利用数字微镜技术原位合成高密度DNA芯片的方法 本发明是一种涉及到用于原位DNA合成芯片的微镜阵列装置，该装置包括一个二维可寻址的微镜阵列反射装置，每一块微镜呈正方形，底部有一旋转轴，可单独控制改变镜面方向。整个微镜阵列可包含多至几百万片微镜，由可编程软件控制微镜阵列中各个微镜的反射状态，编辑微镜阵列的打开模型，反射不同的透光图象(功能等同于蔽光罩)，利用编辑各种不同的透光图像模型，激活固相表面的不同序列寡核苷酸探针阵列的合成。该技术可用于高密度寡核苷酸探针阵列的制备。
【发明背景】
随着人类基因组(测序)计划(Human genome project)的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。其中，序列信息全部已知的微生物就有11种，其它几类生物包括大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、小鼠等也进行了部分序列的测定，基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。然而怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成了全世界生命科学工作者共同地课题。
这就为大量DNA、RNA序列测定及其分析提出了更高的要求。基因芯片(Genechip)又称DNA芯片(DNA Chip)的出现为解决此类问题提供了更好的平台技术。早在八十年代初有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查，但直到光引导原位合成(light-directedsynthesis)高密度探针技术问世之后才使该设想逐步成为现实。
所谓基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。由于用该技术可以将极其大量的针探同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等问题，而且，通过设计不同的探针阵列，还可以用于测序分析。
已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上，这些方法可分为原位合成(in situ synthesis)与预先合成然后点样(off-chip DNA synthesis)两种。DNA原位合成主要是指光引导聚合技术，当然该技术除了可以用于合成寡聚核苷酸外还可以用于寡肽的合成。光引导聚合技术是照相平板印刷技术与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透结果。照相平板印刷技术中可用光引导形成电子线路，利用类似的道理可在固相支持物上同时合成出大量不同的化合物。
开发并掌握这一技术的是美国Affymetrix公司。Affymetrix公司采用了照相平板印刷技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片，生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106/cm2的微探针排列密度，能够在1平方厘米的片基上排列一百万个寡聚核苷酸探针。
然而，该技术难度操作较大，除了在基因芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司使用此技术原位合成寡核苷酸探针外，其他公司和研究单位多数使用第二种合成点样技术。合成点样技术在寡核苷酸探针的设计方面与前者相似，用传统的DNA或蛋白固相合成仪进行预先合成，再用特殊的点样装置或仪器将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过特殊处理的玻璃片上，点阵密度可达到2500点/cm2。尽管如此，两种方法在样品的处理、标记和检测分析等方面具有许多相似之处。预合成点样方法的缺陷是探针的数量受到合成步骤的限制，难以用于制备高通量的寡核苷酸芯片。
Affymetrix公司的光屏蔽原位合成技术是这样完成的：
