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本中请要求于2005年6月2日提交的美国临时申请第 60/686,706号的优先权，将其全部内容结合于此供参考。
技术领域
本发明的公开内容广泛涉及用于通过使用预血管化的构建体 (预血管化的构建体，prevascularized construct)来提高基于细胞的 疗法的效力的装置及方法，包括显著延长植入细胞的存活性和功能 的装置及免疫隔离装置。
背景技术
糖尿病是一类特征为由胰岛素产生、胰岛素作用或其二者同时 缺陷而引起的高血糖水平的疾病。目前，估计在美国约有2080万 人，或约7％的美国人患有糖尿病，并且该病的发病率正在增大。
糖尿病的主要类型包括1型糖尿病(或I型糖尿病)、2型糖尿 病(或II型糖尿病)、妊娠糖尿病和前驱糖尿病。由特定遗传条件、 外科手术、药物、营养不良、感染和其它疾病还可引起其它类型的 糖尿病。这些“其它”类型的糖尿病约占该疾病所有诊断病例的1-5 ％。
当人体免疫系统破坏产生胰岛素的胰脏β细胞时就引起1型糖 尿病，也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)或幼年发病型糖尿病。 1型糖尿病约占所有诊断病例的5-10％。由胰岛素耐受性连同相关 胰岛素缺陷产生2型糖尿病，也称为非胰岛素依赖性糖尿病 (NIDDM)或成年发病型糖尿病。2型糖尿病代表所有诊断病例的 约90％。其主要影响45岁或更大年龄的人并且与肥胖症和久坐的 生活方式相关。
已经被诊断患有1型或2型糖尿病的病人具有发展成其它严重 并发症的明显增大的危险，这些并发症包括心血管疾病、高血压、 中风、肢体截断、视网膜病变(retinoplasty)、神经病变、肾病、牙 周病、妊娠期并发症和包括糖尿病酮症酸中毒和高渗性昏迷的其它 并发症。
妊娠糖尿病影响所有妊娠妇女的4％并且由一种葡萄糖耐受不 良引起。患有妊娠糖尿病的妇女在随后的5-10年内具有20-50％的 机会发展成该疾病的另外的类型。前驱糖尿病的特征是血糖水平高 于正常但还不足够高至诊断成2型糖尿病。患有前驱糖尿病的人具 有空腹葡萄糖受损或葡萄糖耐量降低或二者兼有。估计4100万的 美国人承受前驱糖尿病状态的痛苦，并且因此他们处于发展成2型 糖尿病、心脏病和中风的增大的危险中。
患有1型糖尿病的病人为了存活必须通过注射或泵递送的胰岛 素。在其早期阶段，患有2型糖尿病的某些人可通过增加胰脏胰岛 素或作用于肝脏、肌肉或肠的药物组合物加上饮食及锻炼的生活方 式的改变的组合来控制该疾病。然而，尽管做了这些努力，所有2 型糖尿病病人的40％最终仍需要注射胰岛素。因此，对于1型和2 型糖尿病两者最有前途的治疗方法可能是通过胰岛β移植(beta islet transplantation)而用完整的功能性β细胞代替受损的胰腺β细胞。
通过胰岛移植的β细胞替代疗法已经达到临床试验阶段。然而， 仍然存在与该疗法相关的主要限制-即由于缺少支持细胞存活的 血液供应而造成β细胞存活能力(存活性)和功能的丧失。尽管胰 脏的全器官同种异体移植具有每年大于80％的预期移植存活率，但 是严重的术后并发症的危险以及慢性免疫抑制的危险限制了该方 法。β细胞移植提供了优于全器官移植的若干优点，包括从不适合 全器官移植的器官中分离并保存胰岛的能力、降低的发病率及死亡 率，以及最后是免疫隔离β细胞并且避免了利用免疫抑制性药物的 机会。β细胞移植的临床应用的显著障碍是缺少用来维持移植细胞 存活，由此维持其功能的宿主来源(host-derived)的血液供应(De Vos P.et al. Efficacy of a prevascularized expanded polytetrafluoroethylene solid support system as a transplantation site for pancreatic islets.Transplantation 63：824-830，1997；Risbud M.V.and Bhonde R.R.Islet immunoisolation：experience with biopolymers.J Biomater Sci Polym Ed 12：1243-1252，2001；Vajkoczy P.et al. Angiogenesis and vascularization of murine pancreatic islet isografts. Transplantation 60：123-127，1995)。在生物材料植入物和植入物周 围愈合反应的领域中，无血管的纤维囊的形成提供了血管停滞 (angistasis)、血管发生和血管退化(angioregresssion)的元件 (element)的最恰当实施例(Auerbach R.et al.Angiogenesis assays： a critical overview.Clin Chem 49：32-40，2003；Djonov V.et al. Vascular remodeling by intussusceptive angiogenesis.Cell Tissue Res 2003；Folkman J.Anti-angiogenesis：new concept for therapy of solid tumors.Am Surg 175：409-416，1972；Folkman J.Tumor angiogenesis. Adv Cancer Res 19：331-358，1974；Hoying J.B.et al.Heterogeneity in Angiogenesis.In：Genetics of Angiogenesis，edited by Hoying J.B. BIOS Scientific Publishers Ltd.，2003，p.191-203；Ingber D.E. Mechanical signaling and the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology.Circ Res 91：877-887； 2002；Kale S.et al.Microarray analysis of in vitro pericyte differentiation reveals an angiogenic program of gene expression. FASEB J 19：270-271；2005；Pierce S.and Skalak T.C.Microvascular remodeling：a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis.Microcirculation 10：99-111，2003；Rifkin D.B.et al. The involvement of proteases and protease inhibitors in neovascularization.Acta Biol Med Ger 40：1259-1263，1981；Wahlberg E.Angiogenesis and arteriogenesis in limb ischemia.J.Vase Surg 38： 198-203，2003)。考虑到与现有细胞替代技术相关的问题，存在对于 可通过延长细胞存活能力和功能而显著提高细胞疗法效力的用于 细胞替代疗法中的装置和方法的需要。
本发明的发明人已经建立了新技术来解决这些关键性的问题。 具体地，本发明人已经研发了一种用于形成预血管化的组织改造 (或工程化)的构建体的新的基于细胞的疗法(Shepherd B.R.et al. Rapid perfusion and network remodeling in a microvascular construct after implantation.Arterioscler Thromb Vase Biol 24：898-904，2004)。 在美国专利第7,029,838号和美国专利第7,052,829号中(其全部内 容结合于此)，本发明人以前公开过用于制备预血管化的构建体的 材料及方法，该预血管化的构建体可利用于血管化经改造的组织构 建体或在移植后再血管化受损的或患病的组织或器官。本发明人还 开发了一种可支持广泛性血管化的新一代生物材料(Kidd K.R.et al. Angiogenesis and neovascularization associated with extracellular matrix-modified porous implants.Journal of Biomedical Materials Research 2：366-377，2002；Kidd K.R.et al.Angiogenesis and neovascularization associated with extracellular matrix-modified porous implants.J Biomed Mater Res 59：366-377，2002；Kidd K.R. and Williams S.K.Laminin-5-enriched extracellular matrix accelerates angiogenesis and neovascularization in association with ePTFE.J Biomed Mater Res A 69：294-304，2004)。组合的细胞和材料构造被称 为预血管化的装置或构建体，或预血管化的免疫隔离装置(PVID)， 并且起到在体外显著延长细胞的存活能力和功能的作用，并且具体 地，在受试者体内移提供植的胰岛β细胞的长期功能。这些构建体 代表可从患者自身脂肪诱导(fat-derived)的微血管内皮细胞中构建 的预形成的微循环(系统)，避免了使用免疫移植药物(Williams S.K. Endothelial cell transplantation.Cell Transplant 4：401-410，1995)。根 据以下的公开内容，本发明的其它优点将被公开和/或显而易见。
