这类实施方式中，所述治疗性制剂被局部施用来治疗皮肤病。尽管使用的局部制剂的量将取决于(例如)预期使用的总组合物(即相对于维持方案的治疗剂)和受试个体对所述治疗剂的敏感性，但在一实施方式中，所述本发明的局部制剂被每隔一定时间使用来影响受体身体。在一些实施方式中，在治疗的起始阶段所述组合物被更频繁地使用，直到达到理想的效果，然后在需要维持时较少频率使用。
所述本发明的局部制剂可用各种方法使用。在一实施方式中，所述制剂被施用在炎症影响的皮肤区域。然后按摩或摩擦该区域直到所述制剂被均匀分布或消失。一天可重复该过程1、2、3、4、5、6或更多次。在另一方法中，所述局部制剂在皮肤贴片上使用，然后将其贴在受影响的皮肤区域30分钟到数小时、数天、数月、数周或更长。在另一实施方式中，所述本发明的局部制剂用离子电渗疗法递送到受影响的区域。该方法中，所述局部制剂位于和电极接触的容器或接线板中。然后所述容器被放置在受影响的区域上，激活电极。这引起电流产生，通过电斥力递送所述局部制剂穿过皮肤。
其他用于递送所述本发明的局部制剂穿过皮肤的合适方法包括超声波法和玻璃纸包装法。在超声波法中，首先在受影响的皮肤区域使用所述局部制剂。然后将超声波装置放在所述受影响的区域。一旦启动，所述装置通过超声波能量递送制剂穿过皮肤。在玻璃纸包装法，所述制剂被使用到受影响的区域并用玻璃纸薄膜包裹所有地方，从几分钟到几小时、几天、几周或几个月。
在本发明的一个实施方式中，一个或多个本发明制剂被纳米胶囊化成纳米颗粒用于递送。所述纳米胶囊化材料可是生物降解性的或非降解性的。所述纳米胶囊化材料可用合成聚合物、天然聚合物、寡聚物或单体制成。聚合物、天然聚合物、寡聚物或单体包括那些物质，这些物质源于多聚环氧烷烃前体分子，比如聚(环氧乙烷)(PEO)，聚(乙二醇)(PEG)和聚(环氧丙烷)(PEG-共-PPO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙基噁唑啉)(PEOX)的共聚物，聚氨基酸和假聚氨基酸，以及这些聚合物的共聚物Sawhney et al.，Macromolecules 26：581-587(1993)。共聚物也可用其他水溶性聚合物或水不溶性聚合物形成，只要其缀合物是水溶的。一个水溶性缀合物的实施例是阻断的聚乙二醇和聚环氧丙烷的共聚物，商品名为Pluronic.TM.表面活性剂(BASF)。
天然聚合物、寡聚物或单体包括蛋白质(比如纤维蛋白原、纤维蛋白、明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、醇溶蛋白和白蛋白，无论产于天然来源还是重组来源)和多糖(比如琼脂糖、海藻酸钠、透明质酸、硫酸软骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、瓜尔豆胶、水溶性纤维素衍生物和角叉菜)。这些聚合物仅是能被利用的纳米胶囊化材料的示例类型，并且不打算代表所用可能范围之内的所述纳米胶囊化材料。
“受控释放”指制剂(比如源于组合物或剂型的药物)的释放，其中制剂根据期望的维持一段延长期的图谱被释放。受控释放图谱包括，例如持续释放、延长释放、脉冲释放、延迟释放图谱。与立即释放组合物相反，受控释放组合物允许根据预定图谱递送制剂给受试者维持一段延长期。该释放速度能提供治疗用于一段延长期的有效的制剂水平，并因而相比于传统的快速释放药物形式，提供一个较长的药理学或诊断反应的周期。这些较长的反应周期可提供许多内在益处，这些益处在相应的短效作用的、立即的释放制剂中不能实现。例如，在慢性疼痛的治疗中，相比于传统的短效作用的制剂，受控释放制剂通常是非常优选的。
受控释放药物组合物和剂型被设计改善制剂的递送图谱，比如药品、药剂、活性剂、诊断试剂、或任何被内部施用给动物(包括人)的物质。受控释放组合物通常用于通过优化递送动力学提高施用的物质的效用，因而能增强生物利用度、便利性、病人依从性，并使不适当的立即释放速度(比如高起始释放速度和(如果不是故意的)不均匀的血液或组织水平)相关的负作用最小化。
一些组合物提供活化的化合物的受控释放，制备和使用这些组合物的现有技术教导提供用于延长施用后药物释放的各种技术。本领域内已知的示例性受控释放制剂具体包括包覆颗粒、微粒、纳米粒子、植入物、片剂、小片剂和胶囊，其中所述药物的受控释放(例如)通过制剂包膜的选择性破裂，或通过穿过包膜释放，或通过和特异的基质混合来影响药物的释放，或通过这些技术组合释放。一些受控释放制剂提供在施用后的预定时期单个活化的化合物药物的脉冲式释放。