先制作光屏蔽罩，利用激光刻蚀技术将屏蔽罩刻成不同图案的透光孔，透光部位即是待合成的部位。屏蔽罩的数目与合成的寡核苷酸的长度有关，因DNA由4种碱基组成，每增加一个碱基长度的寡核苷酸需要4块屏蔽罩，如果合成8个碱基的寡核苷酸需要32块屏蔽罩。每次通过控制挡光板(透光与不透光)的图案以及参与反应的单体种类，就可以实现在特定位点同时合成大量已知序列寡聚体的目的。
合成时，先使玻璃支持物氨基化，然后用光不稳定保护基将NH2基保护起来。每次选择适当的屏蔽罩使需要聚合的部位透光，不需发生聚合反应的部分不透光。这样，光通过屏蔽罩照射到支持物上，受光的部分NH2解保护。合成所用单体分子一端按传统固相合成方法活化另一端则受光敏保护基团保护。这时，用单体分子去和支持物上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基团。类似地，进行以后其它反应直至得到目的寡聚体序列。该方法以传统的亚磷酰胺合成法为基础，只需较少步骤就可以合成大量不同序列分子高密度的微小点阵。例如，合成65,536个探针的8聚体寡核苷酸序列仅需32步反应，8小时就可完成。
但是，激光刻蚀的硬避光罩的操作存在下列缺陷：
1)需昂贵激光刻蚀设备
目前在全球范围内采用激光刻蚀设备制作DNA芯片的公司非常少，只有Affymetrix公司配备了全套的激光刻蚀设备，这除了知识产权的因素外，昂贵的激光刻蚀设备和众多的高精度光屏蔽罩限制了这一技术的发展。按目前Affymetrix公司可提供的25个寡核苷酸探针的合成技术来说，需要100个激光屏蔽罩用于这些探针的合成。
2)更换避光罩容易造成位移
虽然更换光屏蔽罩有自动操作装置，但是要让100个光屏蔽罩完全对位还是需要非常精密的技术，其中只要一个对位发生移位，则可使整个制作报废。因为高密度芯片制作，每个探针点的大小，已经小至微米级以下，要想在一平方厘米的方位内排列100万个探针，其探针的直径已小于10微米，这对于更换不同屏蔽罩并完全对位非常困难。
3)操作繁琐费时
操作烦琐主要在于光屏蔽罩的更换和高精度的对位，
4)难以大规模操作、控制。
Affymetrix公司技术难以大规模制作的原因是需要大量的光屏蔽罩，需要大量的控制设备，因此限制了激光刻蚀技术和光屏蔽罩方法大规模制作的高密度基因芯片。
5)不能提供客户定制芯片制作
客户要求制作基因芯片在于按照客户的要求设计探针和制作探针阵列，因此需要特殊的光屏蔽罩，这对于光屏蔽罩的需要很大，成本很高，几乎不可能为客户提供芯片制作的服务。而对寡核苷酸芯片的制作来说，恰恰又在于能迎合客户的需要提供不同寡核苷酸探针阵列的芯片。
为了克服激光刻蚀硬屏蔽罩所带来的不便以及昂贵的成本，本发明利用程控微镜反射技术和数字光学处理技术代替激光刻蚀的屏蔽罩，利用可编程软件或直接图像编辑控制数字微镜阵列中每个镜片的旋转，来制备光屏蔽罩。
本发明原理及技术和步骤：
1.采用高分辨率的数字微镜设备
数字光学处理技术(Digital Light Processing，DLP)是作为用来改进传统LCP投影图象质量而诞生的，作为来自Texas Instruments的一项独创性的新光学技术，已成为替代传统投影机的新生产品。与LCP技术相比，DLP不是使用阻塞光源的各个部分来建立图象的传递性的技术，而是使用微小的镜子来反射光，产生一个光亮得足以在一个正常光线的房间里看得清的图象。
本发明应用数字光学处理技术，使用数字微镜来反射光线，控制每个微镜光线的反射达到控制DNA合成位点的目的(图1)。这些小镜子是一个数字微镜设备1(Digital Micromirror Device，DMD)装置的一部分，上面覆盖有微小的、四方形的铝反射物4，可绕轴5旋转。当某一特定镜子单元的光系统向芯片合成表面倾斜时，象点(象素)就出现了；否则，就没有出现。DMD是由超过五十万块的微小镜面组成，而一个镜面则代表一个像素，一个镜面之下有一个合叶装置。这种结构可以对输入进来的数字信号做出每秒开关超过五千次的响应，以产生像素。就是说，利用数字微镜设备的微镜片的可寻址控制镜片的反射方向，即可控制该镜片象素位点的DNA合成状态。如果每个微镜片作为一个DNA探针合成位点的，每块DMD设备可以控制合成50万个探针，足以满足研究或临床诊断芯片制作的需要。而且，随着DMD微镜数的增加，可以很轻易的合成100万以上的探针。