发明内容
本发明是基于如下发现：预血管化的构建体或装置、和/或预血 管化的免疫隔离装置可用于通过显著延长植入细胞的存活能力和 功能而改进受试者基于细胞的疗法。具体地，本发明的发明人已发 现，利用人造装置或人造免疫隔离装置联合移植微循环使得植入的 细胞可以更长时间起作用，因此增高了它们的治疗功效。此外，这 种改进装置的利用消除了对于免疫抑制性药物的需要及它们伴随 的负面副作用。这个发现在治疗和预防以一种或多种特定生物学活 性剂水平(浓度)不足为特征的疾病和紊乱(disorder)(包括但不 限于糖尿病)中具有广泛的启示。
因此，本发明提供了一种用于将生物学活性剂提供给受试者的 可植入装置，包括一种与生物相容性的、半透性囊接触的微血管构 建体，其中该囊包封有能够产生生物学活性剂的细胞或组织。本发 明涵盖微血管构建体，其中微血管构建体的血管与受试者是同源 的。植入的细胞或组织与受试者可以是异源的或同源的。在一个具 体实施方式中，该植入细胞或组织分泌或产生胰岛素。在一个优选 的具体实施方式中，植入细胞是产生胰岛素的胰岛β细胞。
本发明的囊可由任何可降解的、可生物吸收的或不可降解的、 生物相容性的聚合物构成。在一个优选的具体实施方式中，该囊由 膨胀聚四氟乙烯(可发或发泡聚四氟乙烯，ePTFE)构成。在另一 个优选的具体实施方式中，该囊由聚对苯二甲酸乙二酯(PET)构 成。在本发明的另一个具体实施方式中，该装置是免疫隔离装置， 其中囊由半透性或选择性渗透的材料构成，其中该材料允许至少一 种生物制剂以及包括但不限于氧气和葡萄糖的营养物质通过，并阻 止大的体液免疫分子和免疫细胞通过。
技术人员应该理解，本发明的受试者可以是任何动物，包括两 栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物以及有袋类动物，但优选哺乳动物 (如人类；家养动物，如猫、狗、猴子、小鼠、和大鼠；或经济动 物，如奶牛、马或猪)。此外，本发明的受试者可以为任何年龄， 包括胎儿、胚胎、儿童和成人。在本发明的一个优选具体实施方式 中，受试者是人。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者体内的疾病或紊乱的 方法，该方法包括将一种装置植入受试者体内，其中该装置包括一 种与生物相容性的、半透性囊接触的微血管构建体，该囊包封有能 够产生治疗有效量的生物学活性剂的一种细胞或多种细胞。该微血 管构建体的血管可以是与受试者同源的，并且植入的细胞或组织可 与受试者是异源的或同源的。在本发明的一个具体实施方式中，紊 乱是糖尿病，并且植入的细胞或组织分泌或产生胰岛素。在一个优 选的具体实施方式中，紊乱是1型糖尿病或2型糖尿病，并且植入 的细胞是胰岛素分泌细胞如胰岛β细胞。
在本发明方法中使用的囊可以由任何可降解的、可生物吸收的 或不可降解的、生物相容性的聚合物构成。在一个优选具体实施方 式中，该囊由膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)或聚对苯二甲酸乙二酯 (PET)构成。在本发明的另一具体实施方式中，装置是免疫隔离 装置，其中该囊由半透性或选择性渗透的材料构成，其中该材料允 许至少一种生物制剂以及包括但不限于氧气和葡萄糖的营养物质 通过，并且阻止大的体液免疫分子和免疫细胞通过。
还具体地提供了用于治疗或预防受试者体内的糖尿病的方法， 该方法包括将一种装置植入受试者体内，其中该装置包括一种与生 物相容性的、半透性囊接触的微血管构建体，该囊包封有能够产生 治疗有效量胰岛素的一种细胞或多种细胞。在一个优选的具体实施 方式中，该糖尿病是1型糖尿病或2型糖尿病，并且该胰岛素产生 细胞是胰岛β细胞。
此外，本发明提供了一种用于在受试者体内血管化经改造的组 织的方法，该方法包括：将至少一种预血管化的构建体与经改造的 组织结合，其中该构建体包含从新鲜分离的自体内皮细胞沉淀物 (或细胞提取物，cell pellet)再悬浮(得到)的细胞；然后植入该 经改造的组织，由此在体内血管化该经改造的组织。在一个具体实 施方式中，结合包括将至少一种预血管化的构建体连接到经改造的 组织上。连接可包括缝合、U形钉固定(stapling)、粘结或它们的 组合。该预血管化的构建体可包含来自从血管组织获得的至少一种 内皮细胞沉淀物的细胞。该血管组织可以是皮肤、骨骼肌、心肌、 心耳(artrial appendage of the heart)、肺、肠系膜或脂肪组织。在一 个优选具体实施方式中，血管内皮沉淀物从人获得。
本发明的经改造的组织可选自由心脏组织、肺组织、心肌组织、 横纹肌组织、肝组织、胰组织、软骨、骨、心包(pericardium)、腹 膜、肾、平滑肌、皮肤、粘膜组织、小肠以及大肠组成的组。该经 改造的组织可利用例如注射器、针头(needle)、插管(cannula)、 导管(catheter)、管子(tube)或显微针(microneedle)注射到受试 者体内。
还提供了用于再血管化需要其的受试者的组织或器官的方法， 其中通过将至少一种预血管化的构建体注射到该组织或器官中，所 述预血管化的构建体包含从新鲜分离的、自体内皮细胞沉淀物再悬 浮获得的细胞；并由此在体内再血管化该组织或器官。如上所述， 该血管组织可包括皮肤、骨骼肌、心肌、心耳、肺、肠系膜或脂肪 组织。此外，脂肪组织可包括网膜脂肪、腹膜外脂肪、肾周脂肪、 心包脂肪、皮下脂肪、胸部脂肪或附睾脂肪。在本发明的一个方面 中，脂肪组织是通过吸脂术、腹壁成形术或它们的组合来获得的。
而且，需要进行再血管化(血管再生成revascularization)的器 官可包括但不限于心、肺、心肌、横纹肌、肝、胰、肾、皮肤、脑、 眼睛、膀胱、气管、隔膜、卵巢、输卵管、子宫、小肠或大肠。在 另一具体实施方式中，预血管化的构建体包含至少一种相关细胞 (Relevant cell)，其可以是但不限于神经元、心肌细胞、软骨细胞、 胰腺腺泡细胞、胰岛、骨细胞、肝细胞、肝巨噬细胞、成纤维细胞、 肌细胞、成肌细胞、卫星细胞、脂细胞、脂肪前体细胞、胆上皮细 胞、浦肯野(氏)细胞(Purkinje cell)或P细胞(起搏细胞，pacemaker cell)。在另一具体实施方式中，预血管化的构建体可包含细胞因子、 趋化因子、抗生素、药物、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂或它们的 任何组合。
还提供了用于再血管化受试者的组织或器官的方法，其中通过 用来自从血管组织获得的至少一种内皮细胞沉积物的细胞处理多 孔性生物材料的表面，其中所述细胞被沉积在该材料的表面上并且 被立即植入受试者体内。
在某些具体实施方式中，上述方法可以并入组织构建方法中， 以便在植入前在组织经改造的器官或组织中建立功能性的脉管系 统。在培养物中形成的毛细血管床的表征以及植入后得到的脉管系 统产物(present)表明，培养的血管具有分化成或变成所需类型的 脉管系统以满足特定组织需要的潜力。这就意味着其有可能影响对 这个在实验室中建立的基本“基础”微脉管系统的改变，并赋予该微 血管床新的性质以匹配建立的组织类型。例如，经改造的的心肌将 具有相对高的毛细血管密度，而肝细胞器(肝类器官，liver organoid) 的脉管系统将表现出典型的类似正弦曲线的性质。本文中公开的预 血管化方法具有将血管网络结合在经改造的组织中并且将其加以 改造以与感兴趣的特定组织相匹配的巨大潜力，因此克服了组织工 程学中的巨大困难。
在遭受慢性局部缺血性疾病后果的组织中，如在心肌梗塞或外 周血管疾病后，邻近受影响组织区域的脉管系统向局部缺血区域的 扩张提供了一种这些组织通过其可恢复的机制。预血管化的构建体 的植入可作为受影响区域再血管化(血管再生成)的刺激物或生长 源(nidus)。在这点上，植入物将作为血管生长的核，快速在之前 的无血管或“血管不足(hypovascular)”区域内建立一个新的血管网 络。本发明的发明人已经证实，经改造的血管的存在保持了外围组 织完整性。这些预血管化的构建体的植入不仅提供用于受损组织的 快速再灌注，而且还支持那些组织的重建和修复。通过将干细胞、 祖细胞或相关细胞结合到预血管化的构建体中，提供了对于重建、 修复和/或再生受损组织或器官有用的细胞。在某些具体实施方式 中，提供了用于刺激或诱导至少一种组织或至少一种器官再血管化 的方法。在某些具体实施方式中，该组织或器官可能是局部缺血的 和/或是无血管或血管不足的局部或区域，例如，但不限于，慢性局 部缺血性疾病，如在心肌梗塞、外周血管疾病或脑血管意外(中风) 后。
目前基因治疗策略遭受成功实现将所需基因结合到病人细胞 中及遍布全身的治疗蛋白(由重组基因产生的)中的困难。在基因 递送中使用预血管化的构建体提供了1)一种措施(手段)，其中包 含在组织构建体中的遗传改造的细胞通过其已经易于进入血流(到 血流和来自血流的分子交换最好发生在毛细血管)以及2)培养的 脉管元件(vessel element)自身受到遗传改造的作用并且可以作为 治疗性基因产物的来源。预血管化的构建体提供了解决这个问题的 可行措施(手段)。
在某些具体实施方式中，公开了包括遗传改造细胞的预血管化 的构建体。这样的包括遗传改造细胞的预血管化的构建体在本发明 的血管化和再血管化方法是有用的。
参考以下参照附图的详细描述，将会更加充分理解本发明的设 计和功能、及其优点。
附图说明
通过参考以下更清楚图解说明本发明的原理的附图，可以更好 地理解本发明内容的许多方面。
图1描绘了微血管构建体的再血管化。黑墨示出了移植血管的 开放(性)(不闭合，patency)。
图2示出了利用人造免疫隔离装置(PVID)和移植的微循环(系 统)的杂交(混合)系统。箭头示出了与微血管构建体接触的免疫 隔离装置。
图3示出了在已用血管内皮沉淀物处理过的生物材料周围形成 的微循环(系统)。
