技术领域
本发明属于肿瘤用药物及其应用领域，具体涉及一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类健康的大敌，其死亡率仅次于心脑血管疾病，且发生率有逐年上升的趋势。防治肿瘤是当代医学界的重大课题，广泛受到国内外医学界的关注。然而恶性肿瘤的治疗十分困难。西医的外科手术、放疗、化疗目前是治疗恶性肿瘤的三大基本手段。然而外科手术不但给病人带来巨大的生理和心理上的痛苦，而且其远期疗效也不尽人意。放疗和化疗的非特异性杀灭肿瘤细胞的作用导致正常细胞和脏器损害无法避免，以至于有些患者并非死于癌症本身，而是间接的死于放疗和化疗药物所带来的毒副反应。而中药以其药源广泛、价格低廉、应用历史悠久等优点正成为抗肿瘤药物研究的热点。
对于恶性肿瘤的治疗，西医以外科手术、放疗、化疗目前为三大基本手段。然而外科手术不但给病人带来巨大的生理和心理上的痛苦，而且其远期疗效也不尽人意。放疗和化疗的非特异性杀灭肿瘤细胞的作用导致正常细胞和脏器损害无法避免，以至于有些患者并非死于癌症本身，而是间接的死于放疗和化疗药物所带来的毒副反应。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中存在的不足，提供一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明的一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物，所述的中药组合物按质量份数由40-50份北豆根、20-30份地龙、40-60份黄芪、15-25份党参及5-10份三七制成。
本发明的一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物的应用，它用于防治消化道恶性肿瘤。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
(1)本发明的组合物全方具有清热解毒、消肿止痛、补气固表、散瘀止血、活血化瘀及软坚散结的功效，经临床验证疗效满意；
(2)北豆根清热解毒、消肿止痛，地龙清热定惊、通络、平喘、利尿；黄芪补气固表、利尿生肌、抗毒排脓；党参补中益气，和胃生津；三七散瘀止血，消肿定痛，诸药配伍共奏具有清热解毒消肿止痛、补气固表、散瘀止血、消肿定痛之效；
(3)通过研究该中药组合物对体外肿瘤模型的抗肿瘤作用及作用机制，为进一步研发治疗恶性肿瘤的中药新药提供客观依据，为研发出作用机制明确安全有效的抗肿瘤中药新药奠定基础，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1为各组中Raf蛋白激酶的表达图；
图2为各组中GAPDH蛋白的表达图；
图3为各组中丝裂原活化蛋白激酶激酶1 MEK1蛋白的表达图；
图4为各组中GAPDH蛋白的表达图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物，所述的中药组合物按质量份数由40-50份北豆根、20-30份地龙、40-60份黄芪、15-25份党参及5-10份三七制成。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由42-48份北豆根、22-28份地龙、45-55份黄芪、17-23份党参及6-9份三七制成。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：本实施方式的一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由45份北豆根、25份地龙、50份黄芪、20份党参及7份三七制成。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由40份北豆根、20份地龙、40份黄芪、15份党参及5份三七制成。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物按质量份数由50份北豆根、30份地龙、60份黄芪、25份党参及10份三七制成。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：本实施方式的一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物制成水煎剂，具体方法是：按下述质量份数取40-50份北豆根，20-30份地龙，40-60份黄芪，15-25份党参和5-10份三七，将上述原料药用蒸馏水浸泡1h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用4℃保存。