DMD镜片体积微小，正方形4，每一侧边的长度为16微米，相邻镜片之间的缝隙小于1微米，几乎是无缝效果。用于投影的数字微镜设备最多可由1280×768＝983040个微镜组成，这每一个镜面均可由程序寻址进行单独控制，因此只要控制这些镜面的反射方向，就可控制图象(屏蔽罩)的生成。
生物芯片的探针阵列结构实际上也是一个二维图象，有若干个点(象素)组成，记录了探针的在芯片表面的位置等信息。由电脑寻址的光线控制代替屏蔽罩的对光线的控制，甚至可以控制光线反射的量以达到不同灰度级的光线量。
2.数字微镜设备与DNA合成仪的结合
DNA合成仪是由许多微泵32，33，34和通道以及反应室27(合成池)所组成，控制DNA合成过程中各种液体的链接、洗脱，其中DNA合成池是DNA合成的场所(图3)。在现有DNA合成仪的基础上，加上芯片固定支撑物质如硅片、玻片26等物质和数字微镜反射光通路所需要的编程控制器22、图象控制卡23、分光镜25、透镜组28、30、以及光源31和反射镜等器件，就可以构成芯片制作设备了。
3.电脑界面编制合成模型组合
数字蔽光罩的制作编辑是通过改变微镜旋转方向来完成的。当某一特定微镜单元向DNA合成界面倾斜时，象点就出现在指定的合成位点，相当二元开关的ON状态。DMD是由超过五十万块的微小镜面组成，而一个镜面则代表一个像素，并由相应的控制机制控制微镜的开关。我们可以将这些微镜阵列视为显示设备，因此任何可以控制显示设备图象的方法来控制这些微镜阵列。如专用的编辑软件、图象编辑方法等均可改变微镜的状态(图2)。
4.光敏基团保护的核苷酸连接到芯片表面
首先，在待合成的支撑物表面带有光敏反应基团，可以利用微镜蔽光罩技术使光照射到DNA待合成部位使其去保护。DNA寡核苷酸合成时，在合成碱基单体的5′羟基末端连上一个光敏基团42。合成前利用光照射使碱基单体的羟基端脱保护40，然后一个5′端带有光敏基团的核苷酸单体41连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕(图4)。
在制作DNA寡核苷酸芯片时，用预先制作的蔽光板6-21和经过修饰的4种碱基，通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前，预先将玻片氨基化，并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的微镜开关图像使需要聚合的部位得到反射光线，不需要发生聚合的位点微镜处于关闭状态。这样，光通过微镜反射照射到DNA合成支持物上，受光部分的氨基解保护，从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基(A、T、C、G中的一种)。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护，所以可以通过控制微镜反射光线的象素图案以及每次参与反应单体分子的种类，就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸的目的。
5.核酸杂交
通过上述光敏技术合成的DNA寡核苷酸探针阵列，其探针长度可以根据需要而定，一般以8个核苷酸到25个核苷酸为佳。由于寡核苷酸探针碱基组成的不同，使得探针的变性、复性以及Tm值都不一致，使杂交信号难以得到真实的表现。因此寡核苷酸阵列的杂交的条件与方法与通常的Southern blot技术有很大的不同。为了改变探针的Tm值的不已知性，可在杂交缓冲液中将引入“等离子稳定”试剂，即在杂交体系中加入2.3M～3M的氯化四甲胺，氯化四甲胺可选择性的与A:T对结合，并使稳定性升高，Tm值升高，使A:T对的解链温度趋同于G:C对，达到寡核苷酸探针的Tm值只与探针长度有关而其碱基组成无关。
核酸杂交的信号记录，主要采用荧光标记、直接荧光染色等方法标记靶DNA或者染色特异性双链DNA，使杂交形成的杂交位点出现相应的荧光信号。
6.信号检测