图4示出了预血管化免疫隔离装置(PVID)。箭头示出了包封 的细胞、半孔性(semi-porous)生物材料、以及来自与该半孔性生 物材料接触的内皮细胞沉淀物的细胞。
图5示出了一种血管化的构建体(夹层植入物(sandich implant))，其中胰岛细胞(在显微照片上染成绿色)被放置在或“夹 在”病人自身血管细胞(在显微照片上染成红色)之间。
图6示出了一种血管化的构建体(夹层植入物)，其中胰岛细 胞(在显微照片上染成绿色)被放置或“夹在”多孔性生物材料 (ePTFE)之间，并且该胰岛/ePTFE结构被进一步放置或“夹在” 患者自身血管细胞之间。
图7示出了在对照胰脏和在第7、14和28天的夹层植入物中 的胰岛素染色。该照片证明了在所有时间点上都存在可测数量的胰 岛素。另外，在完整以及部分分解的胰岛中可观察到胰岛素产生。
具体实施方式
如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文内容另有明确指 示，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。本文中提及的所 有公开出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容结合于 此供参考。另外，本文使用的各部分标题仅用于组织的目的而不能 被解释为限制所描述的主题。在本申请中引用的所有参考文献明确 地结合于此用于任何目的。
本发明是基于这样的发现：预血管化装置或结构(包括预血管 化免疫隔离)，可通过显著地延长植入细胞的存活能力和功能而改 进基于细胞的疗法在受试者体内的效力(疗效)。重要地，本发明 的构建体或装置的利用消除了对于免疫抑制(性)药物的需要和它 们伴随的负面副作用。这些发现在治疗和预防以一种或多种特定生 物学活性剂水平(浓度)不足为特征的疾病和紊乱(包括但不限于 糖尿病)中具有广泛的启示。
在一个方面，本发明提供了一种用于将生物学活性剂提供给受 试者的可植入装置，包括一种与生物相容性的、半透性囊接触的微 血管构建体，其中该囊包封有能够产生生物学活性剂的细胞或组 织。本发明涵盖微血管构建体，其中微血管构建体的血管与受试者 是同源的。植入的细胞或组织与受试者可以是异源的或同源的。在 一个具体实施方式中，该植入细胞或组织分泌或产生胰岛素。在一 个优选的具体实施方式中，植入细胞是产生胰岛素的胰岛β细胞。
在本发明的上下文中，术语“生物学活性剂”是指能够在受试者 体内施加生物学有益效果的任何物质。因此，生物学活性剂涵盖提 供代谢能力或功能，如将特定的溶质(溶解物)从血流中去除的任 何生物学活性分子、产物或溶质；或生物学活性分子或物质，如以 非限制性实施例的方式的酶、营养因子、激素、神经递质、神经调 节物质或生物学应答调节剂。
本发明的囊可由任何可降解的、可生物吸收的或不可降解的、 生物相容性的聚合物构成。在一个优选的具体实施方式中，该囊包 括膨胀聚四氟乙烯(可发或发泡聚四氟乙烯，ePTFE)。在另一个优 选的具体实施方式中，该囊包括聚对苯二甲酸乙二酯(PET)。在本 发明的另一个具体实施方式中，该装置是免疫隔离装置，其中囊由 半透性或选择性渗透的材料构成，而该材料允许至少一种生物制剂 以及包括但不限于氧气和葡萄糖的营养物质通过，并阻止大的体液 免疫分子和免疫细胞通过。
技术人员应该理解，本发明的受试者可以是任何动物，包括两 栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物以及有袋类动物，但优选哺乳动物 (如人类；家养动物，如猫、狗、猴子、小鼠、和大鼠；或经济动 物，如奶牛、马或猪)。此外，本发明的受试者可以为任何年龄， 包括胎儿、胚胎、儿童和成人。在本发明的一个优选具体实施方式 中，受试者是人。
本发明还提供了用于治疗或预防受试者体内的疾病或紊乱的 方法，该方法包括将一种装置植入受试者体内，其中该装置包括一 种与生物相容性的、半透性囊接触的微血管构建体，该囊包封有能 够产生治疗有效量的生物学活性剂的一种细胞或多种细胞。该微血 管构建体的血管可以与受试者是同源的，并且植入的细胞或组织可 与受试者是异源的或同源的。在本发明的一个具体实施方式中，紊 乱是糖尿病，并且植入的细胞或组织分泌或产生胰岛素。在一个优 选的具体实施方式中，紊乱是1型糖尿病或2型糖尿病，并且植入 的细胞是胰岛素分泌细胞如胰岛β细胞。
还提供了一种用于在受试者体内血管化经改造的组织的方法， 包括将至少一种预血管化的构建体与经改造的组织结合，其中该构 建体包含从新鲜分离的自体内皮细胞沉淀物再悬浮(得到)的细胞； 然后植入该经改造的组织，由此在体内血管化该经改造的组织。例 如，图3示出了在已用血管内皮沉淀物处理过的生物材料周围形成 的微循环(系统)。本发明上下文中的结合(combining)可包括将 至少一种预血管化的构建体连接到经改造的组织上。例如，图5和 图6实处了血管化“夹层”构建体，其中胰岛细胞位于或“夹在” 病人自身血管细胞之间，或者可替换地，“夹在”多孔性生物材料 之间，而该胰岛/生物材料构建体可以被进一步夹在病人自身的血管 细胞之间，。
术语“连接(attaching)”可包括缝合、U形钉固定、粘结、或 本领域技术人员已知的其他方法或者它们的任何组合。该预血管化 的构建体可包含来自从血管组织获得的至少一种内皮细胞沉淀物 的细胞。该血管组织可以是皮肤、骨骼肌、心肌、心耳、肺、肠系 膜或脂肪组织。在一个优选具体实施方式中，血管内皮沉淀物从人 获得。
本发明的经改造的组织可选自由心脏组织、肺组织、心肌组织、 横纹肌组织、肝组织、胰组织、软骨、骨、心包、腹膜、肾、平滑 肌、皮肤、粘膜组织、小肠以及大肠组成的组。该经改造的组织可 利用例如注射器、针头、插管、导管、管子或显微针注射到受试者 体内。
还提供了用于对其有需要的受试者的组织或器官再血管化的 方法，其中通过将至少一种预血管化的构建体注射到该组织或器官 中，所述预血管化的构建体包含从新鲜分离的、自体内皮细胞沉淀 物再悬浮获得的细胞；并由此在体内再血管化该组织或器官。如上 所述，该血管组织可包括皮肤、骨骼肌、心肌、心耳、肺、肠系膜 或脂肪组织。此外，脂肪组织可包括网膜脂肪、腹膜外脂肪、肾周 脂肪、心包脂肪、皮下脂肪、胸部脂肪或附睾脂肪。在本发明的一 个方面中，脂肪组织是通过吸脂术、腹壁成形术或它们的组合来获 得的。
而且，需要进行再血管化的器官可包括但不限于心、肺、心肌、 横纹肌、肝、胰、肾、皮肤、脑、眼睛、膀胱、气管、隔膜、卵巢、 输卵管、子宫、小肠或大肠。在另一具体实施方式中，预血管化的 构建体包含至少一种相关细胞，其可以是但不限于神经元、心肌细 胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、胰岛、骨细胞、肝细胞、肝巨噬细 胞、成纤维细胞、肌细胞、成肌细胞、卫星细胞、脂细胞、脂肪前 体细胞、胆上皮细胞、浦肯野(氏)细胞或P细胞。在另一具体实施 方式中，预血管化的构建体可包含细胞因子、趋化因子、抗生素、 药物、止痛剂、抗炎剂、免疫抑制剂或它们的任何组合。
还提供了用于再血管化受试者的组织或器官的方法，其中通过 用来自从血管组织获得的至少一种内皮细胞沉积物的细胞处理多 孔性生物材料的表面，其中所述细胞被沉积在该材料的表面上并且 被立即植入受试者体内。
术语 “三维培养物(three-dimensional culture)”在本文中以其广 义使用，并且指的是包括生物相容性基质、支架等的组合物。该三 维培养物可以是在25℃的液体、凝胶、半固体或固体。该三维培养 物可以是可生物降解的或不可生物降解的。示例性三维培养物材料 是聚合物和水凝胶，包括胶原、纤维蛋白、壳聚糖、MATRIGE、 聚乙二醇、葡聚糖(包括化学交联的或光交联的葡聚糖)等。在某 些具体实施方式中，三维培养物包括同源组分、自体组分、或同源 且自体组分。在某些具体实施方式中，该三维培养物包括人造(合 成)或半合成的材料。在某些具体实施方式中，三维培养物包括框 架或支撑物，如纤维蛋白衍生的支架。术语“支架(scaffold)”在本 文中也以其广义使用。因此，支架包括大范围的各种各样的三维框 架，例如但不限于筛网、网格、海绵、泡沫等。
如本文使用的，术语“经改造的组织(或经工程化的组织 engineered tissue)”、“经改造的组织构建体(engineered tissue construct)”或“组织经改造的构建体(tissue engineered construct)” 是指这样一种组织或器官，其全部或部分是利用组织工程技术(组 织改造技术)产生的。这些技术的描述可以在其它出处找到， ″Principles of Tissue Engineering，2d ed.″，Lanza，Langer，and Vacanti， eds.，Academic Press，2000(在下文中为″Lanza et al.″)、″Methods of Tissue Engineering″，Atala and Lanza，eds.，Academic Press，2001(在 下文中为″Atala et al.″)、Animal Cell Culture，Masters，ed.，Oxford University Press，2000(在下文中为″Masters″)，特别是第6章、以及 美国专利第4,963,489号和相关的美国专利。
如本文使用的，术语“微血管片段(microvessel fragment)”是 指血管组织的一节段或一片，其包括至少一个动脉、微动脉、毛细 血管、微静脉或静脉的至少一部分或一节段。典型地，微血管包括 被一层或多层周细胞(如平滑肌细胞或外膜细胞)包围的排列在管 中的内皮细胞，并且还可包括胞外基质成分，如基膜蛋白。在某些 具体实施方式中，微血管片段获自血管组织，例如但不限于皮肤、 骨骼肌、心肌、心耳、肺、肠系膜或脂肪组织。在某些具体实施方 式中，脂肪组织微血管片段可获自例如但不限于皮下脂肪、肾周脂 肪、心包脂肪、网膜脂肪、胸部脂肪、附睾脂肪，腹膜外脂肪等。 技术人员应该理解，其它脂肪沉着体(fat deposit)或任何富血管组 织或器官可用作本发明的微血管片段的来源，例如但不限于皮肤、 肌肉、包括骨骼肌或心肌、肺和肠系膜。在某些具体实施方式中， 该微血管片段是通过吸脂术或腹壁成形术收集的脂肪组织中获得 的。通过在收集期间不使用声波探针的吸脂过程收集的脂肪组织尤 其有用。