在一实施方式中，包含调节至少一种T细胞依赖性免疫应答的制剂的受控释放制剂靶向于具体细胞类型或组织。这可以被实现，例如通过结合所述受控释放制剂的靶药物/靶物质来保护其在体内或体外(例如，在细胞培养中或离体)远离外部干扰，直到其暴露于期望的靶点，比如在靶细胞内，报道于美国专利公开No.2007/0190160。在一优选的实施方式中，所述受控释放制剂靶向受体的淋巴结。在另一优选的实施方式中，所述受控释放制剂靶向移植物(例如，移植的器官)或植入物(例如，包含生物材料的植入装置)的位点或其附近。
本发明的方法包含以各种剂量施用所述治疗性制剂的步骤。口服、肺的和局部剂量范围可在约每天每公斤体重0.01mg(mg/kg/day)到约100mg/kg/天，优选约0.01mg/kg/天到约10mg/kg/天，更优选约0.1mg/kg/天到约5.0mg/kg/天。例如，口服施用，所述组合物通常包含约0.01mg到约500mg活性成分，优选约1mg到约100mg活性成分。静脉内施用，最优选的剂量范围为在恒定速度输液时约0.001到约10mg/kg/小时。有利的是，治疗性制剂可用单个日剂量施用，或总的日剂量分为每日2、3、4次施用。在一些实施方式中，施用所述制剂达1、2、3、或4周、两个月、三个月、一年、两年、几年或更长，根据熟练的从业医师决定是合适的。
用本发明的方法分化和/或扩展的Treg细胞用于抑制受试者的免疫功能。具体为自体细胞被分离；在体外修饰、分化、和/或扩展；随后施用或重新植入给受试者。治疗有效量的Treg细胞可结合药物可接受载体施用。施用路径可包括任何合适的方式，包括但不限于，口、直肠、阴道、颊部、局部、鼻腔、皮肤、透皮、气管、舌下、结内、肠胃外、静脉内、腹腔内、注射、鼻吸入、肺吸入、皮下、眼部、黏膜、耳、关节内和鞘内路径，以及经过消化道(例如，经过淋巴集结)。施用的局部路径包括关节内，肌肉内和脊柱内施用，以及经过排入胰腺的血管(比如前、后胰十二指肠动脉)施用。在优选的实施方式中，本发明的Treg细胞和包含所述细胞的药物组合物通过肌肉、腹膜内或静脉内注射或直接注射到患者的淋巴结施用给受试者。在一例示实施例中，所述Treg细胞被局部施用于所述炎症位点。施用路径将根据具体治疗选择。所述细胞可用单次剂量施用或用跨越选定间隔期的几个剂量来滴定药物。在某些实施方式中，剂量范围从104/kg到109/kg治疗的细胞，优选从105/kg到107/kg细胞，更优选约106/kg细胞被施用给受试者。所述细胞能被一次施用或在一段时期内施用，比如12、24、48、72、96个小时，或在一段延长的时期，比如一周、十天、两周、1个月、3个月、或6个月；或只要施用是治疗有益的。
在移植的事例中，使用受体细胞的所述Treg细胞是有同种活性的。在一优选的实施方式中，在移植手术之前，所述Treg细胞在体外被分化和/或扩展，并随后在手术中被施用以治疗或预防移植物抗宿主病。在某些实施方式中，所述Treg细胞以受控释放机制施用，比如人造凝胶或血浆凝块。
在一些实施方式中，在预期引起免疫应答的事件中(比如输血或移植)，施用所述Treg细胞给受试者。在该事例中，例如，在输液之前一周或6、5、4、3、2、1天或早于12天、早于4天、或早于2小时，施用调节性T细胞。
在任何事件中，医生或技术人员能决定最适合于患者个体的实际剂量，该剂量有可能因施用路径、治疗的疾病类型和严重程度，以及治疗的具体患者的种类、年龄、体重、性别、肾功能、肝功能和反应而变化。所述上述剂量是平均事例的例示；当然，单个事例中具有较高或较低的剂量范围是允许的，并且这些在本发明的范围内。
为了能更好地理解本发明，列举下列实施例。这些实施例仅仅旨在例证，并不以任何方式解释为本发明的限制范围。
实施例
实施例1：crt-/-T细胞中减少的ER的Ca2+和增强的线粒体的Ca2+摄入
现有研究已经显示CRT表达水平和ER储存的Ca2+数量直接相关(Pinton et al.，EMBO J 20：2690-2701(2001)；Arnaudeau et al.，J Biol Chem 277：46696-46705(2002))。我们检测CRT是否在特异于卵清蛋白肽323-339(OVAp)的CD4+T细胞克隆上发挥类似功能。这些克隆源于crt+/+或crt-/-DO.11.10TCR转基因胚胎的造血祖细胞产生的FLC(Porcellini et al.，J Exp Med 203：461-471(2006))。在无细胞外钙时，细胞被负载Ca2+指示剂Fura-2，并被毒胡萝卜内酯(一个肌浆内质网Ca2+ATP酶(SERCA)抑制剂)刺激。通过ER中Ca2+被动渗漏产生的缓慢的细胞溶质Ca2+升高的定量显示，和crt+/+细胞相比，crt-/-细胞中ER Ca2+含量减少20％(图2A)。
