《生血丸在制备预防低剂量电离辐射致细胞损伤药物中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生血丸在制备预防低剂量电离辐射致细胞损伤药物中的应用.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102349978 A (43)申请公布日 2012.02.15 CN 102349978 A *CN102349978A* (21)申请号 201110331317.X (22)申请日 2011.10.27 A61K 36/899(2006.01) A61P 7/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 39/00(2006.01) A61K 35/32(2006.01) A61K 35/50(2006.01) (71)申请人 天津中新药业集团股份有限公司达 仁堂制药厂 地址 300457 天津。
2、市塘沽区开发区第十大街 21 号 (72)发明人 严苏纯 王光普 张晓乐 (74)专利代理机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 代理人 朱红星 (54) 发明名称 生血丸在制备预防低剂量电离辐射致细胞损 伤药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了生血丸在制备预防或修复低剂 量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中的应用 ； 其中 所述的预防或修复骨髓细胞损伤指的是 ： 抑制癌 前细胞的增殖。所述的预防和修复指的是 ： 对低 剂量辐照带来的染色体断裂加以修复。本发明从 血液淋巴细胞、 骨髓微核率的变化 ； 自由基的清 除能力 ； 癌前细胞增殖的抑制等方面， 检验生血 丸抗环境污染致畸的功效， 。
3、为生血丸的临床应用 开辟更广阔的前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 102349981 A1/1 页 2 1. 生血丸在制备预防或修复低剂量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中的应用 ； 其中所 述的预防或修复骨髓细胞损伤指的是 ： 抑制癌前细胞的增殖。 2. 生血丸在制备提前预防低剂量电离辐射致白血病、 多脏器肿瘤发生药物中的应用。 3. 生血丸在制备早期修复低剂量电离辐射致白血病、 多脏器肿瘤发生药物中的应用。 4. 权利要求 1 所述的应用， 其中所述的预防和修复指的是 ： 对低剂量辐照带来的染色 。
4、体断裂加以修复。 权 利 要 求 书 CN 102349978 A CN 102349981 A1/5 页 3 生血丸在制备预防低剂量电离辐射致细胞损伤药物中的应 用 技术领域 0001 本发明属于中药制剂技术领域， 涉及中药的新用途， 更具体的说是生血丸在制备 预防或修复低剂量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中的应用。 背景技术 0002 达仁堂生血丸源于中医研究院广安门医院名老中医谢海洲教授数十年临床之验 方。善于补肾阳和肾精， 精足则血旺。现代研究， 生血丸有保肝利胆、 抗肿瘤、 抗氧化、 镇静、 降血糖等多种作用， 治疗放、 化疗后的全血细胞减少、 再生障碍性贫血有确切疗效。方中有 鹿茸、 。
5、黄柏、 山药、 炒白术、 桑枝、 白扁豆、 稻芽、 紫河车。具有补肾健脾， 填精补髓之功效。主 药鹿茸温肾壮阳、 强筋健骨、 生精益血， 是峻补元阳之要药， 用于治疗精血两亏， 活血又补 血， 具有促进造血之功能 ； 紫河车益气、 养血、 补精， 有强壮作用 ； 白术、 山药为健脾开胃之 品， 于大补之中防滋腻， 有益气生血之作用 ： 黄柏为泻火滋阴、 清解清泻之品， 取其缓解滋补 过峻之作用而有利于体内吸收， 该方组方严谨， 临床应用功效确切。 0003 众所周知， 各种各样的污染威胁着我们赖以生存的环境。例如无处不在的辐 射 - 家用电器电视、 电冰箱、 空调、 微波炉、 吸尘器等 ； 办。