如在本发明上下文中使用的，术语“内皮细胞沉淀物(或内皮 细胞提取物，endothelial cell pellet)”是指根据技术人员所熟知的任 何细胞沉淀物形成方法制备的大量内皮细胞，如血管内皮细胞。在 某些具体实施方式中，典型地，微血管包括被一层或多层周细胞(如 平滑肌细胞或外膜细胞)包围的布置在管中的内皮细胞，并且还可 包含细胞外基质成分，如基膜蛋白。在某些具体实施方式中，内皮 细胞沉淀物获自血管组织，例如但不限于皮肤、骨骼肌、心肌、心 耳、肺、肠系膜或脂肪组织。在某些具体实施方式中，脂肪组织内 皮细胞沉淀物可获得自例如但不限于皮下脂肪、肾周脂肪、心包脂 肪、网膜脂肪、胸部脂肪、附睾脂肪、腹膜外脂肪等。技术人员应 该理解其它脂肪沉着体或任何富血管的组织或器官可用作本发明 的内皮细胞沉淀物的来源，例如但不限于，皮肤、肌肉、包括骨骼 肌或心肌、肺和肠系膜。在某些具体实施方式中，该内皮细胞沉淀 物是通过吸脂术和腹壁成形术收集的脂肪组织中得到的。通过在收 集期间不使用声波探针的吸脂过程收集的脂肪组织尤其有用。
如本文使用的，术语“血管化(血管形成，vascularize、 vascularizing或vascularization)”是指为器官或组织，特别是经改造 的组织提供一种功能或基本功能的血管网络。功能或基本功能的血 管网络是一种灌注或能够灌注组织或器官以满足组织或器官部分 或全部营养需要、氧气需求和废物排除需要的血管网络。血管组织 是一种富血管元件(如微血管)的天然组织，例如但不限于脂肪组 织。
如本文使用的，术语“再血管化(血管再形成，revascularize、 revascularizing或revascularization)”、“新血管的形成 (neovascularization)”指在具有无血管或血管不足区域(通常由于 疾病、先天性缺陷或损伤造成)的组织或器官上修复现有血管网络 或建立新的功能或基本功能的血管网络。此外，某些化疗剂例如但 不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)的局部施用也可导致形成局部缺血或 无血管区域。这样的无血管或血管不足的组织或器官经常是全部或 部分功能障碍或具有有限的功能，并且可能需要再血管化。再血管 化这样的组织或器官可得到恢复或增强的功能。
如本文使用的，术语“聚合物”以其广义使用，并且用于包括广 泛范围的生物相容性聚合物，例如但不限于均聚物、共聚物、嵌段 聚合物(成块聚合物)、可交联的或交联聚合物、光引发的聚合物、 化学引发的聚合物、可生物降解聚合物、不可生物降解聚合物等。 在其它具体实施方式中，预血管化的构建体包括未被聚合的聚合物 基质，以允许其以液体或半液体状态(例如通过注射)与组织、器 官或经改造的组织结合。在某些具体实施方式中，包括液体基质的 预血管化的构建体可在“体外”聚合或基本上聚合。在某些具体实施 方式中，预血管化的构建体在注射之前被聚合或基本上聚合。这样 的可注射组合物可利用本领域熟知的传统材料和方法进行制备，包 括，但不限于，Knapp et al，Plastic and Reconstr.Surg.60：389 405， 1977；Fagien，Plastic and Reconstr.Surg.105：362 73 and 2526 28， 2000；Klein et al.，J.Dermatol.Surg.Oncol.10：519 22，1984；Klein，J. Amer.Acad.Dermatol.9：224 28，1983；Watson et al，Cutis 31：543 46， 1983；Klein，Dermatol.Clin.19：491 508，2001；Klein，Pedriat.Dent. 21：449 50，1999；Skorman，J.Foot Surg.26：511 5，1987；Burgess， Facial Plast.Surg.8：176 82，1992；Laude et al.，J.Biomech.Eng. 122：231 35，2000；Frey et al.，J.Urol.154：812 15，1995；Rosenblatt et al.，Biomaterials 15：985 95，1994；Griffey et al.，J.Biomed.Mater.Res. 58：10 15，2001；Stenburg et al.，Scfand.J.Urol.Nephrol.33：355 61，1999；Sclafani et al.，Facial Plast.Surg.16：29 34，2000；Spira et al.， Clin.Plast.Surg.20：181 88，1993；Ellis et al.，Facila Plast.Surg.Clin. North Amer.9：40511，2001；Alster et al.，Plastic Reconstr.Surg. 105：2515 28，2000；以及美国专利第3,949,073号和第5,709,854号。
在某些具体实施方式中，聚合或未聚合的基质包括：胶原，包 括缩合(contracted)和未缩合的胶原凝胶；水凝胶，包括例如但不 限于纤维蛋白、藻(朊)酸盐、琼脂糖、明胶、透明质酸酯、聚乙二 醇(PEG)；葡聚糖，包括适合于化学交联、光交联或二者都适合的 葡聚糖；白蛋白、聚丙烯酰胺、聚乙醇酸、聚氯乙烯、聚乙烯醇、 聚(n-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、亲水性 聚氨酯、丙烯酸衍生物；普流罗尼类(pluronics)，如聚环氧丙烷和 聚环氧乙烷共聚物等等。在某些具体实施方式中，纤维蛋白或胶原 对于目标受体(预受试者)是自体同源或异体同源的。技术人员应 该理解，所述基质可包括非可降解材料，例如但不限于膨胀聚四氟 乙烯(ePTFE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、 聚氨酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、硅树脂(硅酮，silicone) 等，或选择性可降解材料，如聚(乳酸-共-乙醇酸，PLGA)、PLA 或PGA。(还参见，Middleton et al.，Biomaterials 21：2335 2346，2000； Middleton et al.，Medical Plastics and Biomaterials，March/April 1998， at pages 30 37；Handbook of Biodegradable Polymers，Domb，Kost， and Domb，eds.，1997，Harwood Academic Publishers，Australia； Rogalla，Minim.Invasive Surg.Nurs.11：67 69，1997；Klein，Facial Plast.Surg.Clin.North Amer.9：205 18，2001；Klein et al.，J.Dermatol. Surg.Oncol.11：337 39，1985；Frey et al，J.Urol.154：812 15，1995； Peters et al.，J.Biomed.Mater.Res.43：422 27，1998；and Kuijpers et al.，J.Biomed.Mater.Res.51：136 45，2000)。
I、预血管化的构建体
术语“预血管化的构建体”或“经改造的微血管网络”是指一种组 合物，其包含在三维培养物中的至少一种微血管片段或来自内皮细 胞沉淀物(通常从富血管的组织中分离出)的细胞，包括但不限于 基质、支架、凝胶或液体。在某些具体实施方式中，预血管化的构 建体包含三维基质和微血管片段。在某些具体实施方式中，基质包 含预形成的框架，例如但不限于纤维蛋白支架。在某些具体实施方 式中，三维培养物包括聚合、基本上聚合或未聚合的基质。
在某些具体实施方式中，预血管化的构建体通过将微血管片段 或从内皮细胞沉淀物中得到的细胞与液体三维培养物(如非聚合的 胶原、琼脂糖、明胶、其它非聚合的聚合物基质等)结合而进行制 备。在其它具体实施方式中，微血管片段或从内皮细胞沉淀物中得 到的细胞是接种、铺在或灌注在固体或半固体三维培养物环境(例 如但不限于骨架、支架、中空纤维过滤器等)上或其中。
预血管化的构建体可分为“培养的微血管构建体”或“新鲜分离 的微血管构建体”。培养的微血管构建体通常在植入之前进行孵育。 例如但不限于在37℃和5％CO2的潮湿培养箱中。通常这种培养的 微血管构建体孵育1小时至30天的时间，但根据需要可孵育更短 或更长的时间。技术人员应该理解，术语“培养(cultured)”可指或 可以不指使用传统的孵育方法，如控温孵育器。可替代地，预血管 化的构建体可包括在使用之前经过短暂或没有孵育的新鲜分离的 微血管构建体。技术人员将理解，新鲜分离的微血管构建体可以但 不必须被孵育。在某些具体实施方式中，新鲜分离的微血管构建体 包括在三维培养物中的微血管片段或从血管内皮沉淀物中得到的 细胞，其在引入微血管后已被“孵育”，例如但不限于以允许该构 建体可以发生聚合。在其它具体实施方式中，新鲜分离的微血管构 建体包括液体三维培养物，如可适合于通过注射植入的(参照，例如， 美国专利第5,709,854号和第6,224,893号)。这样的液体构建体可 以但不必需在合适条件下在体外发生聚合。
