生长因子样活 性的肽组合物 本发明一般涉及生长因子及神经营养因子，特别地涉及一个具有(或者模拟)转化生长因子-β活性的合成的小肽，基质以及含有该小肽的组合物。
生长因子是一类诸如多肽激素的物质，能够在体内或体外影响动物细胞确定种群的生长，但又不是营养物质。与组织生长和组织分化有关的蛋白质可能促进或抑制生长，可能促进或抑制分化，因而普通术语“生长因子”包括细胞因子和营养因子。
典型的生长因子是分子量介于5000-50,000道尔顿的多肽。根据结构上的相似性，生长因子分为以下几类：胰岛素样生长因子(IGFs)，血小板衍生的生长因子(PDGFs)，成纤维细胞生长因子(FGFs)，表皮生长因子(EGFs)，神经生长因子(NGFs)和转化生长因子β型(TGF-βs)。
TGF-βs最初是由于其能够转化正常成纤维细胞，使其具有锚地-非依赖性生长能力而得名的。然而，不论它的名字，TGF-βs是多种上皮，内皮及间充质细胞正常发育、生长和分化所需的多功能生长因子。与其它细胞因子相似，TGF-βs的特殊效应依赖于特定的细胞类型和它周围的环境。
TGF-βs对细胞的效应一般分为增殖性的和非增殖性的。正如最初通过第一个对成纤维细胞的实验所证实的，TGF-βs是真实的生长因子。TGF-βs能增强其增殖的两种重要细胞类型是成骨细胞和外周神经系统的施旺细胞。然而，对许多细胞而言，TGF-βs是有效的细胞增殖抑制剂。这种负生长控制可能是用于检验特定组织再生的调节机制，并可能在癌变地起始中起作用。
TGF-βs最重要的非增殖功能是增强细胞外基质的形成。虽然这最初主要是通过增加胶原和纤连蛋白的转录获得的，但抑制蛋白酶对基质的降解也对基质的稳定作出了贡献。通过减少蛋白酶的分泌，同时增加蛋白酶抑制剂的水平，抑制了胞外基质的降解。TGF-βs对胞外基质显著的和一般的效应是很可能在组织修复过程及某些纤维组织疾病发病中起着重要作用。
Lin等人在1993年5月13日公布的PCT申请书WO 93/09228中描述了DNA编码的一些不同的TGF-β受体。TGF-β受体的存在将会便于对TGF-β功能的进一步评估。
TGF-β总家族的许多成员都有了特征性记述。例如，Basler等用图表阐明了TGF-β总家族成员间的序列关系。细胞(Cell)，73，PP.687-702(1993)。Massague，细胞生物学年鉴(Annu.Rev.Cell.Biol.)，6，pp.599-641(1990)也综述了TGF-β家族，包括对TGF-β作用机制的讨论。Daopin等报道了TGF-β1二级结构的核磁共振特征，并描述了TGF-β2的精确三维晶体结构。蛋白质(Proteins)，17，PP.176-192(1993)。TGF-β2单体采纳了类似轻微弯曲的左手的折叠，两对反平行β折叠形成四根手指。这些四指区和保守的二硫键确定了TGF-β总家族的折叠。
在TGF-β成员还包括骨形态发生蛋白(BMP)。BMPs曾被指出有益于伤口愈合，组织修复及诱导软骨和/或骨的生长。例如，在1993年5月13日公布的PCT申请书9,309,229中，发明人Israel和Wolfman描述了具有骨刺激活性蛋白的应用，比如用于骨折愈合或可能用于牙周病治疗及其它牙修复过程。最近，在C&EN，Hubbell和Langer所写的一篇特别的文献中，(PP.42-54，1995年5月13日)，报道了把BMP掺入到聚合物颗粒中，以使当聚合物降解时，蛋白质缓慢释放到周围组织，刺激细胞迁移到多孔基质中，并最后实现了新骨的合成。文献同时指出，通过缓慢释放TGF-β也可产生骨。
由于TGF-βs在临床治疗中的广泛应用，它已成为许多方面研究的焦点。虽然多数研究工作涉及体外应用，最近的体内研究已证实了一些更有前景的体外效应。因此，TGF-βs的一些可能的临床应用包括刺激血管生长，与伤口愈合有关的肉芽组织的形成，以及骨和软骨的形成。