细胞刺激后Ca2+升高被线粒体察觉，线粒体通过缓冲细胞溶质Ca2+来调节Ca2+信号转导(Rizzuto and Pozzan，Physiol Rev 86：369-408(2006))。我们研究T细胞中线粒体的Ca2+摄入是否受到crt缺失的影响。我们通过在无Ca2+的培养基中用毒胡萝卜内酯耗尽Ca2+储存，并随后添加0.5mM Ca2+来诱导crt-/-和crt+/+T细胞中的CCE。在大量冲洗掉细胞外的Ca2+后，添加所述Ca2+离子载体离子霉素来通过CCE释放线粒体中积累的Ca2+(Hoth et al.，J Cell Biol 137：633-648(1997))。图1A显示和crt+/+细胞相比，crt-/-细胞中Ca2+积累到更高的程度，尽管CCE期间细胞溶质钙升高的幅度在两种细胞中相似。如果在添加0.5mM Ca2+之前添加离子霉素，则在crt-/-和crt+/+T细胞中没有观测到差异(未显示)，表明Ca2+是在CCE期间被积累到线粒体中。这排除了在crt-/-细胞中组成性线粒体Ca2+的过载。在crt+/+细胞中，耗尽Ca2+储存后升高的细胞外钙浓度并行于线粒体钙摄入的增加，但在crt-/-细胞中不存在(图1B)。事实上，在crt-/-T细胞中线粒体缓冲维持细胞外Ca2+的恒定范围在0.5～2mM。
线粒体的Ca2+缓冲依赖通过耗尽通道口附近的Ca2+离子使CRAC通道的失活来影响Ca2+(Gilabert et al.，EMBO J 20：2672-2679(2001)；Hoth et al.，Proc Natl Acad Sci USA 97：10607-10612(2000)；和Gilabert et al.，EMBO J 19：6401-6407(2000))。我们利用这一性质进一步证实在crt-/-T细胞中线粒体的Ca2+摄入是增强的。在无Ca2+的培养基中，我们耗尽毒胡萝卜内酯-敏感的负载Fura-2的细胞的储存，并对细胞连续两次添加0.5mM Ca2+(图1C和图2C)。由于细胞溶质Ca2+浓度升高速率决定于CRAC通道的活性，在第一和第二次添加细胞外Ca2+时定量该参数，能估计CRAC通道的Ca2+依赖性失活的程度(Hoth et al.，J Cell Biol 137：633-648(1997))。在crt+/+细胞中，我们计算出第二次添加细胞外Ca2+时CRAC活性减少57％。然而，在crt-/-细胞中，第二次添加细胞外Ca2+时CRAC通道显示只有14％失活(图1C)，因此证明在crt-/-细胞中CRAC通道的Ca2+依赖性失活是降低的。为了证实该现象中线粒体的作用，我们在CCCP(一个线粒体解偶联剂)存在下重复所述相同的实验。当线粒体钙摄入被抑制时，crt-/-和crt+/+细胞中所述CRAC通道的Ca2+依赖性失活是相当的(图1D)。
通过正吖啶橙染色的细胞的FACS分析测量线粒体质量，揭示了其在crt-/-和crt+/+细胞中没有差异(未显示)。类似的，通过荧光染料TMRM(其以电压依赖性方式保留在线粒体中)染色的细胞的FACS分析测定所述线粒体膜电势，揭示了其在crt-/-和crt+/+细胞中没有差异(图2B)。因此，crt-/-CD4+T细胞有减少的ER的Ca2+储存能力和增强的线粒体Ca2+缓冲潜能，这导致较慢的Ca2+依赖性的CRAC失活。
实施例2：crt-/-T细胞中增加的ATP生成
线粒体Ca2+摄入的另一个重要结果是刺激提高的ATP合成的线粒体代谢活动(Jouaville et al.，Proc Natl Acad Sci USA 96：13807-13812(1999)；Hajnoczky et al.，Cell 82：415-424(1995))。因而通过crt-/-CD4+T细胞的抗原激活诱导的CCE可能和较高的(和crt+/+细胞相比)ATP产量有关。实际上，在刺激离体分离的幼稚的(图3A)和效应子/记忆(未显示)CD4+T细胞后，相对于crt+/+细胞，我们在crt-/-细胞中检测较高的ATP水平。诱导ATP合成的活性源于线粒体的呼吸，因为通过寡霉素处理其被摧毁(图3B)。