技术人员应该理解，包含未聚合液态三维培养物(其后来可聚 合)或凝胶的预血管化的构建体能够呈现出多种形状。因此，在某 些具体实施方式中，聚合的构建体的最终大小和形状(部分地)取 决于该构建体在其中发生聚合的容器(血管)的大小和形状。例如， 但不限于，圆柱体或管状构建体可利用圆锥形管制备；盘状构建体 可以利用多孔板制备；平面构建体可以利用平的表面例如培养皿、 多孔板的相对的盖(背面)或平底盘制备。另外，在某些具体实施 方式中，聚合的预血管化构建体可以被切割或修整成所需的大小或 形状。因此，在应用之前或过程中，预血管化的构建体实际上可以 制成任何大小和形状。
在某些具体实施方式中，预血管化的构建体包括在自体的或完 全自体的三维培养物中的自体微血管片段或从内皮细胞沉淀物中 得到的细胞。在某些具体实施方式中，预血管化的构建体包括在三 维培养物中的微血管片段，该三维培养物包括支架，例如但不限于 纤维蛋白衍生的支架(参见，例如，Nicosia et al.，Lab.Invest.63：115 22，1990)和包括人工的、FDA-认证的人造生物相容性聚合物，例 如但不限于聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯，乙烯类树脂 (vinyl)，如聚氯乙烯、硅树脂(硅酮)、PLGA、PTFE、ePTFE、 聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、尼龙、聚乳酸化合物和聚乙 醇酸交酯的支架。示例性生物相容性聚合物、支架和其它基质材料 (包括它们的制备和利用方案)的讨论可以在其它出处找到，Atala et al，特别是第42 76章；Lanza et al.，特别是第21和22章；以及 Handbook of Biodegradable Polymers，Domb，Kost，and Domb，eds.， 1997，Harwood Academic Publishers，Australia。
在某些具体实施方式中，预血管化的构建体包括与目标人类或 动物接受者是自体同源或异源的微血管片段。在某些具体实施方式 中，该预血管化的构建体还包括至少一种细胞因子、至少一种趋化 因子、至少一种抗生素(如抗菌剂)、至少一种药物、至少一种止 痛剂、至少一种抗炎剂、至少一种免疫抑制剂，或它们的各种组合 物。在某些具体实施方式中，该至少一种细胞因子、至少一种抗生 素、至少一种药物、至少一种止痛剂、至少一种抗炎剂、至少一种 免疫抑制剂、或它们的各种组合物包括控释剂型(controlled-release format)，如本领域普遍已知的那些，例如但不限于Richardson et al.， Nat.Biotechnol.19：1029 34，2001。
示例性的细胞因子包括血管生成素、血管内皮生长因子 (VEGF，包括，但不限于VEGF-165)、白介素、成纤维细胞生长 因子(例如，但不限于FGF-1和FGF-2)、肝细胞生长因子(HGF)、 转化生长因子β(TGF-β)、内皮素(如ET-1、ET-2和ET-3)、胰岛 素样生长因子(IGF-1)、血管生成素(如Ang-1、Ang-2、Ang-3/4)、 血管生成素样蛋白(如ANGPTL1、ANGPTL-2、ANGPTL-3和 ANGPTL-4)、血小板衍生生长因子(PDGF)(包括，但不限于 PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB)、表皮生长因子(EGF)、内皮 细胞生长因子(ECGF)(包括ECGS)、血小板衍生内皮细胞生长因 子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PLGF)等。细胞因子(包括重组 细胞因子)和趋化因子通常可以从多种渠道商购得到，例如，R&D Systems(Minneapolis，Minn.)、Endogen(Woburn，Wash.)和Sigma(St. Louis，Mo.)。技术人员应该理解，对结合到具体预血管化的构建体 中的趋化因子和细胞因子的选择将(部分)取决于待血管化或再血 管化的靶组织或器官。
在某些具体实施方式中，预血管化的构建体还包括至少一种遗 传改造的细胞。在某些具体实施方式中，包含至少一种遗传改造细 胞的预血管化的构建体将会构成地表达或诱导地表达至少一种基 因产物，该基因产物通过由于本领域已知技术诱导的在至少一种遗 传改造的细胞中的遗传变异引起的至少一种遗传改造的细胞所编 码。示例性遗传工程(改造)技术的描述可以在其它出处找到， Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(包括2002年3 月的增刊)；John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1989；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2.sup.nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989； Sambrook and Russell.Molecular Cloning：A Laboratory Manual， 3.sup.rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.，2001；Beaucage et al.，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，John Wiley & Sons，New York，N.Y，2000(包括2002年3 月的增刊)；Short Protocols in Molecular Biology，4.sup.th Ed.，Ausbel， Brent，and Moore，eds.，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1999； Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology，McGraw Hill Professional Publishing，1995；Molecular Biology Protocols(参照 highveld.com网站)以及Protocol Online(protocol-online.net)。用于 遗传修饰本发明的遗传改造细胞的示例性基因产物包括纤溶酶原 活化因子、可溶CD4、因子VIII、因子IX、血管假性血友病因子(von Willebrand Factor)、尿激酶、水蛭素(hirudin)、干扰素(包括α-、 β-、γ-干扰素)、肿瘤坏死因子、白介素、造血生长因子、抗体、葡 糖脑苷脂酶、腺苷脱氨酶、苯丙氨酸羟化酶、人(垂体)生长激素、 胰岛素、促红细胞生成素、VEGF、血管生成素、肝细胞生长因子、 PLGF等。
在某些具体实施方式中，预血管化的构建体进一步包括适当的 基质细胞、干细胞、相关细胞、或它们的组合。如本文使用的，术 语“干细胞”以其广义使用，并且包括传统干细胞、祖细胞、先祖 细胞(preprogenitor cell)、储藏细胞(reserve cell)等。示例性的干 细胞包括胚胎干细胞、成熟干细胞、多(潜)能干细胞、神经干细 胞、肝干细胞、肌肉干细胞、肌肉前体干细胞(muscle precursor stem cell)、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞、 软骨形成干细胞、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、外周神经系 统干细胞等。对这些干细胞(包括分离和培养它们的方法)的描述， 可以在其它出处找到，Embryonic Stem Cells，Methods and Protocols， Turksen，ed.，Humana Press，2002；Weisman et al.，Annu.Rev.Cell. Dev.Biol.17：387 403；Pittinger et al.，Science，284：143 47，1999； Animal Cell Culture，Masters，ed.，Oxford University Press，2000； Jackson et al.，PNAS 96(Shepherd BR et al.Rapid perfusion and network remodeling in a microvascular construct after implantation. Arterioscler Thromb Vase Biol 24：898-904，2004)：14482 86，1999； Zuk et al.，Tissue Engineering，7：211 228，2001(″Zuk et al.″)；Atala et al.，特别是第33 41章；和美国专利第5,559,022、5,672,346和 5,827,735号。对这些基质细胞(包括分离它们的方法)的描述， 可以在其它出处找到，Prockop，Science，276：71 74，1997；Theise et al.， Hepatology，31：235 40，2000；Current Protocols in Cell Biology， Bonifacino et al.，eds.，John Wiley & Sons，2000(包括2002年3月的 更新)；和美国专利第4,963,489号。技术人员应该理解，选择用于 包含在预血管化的构建体中的干细胞和/或基质细胞通常是适合于 该构建体计划的用途。