发明人Derynk和Goeddel在1994年2月8日公布的美国专利5284763中描述了核酸编码TGF-β及TGF-β的多种用途。发明人Chu等在1993年11月2日公布的美国专利5258029中描述了移植后出现骨向内生长的承压修补物制剂，该修补物包含以胶原组合物或陶瓷为载体的TGF-β。发明人Hunziker在1994年11月29日公布的美国专利5,368,858中描述了生物可降解基质制剂，其中含有TGF-βs作为增殖剂，趋化剂和转化因子。
发明人Palladino等在1991年10月8日公布的美国专利5,055,447中描述了用于治疗和预防菌血感染造成的脓毒性休克的方法和组合物。从而，例如，这个专利提供了通过服用TGF-β治疗遭受或具有脓毒性休克危险病人的方法。近来，人们更多地认为“脓毒症”是一种炎性状态，并有一批研究人员建议命名“全身发炎反应综合症”来描述“脓毒症”(血流中存在细菌造成的感染)和其它(非脓毒症性)发炎状态。胸(Chest)，101，PP.1644-1655(1992)。
因此，生长因子在多种治疗，临床，科研、诊断及药物设计应用中作用。但是，前已述及，典型的生长因子一般较大。TGF-β家族的天然成员分子量可高至25千道尔顿。生长因子的临床应用(包括TGF-βs)可能由于它们的大小会导致诸如免疫反应等而受到局限。例如，人的TGF-β1是一个25,000道尔顿的同型二聚体蛋白质。除了可能有害的免疫反应，大的蛋白质也因为给药和释放中的困难而通常不是最好的药物候选物。
所以，在使用或建议使用TGF-β的应用中需要能够避免大多数这些问题的模拟天然生长因子的小肽。利用小肽模拟大的天然成员的生物活性有其优点，因为基于摩尔质量，施药时需要的小肽的净量少得多，局部用药也更为可行。同时，很小的肽趋向于只有很小的或没有不良的免疫反应，而且能够用简单的肽化学工艺容易地进行合成。
本发明描述了一种名为“细胞调节素”的新肽的特征、性质和应用。细胞调节素能够在多种细胞类型中模拟TGF-β1的广泛的活性。另外，用人成骨瘤(HOS)细胞系进行实验的原始结果表明细胞调节素也可能是TGF-β总家族其它成员的模拟物，例如可以骨形态发生蛋白(HMPS)和成骨蛋白(OPS)，证据是它能特异性刺激的成骨细胞表型特征标示物(碱性磷酸酶和骨粘连蛋白)。
这种我们称为细胞调节素的新化合物具有以下氨基酸顺序：丙氨酸-天门冬酰胺-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天门冬酰胺-丙氨酸(Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala)(序列1)，它能够很容易地根据现有技术合成。因而，本明一方面提供了一种生物活性肽，它具有序列1所显示的氨基酸顺序。
本发明另一方面提供了一种用于组织修复的组合物，该组合物包含有生物相容性基质及其结合的本质上具有序列1同样氨基酸顺序的肽(生长因子)。生物相容性基质可能是生物可降解性的或非生物可降解性的。肽以能有效促进细胞生长的用量掺入基质或以基质为载体。这些基质可用于在修复软和硬组织中，快速替换丢失组织中，以及重塑和整形手术中构建模板。这些组合物保证和支持细胞再生，并且可与其它生长因子联合使用，尽管如此，令人惊奇的是，本发明一个优选实例的肽在没有诸如表皮生长因子和血小板衍生生长因子等其它生长因子存在的情况下，可以诱导成纤维细胞集落形成。
本发明再一方面提供了一个药物配方，其中包含实际上等同于序列1的化合物(可能以盐的形式)及一个生理相容性载体。
我们称之为细胞调节素的序列1化合物至少可以模拟TGF-βs的一类生物活性，例如抑制貂肺上皮细胞Mv-1-Lu的DNA合成，促进NRK-49F成纤维细胞的生长和集落形成，诱导I型胶原蛋白的增量表达，和/或诱导TGF-β的表达。附图的简要说明
图1图解表示了细胞调节素对貂肺上皮细胞Mv-1-Lu DNA合成的抑制作用。
图2是显微照片(放大500倍)，其中图A是对照，图B是有100nM细胞调节素的，图C是有100nM细胞调节素加上EGF和PDGF的。所有试验组都含有正常大鼠肾成纤维细胞NRK-49F，并在软琼脂中培养5天。