作为细胞溶质钙升高结果的ATP生成被认为用于提供细胞活化期间需要的细胞能量。另外，认为ATP对嘌呤型受体的刺激涉及T细胞的有丝分裂刺激(Baricordi et al.，Blood 87：682-690(1996))。ATP或者储存在分泌颗粒或者在细胞溶质中。为了分析T细胞中ATP的亚细胞分布，我们在含4nM奎纳克林的培养基中温育离体纯化的CD4+T细胞30分钟。该荧光化合物高亲和性集合核酸，并用于使含ATP的囊泡可视化(Belai and Burnstock，Neuroreport 11：5-8(2000))。如图3D所示，奎纳克林染色显示均匀的细胞溶质分布且没有任何关于分泌颗粒的囊泡染色的迹象。为了进一步证实T细胞中ATP的专一性细胞溶质定位，我们用连续蔗糖梯度分级分离T细胞裂解物。用生物发光分析来检测所述梯度级分中ATP的存在(Lyman and De Vincenzo，Analytical Biochemistry 21：435-443(1967))。根据奎纳克林的分布，我们仅在相应于细胞溶质的级分发现可检测的ATP含量，由在Western印记分析中存在Zap 70确定。有趣的是，在分级分离前用CD3抗体刺激T细胞，导致细胞溶质级分中ATP恢复增强(图3E)。这些结果排除了源于活化的T细胞的ATP的调控性分泌释放，并暗示ATP可能通过连接蛋白/pannexin hemichannels或P2X7嘌呤型受体被释放。
已显示细胞外ATP能通过激活膜金属蛋白酶引起L选择素(CD62L)的流出。认为该流出受到P2X受体拮抗剂oATP的抑制(Gu et al.，Blood 92：946-951(1998))。幼稚的CD4 T细胞的体外活化引起CD62L的流出，其在TCR触动后逐渐再次表达。在crt-/-T细胞中，和野生型细胞相比，活化后CD62L的再次表达受损，暗示细胞周围存在较高的ATP浓度。事实上，添加oATP到培养基，在crt-/-和野生型细胞中引起增强的且等同的再次表达效率(图3C)。因此，在crt-/-FLC的外周淋巴器官中CD62L阴性细胞显著增加(Porcellini et al。，J Exp Med 203：461-471(2006))。
实施例3：crt-/-T细胞中通过P2X受体的自分泌活化延长MAPK活化
ATP已被证明作为共刺激物参与T细胞有丝分裂反应(Baricordi et al.，Blood 87：682-690(1996))。因此，我们假设crt-/-T细胞的高反应性可能源于抗原遭遇时增加的ATP产物和释放，其导致延长的MAP激酶活化和NFAT核转移(Porcellini et al.，J Exp Med 203：461-471(2006))。为了深刻理解T细胞中潜在的自分泌ATP信号转导，我们首先用RT-PCR测定DO11.10T细胞克隆表达的嘌呤型受体的组成。发现P2X1、4和7连同P2Y1、12、13和14共表达(图4A)。当Ca2+存在于细胞外培养基中时，用1mM ATP刺激引起细胞中钙上升52％。当无细胞外Ca2+下使用时，由于IP3介导的Ca2+从ER储存中释放，ATP也引发适度的细胞溶质的钙上升，从而证实存在代谢型P2Y受体(图4B)。用优选的P2X亚型激动剂，我们发现在用P2X1和P2X3特异的激动剂αβMeATP刺激后有18％的细胞被激活，而35％的细胞对P2X激动剂MeSATP有反应，33％的细胞对P2X7特异的激动剂BzATP有反应(图4C)，31％的细胞对2MeSADP(其激活P2Y1、12、13)有反应，36％的细胞对P2Y14激动剂UDP-葡萄糖有反应(图4D)。因此，在培养的DO11.10T细胞克隆中，通过RT-PCR检测的P2受体亚型是有功能的。
考虑到crt-/-T细胞中的较高的活性依赖性ATP合成，我们检测P2受体的自分泌活化是否可能在T细胞高反应性中起作用，通过分析MAPK活化，其在crt-/-T细胞中是延长的。为此，在寡霉素存在下用CD3抗体刺激crt-/-CD4+T细胞16小时，来抑制Ca2+刺激的线粒体的ATP合成，作为非特异的P2受体拮抗剂的PPADS或oATP，优先抑制P2X7受体。在未处理的细胞中检出的延长的MAPK活化被各种药物制剂几乎完全废除(图5B)。然而，相同的处理并不显著影响NFAT1的核定位(未显示)。用寡霉素、PPADS或oATP处理后降低的MAPK活化并不归因于毒性引起的细胞损伤，由于处理细胞的碘化丙锭(PI)染色揭示相对于未处理的相应部分，二者没有差异(未显示)。这些结果暗示活化的共刺激作用在T细胞信号转导中诱导ATP合成和释放。为了进一步证实该假说，我们通过用CD3抗体刺激进行ERK活化。如图5A的第一个图所示，ERK活化峰出现在CD3刺激后1.5小时左右，3.5小时短暂下降并在5.5～7.5小时回到高水平。为了区分TCR依赖性和独立的ERK活化，在CD3活化后30分钟时用酪氨酸激酶抑制剂PP2(其抑制TCR依赖性lck/fyn src-类激酶活性)阻断TCR信号转导。如图5A的第二个图所示，鉴于PP2处理影响的TCR依赖性的ZAP-70的磷酸化，其在稍后的时间点没有显著影响ERK磷酸化，因而暗示ERK活化可独立于TCR信号转导维持。然而，当PP2和PPADS(未显示)或oATP(图5A)联合加入时，观测到ERK磷酸化的显著抑制。因此，我们发现当PP2和ARL67156(外切ATP酶抑制剂，其延长细胞外培养基中ATP的半衰期)联用时，ERK活性增加。这些结果表明P2X受体依赖性的信号转导在维持T细胞活化中的重要作用。