如本文使用的，术语“相关细胞”指基于构建体计划的用途，适 合于结合到预血管化的构建体中的细胞。例如，适合于受损肝脏的 修复、重建、或再生(repopulating)的相关细胞可包括但不限于肝 细胞、胆上皮细胞、肝巨噬细胞(Kupffer cell)、成纤维细胞等。用 于结合到预血管化的构建体中的示例性相关细胞包括神经元、心肌 细胞、肌细胞(myocyte)、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、胰岛、骨细 胞、肝细胞、肝巨噬细胞、成纤维细胞、肌细胞、成肌细胞、卫星 细胞(satellite cell)、内皮细胞、脂细胞、脂肪前体细胞、胆上皮细 胞等。这些类型的细胞可通过本领域熟知的传统技术分离和培养。 示例性的技术可以在其它出处找到，Atala et al.，特别是第9 32章； Freshney，Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques，4th ed.，Wiley Liss，John Wiley & Sons，2000；Basic Cell Culture：A Practical Approach，Davis，ed.，Oxford University Press，2002；Animal Cell Culture：A Practical Approach，Masters，ed.，2000；以及美国专利 第5,516,681和5,559,022号。
技术人员应该理解，这样的基质细胞、干细胞和/或相关细胞在 制备过程中或制备之后可结合到预血管化的构建体中。例如，但不 限于将微血管片段、干细胞、相关细胞，和/或基质细胞与液体三维 培养物，如胶原、纤维蛋白等结合，或可以实现将干细胞、相关细 胞和/或基质细胞接种或铺在预血管化的构建体中或上。用于结合到 预血管化的构建体中的合适干细胞、基质细胞和相关细胞的示例性 组合包括：在用于再血管化受损胰脏的预血管化的构建体中的胰岛 细胞和/或胰腺腺泡细胞；在用于再血管化受损肝脏的预血管化的构 建体上的肝细胞、肝祖细胞、肝巨噬细胞、内皮细胞、内胚层干细 胞、肝成纤维细胞、和/或肝储藏细胞。例如，但不限于，用于血管 化、修复和重建受损或患病肝脏的预血管结构的合适的干细胞或基 质细胞可包括肝储藏细胞、肝祖细胞，例如但不限于肝成纤维细胞、 胚胎干细胞、肝干细胞；用于再血管化受损或局部缺血的心脏的心 肌细胞、浦肯野(氏)细胞、P细胞(起搏细胞)、成肌细胞、基质干细 胞、卫星细胞、和/或骨髓干细胞(参见，例如，Atkins et al.，J.of Heart and Lung Transplantation，December 1999，at pages 1173 80；Tomita et al.，Cardiovascular Research Institute，American Heart Association， 1999，at pages 92 101；Sakai et al.，Cardiovascular Research Institute， American Heart Association，1999，at pages 108 14)等。
II.用于血管化经改造的组织和器官的方法
在某些具体实施方式中，提供了用于血管化经改造的组织的方 法，包括将至少一种预血管化的构建体与经改造的组织结合以产生 血管化的改造组织。在某些具体实施方式中，用于血管化经改造的 组织的预血管化的构建体还包括至少一种基质细胞、干细胞、相关 细胞或遗传改造细胞。在某些具体实施方式中，用于血管化经改造 的组织的预血管化的构建体包括至少一种细胞因子、趋化因子、抗 生素、药物、止痛剂、抗炎剂等。用于制备经改造的组织的方法是 本领域所熟知的。这种技术的描述可以在其它出处找到，Atala et al.； Lanza et al.；Masters；以及在美国专利4,963,489、5,266,480、 5,510,254、5,512,475、5,516,680、5,516,681、5,518,915、5,541,107、 5,578,485、5,624,840、5,763,267、5,785,964、5,792,603、5,842,477、 5,858,721、5,863,531、5,902,741、5,962,325、6,022,743、6,060,306、 6,121,042和6,218,182中。
根据用于血管化经改造的组织的某些方法，术语“结合”包括将 至少一种预血管化的构建体放置或植入在经改造的组织的任何表 面上、之中、层之间、或相邻。例如，图6和图7描述了血管化“夹 层”构建体，其中胰岛细胞位于或“夹在”病人自身血管细胞之间，或 可替代地，“夹在”多孔性生物材料之间，该胰岛/生物材料构建体可 进一步夹在病人自身的血管细胞之间。在某些具体实施方式中，结 合包括用预血管化的构建体涂覆经改造的组织。例如，但不限于， 将经改造的组织浸入液体预血管化的构建体中或者将液体预血管 化的构建体倾倒或喷射在经改造的组织上。在某些具体实施方式 中，涂覆在经改造的组织上的这种液体预血管化的构建体发生聚 合。在某些具体实施方式中，这种涂覆的经改造的组织在植入受试 的动物或人之前进行孵育。在某些具体实施方式中，预血管化构建 体通过注射与经改造的组织结合。
如本文使用的，术语“注射(injecting或injection)”或其变体 指通常通过管子或者包含孔或外部开口的结构射出或挤出物质的 任何方式。这样的管子或结构可以是柔性的、刚性的、或可包含至 少一个柔性部分和至少一个刚性部分。示例性的注射工具包括带有 或不带有针头的注射器、插管、导管、软管等。预血管化的构建体 的递送还可通过使用可穿过组织的装置(如显微针)完成。与传统 利用标准规格的皮下注射针进行的注射相反，显微针(通常定义为 曲率半径约1μm)或显微针阵列(microneedle arrays)通过产生极 微小的洞而透过皮肤或内皮细胞层。这些洞有效地作为材料供给的 管道并且可增强预血管化的构建体与血管、组织或器官的连接或递 送。因此，技术人员应该理解，包括孔或外部开口(通过其至少一 种预血管化的构建体可以被挤出到组织或器官上或中)的任何结 构，或可透过组织或器官(包括经改造的组织)的表面的任何结构 都属于本发明的计划范围。在某些具体实施方式中，这种注射构建 体在体外聚合，然后注射。在某些具体实施方式中，这种注射的预 血管化的构建体包括至少一种培养的微血管构建体、至少一种新鲜 分离的微血管构建体、或它们二者。
在某些具体实施方式中，至少一种预血管化的构建体与经改造 的组织的结合包括利用本领域已知的技术将至少一种预血管化的 构建体连接至至少一种经改造的组织。示例性的连接方式包括缝 合、U形钉固定，例如，用外科U形钉、胶或胶粘剂，如外科胶、 生物化学相互作用如与细胞外基质、光活化胶、纤维蛋白胶、基于 丙烯酸酯的胶粘剂等。
在某些具体实施方式中，结合包括将至少一种预血管化的构建 体放置在经改造的组织的层之间，以使至少一种预血管化的构建体 的至少一个表面邻近或接触至少一种经改造的组织的至少一个表 面。在某些具体实施方式中，结合包括在经改造的组织中嵌入或植 入至少一种预血管化的构建体，例如，但不限于，在设计的袋、孔、 缝隙等中。在某些具体实施方式中，该预血管化的构建体被嵌入经 改造的组织的切口中。在某些具体实施方式中，结合包括将至少一 种预血管化的构建体缠绕在至少一种经改造的组织的周围或内部， 以使该预血管化的构建体包围或基本包围该经改造的组织，或被该 经改造的组织包围或基本包围。在某些具体实施方式中，结合包括 在组织改造过程中将至少一种预血管化的构建体形成或合并到经 改造的组织中。在某些具体实施方式中，结合包括例如在生物反应 器里的组织改造过程中，在正在生长的经改造的组织的上面或里面 培养至少一种预血管化的构建体。在某些具体实施方式中，在组织 改造过程中，至少一种预血管化的构建体被邻近的组织或器官包围 或基本包围。
在某些具体实施方式中，在体内植入受体动物或人之前，结合 的经改造的组织和至少一种预血管化的构建体例如在生物反应器 或潮湿的培养箱中被孵育。在某些具体实施方式中，结合包括将短 暂或没有额外孵育的、包括至少一种预血管化的构建体的至少一种 经改造的组织直接植入受体动物或人中。
在某些具体实施方式中，植入的预血管化的构建体充当用于血 管化经改造的组织的核心位点。在某些具体实施方式中，来自预血 管化的构建体的适当基质细胞、干细胞，和/或相关细胞将支持经改 造的组织在受体动物或人中的一体化(整合，integration)。包括遗 传改造的细胞的构建体可产生重组产物，其可通过血流全身分布或 输送到局部微环境以诱导修复、伤口愈合等。
III、用于再血管化受损或受伤组织或器官的方法
在某些具体实施方式中，提供了用于再血管化受损或受伤组织 或器官(即，需要再血管化和修复或重建的组织或器官)的方法。 在某些具体实施方式中，用于再血管化组织或器官的预血管化的构 建体还包括至少一种合适的基质细胞、干细胞、相关细胞、或遗传 改造的细胞。在某些具体实施方式中，用于再血管化组织或器官的 预血管化的构建体包括至少一种细胞因子、趋化因子、抗生素、药 物、止痛剂、抗炎剂等。在某些具体实施方式中，预血管化的构建 体一旦植入体内将形成一种功能性血管床并且与周围的功能性血 管系统吻合并灌注或能够灌注受损组织或器官。
根据用于再血管化组织或器官的某些方法，至少一种预血管化 的构建体与该组织或器官结合并且产生一种再血管化的组织或器 官。根据用于再血管化组织或器官的某些方法，术语“结合”包括将 至少一种预血管化的构建体放置或植入到组织或器官的任一表面 上面、里面、层之间、或相邻。在某些具体实施方式中，通过注射 将预血管化的构建体植入到组织或器官中。在某些具体实施方式 中，这种注射的构建体将在体外聚合，然后注射。在某些具体实施 方式中，这种注射的预血管化的构建体包含至少一种培养的微血管 构建体、至少一种新鲜分离的微血管构建体或它们二者。在某些具 体实施方式中，结合包括利用如上所述的本领域熟知技术将至少一 种预血管化的构建体连接到需要再血管化的至少一种组织或器官。