图3图解表示了细胞调节素对HOS细胞中基因表达的调节，其中图A、B和D表明了增量表达而图C中调节活性依赖于浓度，这是细胞中TGF-β的典型特征。
图4中图A到D是分别对应于图3A到D数据的Northern印迹。
表5给出了本发明中细胞调节素实施例的1-101位原子的原子坐标。
本发明中的肽在生理条件下含有一个由-缬氨酸-丙氨酸-(-Val-Ala-)形成的稳定β-弯曲。这个稳定β-弯曲通过至少一个贴近的带电氨基酸残基而稳定化。我们已命名这个新化合物为“细胞调节素”(cytomodulin)。这个我们称为细胞调节素的新化合物的氨基酸顺序是：丙氨酸-天门冬酰胺-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天门冬酰胺-丙氨酸(序列1)，(Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala)，它很易于用本技术领域熟知的方法进行合成。
该肽可由多种合适的方法合成，优选方法是手动或自动固相合成，该方法最早由R.B.Merrifield发展起来并由J.M.Stewart和J.D.Young在“肽的固相合成”(“Solid Phase Peptide Synthesis”)(1984)中记述。化学合成从C末端开始按预定顺序连接氨基酸。基本的固相合成方法需要把C末端保护的α-氨基酸偶联到合适的不溶性树脂载体上。用于合成的氨基酸需要保护α-氨基基团以保证与前面的残基(或树脂载体)形成正确的肽键。接下来是完成羧基端的缩合反应，去除α-氨基的保护基团以允许下一个残基的加成。J.M.Stewart和J.D.Young在“肽固相合成”(1984)中描述了几类α保护基团，其中包括历史上优选的，酸活泼的，氨基甲酸乙酯为基的叔丁氧羰基(Boc)。还可以使用其它的保护基团及其相关化学方案，其中包括碱活泼的9-芴甲氧羰基(FMOC)。同时，反应性的氨基酸侧链官能团需要封闭直至合成结束。J.M.Stewart和J.D.Young在“肽固相合成”中综述了官能封闭基团复合体系列及其应用中的策略和局限。
固相合成从前述C-末端α-保护的氨基酸残基的偶联开始。偶联需要活化剂，例如N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)同时加入或不加1-羟基苯并三唑(HOBT)，二异丙基碳二亚胺(DIIPC)或乙基二甲氨丙基碳二亚胺(EDC)。C末端残基偶联后，如果α-氨基保护基团是酸活泼叔丁氧羰基，则用溶于二氯甲烷的三氟乙酸(25％或更高浓度)去保护。用溶于二氯甲烷的三乙胺(10％)的中和步骤恢复了自由胺基(与盐形式相对应)。C末端残基加到树脂上以后，将去保护，中和，偶联及中间的洗脱步骤循环过程重复进行，以扩展保护的肽链。在合适的溶剂中，每一被保护的氨基酸均与等摩尔的偶联剂一起过量(3至5倍)引入。最后，完全封闭的肽在树脂载体上装配好后，使用试剂把肽从树脂上切下来并去除侧链封闭基团。无水氟化氢用于切下酸活泼的叔丁氧羰基(Boc)化学基团。也有使用一些诸如甲硫醚和苯甲醚等亲核清除剂的，以避免副反应特别是侧链官能团的反应。
我们制备的细胞调节素，当以109-10-6M(1.4pg/mil到1400pg/mil)浓度加入细胞培养物中时，能引发若干不同细胞类型产生确定的高特异性效应，从而为生长因子模拟特性提供了证据。例如，这些观察到的效应中包括貂肺上皮细胞Mv-1-LuDNA合成的抑制，成纤维细胞NRK-49F在软琼脂上的生长和集落形成，在新生儿表皮成纤维细胞原代培养物和HOS(人成骨瘤)细胞系中诱导I型胶原的增量表达，以及诱导转化生长因子β的表达等。