6、公设备 ： 手机、 电脑、 复印机、 电 子仪器、 医疗设备等 ； 家庭装饰 ： 大理石、 复合地板、 墙壁纸、 涂料等 ； 周边环境中的高压线、 变电站、 电视 （广播） 信号发射塔等 ； 自然环境中的太阳黑子等。在辐射源集中的环境中工 作、 学习、 生活的人， 容易失眠多梦、 记忆力减退、 体虚乏力、 免疫力低下等， 其癌细胞的生长 速度比正常人快二十四倍。为临床寻求一种能保护细胞， 修复损伤， 防止 DNA 突变的中成药 是当务之急。前期的实验 （生血丸对骨髓抑制小鼠造血调控的实验研究） 表明生血丸能显著 提高骨髓抑制小鼠外周血血像和骨髓有核细胞计数 ； 提高骨髓抑制小鼠外周血网织红细胞。
7、 的计数 ； 可促进骨髓抑制小鼠骨髓细胞从 G0/G1期进入增殖周期 ； 提高骨髓抑制小鼠体外培 养造血干祖细胞集落的产率 ； 能有效调节骨髓微环境中TPO、 EPO和G-CSF的表达， 从而促进 外周血像的提升。 发明内容 0004 本发明公开了生血丸在制备预防或修复低剂量电离辐射致骨髓细胞损伤药物中 的应用 ； 其中所述的预防或修复骨髓细胞损伤指的是 ： 抑制癌前细胞的增殖。 0005 本发明进一步公开了生血丸在制备提前预防低剂量电离辐射致白血病、 多脏器肿 瘤发生药物中的应用。 0006 本发明进一步还公开了生血丸在制备早期修复低剂量电离辐射致白血病、 多脏器 肿瘤发生药物中的应用。 0。
8、007 本发明所述的预防和修复指的是 ： 对低剂量辐照带来的染色体断裂加以修复。 0008 本发明所述的低剂量电离辐射指的是 ： 自然界存在的天然辐射 ； 家用电器和办公 设备产生的辐射 ； 放射医学中， 应用于诊断和治疗的医用 X 射线、 射线等。根据 UNSCEAR 说 明 书 CN 102349978 A CN 102349981 A2/5 页 4 1988 年报告， 低剂量是指低于 0.2Gy（Gy 是吸收剂量单位） 的剂量。在实际应用中， 一般将 低于 0.5Gy 的剂量称为低剂量。长期接触低剂量辐射， 射线会导致机体造血系统、 神经系 统、 性腺、 视神经、 眼晶体及免疫系统的损伤。
9、,外周血淋巴细胞染色体、 微核尤为敏感,常出 现异常现象。 0009 本发明的实验结果提示生血丸能很好地预防和治疗低剂量辐照带来的染色体断 裂 ； 生血丸能预防性降低和清除羟自由基和超氧阴离子 ； 生血丸能有效产生 ODC， 抑制多胺 的合成， 抑制变异细胞的增殖。 0010 本发明以达仁堂生血丸为实验用药， 从血液淋巴细胞、 骨髓微核率的变化 ； 自由基 的清除能力 ； 癌前细胞增殖的抑制等方面， 检验生血丸抗环境污染致畸的功效， 为生血丸的 临床应用开辟更广阔的前景。 具体实施方式 0011 为了更充分的解释本发明的实施， 下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说 明这些实施实例仅仅是解释。
10、、 而不是限制本发明的范围。 0012 实施例 1 第一部分 生血丸修复低剂量辐照致骨髓细胞损伤的病理研究 1 材料和方法 1.1 动物 中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供雄性 BalB/C 小鼠 150 只， 体重 202g， 8-12 周龄 , 许可证号 SCXK（军） 2007004。 0013 1.2 主要材料和试剂 快速姬姆萨染液 ： 南京建成科技， 批号 ： 20101109 类标准胎牛血清 ： 100ml， 中美合资兰州民海生工程有限公司， 批号 ： 20100921 肝素钠 注射液 ： 2ml， 1.25 万单位， 批号 ： 20100502 羟自由基检测试剂盒 ： 。
11、南京建成科技， 批号 ： 20110224 超氧阴离子检测试剂盒 ： 南京建成科技， 批号 ： 20110303 鸟氨酸脱羧酶 ELISA 试剂盒 ： 华北制药金坦生物技术股份有限公司， 批号 ： E03O0007 生血丸干粉 ： 达仁堂制药厂提供 1.3 主要仪器和设备 OLYMPUS 显微镜 ： 日本， BX51 型 酶标仪 ： 上海科华实验系统有限公司， ST-360 型 高速低温离心机 ： 美国 sigma 公司， 3k-30 型 电子分析天平 ： Sartorius 德国， BP61 型 137Cs 射线源 ： Nordion, Ottawa, Canada ， Gamma cell。
12、 40 Exactor 1.4 动物模型制备、 分组和给药 BalB/C 小鼠 150 只， 雄性， 体重 202g， 8-12 周龄。分为五组 ： 正常组 30 只， 普食， 正 常饮水， 16 天 ； 模型组 1， 30 只， 0.4GyX 射线辐照 4 天后， 普食， 正常饮水 12 天 ； 模型组 2， 30 只， 普食， 正常饮水12天后， 0.4GyX射线辐照4天 ； 预防组30只， 生血丸2.5g/kg饲胃， 正常 饮水 12 天后， 0.4GyX 射线辐照 4 天 ； 治疗组 30 只， 0.4GyX 射线辐照 4 天后， 生血丸 2.5g/ 说 明 书 CN 10234997。