实施例4：IL-2表达和T细胞增殖依赖于细胞外ATP
在T细胞活化后期ERK的磷酸化已被证明对IL-2表达有关键作用(Koike et al.，J Biol Chem 278：15685-15692(2003))。因此我们推测在存在oATP时T细胞刺激可能抑制IL-2表达。事实上，在oATP存在下，用结合平板的CD3和CD28单克隆抗体刺激离体分离的幼稚的(图6B)和效应子/记忆(未显示)CD4+T细胞，和未处理的细胞相比，引起细胞培养液上清中IL-2显著减少。用PPADS处理也观测到类似抑制。根据假设的ATP在MAPK活化中的作用，IL-2表达的oATP和PPADS依赖性抑制被同时添加(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)解救，其中PMA激活蛋白激酶C(PKC)(图6B)。oATP对外周血液T细胞增殖的抑制效应已被报道(Baricordi et al.，Blood 87：682-690(1996))。如图6A所示，用结合平板的CD3和CD28单克隆抗体刺激的幼稚的CD4 T细胞中，oATP几乎完全抑制T细胞增殖，测量为CFSE稀释。该抑制通过以250U/ml添加IL-2解救，并通过添加PMA完全解救。因而我们假设源于活化的T细胞释放的ATP是自分泌环的一部分，其在T细胞生成活化中其必要作用。
NFAT核转移不需要伴随的MAPK活化，这获得于寡霉素处理，提供导致T细胞无反应性的转录程序(Macian et al.，Cell 109：719-731(2002))。尽管有显著的MAPK抑制，但oATP不影响NFAT核转移。然后，我们假设存在oATP时T细胞的活化能诱导T细胞无反应性。根据显示在诱导无反应性后早期有减少的TCR信号转导的现有结果，我们发现在存在oATP下，先前刺激的T细胞的钙成像实验中有减少的反应性。用离子霉素处理细胞也获得类似结果(图6D)(也见Heissmeyer et al.，Nat Immunol 5：255-265(2004))。通过FACS分析测定，oATP的效应不是由于改变的TCR/CD3复合体在细胞表面的翻转(数据未显示)。为了证实在存在oATP下T细胞刺激能上调无反应性相关的基因，我们进行Egr2和Egr3(两个经无反应性诱导特异诱导的转录因子)的实时PCR分析(Safford et al.，Nat Immunol 6：472-480(2005))。图6C显示当添加oATP到培养基，在T细胞活化后早期(2小时)和晚期(16小时)，Egr2和Egr3的转录显著上调。一起添加PMA和oATP来克服MAPK活化的缺乏，能强烈降低Egr2和Egr3的转录。这些结果指示T细胞活化中P2X信号转导的缺乏使MAPK活化钝化并提供无反应性特有的转录程序。
实施例5：oATP在T细胞介导的炎症中的效应
我们研究oATP作为药物制剂来限制T细胞介导的炎症的可能用途。在表达受小鼠胰岛素启动子控制的流感血凝素(HA)(INS-HA)的RAG-2-/-小鼠中，继承性转移HA特异的转基因的TCR 6.5(TCR-HA)CD4细胞，能激起胰岛炎和糖尿病迅速发作。我们从重建后1到10天，通过每日两次静脉内和腹腔内注射PBS(阴性对照)或oATP处理小鼠。在oATP处理的小鼠中血糖到12天都是正常的，而未处理和PBS处理的小鼠表现严重的多糖症(图7A)。在oATP处理的小鼠的胰腺中没有出现相关病理学发现。相反，在PBS处理的动物中检出多病灶的聚结的炎症损伤代替了胰岛(图7B)。继承性转移小鼠的TCR-HA+细胞在脾中显著减少(图7C)，并且仅在oATP处理的动物的胰腺中检出(图7D)。另外，鉴于在PBS处理的小鼠的胰腺中大部分转基因的T细胞被激活并表达CD69，在oATP处理的动物的胰腺中，CD69+细胞是不可检出的(图7D)。用HA 110～120肽脉冲离体培养脾细胞，并且培养液中IL-6、IFN-γ、TNF-α的分析表明，相较于PBS处理的对照组，来自oATP处理的小鼠的培养物的这些细胞因子在每个细胞中均显著降低(图7E)。