含缬氨酸-丙氨酸β-弯曲的新肽肯定能作为媒剂用于提高神经和肌肉细胞的存活率或诱导生长。细胞调节素当然可作为一个新的培养基成分用于体外培养神经细胞。这个肽还可作为天然细胞因子的替代物应用到许多领域：在外科手术中用作促进伤口愈合再生的药剂；在矫形术中用作促进骨修复和移植整合的药剂；在牙科中用于骨损伤修复和移植整合；在癌症化疗和放射性治疗中作为细胞稳定剂保护正常干细胞对抗细胞周期特异性过程；风湿性关节炎的治疗；眼科学中用于修复斑点损伤，眼科学中用于眼色素层炎的治疗；作为内脏动脉闭锁症倒灌损伤的保护剂，以及在生物学上作为研究生长因子的试剂。
本发明中的治疗组合物将包括含缬氨酸-丙氨酸β-弯曲的新肽，使用浓度取决于所需的有效剂量及所用的给药方式。很容易想到关于细胞调节素组合物的多种治疗适应症。第一个适应症是割伤和暴露组织的局部敷用以促进伤口愈合。伤口或其它可被治疗的创伤类型包括(但不仅限于)：一、二、三度烧伤(特别是二、三度烧伤)；表皮及内部手术割伤，包括美容手术；伤口，包括撕裂伤，割伤及刺伤；表皮溃疡包括褥疮，糖尿病，牙病，血友病，静脉曲张。
使用方式多种多样，例如全身给药，局部施用，静脉施药，皮下施药，腹膜内注射，骨膜下注射，气管内施药，多聚体或泵释放，移植物，或脂质体释放。合适的移植物(如果使用移植器械)包括诸如以凝胶泡沫，蜡或微粒为基的移植物。使用剂量应当足以使循环血浆中的有效成分浓度达到有效水平。有效剂量可以从体外或动物模型实验系统中得到的剂量—响应曲线中推出。
新的细胞调节素也可用于诱导骨生长。所以，可以在药学可接受载体或赋形剂中施用成骨有效剂量的新肽，以引导骨在原位沉积和成熟。另外，细胞调节素能掺入生物材料或以生物材料为载体，例如羟基磷灰石，以应用于骨再生或修复，使用方法例如见于1992年10月27日公布的美国专利5,158,934和1993年5月4日公布的美国专利5,208,219中的描述，细胞调节素可用组合物形式，例如1993年1月12日公布的美国专利5178845所述，以上专利的公开内容以参考文献的形式并入本发明。
这些骨修复组合物特征性含有多种磷酸钙矿物成分材料，例如，命名为Synthograft，Tricalcium Phosphate或Periogras的商品化羟基磷灰石。羟基磷灰石(或磷酸三钙)可由已知方法制备而无须购买，例如Termine等在生物化学和生物物理文献(Arch.Biochem.Biophys.)，140，TP307-325(1970)中公开的方法。这种材料可以粉状提供，优选颗粒大小一般在100-2,000微米范围。
本发明的细胞调节素组合物的另一个治疗适应症是与基质形成材料结合。优选的配方包括能提供发育的骨和软骨构架的基质。潜在的基质可能是生物可降解性的或非生物降解性的，可进行化学性或生物性定义。
试举一例，基质可以是惰性的，固体的和不含孔的，例如已知目前作为细胞培养容器的物质。
本发明基质可采取的另一种形式是可溶性多聚物。
本发明其它合适的实用基质包括多种多聚物和水凝胶。这些组合物可用于在软组织修复，损失组织的快速替代以及重塑和整形手术模板构造。
因而，本发明的组合物能用多类可再吸收的多聚物制造，载有肽或把肽移植入多聚物材料网格中。当然，在重吸收特性上有局限性的多聚物载体，例如异丁烯酸羟乙酯，聚甲基丙烯酸甲酯，以及N-乙烯基吡咯烷酮甲基丙烯酸甲酯等也是适用的。然后，组合物就可植入组织损伤。
已知合适的可再吸收水凝胶中包括聚乳酸盐和聚乙醇酸盐的复合物。本发明的化合物能在多聚物合成中共价连接于这类物质，或可水解多聚物以便通过光照或化学活化多聚物产生自由基团以暴露接合位点。随后使用常规技术把肽移植或固定到多聚物载体，制备发明的组合物。这样制备的可重吸收水凝胶或多聚物尤其适用于软组织重建。对硬组织的重建或修复(例如骨修复)，需要联合那些水溶性的或可重吸收的多聚物种类与生物陶瓷，例如生物玻璃，氧化铝，铝酸钙，磷酸三钙和羟基磷灰石等。