13、8 A CN 102349981 A3/5 页 5 kg， 正常饮水 12 天。 0014 1.5 外周血淋巴细胞微核率的检测方法 小鼠目内眦眶静脉取血 0.1ml， 肝素抗凝 , 与 1/2 量的 3% 明胶放入离心管中 , 加盖混 匀,垂直至于37水浴箱中自然沉降40分钟左右。 吸取上清液， 注入离心管中， 1000rpm/5 分钟， 弃上清， 取沉淀物推片， 干后， 甲醇固定 1 分钟， 瑞 - 姬氏染色 1 0 分钟。 0015 微核计数标准 ： 在油镜下观察1000个淋巴细胞， 按Country-man的标准确定微核， 即微核大小为主核的 1/20 1/3， 与主核核膜完全分离， 形。
14、态较规正， 圆形或椭圆形， 染色 性与主核相似或稍淡， 无明显折光性。观察 5000 个淋 巴细胞中所含微核的淋巴细胞数。 0016 1.6 骨髓细胞微核率的检测方法 小鼠颈椎脱臼法处死以后， 取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用小牛血清冲洗骨髓, 直至骨髓腔发白为止。 将骨髓冲洗液1500r/min离心8min,弃上清,然后用约0. 5mL的小 牛血清将沉淀悬浮起来。 每个载玻片滴一滴,涂开后于空气中自然干燥,甲醇固定15min, 晾干 , 瑞姬染色 15min, 细水流冲洗晾干 , 即可观察。统计 1000 个骨髓细胞中所含微核的 细胞。 0017 1.7 骨髓细胞抑制羟自由基能力的检测方法。
15、 小鼠颈椎脱臼法处死以后， 取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用生理盐水冲洗骨髓, 直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液 1500r/min 离心 8min, 弃上清。细胞匀浆， 按羟自由 基检测试剂盒说明书操作， 各样本以吸光值表示 （OD） 。 0018 1.8 骨髓细胞抗超氧阴离子能力的检测方法 小鼠颈椎脱臼法处死以后， 取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用生理盐水冲洗骨髓, 直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液 1500r/min 离心 8min， 弃上清。细胞匀浆， 采用比色法 测定抗超氧阴离子活性， 操作步骤按试剂盒说明书进行。蛋白测定采用考马斯亮蓝法。各 样本以吸光值表示 （OD） 。 00。
16、19 1.9 骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶 （ODC） 表达的检测方法 小鼠颈椎脱臼法处死以后， 取双侧的小鼠股骨,剪去骨的两端,用生理盐水冲洗骨髓, 直至骨髓腔发白为止。将骨髓冲洗液 1500r/min 离心 8min， 弃上清。细胞匀浆， 按 ELISA 试 剂盒说明书操作， 在酶标仪以波长 450nm 检测。各样本以吸光值表示 （OD） 。 0020 2 结果 2.1 生血丸对低剂量辐照小鼠外周血淋巴细胞及骨髓细胞微核率的影响 表 1 生 血 丸 对 低 剂 量 辐 照 小 鼠 外 周 血 淋 巴 细 胞 及 骨 髓 微 核 率 的 影 响 （ ,n=10） 说 明 书 CN 102349978。
17、 A CN 102349981 A4/5 页 6 模型组 1vs空白组， p0.05 ； 模型组 2vs空白组， p0.05 ； 预防组vs模型 组 2， p0.05 ； 治疗组vs模型组 1, p0.05。 0021 结果显示 ： 模型组 1、 模型组 2 均比正常组外周血淋巴细胞、 骨髓细胞微核率显著 增加 （p0.05） ； 生血丸预防组及治疗组的微核率明显少于模型组 2 和模型组 1（p0.05） 。 0022 2.2 生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞羟自由基、 超氧阴离子表达的影响 表 2 生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞羟自由基、 超氧阴离子表达的影响 （ ,n=10） 模型组 1vs。