为了检测T细胞介导的炎症的非转基因的模型中的oATP，我们在T淋巴细胞减少性的cd3ε-/-小鼠中通过注射幼稚的CD4+T细胞诱导炎性肠病(IBD)。我们使用注射结合包含调节性T细胞(Treg)的CD4+ CD25+细胞的幼稚的CD4+T细胞的cd3ε-/-小鼠作为健康对照。事实上，通过调节性淋巴细胞和免疫抑制细胞因子的有效抑制被证明能调控粘膜免疫和器官完整性。在细胞转移后第15天开始，每日给所述IBD组静脉内注射PBS或oATP。重建5周后肠的宏观分析揭示，在用CD4+细胞继承性转移的小鼠和PBS注射的小鼠中，存在肠壁增厚和未成形的或缺少的粪便。该表型在oATP处理的动物中显著改善；另外，脾和肠系膜淋巴结大小正常(图8A)。oATP处理的小鼠的炎症分值与注射CD4+和Treg细胞的动物无显著差异(图8B)。引人注目的是，oATP处理的小鼠的脾和肠系膜淋巴结中CD4+效应子/记忆亚类(CD44+62L-)和CD69+细胞的细胞结构和表征和健康对照难以区分(图8D、F)。此外oATP显著减少分泌促炎症细胞因子(IL-2、IFN-γ和TNF-α)的细胞的数量。有趣的是，分泌IL-17的细胞(最近证明其协同生产IFN-γ的细胞激起严重的肠炎(Kullberg et al.，J Exp Med 203：2485-2494(2006))数量，类似于注射CD4+和CD25+T细胞的对照小鼠中的数量(图8E)。总之，这些结果强烈支持oATP对P2X受体的抑制能抑制T细胞活化、增殖和效应功能，并在T细胞依赖性的炎症中抑制组织损伤。
实施例6：在T细胞介导的炎症中施用PX10的效应
我们的结果表明T细胞中pannexin hemichannels在ATP释放中的作用。为了进一步检验该假说，我们研究pannexin hemichannels组装的抑制是否类似于oATP抑制T细胞活化。在存在100μM oATP或200μM PX10肽时，用结合平板的抗CD3/28抗体刺激负载CFSE的人类T细胞。4天后，用FACS分析测量其增殖。PX10肽和oATP都强烈抑制T细胞增殖(图9A)。类似的，在存在oATP或PX10肽时刺激小鼠T细胞，通过ELISA检测检出强烈已知的IL-2分泌(图9B)。
最后，我们检测抑制pannexin-介导的ATP释放是否可导致T细胞活化后ATP迅速积累。预先用200μM PX10温育T细胞克隆30分钟。然后用生物素化的抗CD3抗体和strepavidine交联后刺激它们。在指示的时刻收集样品，用去垢剂溶解并冰冻直到它们用于标准的荧光素酶检测来测定细胞ATP含量。如图10所示，PX10引起细胞内ATP迅速上升，因此指示pannexin hemichannels表示一个T细胞中释放ATP到细胞外培养基的重要路径。
实施例7：施用oATP治疗炎性肠病
为了治疗人的炎性肠病，可静脉内施用oATP达到局部浓度为100μM。可一天一次或几次施用oATP长达数周、数月、数年，或只要oATP治疗能对患者提供治疗效应。预期这将改善症状(比如肠壁增厚和未成形或减少的粪便)，并能减少分泌促炎症细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-17)细胞的数量。
实施例8：施用oATP治疗糖尿病
为了治疗人的糖尿病，可通过静脉内和/或腹腔内注射施用oATP达到局部浓度为100μM。可一天一次或几次施用oATP长达数周、数月、数年，或只要oATP治疗能对患者提供治疗效应。预期oATP治疗将帮助使血糖水平正常化。
实施例9：施用oATP抑制抑制排斥
患有糖尿病的患者被植入包含胰岛细胞的装置。所述胰岛优选同种的或同基因型的。结内施用oATP到移植位点附近、邻近或周围的淋巴结，达到局部浓度为100μM。
移植后，每天监测患者的血糖水平。预期血糖水平的调控将通过植入装置和施用oATP而改善。可一天一次或几次施用oATP长达数周、数月、数年，或只要oATP治疗能对患者提供治疗效应。
实施例10：通过oATP分化和扩展Treg细胞