当把细胞调节素混合于生理可接受的载体，即在使用剂量和浓度下对受体无毒的载体，制备成药物时，通常需要把细胞调节素与缓冲液，抗氧化剂例如抗坏血酸，低分子量(小于10个残基)多肽，蛋白质，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖和糊精，螯合剂例如EDTA，及其它赋形剂联合起来。用于治疗给药的细胞调节素必须是无菌的。这可通过无菌滤膜(0.22微米)过滤很容易地完成。
含缬氨酸-丙氨酸β-弯曲的新肽可通过任何药学可接受载体施用，这取决于所需的给药方式。其可与液相载体一起配制成脂质体，微囊，多聚体或蜡为基础的可控释放制剂，或配制成片剂，丸剂，或胶囊形式。
肽与有机和无机酸形成药学可接受盐，以盐的形式给药或者酰胺化新肽。形成药学可接受盐合适的酸的例子是：盐酸，硫酸，磷酸，醋酸，苯甲酸，柠檬酸，丙二酸，水杨酸，苹果酸，延胡索酸，琥珀酸，酒石酸，乳酸，葡糖酸，抗坏血酸，马来酸，苯磺酸，甲基磺酸和乙基磺酸，羟甲基磺酸和羟乙基磺酸。
盐也可由合适的药学可接受有机碱的加成而形成。这些有机碱形成这样的一类，他们的局限性对那些本领域熟练技术人员来讲易于理解。仅为了举例说明，这一类可包括：单，双，或三烷基胺，例如甲胺，双甲胺，和三乙胺；单，双，或三羟基烷胺，例如单，双，和三乙醇胺；氨基酸例如精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡糖胺；N-甲还原葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；三(羟甲基)氨基甲烷；及以上类似物。(例如，可参看“药用盐”(“Pharmaceutical Salts”)，药学杂志(J.Pharm.Sci.)，66(1)，1-19(1977))。
治疗用细胞调节素制剂，例如用于促进骨细胞生长，可以把具所需纯度的新肽与可选择性的生理可接受载体，赋形剂或稳定剂混合制备成用于贮存的剂型，可采取冻干饼或水溶液形式。可接受载体，赋形剂或稳定剂在施药时使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，它们包括诸如磷酸，柠檬酸和其它有机酸缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白。
其它成分包括甘氨酸，丁胺(blutamine)，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，双糖，和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的平衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN，PLURONICS或PEG。另外，其它需要包含于细胞调节素治疗制剂的有用成分是一种或多种其它生长因子，例如表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)。
局部敷用于例如用于伤口愈合时使用细胞调节素的最初剂量应当使释放到治疗部位的浓度在大约50到500纳克/毫升范围，然后根据临床经验进行调节。由于细胞调节素组合物不但提供而且支持细胞再生，意味着连续使用或定期重敷该组合物。期望临床医生按照临床经验修改使用剂量。
细胞调节素组合物可用无菌灌注形式使用，优选地与生理盐水联用，或以油膏或悬浮液形式，优选地与其它上文已述及的生长因子联用，并可进一步与胶原，胶原类似物，或胶原模拟物联用，例如发明人Bhatnagar在1994年10月11日公布的美国专利5,354,736中所述，其公开内容以参考文献形式并入本发明。组合物也可渗入穿皮补片，石膏或绷带，优选的形式是液体或半液体。这类物品或组合物还应当包括磺胺嘧啶银等自体微生物制剂。
细胞调节素也可经全身给药治疗伤口和类似的创伤。全身给药可用于不存在或极少有不希望的副反应的情况下，例如刺激癌症病人瘤细胞生长。用于全身给药的细胞调节素组合物优选地配制成无菌，等渗肠胃外注射剂或输注剂。