具体实施方式七：本实施方式记载的是一种防治消化道恶性肿瘤的中药组合物的应用，它用于防治消化道恶性肿瘤。
本发明中的各原料药粉碎后加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常规方法还可以做成临床上适宜的各种制剂，譬如胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。上述制剂的制备方法属于常规制剂方法，在此无需赘述。
实施例1：
临床研究
所用的中药组合物按照以下方法制备：
按以下质量份数称取各原料药：40-50份北豆根、20-30份地龙、40-60份黄芪、15-25份党参及5-10份三七。将上述原料药用蒸馏水浸泡1h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用4℃保存，用于以下研究：
1.资料与方法
1.1入选标准：51例病人均为2014年2月-2015年1月在黑龙江中医药大学附属医院住院治疗的消化道恶性肿瘤病人。全部病例患者就诊时绝大多数为西医诊断确切，手术、化疗后复发者。
1.2一般资料：设置对照组和治疗组。见表1
表1两组临床资料
1.3临床分期：按照国际抗癌联盟(UICC)1987年关于恶性肿瘤的TNM标准进行临床分期。51例恶性肿瘤患者中，多数是中期(占83％)，并有不同情况的转移，如淋巴结肿大，胃、脑、腹腔转移，伴胸、腹水及发烧，出血，疼痛等。
1.4临床诊断标准：根据现代医学检查，凡为阳性者可确诊肿瘤：①胸片、x线、cr、MRI、干板等仪器检查阳性(+)；②纤维支气管镜检查阳性(+)；③活体组织取材经病理组织检查阳性(+)；④分泌物脱落细胞学检查阳性(+)；⑤体腔积液抽水检查阳性(+)；⑥凡远端器官或部位有转移者；⑦临床症状表现与上述有关诊断相结合的明确诊断。
1.5治疗方法：治疗组应用中药组合物1剂/日，20天为一疗程，共3个疗程；对照组未用中药组合物。两组均同时进行辅助治疗，如祛胸水、腹水、止痛、止血、增进食欲和通便等。
1.6疗效标准：根据病情进行血、尿、便常规化验和特异性指标化验，x线拍片、B超、CT等检查，观察临床症状，如体重、咳嗽、进食、疼痛、出血、体温、呼吸、心率、胸水、腹水、肿瘤大小等。
2.观察结果，见表2
表2两组患者临床总疗效比较
经Ridit分析，两组间有显著性差异(概率P＜0.05)。
实施例2：
药理学实验
所用的中药组合物按照以下方法制备：
按以下质量份数称取各原料药：40-50份北豆根、20-30份地龙、40-60份黄芪、15-25份党参及5-10份三七。将上述原料药用蒸馏水浸泡1h后，煎煮2次，每次加入1L蒸馏水且每次煎煮30min，两次水煎药液混匀后，利用旋转蒸发仪浓缩至100mL，制成水煎剂，并用4℃保存，用于以下研究：
对人胰腺癌BxPC-3细胞进行体外培养，以中药组合物终浓度为80μg/mL、40μg/mL(中药组合物高剂量组、低剂量组)，5-FU终浓度为50μg/mL(5-FU组)的培养液进行干预，对照组(C组)用正常培养液培养，进行以下实验：细胞划痕实验测定BxPC-3细胞的运动能力；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测BxPC-3细胞增殖的抑制作用；流式细胞术(FCM)检测BxPC-3细胞的凋亡；Real-time PCR法检测BxPC-3细胞中Raf mRNA和MEK1 mRNA的表达；Western Blot法检测BxPC-3细胞中Raf蛋白和MEK1蛋白的表达。
1.实验材料