技术人员应该理解，某些组织和器官被一层纤维组织、结缔组 织、脂肪组织等覆盖或包含一层纤维组织、结缔组织、脂肪组织等， 并且在不去除该层的情况下可以再血管化在下面的(underlying)组 织或器官。这样的层可以是天然的(如浆膜层、粘膜、纤维囊等)， 可由纤维化、坏死或局部缺血(由于疾病、缺陷、受伤或生物化学 缺陷)造成。通常，预血管化的构建体的微血管片段可穿透这样的 层并且与在下面的组织或器官的脉管系统吻合以再血管化该组织 或器官。因此，预血管化的构建体与需要再血管化的组织或器官的 结合包括将该预血管化的构建体放置在这样的层的上面或里面。例 如，但不限于，将预血管化的构建体放置在脑膜上以再血管化脑组 织；放置在心外膜以再血管化心肌；放置在腹膜和/或浆膜上以再血 管化大肠的部分；放置在结膜和/或结膜下以再血管化眼睛；放置在 气管表面以再血管化气管；放置在口腔粘膜(bucchal mucosa)以 再血管化嘴；放置在胸膜和/或浆膜表面以再血管化肺；放置在胸膜 和/或腹膜表面以再血管化隔膜；放置在皮肤以再血管化非愈合性皮 肤溃疡、如糖尿病溃疡；放置在心包表面以再血管化心包等。
在某些具体实施方式中，当与动物或人类内的组织或器官结合 时，预血管化的构建体将形成功能化的血管床并且与周围的功能性 血管系统吻合，并灌注受损的组织或器官。在某些具体实施方式中， 植入的预血管化的构建体作为再血管化受损组织或器官的核心位 点。在某些具体实施方式中，预血管化的构建体上的合适的干细胞、 基质细胞、和/或相关细胞将支持受损组织或器官重建和修复。包含 遗传改造的细胞的构建体可产生重组产物，其可通过血流而全身分 布或释放到局部微环境以诱导修复、伤口愈合等。
通过参考多个实施例可以更好地理解以上已经描述的本发明。 下面的实施例只是出于说明的目的，并且在任何情况下均不应该解 释为限制本发明的范围。
实施例
概要
避免使用免疫抑制性药物的用于胰岛细胞移植的医学技术存 在一个重要目标是医治糖尿病高血糖症。这些实验评价了利用形成 的微循环构建的新的免疫隔离装置。考察了利用这种预血管化的构 建体保持在体内胰岛细胞存活的能力。被考察的细胞移植方法与人 操作室具有相容性并评价了这些临床前研究向用于糖尿病治疗的 人临床环境(条件)转移的可行性。
PVID的评价
由于恢复和建立一个稳定脉管系统需要时间，所以任何装置或 组织的植入都处于早期失败的危险中。本发明的发明人已开发了用 于预形成适应性微血管系统的方法，该微血管系统在植入后能够快 速形成为成熟有效的灌注循环。利用这个系统，对用于与胰岛移植 一起使用的装置预血管化，以便证明预血管化免疫隔离构建体在移 植后在该构建体周围加速稳定微循环的形成。
还评估预血管化的构建体在移植后支持长期胰岛功能的能力。 具体地，为了证明免疫隔离装置周围的微循环的加速形成将会扩展 (延长)胰岛细胞的功能，评估了PVID将营养成分提供到置于免 疫隔离装置中的胰岛的能力。
免疫隔离装置和微循环
同种异体胰岛细胞移植中的迫切需要是将这些同种异体移植 材料与免疫系统识别和随后的破坏分离开。对免疫反应问题提供可 能性的解决方案的各种免疫隔离装置处于开发之中(Berney T.and Ricordi C.Immunoisolation of cells and tissues for transplantation.Cell Transplantation 8：577-579，1999)。具有选择渗透性的人造植入物在 关于免疫隔离装置的进展中已经被报道了。Brauker报道了可以制 备特别设计的聚合物，其刺激血管原性反应，使得聚合物作为免疫 隔离装置具有商业价值(Brauker J.H.et al.Neovascularization of synthetic membranes directed by membrane microarchitecture.Journal of Biomedical Materials Research 29：1517-1524，1995)。因为这些装 置必须对内部组织提供养分、去除合成的细胞产物并且保持对细胞 免疫反应的屏障，所以在这些装置的外表面上形成和保持功能的微 循环的能力对于它们最终的生物学成功是最重要的。本发明的发明 人将直接解决目前利用植入的胰岛来解决高血糖症方法中的显著 缺点。本发明的发明人的方法包括整合现有的和新的技术以独特地 适于胰岛移植和构建具有长期存活能力和功能的胰岛移植物。需要 解决的最重要问题是与这些植入的免疫隔离装置相关的稳定微循 环的形成。
微血管的自我平衡(内环境稳定，homeostasis)
在多数成熟组织中，微循环已经达到平衡或自我平衡，其中在 密度上新的血管既不增加也不减少。毛细血管内皮表现出特异于被 灌注组织的功能的形态学特性。例如，灌注胰腺胰岛的毛细血管在 它们的膜上表现出薄膜开口(homeostasis)，肝内皮表现出细胞之间 的空隙异允许快速细胞交换，以及脑内皮表现出细胞之间的紧密连 接异建立血脑屏障。这个在血管生长中的自我平衡是通过各种细胞 类型和代谢因子调控的。该平衡可被改变而导致：新血管形成的刺 激(一种通常称为血管形成的过程)和血管变性或退化的刺激。伤 口愈合是一个实例，其中微血管自平衡或“血管停滞(血管静止， angiostasis)”被破坏，经常导致血管形成的时期。伤口愈合的短暂 事件经常包括“血管退化(angioregression)”的时期，导致形成例如 主要包含有限数量的毛细血管的肉芽组织。
在生物材料植入物和植入物周围愈合反应的领域中，血管纤维 囊的形成提供了血管停滞、血管形成和血管退化的要件的最合适实 例(Auerbach R.et al.Angiogenesis assays：a critical overview.Clin Chem 49：32-40，2003；Djonov V. et al.Vascular remodeling by intussusceptive angiogenesis.Cell Tissue Res 2003；Folkman J. Anti-angiogenesis：new concept for therapy of solid tumors.Am Surg 175：409-416，1972；Folkman J.Tumor angiogenesis.Adv Cancer Res 19：331-358，1974；Hoying J.B.et al.Heterogeneity in Angiogenesis.In： Genetics of Angiogenesis，edited by Hoying J.B.BIOS Scientific Publishers Ltd.，2003，p.191-203；Ingber D.E.Mechanical signaling and the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology.Circ Res 91：877-887；2002；Kale S.et al. Microarray analysis of in vitro pericyte differentiation reveals an angiogenic program of gene expression.FASEB J 19：270-271；2005； Pierce S. and Skalak T.C. Microvascular remodeling：a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis.Microcirculation 10： 99-111，2003；Rifkin D.B.et al.The involvement of proteases and protease inhibitors in neovascularization.Acta Biol Med Ger 40： 1259-1263，1981；Wahlberg E.Angiogenesis and arteriogenesis in limb ischemia.J Vasc Surg 38：198-203，2003)。这个自我平衡将向着与植 入的材料和装置相关的成熟完全功能化的微循环形成而改变。
在形成微循环过程(血管生成(vasculogenesis))中和从现有 脉管系统形成微循环(血管发生)的机制已经由许多科研人员认真 进行了评价(Ashley RA et al.Erythropoietin stimulates vasculogenesis in neonatal rat mesenteric microvascular endothelial cells.Pediatr Res 51：472-478，2002；Flamme I et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF)and VEGF receptor 2(flk-1)are expressed during vasculogenesis and vascular differentiation in the quail embryo.Dev Biol 169：699-712，1995；Risau W and Flamme I.Vasculogenesis. [Review][122 refs].Annual Review of Cell & Developmental Biology 11：73-91，1995；Shalaby F.et al.Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice.Nature 376：62-66，1995)。除 了评价血管形成过程的研究之外，还有病理状况如癌症和缺血性心 脏病被认真地评价，以确定对血管形成过程的控制是否可用于改变 病理进展。在这些研究过程中，控制血管发生的多种常用途径已经 被阐明并且通常可根据生长因子和它们的受体(如VEGF、FGF)、 金属蛋白酶(methalloproteinase)以及胞外基质蛋白进行分类。与 基于免疫隔离装置的ePTFE相关的微脉管系统的形成被加速，以便 提供流入移植胰岛的普通营养物质的快速恢复。
用于组织灌注的预血管化的构建体