细胞调节素组合物，如前所述，或单独使用细胞调节素，或联合使用其它生长因子，胶原，前述的生理可接受载体，赋形剂或稳定剂，均可以生物相容性基质作为载体(或掺入生物相容性基质)。发明的基质可是多孔珠状颗粒或是纤维状。建议用例如磷酸钙材料，诸如磷灰石为基础的陶瓷来生产多孔组织移植物或假体材料，上有足够的微孔允许组织附着。从而，本发明细胞调节素组合物一种治疗应用是用于基质形成材料是生物可降解性的地方，并可用于例如软骨修复。
用于填充或其它修整软骨损伤的基质材料包括，例如，纤维蛋白原(在损伤或损坏时由凝血酶活化形成纤维蛋白)，胶原，明胶或任何其它生物可降解材料，这些材料形成的基质具足够大的孔允许修复细胞填入和在其内增殖，并能在修复过程中降解和由软骨替代。
本发明的组合物和方法中有用的基质可以预制成或在原位形成，例如通过多聚化合物和组合物，诸如纤维蛋白原以形成纤维蛋白基质。可以预制的基质包括：胶原，胶原类似物或胶原模拟物(例如胶原海绵和胶原羊毛)，化学修饰胶原，明胶珠或海绵，凝胶形成物质，任何其它由生物可降解基质材料组成，能填充组织或骨损伤并允许修复细胞填入其中的凝胶形成和组成物质，或者以上物质的混合物。
细胞调节素的生物活性现在将由下面的实施例进一步说明，这些实施例是为了说明而不是其限制。
实施例1
貂肺上皮细胞Mv-l-Lu DNA合成的抑制
TGF-β和细胞调节素的效应是通过测定[1H]胸苷掺入总酸不溶DNA的比率和细胞数进行评价。通常可参照Sampath等，生物化学杂志(Joumal ofBiological Chemistry)，267，PP.20352-20362(1992)。DNA合成速率在三平行培养基中测定，培养物用不同浓度(10-9M至10-6M)的TGF-β或细胞调节素(用Merrifield方法合成)处理24小时，培养终止前6小时加入[甲基-3H]胸苷(μCi/ml，80Ci/mmol)。通过培养基抽吸终止掺入，用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次后，三氯乙酸(10％)沉淀放射性DNA，用1.0％(W/V)十二烷基磺酸钠，0.1M氢氧化钠抽提，通过液体闪烁计数定量。测定细胞数，将1×105个细胞在含10％FBS的MEM培养基烧瓶中铺平板，培养24小时后，以含不同种类TGF-β和细胞调节素的无血清培养基替代生长培养基。每24小时收集三平行培养物，连续7天，通过固定容积血球计数计中胰蛋白酶消化释放的细胞计数测定细胞数。
细胞调节素的生长抑制曲线类似于在相同浓度范围的TGF-β所观察到的生长抑制曲线。
实施例2
成纤维细胞NRK-49F在软琼脂上的生长和集落形成
最初对TGF-β检测其促进正常成纤维细胞不依赖于贴壁生长的能力仍然是TGF-β活性的一个标志。NRK-49F成纤维细胞生长在37℃的补充有10％胎牛血清的DEM培养基上。实验使用培养基，10ng/mg表皮生长因子(EGF)和10ng/ml血小板衍生生长因子(DDGF)；然而，同TGF-β不同，它缺少这些生长因子时不能诱导集落形成(参看例如，Massagu，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，259，PP.9756-9761(1984))，细胞调节素确实在不存在上述两种生长因子的情况下能诱导集落形成。在这里，或者加入100nM TGF-β(阳性对照)或者加入100nM细胞调节素。NRK-49F成纤维细胞(5×104细胞/毫升)混于0.3％琼脂中在35毫米培养皿中铺平板。第三天开始观察到培养基中形成集落。
同预期一致，在基本培养基上没有集落形成。也同预期一致，含TGF-β的克隆长成集落。令人惊奇的是，细胞调节素培养物也形成接近于TGF-β培养物同等程度的集落。TGF-β和细胞调节素培养物集落生长特征在生长期间相似。