中药组合物由北豆根、地龙、黄芪、党参、三七。按常规方法浓缩煎液成2g/mL的生药浓度，灭菌后冷藏备用制备水煎液，4℃保存备用。人原位胰腺癌细胞株BxPC-3，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。噻唑蓝(MTT)(美国sigma公司)，改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗(青霉素100μg/mL及链霉素100μg/mL)、消化胰酶(美国HyClone公司)，Trizol试剂盒、DEPC(上海生工生物工程)，ExScriptTMRT-PCR kit、RNAiso Reagent(TAKARA公司)。
2.主要仪器设备
CO2培养箱(TC 2323型)，超净工作台，数显电热恒温干燥箱(202-2A型)，倒置相差显微镜(LH50A型)，酶联免疫检测仪(DG3022A型)，高速台式离心机(TGL-16C型)，离心机(LD42型)，研究用显微镜(BH-2型)，ABI7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；2700型PCR System扩增仪(Applied Biosystems公司)；UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津)。
3实验方法
3.1胰腺癌细胞株BxPC-3的体外培养
3.1.1细胞传代
吸出旧的培养液，加入PBS磷酸盐缓冲液洗涤两次。加入胰蛋白酶，确保消化胰酶和细胞充分作用。放于细胞培养箱内消化3～5分钟，在发现少量细胞脱落时，加培养液终止反应。收集细胞后以1500rpm离心5分钟，除去上清液后PBS液两次清洗。加入培养液后多次吹打，将单细胞悬液的浓度调到1×105个/mL。最后接种于培养瓶，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
3.1.2细胞冻存
提前配置冻存液(10％DMSO和90％FBS胎牛血清混合)，加入传代后的浓度调到3～9×106个/mL的细胞。装入多个准备好的冻存管里，先放入4℃。10分钟后取出，放入-20℃中。半小时后取出，放入-80℃。第二天取出，放入液氮内长期储存。
3.1.3细胞复苏
自液氮(-196℃)取出冻存管，立即投入37℃水浴。轻柔摇动，争取在2分种内融解管内液体。在放入超净工作台之前，以75％酒精擦拭管壁。将解冻的细胞悬液吸入EP管，以1000rpm离心3分种。再加入培养基，吹打成单细胞悬液。进行细胞计数，将浓度调为5×105个/mL。将培养瓶放于37℃、5％CO2培养箱内，第二天更换培养液。
3.1.4药物干预
应用胰蛋白酶对处于对数生长期的人胰腺癌细胞株BxPC-3进行消化。再用PBS液清洗三次，并且制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液。分别接种于四个培养瓶，间隔24小时后从培养箱取出。弃去培养液分组给药：中药组合物高剂量组为终浓度48μg/mL的中药组合物培养液；中药组合物低剂量组为终浓度24μg/mL的中药组合物培养液；5-FU组为终浓度50μg/mL的5-FU培养液；Control组为常规培养液。给药后放于细胞培养箱中48小时。
3.1.5细胞的计数
将盖玻片置于血细胞计数板凹槽，并擦拭干净。均匀吹打细胞，确保为单细胞悬液。吸取100μL加入等量的台盼蓝。将10uL混合液滴在并等其渗入盖玻片与计数板间隙，相差显微镜下计数。其活细胞浓度为：四个象限中存活(未染色)的细胞数之和/4×2×104。
3.2细胞划痕实验检测胰腺癌细胞株BxPC-3的运动能力
以油性(Marker)笔卡着直尺，在6孔板背面划横线。每条线间隔0.5cm～1cm，每孔不少于3条。将大约5×105个胰腺癌BxPC-3细胞，分别加入孔中。放于37℃、5％CO2培养箱，24小时后取出。以移液枪头(20μL)卡着直尺，垂直6孔板背面的横线进行划痕。以PBS液洗涤各孔，重复洗三次。在除去划掉的细胞后，分别给药：中药组合物高剂量组为终浓度48μg/mL的中药组合物培养液；中药组合物低剂量组为终浓度24μg/mL的中药组合物培养液；5-FU组为终浓度50μg/mL的5-FU培养液；Control组为常规培养液。每组各设4个复孔，给药后放于细胞培养箱中两天。每间隔24小时(0h、24h和48h)，对划痕位置拍照一次。在每孔随机选择3个位置，上述操作重复两次，使用图像处理软件(E-ruler 1.0)测出划痕距离。其划痕愈合百分比为：(1-48h划痕距离/0h划痕距离)×100％，用以反映BxPC-3细胞株的迁移运动能力。