在包含0.5μg/ml抗CD3抗体、并增加100μM oATP和50U/ml IL-2的培养基中共培养分选的幼稚的CD4+ CD25- CD44- CD62L+T细胞(105)和2.5x105耗尽受辐射的(50Gy)脾细胞的T细胞。培养2～6天后，冲洗细胞并在包含50U/ml IL-2的培养基中重悬。培养7～10天后通过流式细胞术检测Treg细胞增殖。在oATP以100μM存在下，刺激幼稚的CD4+T细胞显著增强CD4+CD25高Foxp3+Treg细胞的百分比(图11A)。在抗CD3抗体刺激后第6天，用定量RT-PCR分析Th1(T-bet)、Th17(RORγT)给和Treg(Foxp3)细胞系的主要转录因子，揭示在oATP存在下，存在Foxp3的连续上调，相反，在未治疗的培养物中存在T-bet的连续上调。另外，在以100μM添加oATP到培养基中时，包含天然Treg细胞的分选的CD4+CD25高细胞的刺激在相同条件下诱导具有较高Foxp3表达水平的Treg细胞的扩展(图11B)。
用100μM oATP制疗抑制Th17分化并促进Foxp3表达。通过定量RT-PCR，我们证明在偏向Th17的条件(10ng/ml TGFβ和20ng/mlIL-6；也参见，例如Bettelli et al.，Nature 441：235-238(2006))下用抗CD3抗体刺激的T细胞中，100μM oATP逐渐增加Foxp3的表达而抑制RORγT的表达(图12A)。通过FACS分析，表达Foxp3的CD4+CD25高细胞的绝对数是增加的(图12B)。此外，刺激后分选的CD4+CD25高天然Treg细胞向Th17细胞系的去分化(Koenen et al.，Blood 112(6)：2340-2352(2008)被100μM oATP阻碍(图12C)。
实施例11：通过用oATP治疗Treg细胞有效抑制炎性肠病
在IBD的小鼠模型中，其中不足以控制炎症数量的Treg细胞被继承性转移给动物，继承性转移后14天开始每日用100μl 3mM oATP静脉内施用治疗，在第28天测量发现Treg细胞中增强的Foxp3表达(图13A)。oATP治疗的动物没有显示肠炎的迹象，并且脾和肠系膜淋巴结大小没有增加(图13B)，并在肠系膜淋巴结中表现出效应子/记忆T细胞数量减少(图13C)。oATP施用后，较高的Foxp3表达可能揭示了在该环境下Treg细胞较高的免疫活性，由于肠系膜淋巴结中Treg/EM细胞的比例没有通过oATP治疗显著改变(图13D)。
实施例12：在炎性肠病的鼠类模型中oATP对Treg细胞生殖的效用
我们观察炎性肠病的鼠类模型中新Treg细胞的生成。该模型基于继承性转移分选的幼稚的T细胞(CD4+ CD25- CD44- CD62L+)到Cd3ε-/-动物中，其中没有内在的T细胞区室。转移的T细胞迅速被肠道中的细菌激活，因而如果它们的活化/扩展不被共转移的调控性T细胞控制，将在4周内引起大面积肠炎，
检测Cd3ε-/-小鼠的4个实验组中的Treg生殖(图14)。组(1)(阴性对照)继承性转移2×105幼稚的CD4+T细胞。组(2)继承性转移2×105幼稚的CD4+T细胞和100μl 3mM oATP。组(3)继承性转移2×105幼稚的CD4+T细胞，并在继承性转移16小时候接受100μl 3mM oATP的首次治疗。组(4)继承性转移2×105幼稚的CD4+T细胞和105天然的Treg细胞(阳性对照)。在第2～5天和8～12天组(2)和组(3)每日接受100μl 3mM oATP的静脉内施用，而在第6和第7天没有oATP施用。在第28天检测小鼠。
在最后一次注射oATP的第14天检测动物结肠的炎症(图15A)。另外检测脾和肠系膜淋巴结(LN)(如引流淋巴结)中CD4+亚群的存在。进行FACS检测来鉴定CD4+CD25高Foxp3调节性T细胞(图15B)。效应子记忆T细胞被认为是CD4+CD44+CD62L-或CD4+CD25+CD69+。在该实验模型中，肠系膜淋巴结(而不是脾)中的Treg细胞和效应子记忆T细胞的比例似乎是防止疾病开始的关键(图15C)。此外，当在幼稚的T细胞首次活化期间存在oATP时。从幼稚的T细胞生成Treg是最有效的。
实施例13：使用分化和/或扩展的Treg细胞治疗移植排斥或移植物抗宿主病
移植手术之前，Treg细胞被分化和扩展，如实施例10所报道，用受体细胞同种激活(alloactivation)。然后在手术前或手术期间，在移植位点或附近进行施用之前，检测所产生的Treg细胞产物的细胞活力和无菌性、以及存在的任何污染物。如有必要，随后施用相同剂量的分化和扩展的Treg细胞给受试者，只要所述施用是有利的。
实施例14：通过使用oATP治疗改善NZB/NZW F1小鼠的肾小球性肾炎