参照图2，展示的显微照片摄于成纤维细胞培养的第5天。实际上第三天的培养物上已能观察到集落形成。如图2(A)所见，没有任何生长因子的培养物中极少有细胞存活下来，图2(B)和(C)展示了在细胞调节素存在下小集落(箭头)的形成，(C)中还包括EGF和PDGF，诱导了更大的集落(箭头)。这些类似于TGF-β诱导的集落形成，只是TGF-β需要同时存在表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)；然而，如(B)中所见，细胞调节素的确能单独诱导集落形成。
实施例3
RNA分离和Northern检测
细胞总RNA基本上按Maniatis描述的方法分离。Sambrook等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，第二版(1989)。细胞用0.5％十二烷基磺酸钠和0.1醋酸钾裂解。用酚提取裂解液并在500rpm转速离心15分钟。水相在0.1M Tris，pH8.0和0.2M NaCl中用2倍体积乙醇沉淀。沉淀重新悬浮并通过测量260nm紫外吸收定量。RNA纯度通过比较260m和280nm的紫外吸收进行鉴定。
RNA(10微克/泳道)在3到4伏/厘米条件下用0.7％琼脂糖，2.2M甲醛变性凝胶电泳。毛细管转移RNA至尼龙膜。RNA完整性，凝胶荷载和转移效率通过亚甲蓝染色的28S和18S带进行鉴定。滤膜在80℃烘干2小时以固定RNA。烘干后，滤膜在65℃下于0.5M磷酸钠缓冲液中杂交，该缓冲液pH值为7.0，且含有1mM EDTA，7％十二烷基磺酸钠和1％牛血清白蛋白。cDNA探针使用Klenow酶按随机引物方法标记上dDIG(荧光探针)。杂交在65℃进行18小时，然后冲洗。
按照制造商的步骤通过扫描地高辛-dVTP分析数据。(BoehringerMannheim Biochemica，DIG DNA标记试剂盒，Cat.No.1175033)。
表5给出了细胞调节素生物活性结构的原子坐标(原子1-101)。从而，表5描述了本发明肽的生物活性表面。我们相信可以合成出类似物，它呈现对细胞膜受体来讲相同的或实质上相同的表面，从而等价于本发明的细胞调节素。另一方面，通过利用别构结合机理，可以合成对于细胞调节素来讲增加了或减少了活性的复合物。因而，本发明的实施例，例如用于组合修复的组合物，包含一种生物相容性基质和一个由于是细胞调节素本身或是它的类似物而实质上与细胞调节素氨基酸序列相同的肽，该肽当掺入基质或以基质为载体并以能有效促进细胞生长的量存在时，可以表现相同于或本质上相同于图5所示的生物活性表面。
当然，结合上述优选的具体实施例描述了本发明，该描述和实施例都是为了说明，而不是限制本发明的范围，它由附加的权利要求的范围而确定。
序列表(1)一般资料
(i)申请人：加利福尼亚大学董事会
(ii)发明名称：生长因子样活性的肽组合物
(iii)序列数目：1
(iv)通信地址：
(A)收信人：Robbins，Berliner&Carson
(B)街道：201 N.Figueroa Street，5th Floor
(C)城市：洛杉矶
(D)洲：加利福尼亚
(E)国家：美国
(F)邮编：90012-2628
(V)计算机可读形式：
(A)媒介类型：软盘
(B)计算机：IBMPC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30
(vi)当前申请数据：
(A)申请号：
(B)填表日期：
(C)类别：
(viii)律师/代理人资料：
(A)姓名：Berliner，Robert
(B)登记号：20121
(C)目录号：
(ix)电信资料：
(A)电话：213-977-1001
(B)传真：213-977-1003(2)序列1资料
(i)系列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假拟：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：序列1Ala Asn Val Ala Glu Asn Ala