显色和分析测定方法主要为荧光法，主要的检测手段是芯片专用扫描仪(如ScanArray系列的扫描仪)或激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5-35倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。
利用数位微镜技术进行光原位合成制作DNA寡核苷酸芯片具有以下优点：
1.不需要激光刻蚀等昂贵设备
由于采用了数字微镜技术，因此不需要贵重的激光刻蚀设备。适合一般的DNA芯片制作公司制作芯片，降低设备投入。
2.不需要光屏蔽罩
由于采用了数字微镜技术，不需要众多的硬光屏蔽罩，而代之以电脑界面设计的软屏蔽罩，具有多样化、容易制作和随时设计更换的优点。
3.可满足大规模生产的需要
由于数字微镜体积相当微小，可以直接安装在DNA合成仪内，或通过光纤将光导入到DNA合成池内，因此可以象DNA合成那样，进行大规模生产。甚至，可以通过一台数字微镜设备，控制多个DNA合成设备，以达到平行生产的需要。
4.可按照客户要求合成制作寡核苷酸芯片
由于数字微镜技术不涉及硬件的改动，完全通过软件的控制来改变光屏蔽罩，因此可以根据客户的要求生产复合用户要求的DNA芯片。
5.可象DNA合成那样容易地进行芯片的制作
该数字微镜设备可以直接安装在DNA合成仪内，或通过光纤将光源直接导入DNA合成池，因此芯片合成其实就是一般的DNA合成过程，一般的专业技术人员就可以胜任芯片合成的操作。
6.更高的探针密度
由于光波作为电磁波的一种具有波粒二象性，所以具有衍射的特性。当挡光板透光孔间的距离足够小的时候，由于光的衍射，使受光部分与非受光部分光照对比度下降，如果仍用前述光引导合成技术就会使去保护作用不够理想，受照射部分与其它部分差别不够大，聚合纯度不高，降低了检测结果的信噪比，从而影响了聚合点阵的密度的提高。如果通过光线反射的方法，去除了光的衍射的缺陷，或使用波长更短的紫外光作为活化光源，可以在1cm2的面积上合成100万个以上的探针，以满足基因组科技的不断发展。
7.采用DLP制作芯片的技术优势
由于DLP采用光线直接反射的技术，光线不会衰减，因而没有特定波长光线的损失，可以满足受照光线能量和波长的需要。另外光照流明度更高，对比更强，附表为用于数码投影机的DMD参数，可以满足DNA芯片原位合成的要求。
附表：DMD数据投影机部分技术指标参数描述数据兼容模式视频兼容模式微镜片数DMD长宽比对比度光亮度投影镜头灯泡连接SXGA，XGA，SVGA，VGA及苹果系列，1080i/720p HDTVNTSC，NTSC 4.43，PAL及SECAM50万，可以合成50万个探针4∶3400∶1(标准)，最高可达1600∶11300 ANSI流明可缩放透镜270瓦SHP灯泡，4000小时寿命带有USB接头的DVI数字/模拟M1-DA连接器
以下结合实例来描述该发明的工作原理和制作过程。
图1.DMD设备实物图和微镜结构(图解)
1 DMD整装结构 2 微镜阵列区域
3 局部放大的微镜阵列 4 铝箔反射面的正方形微镜镜面
5 微镜中心的旋转轴心
图2.数字微镜编码光线反射图形(图解)，以4个寡核苷酸探针的合成为例，共需要16块光线反射图象模型
6第1块图象模型，合成第一层A 7第2块图象模型，合成第一层G
8第3块图象模型，合成第一层C 9第4块图象模型，合成第一层T
10第5块图象模型，合成第二层A 11第6块图象模型，合成第二层G
12第7块图象模型，合成第二层C 13第8块图象模型，合成第二层T
14第9块图象模型，合成第三层A 15第10块图象模型，合成第三层G
16第11块图象模型，合成第三层C 17第12块图象模型，合成第三层T
18第13块图象模型，合成第四层A 19第14块图象模型，合成第四层G
20第15块图象模型，合成第四层C 21第16块图象模型，合成第四层T
图3.数字微镜编码控制DNA芯片光导合成过程流程(图解)，图形左侧为DNA合成仪的各种控制阀
22 编程控制器 23 微镜阵列二维寻址控制卡
24 DMD 25 分光镜
26 DNA合成池中的芯片 27 DNA自动合成仪DNA合成池
28 透镜组 29 反光镜
30 透镜组 31 光源
32 合成后的废液 33 光敏基团修饰的核苷酸单体