全身性红斑狼疮(SLE)或其小鼠模型NZB/NZW F1(Andrews et al.，J.Exp.Med.148：1198-1215(1978))，是一个慢性炎性病，特征描述为伴随稍后血丙种球蛋白过多的多克隆的B细胞激活和免疫复合物沉积引起的器官损伤。由于CD4+T细胞在疾病的开始和传播中起关键作用，我们检测oATP治疗是否可改善病症。对25周龄(当大部分动物表现蛋白尿时)的雌性NZB/NZW F1小鼠静脉内施用PBS或oATP(以100μl 3mM，治疗5天，中断2天)6周。在首次治疗后和oATP施用3周后每隔一段时间测量蛋白尿值。大多数PBS治疗的动物表现逐渐增长的蛋白尿值，而oATP治疗的小鼠中，蛋白尿值仍类似于治疗前水平(图16和图17，上图)。肾的组织病理学评估显示oATP治疗的动物中，肾小球增殖、淋巴单核细胞渗透、免疫复合物沉积显著减少(图17，下图)。此外，oATP施用显著减少脾和淋巴结中的效应子/记忆T细胞的数量(图18，下图)。在源于oATP治疗动物的细胞中，分选的效应子/记忆T细胞的再次刺激引起较低的IL-4和IFNγ分泌水平(图18、16，下图)。
实施例15：oATP在风湿性关节炎的鼠类模型中的效用
DBA/1小鼠，易感于胶原蛋白诱导的关节炎，是风湿性关节炎(RA)的鼠类模型(Stuart et al.，J.Clin.Invest.69：673-683(1982))。通过在尾巴根部皮内注射0.2ml乳剂免疫DBA/1小鼠(第0天)，所述乳剂包含200μg牛的二型胶原蛋白和包含0.2mg结核杆菌的弗氏完全佐剂。该方法通常大约从18～20天开始引起出现影响一个或多个肢体的炎症迹象。
从第18天开始，根据临床评分对所述动物单独划分疾病严重度，具体评分如下：
(a)在前脚和后脚的指头上存在炎症的临床可视的评分
0＝没有病症
0.5＝1～5根指头/脚趾具有炎症迹象
1＝6～10根指头/脚趾具有炎症迹象
1.5＝11～15根指头/脚趾具有炎症迹象
2＝16～20根指头/脚趾具有炎症迹象
(b)在前脚和后脚上出现爪水肿的临床肿胀的评分。用精密的卡尺每日测量前脚和后脚的爪子厚度
前脚
0＝没有病症(爪子厚度达1.29mm)
0.5＝爪子厚度在1.30和1.49mm之间
1＝爪子厚度在1.50和1.89mm之间
2＝爪子厚度在1.90和2.20mm之间
3＝爪子厚度大于2.20mm
后脚
0＝没有病症(爪子厚度达1.99mm)
0.5＝爪子厚度在2.00和2.19mm之间
1＝爪子厚度在2.20和2.59mm之间
2＝爪子厚度在2.60和3.00mm之间
3＝爪子厚度大于3.00mm之间
两个独立的临床评分的总和(指头和爪子的炎症迹象)是总的临床评分。因此每个动物最大的肿胀评分是14。
免疫后当它们临床评分至少为1.5时，治疗小鼠18～20天。使小鼠静脉内接受oATP(100μl 3mM)或对照的PBS，用药方案为治疗5天，中断2天，再治疗5天，从第0天开始，共12天。每天评估oATP治疗和对照组的起始临床评分的平均偏差。第13天处死小鼠。治疗开始5天后，oATP治疗组的临床评分偏差仍始终维持低于对照组的临床评分偏差(图19)。
对源于oATP治疗小鼠和对照小鼠的样品进行二型胶原蛋白ELISA，用抗二型胶原蛋白的小鼠IgG ELISA试剂盒#CIIAB96-M，源于MDBiosciences，Europe，division of Morwell Diagnostics，Zurich，Switzerland。相较于对照组，oATP治疗降级治疗小鼠中胶原蛋白特异的抗体的百分比(图20)。
实施例16：crt-/-小鼠中通过用oATP治疗改善表型
用源于钙网蛋白(crt)-/-和(crt)+/+E13胚胎的胎儿肝脏的造血祖细胞重建重组酶缺陷的Balb/c小鼠(图21)。产生的crt-/-胎儿肝脏嵌合体(FLC)的表型，其类似于移植物抗宿主病(GVHD)(参见，例如，Porcellini et al.，J Exp Med 203：461-471(2006))，在转移后第8、10、12周对其评估，并在第12周和crt+/+FLC的表型比较。相较于crt+/+FLC，所述crt-/-FLC表现逐渐恶化的脱发、睑炎、姿势蜷缩和衰竭综合征(图22)。皮肤的苏木精-伊红染色显示在crt-/-FLC中有严重的真皮粒细胞炎性渗透，和crt+/+FLC相反，其中缺乏炎症细胞(图23)。
使crt+/+和crt-/-FLCs每天接受PBS或6mM oATP(100μL)静脉内治疗两周。用oATP治疗显著改善crt-/-小鼠的睑炎(图24)。此外，以随机的方式进行的皮肤活体组织检查的组织病理学评估显示，在crt-/-FLC中用oATP治疗引起睑炎的组织学改善(包括炎症和表皮增生)(图25)。
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