微血管构建体基于由分离的、完好无损的微血管元件(如微动 脉、毛细血管和微静脉)(在三维胶原凝胶中悬浮和培养)构成的 3-D血管发生系统。这些血管元件以在类似体内的方式生长，最终 形成填满胶原凝胶空间的微血管的复杂聚集物。形状保持为专有管 状结构的新微血管(新生血管)，保留相关的壁细胞和并且改变周 围的胶原基质。在这个培养系统中的血管片段对于共培养(联合培 养)细胞和外源性生长因子的存在是响应性的。重要的是，该系统 中植入的微血管片段通过首先加工的各种血管“新芽”实施了与体内 血管发生相同的阶段。本发明的体外系统中的血管发生开始于建立 培养的第4天并且是不断变化的，新的萌芽一天之内形成并且退化。 通过培养11天，片段已经生长形成了延长的、简单的、具有的平 均直径为24.8±6.8微米(n＝39)的新血管的聚集物。这些新血管具 有专有内腔和低密度的α-肌动蛋白阳性、血管周围细胞。不同于培 养的内皮细胞，微血管构建体的血管片段从现有血管形成新的血管 (血管生成的标志定义)。
本发明的发明人评价了这种微血管构建体与现有脉管系统的 相互作用以及通过将这种构建体移植到免疫受损(SCID)小鼠后形 成功能性血管床的能力。构建体被放置在皮肤下面并且直接与背部 肌肉组织接触。通过移植物的整体检查，本发明的发明人观察到浅 表血液填充的血管，其与微血管构建体连接但不与血管、胶原凝胶 对照连接。取出的微血管构建体的组织学显示，在该构建体血管网 络中的血管和异源血管中存在血液。本发明的发明人观察到在成熟 的功能化血管床中通常可见的所有血管类型，包括小动脉、微动脉、 毛细血管、微静脉和小静脉。通过墨水灌注进行的吻合的分析(图 1)显示，从植入后的那天起构建体内的血管与宿主脉管系统相连， (由此能够载送血液)。具有灌注能力的血管的数量(专有的和与 宿主脉管系统相连的)随后两天迅速增长，与在全层皮片移植术(其 中移植微循环完好无损)中观察到的非常相似。
PVID构建和评价
本发明的发明人已经确立了利用上述的ePTFE免疫隔离装置 和分离脂肪来源的微血管内皮细胞系统来构建PVID的可行性。图 2和图4示出了利用合成的不可降解ePTFE膜和微血管构建体以提 供成熟微循环加速形成的混合系统。
研究设计和方法
本发明的发明人已经评价了一种预血管化的构建体，其由采用 不可降解的免疫隔离装置和由自体微血管构成的微血管构建体的 混合两组分设计所构成。任何装置或组织的植入由于需要恢复和建 立一个稳定脉管系统的时间都会处于早期失败的危险中。预形成在 植入后就能够快速形成成熟有效的灌注循环的适应性微血管系统 的方法已经建立。B-胰岛构建体在植入之前利用这个系统加以预血 管化，以加速血液供应的建立并且保持β胰岛功能。
微血管分离及培养
利用前述的方法的变型，分离大鼠微血管片段(MF)(Hoying J.B.et al.Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels.In Vitro Cell Dev Biol Anim 32： 409-419，1996；Williams SK and Jarrell BE.Cells derived from omental fat tissue and used for seeding vascular prostheses are not endothelial in origin.J Vase Surg 15：457-459，1992；Williams SK et al. Origin of endothelial cells that line expanded polytetraflourethylene vascular grafts sodded with cells from microvascularized fat.J Vase Surg 19：594-604，1994；Williams SK.et al.Liposuction-derived human fat used for vascular graft sodding contains endothelial cells and not mesothelial cells as the major cell type.Journal of Vascular Surgery 19： 916-923，1994)。在无菌条件下，收集的脂肪组织用0.1％BSA-PBS 清洗，用剪刀细细地剪碎，并且在2mg/ml胶原蛋白酶+2mg/ml BSA(基本不含脂肪酸)的PBS中、在37℃下剧烈振荡消化8分钟。 组织碎屑和大血管碎片通过用无菌的、孔大小为500μm的尼龙滤 网过滤该悬浮液而除去。微血管片段通过利用孔大小为30μm的尼 龙滤网过滤剩余的悬浮液而收获，并利用0.1％的BSA-PBS强烈地 冲洗滤网表面而回收。利用的胶原蛋白酶的类型和数量将被预筛 选，以便在保持微血管构建体的同时使片段产量最佳。微血管片段 以(12,000-15,000)MFs/ml悬浮在利用DMEM(1×最终)制备的 和1M NaOH进行pH中和的冰冷3mg/ml大鼠尾部I型胶原(BD BioSciences，Bedford，MA)中。MF/胶原悬浮液接种到48孔板的每 个孔中(0.25ml/孔)并放置在37℃的培养箱中20分钟以聚合该胶 原。
内皮沉淀物的制备
从雄性大鼠中分离出附睾脂肪并利用胶原蛋白酶在37华氏度 下消化。消化脂肪的浆体被离心而形成飘浮的脂肪细胞“团(cake)” 和含有内皮细胞的沉淀物。该沉淀物在缓冲液和溶解胶原的混合物 中再悬浮。接着该悬浮的细胞被放置在一端具有多孔性ePTFE片的 腔室内。该腔室利用已知为BEEM胶囊的塑料装置加以制备。容纳 有缓冲溶液的注射器放置在腔室的相对端上并且腔室的内部空间 通过不断推进的注射器活塞而加压。这使得细胞从血管的沉淀物沉 积到ePTFE的表面上。3天后，对ePTFE样品进行MTT代谢分析。 ePTFE表面快速改变颜色至深紫色，表明存在存活细胞。
细胞包封(封装，encapsulation)系统及植入
在初步研究过程中，细胞包封装置已经利用ePTFE材料加以制 备。这些装置的实施例在图2和图4中示出。利用小鼠模型来评价 装置的功能。小鼠被麻醉并且被(术前)准备用于到皮下组织中的 装置植入。装置被植入在合适的组织位点。皮肤用金属夹封闭。植 入1到4个星期之后，装置的功能是基于细胞的存活能力。这个方 法在这一点上的潜在好处(如观察到的)是同种异体移植物和异种 移植物的供给以替代丧失的细胞功能。例如，在糖尿病、免疫缺陷 性疾病和肝疾病中。
血管的密度和异质性
活体荧光成像和组织学被用于评价血管组织和微血管/材料植 入物周围的异质性。染色组织切片(H&E或免疫染色)的分析提 供了组织中血管元件(要素)的定量测量。利用这个分析，在给定 区域的毛细血管、微动脉和微静脉的数量和相关存在情况被确定。 通过利用大鼠或小鼠特异性标记评价新形成的微循环中细胞的起 源以便区别宿主和供体细胞。
灌注能力
三种分离技术用来评价形成在免疫隔离装置周围的微循环的 功能：墨汁灌注、微血管造影术和微球流量计量(microsphere flow measurement)。墨汁灌注和微血管造影术使得与宿主脉管系统相连 的连续血管片段被识别，该连续血管片段是专有的并且具有运送血 液的能力。利用微球的灌注指数定量地评价在新形成的微循环中的 血液量。
预血管化的构建体在移植后支持长期胰岛功能评价
胰岛分离并注入装置。从大鼠上分离活体胰岛的标准步骤已经 被建立(Calafiore R.et al.Grafts of microencapsulated pancreatic islet cells for the therapy of diabetes mellitus in non-immunosuppressed animals.Biotechnol Appl Biochem 39：156-164，2004；Chaikof EL. Engineering and material considerations in islet cell transplantation. Anna Rev Biomed Eng 1：103-127，1999；De Vos P.et al. Efficacy of a prevascularized expanded polytetrafluoroethylene solid support system as a transplantation site for pancreatic islets.Transplantation 63： 824-830，1997)。这些胰岛在目标1上建立的PVID中被评价。PVID 被制备并植入SCID小鼠的皮下位置。通过皮肤切口将提供通向内 层(内室，internal compartment)的通道的硅胶管外置。管的一端 被热封并且用敷料覆盖以便减少污染。在装置植入的第1、3、7和 14天之后实施将胰岛注射入装置。此时硅胶管的外置端部被分离并 剪切以允许胰岛的注入。新鲜分离的胰岛被缓慢注入装置的内部空 间，该硅胶管被热封并且管被放置在皮肤下。
胰岛功能的评价
在植入SCID小鼠的第3、7、21和60天之后，将含有胰岛的 PVID移出(图7)。在移出时PVID和周围的组织被分为两个部分。 一个部分被处理以组织学评价PVID内的细胞存活能力以及用于胰 岛的胰岛素产生的免疫细胞化学评价。第二个样品经受胰岛素的蛋 白质印迹分析。
这些实验确定了形成预血管化免疫隔离装置的能力，以及随后 在体内模型中测试该装置的功能。如发明人正在利用异种移植物移 植模型(即大鼠细胞进入小鼠)一样，SCID小鼠模型被用于评价 细胞移植。在该技术的人类应用中，患者自身脂肪组织可以作为微 血管片段的来源用于PVID构建，因此免疫抑制不是必需的。
尽管出于清楚的目的已经详细地示出和描述了示例性的具体 实施方式，但是应该明了，对于本领域普通技术人员来说通过阅读 本披露内容，可以在不背离本发明所附权利要求的实际范围下作出 形式或细节的改变、变更或其它更改。例如，虽然已经描述了构建 体的具体尺寸和材料、装置和方法，但是应该理解的是，尺寸或构 成装置的具体材料的改变将不会偏离本发明构思。因此，所有这样 的改变、变更和更改应该视为属于本发明公开内容的范围。