34 各种合成物质
图4.光导原位DNA芯片的合成过程(图解)
35 芯片表面的光敏基团 36 芯片表面修饰的连接臂
37 芯片支持物，如玻片、硅片 38 光刻胶层
39 从DMD反射来的光线 40 芯片表面光敏基团去保护
41 核苷酸单体连接到芯片表面 42 光敏基团
43 光照射后去光敏基团 44 核苷酸单体的连接反应
实施例 利用数字微镜技术原位合成高密度DNA芯片
1.采用可寻址的高分辨率的数字微镜设备
一个DMD可被简单描述成为一个半导体光开关。成千上万个微小的方形16×16μm镜片，被构建在静态随机存取内存(SRAM)上方的铰链结构上。每一个镜片可以通断一个象素的光。铰链结构允许镜片在两个状态之间倾斜，+10度为“开”。-10度为“关”，当镜片不工作时，它们处于0度“停泊”状态。通过对每一个镜片下的存储单元以二进制平面信号进行电子化寻址，DMD阵列上的每个镜片被以静电方式倾斜为开或关状态。决定每个镜片倾斜在哪个方向上为多长时间的技术被称为脉冲宽度调制(PWM)。
每个DMD是由成千上万个倾斜的、细微的铝合金镜片组成，这些镜片被固定在隐藏的轭上，扭转铰链结构连接轭和支柱，扭力铰链结构允许镜片旋转±10度。支柱连接下面的偏置/复位总线，偏置/复位总线连接起来使得偏置和复位电压能够提供给每个镜片。镜片、铰链结构及支柱都在互补金属氧化半导体上(CMOS)地址电路及一对地址电极上形成。
在一个地址电极上加上电压，连带着把偏置/复位电压加到镜片结构上，将在镜片与地址电极一侧产生一个静电吸引，镜片倾斜直到与具有同样电压的着陆点电极接触为止。在这点，镜片以机电方式锁定在位置上。在存储单元中存入一个二进制数字使镜片倾斜+10度，同时在存储单元中存入一个零使镜片倾斜-10度。
DMD的强反射表面通过消除光路上的障碍以及将更多的光线反射到芯片合成表面上，而最大化地利用了反射光源。DMD不仅通过了所有的标准半导体资格测试，而且还证明了在模拟操作环境中，它的生命期超过10万个小时。测试证明，DMD可以进行超过1.7万千亿次循环无故障运行。
本发明有电脑寻址的光线控制代替屏蔽罩的对光线的控制，甚至可以控制光线反射的量以达到不同灰度级的光线量。
2.编程微镜反射光线模型(数字蔽光板)
本发明直接通过编辑微镜反射图象来控制合成位点的模型。通过电脑直接编辑整个合成过程中所需要的各种反射图象，这种反射图象可以直接象放映幻灯的形式控制投射到芯片表面的光学图象模型，也可以直接利用寻址的方式控制DMD镜片阵列的开关模式。
改变DMD图象就象电脑屏幕图象改变一样简单，因为DMD的光学输出就是作为投影而输出的，因此可以先用电脑编制成蔽光罩的透光模型的图象，制成各种相应的透光模型图象。
3.光敏基团保护的核苷酸连接到芯片表面
合成的第一步是利用微镜反射光照射使芯片表面羟基端脱保护，然后一个将5′端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。
原位合成适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片，具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点，可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸分子。在制作DNA寡核苷酸芯片时，用预先制作的微镜反射光线图像和经过修饰的4种碱基，通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。
合成前，先使玻璃支持物氨基化，然后用光不稳定保护基(photolabileprotecting group)将NH2基保护起来。每次合成时选择适当的微镜反射图像(mask)使需要聚合的部位受光，不需发生聚合反应的部分蔽光。这样，光通过微镜反射照射到芯片支持物上，受光的部分NH2解保护。合成所用核苷酸分子一端按传统固相合成方法活化，另一端则受光敏保护基团保护。这时，用核苷酸单体分子去和支持物上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基团。类似地，进行以后其它反应直至得到目的寡聚体序列。每次通过控制编程控制的微镜光线反射以及参与反应的核苷酸种类，就可以实现在特定位点同时合成大量已知序列寡聚体的目的。该方法以传统的亚磷酰胺合成法为基础，只需较少步骤就可以合成大量不同序列分子高密度的微小点阵(microarray)。例如，合成65,536个探针的8聚体寡核苷酸序列仅需32步反应，8小时就可完成。