18、空白组， p0.05 ； 模型组 2vs空白组， p0.05 ； 预防组vs模型组 2， p0.05 ； 治疗组vs模型组 1， p0.05。 0023 结果显示 ： 模型组 1、 模型组 2 的骨髓细胞羟自由基、 超氧阴离子均比正常组表达 显著增加 （p0.05） ； 生血丸预防组及治疗组的骨髓细胞羟自由基、 超氧阴离子的表达明显 少于模型组 2 和模型组 1（p0.05） 。 0024 2.3 生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶 （ODC） 表达的影响 表3生血丸对低剂量辐照小鼠骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶(ODC)表达的影响 （ ,n=10） 空白组预防组模型组 1模型组 2治疗组 OD。
19、C(OD)0.4530.190.3970.27 0.2160.19 0.1780.43 0.4380.21 模型组 1vs空白组， p0.05 ； 模型组 2vs空白组， p0.05 ； 预防组vs模型组 2， p0.05 ； 治疗组vs模型组 1， p0.05。 0025 结果显示 ： 模型组 1、 模型组 2 的骨髓细胞鸟氨酸脱羧酶 （ODC）表达均比正常 组显著减少 （p0.05） ； 生血丸预防组及治疗组 ODC 的表达明显高于模型组 2 和模型组 1 （p0.05） 。 0026 3 讨论 当射线作用于间期细胞的染色体时 , 可导致染色体损伤 , 包括染色单体断裂和染色 体断片 , 。
20、在细胞分裂末期形成子细胞时 , 这些单体断裂和断片可滞留于胞质中形成微核。 因此 , 微核率的高低可以间接反映机体的吸收辐射的剂量。有研究表明， 放射工作人员 周围血淋巴细胞平均微核细胞率和平均微核率分别为 3.27和 3.43 , 明显高于对照组 (P0.01), 表明低剂量电离辐射对放射工作人员的遗传物质有一定损伤。这些工种涉及到 使用放射性仪表的钢铁、 采矿、 焦化厂等 ； 质检部门使用的 X、 射线工业探伤机 ； 医院使用 的拍片机、 CT 机等放射线诊断仪器。 0027 自由基是指具有未配对电子的原子、 离子或分子等类物质 , 自由基性质活泼 , 可 损伤蛋白质、 脂质、 核酸等。 。
21、超氧阴离子自由基、 羟自由基、 一氧化氮自由基等含氧的自由基 说 明 书 CN 102349978 A CN 102349981 A5/5 页 7 称为氧自由基 , 是人体内比较常见的自由基。超氧阴离子自由基是生物体中第一个生成的 氧自由基 , 是所有氧自由基的前身 , 可以转化为其他氧自由基 , 因此具有非常重要的意 义。超氧阴离子可以氧化体内很多物质 , 使细胞膜脂质过氧化 , 还可以使过氧化氢酶、 谷 胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活。羟基自由基是氧化活性最强的氧自由基 , 几乎可以和 所有细胞成分发生反应 , 对机体危害极大。 0028 鸟氨酸脱羧酶 （ODC） 是细胞中控制多胺生成的关。
22、键酶之一 , 而多胺则是细胞增殖 调控的重要因素 , 对肿瘤的发生发展起重要作用。实验证明 , 抑制 ODC 的活性可以减少多 胺的生成 , 从而抑制肿瘤的生长 , 达到治疗的目的。 0029 在化学性诱癌剂的作用下 , 原癌基因发生突变成为细胞癌基因。癌基因尤其是 c-myc过表达又可启动细胞内鸟氨酸脱羧酶基因表达,鸟氨酸脱羧酶是多胺(polyamines, 包括精脒spermidine、 精胺spermine和腐胺putrescine)合成的限速酶,而多胺是调节细 胞生长、 促进细胞增殖的重要物质 , 通过稳定细胞结构、 与核酸分子结合并增强核酸与蛋 白质合成促进细胞增殖和恶性转化。因此 。
23、, 肿瘤组织 ODC 活性可作为反映其增殖代谢和恶 性程度的可靠指标。故临床用测定癌瘤病人体内多胺含量作为观察病情的指标之一 ； 国外 学者将 ODC mRNA 表达作为术前基因诊断预测癌症患者预后或转移的方法。 0030 据文献报道低剂量辐射累计达到 0.15Gy， 小鼠骨髓细胞微核增加出现显著差异， 0.4Gy 骨髓细胞微核呈现高水平维持。本实验采用 137Cs 射线源 0.4Gy 持续照射 4 天， 分别对生血丸的预防和治疗作用进行了测评， 结果显示， 持续照射可造成外周血淋巴细胞 微核及骨髓细胞微核增加， 同时可以使骨髓造血环境中的羟自由基、 超氧阴离子显著增加， ODC 显著减少。结果还提示生血丸能很好地预防和治疗低剂量辐照带来的染色体断裂 ； 生 血丸能预防性降低和清除羟自由基和超氧阴离子 ； 生血丸能有效产生 ODC， 抑制多胺的合 成， 抑制变异细胞的增殖。 说 明 书 CN 102349978 A 。