应用自动核酸合成仪的方法，经过脱保护活化、偶联、戴帽和氧化等步骤逐个地联结上各个核苷酸。与玻片连接的是核苷酸的顶端。先用N，N一二乙氧基氨丙基三乙氧基硅烷衍生化玻璃基片，再在其表面加上4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)六乙二醇基(2氰乙基-N，N-二异丙基)氨基磷酸酯作保护连接子。经上述处理后的玻璃基片或硅片，置入DNA反应池，通过微镜反射，合成部位受光，然后显影并用酸脱去三苯甲基保护基因，从而显露出活性羟基，这些活性羟基就可以与DMT保护的脱氧核着酸氨基磷酸酯反应，接着用DNA合成仪把DNA合成的标准试剂送入合成池中，经过光照、偶联、氧化、戴帽、脱保护和清洗程序，不断的重复这些操作步骤，按照设计的DNA序列和使用相应的微镜反射模型，就可构建不同序列的寡核苷酸芯片。
4.芯片杂交过程
寡核苷酸探针由于碱基组成的不同，Tm值差别很大，使杂交信号难以得到真实的表现。为了克服这种不利因素，可以在杂交缓冲液中将引入“等离子稳定”试剂，即在杂交体系中加入2.3M～3M的氯化四甲胺(tetremethylammoniumchloride，TMACl)，氯化四甲胺可选择性的与A:T对结合，并使稳定性升高，Tm值升高，使A:T对的解链温度趋同于G:C对，达到寡核苷酸探针的Tm值只与探针长度有关而其碱基组成无关。另一种Betaine(N，N，N，-trimethylglycine)也具有很好的稳定作用。
杂交缓冲液的组成：
a)3M TMACl，50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，0.1％SDS；
b)4.5M Betaine，0.5M LiCl，pH 8.0。
如果不经过PCR扩增的话，基因组DNA可以采用荧光直接标记。可采用psoralen-生物素或ASA-生物素的光化学标记，psoralen和ASA基团具有与DNA分子中的嘧啶环反应，生成共价键，这种反应也较少受到反应体系中存在的物质如蛋白质、氨基小分子物质等的影响，因此也不需要DNA有很高的纯度，这将简化DNA的抽提和纯化过程，psoralen的标记反应需要在365nm的长紫外照射下才能与DNA交联，因此标记的DNA一般也不需要进行游离物质的去除，就可以直接用于杂交检测。
也可采用点灯荧光染料直接检测。点灯荧光物质主要是非对称性的花青素甙类染料，如噻唑橙(Thiazole orange，TO)、以及美国Molecular Probes公司的SYBR Green I和PicoGreen，其中SYBR Green I已成功地用于的实时定量PCR的检测。本发明直接把SYBR Green I加到杂交体系中，而不需要预先进行靶DNA荧光标记，可以省去标记操作；同时由于是点灯式染料，只有在染料与双链DNA结合时才会发出荧光。
杂交时，50μl靶DNA溶液(3-6×SSC加0.2％SDS)加入1μl200倍稀释的SYBR Green I(Molecular Probes，USA)溶液，滴于芯片上的杂交区域，蔽光将芯片封好浸于适宜的温度的水中孵育2～14小时。玻片芯片的杂交温度为20～70℃，通常37～65℃。然后将玻片在含有0.2％SDS的1×SSC室温洗5分钟去除未杂交的DNA，然后再在含有0.2％SDS的0.1×SSC溶液中洗5分钟，最后用0.1×SSC溶液洗去残余的SDS。玻片干燥后进行激光扫描检测。
5.杂交后处理
显色和分析测定方法主要为荧光法，主要的检测手段是芯片专用扫描仪或激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5-35倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。