3.3 MTT法检测胰腺癌细胞株BxPC-3的细胞增殖
取用对数生长期的BxPC-3细胞，以胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液。调整其细胞浓度至2×105个/mL，然后分别取100μL滴加于96孔培养板。常规培养24小时后，换液加药：中药组合物高剂量组为终浓度48μg/mL的中药组合物培养液；中药组合物低剂量组为终浓度24μg/mL的中药组合物培养液；5-FU组为终浓度50μg/mL的5-FU培养液；Control组为常规培养液。给药后放于37℃、5％CO2培养箱48小时。每组各设6个复孔，每孔加液量为100μL。继续培养44小时后，向各培养孔滴加10μL的MTT(5mg/mL)溶液。再次培养4小时后，终止培养。弃去培养液，向各孔滴加100μL的DMSO。置于水平摇床震荡10分钟，使结晶物溶解。设置酶标仪波长在490nm，检测各孔的光密度(OD)值。重复进行三次，用结果分析中药组合物和5-FU对BxPC-3细胞的抑制率。其增殖抑制率为：(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。
3.4FCM法检测胰腺癌细胞株BxPC-3的细胞凋亡
将处于对数生长期的BxPC-3细胞株浓度调至2×105/ml，分别移入25cm2的培养瓶。每瓶均加入4ml，并放入细胞培养箱培养一天。分别给药：中药组合物高剂量组为终浓度48μg/ml的中药组合物培养液；中药组合物低剂量组为终浓度24μg/ml的中药组合物培养液；5-FU组为终浓度50μg/ml的5-FU培养液；Control组为常规培养液。给药后放入细胞培养箱中两天，取出后PBS洗两遍。胰蛋白酶消化3～5分钟后，加培养液终止反应。以1500rpm离心5分钟，之后由PBS洗涤两次。每管加Annexin V-FITC试剂5μL，混合后进行10分钟的室温(20～25℃)避光孵育。再以1000rpm离心5分钟，除去上清后，每管加Annexin V-FITC结合液190μL。每管加10μL的碘化丙啶(Propidium iodide，PI)进行染色，混合后冰浴，同时注意避光。使用流式细胞仪检测，在488nm激发波长处检测红色荧光，以及光散射的数据。以细胞仪自带的软件(CellQuest)收集所有数据，并进行处理和分析。
3.5采用实时定量PCR技术检测BxPC-3细胞中Raf和MEK1 mRNA表达水平
Trizol试剂分别提取各组细胞总RNA。总RNA经紫外线分光光度计定量后，按基因公司逆转录试剂盒操作步骤逆转录反应合成cDNA，-80℃保存备用。应用Primer5.0软件进行待测基因及内参基因的引物设计。应用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时定量PCR，反应体系及条件参考试剂盒说明书。
3.6 Western Blot法检测BxPC-3细胞中Raf蛋白和MEK1蛋白的表达
药物处理一定时间后，提取细胞总蛋白。型号为BCA-100蛋白质定量测定试剂盒测定样品总蛋白含量。每泳道加总蛋白20μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉TBST液浸泡3h，加入相应的I抗孵育4℃过夜，用TBST液洗膜5min×3次。与相应的II抗室温下孵育1h，用TBST液洗膜5min×3次，将膜放在1mL ECL发光试剂混合液中孵育约1min，吸掉混合液，保鲜膜固定，X线胶片曝光1～10min，显影、定影。定影及DAB显色，将反应的显影条带扫描，图像保存入计算机，用Bandscan 5.0软件对图像进行分析。
3.7统计分析
使用统计学软件SPSS 13.0进行数据处理，所获数据均符合正态分布和方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。实验数据以“均数±标准差”表示，P＜0.05差异具有统计学意义，P＜0.01极显著差异具有统计学意义。
4实验结果
4.1中药组合物对胰腺癌细胞株BxPC-3运动能力的影响
表3中药组合物对胰腺癌细胞株BxPC-3运动能力的影响
组别 给药剂量(μg/m1) 愈合百分比(％) 中药组合物高剂量组 48 28.24±1.02** 中药组合物低剂量组 24 33.28±2.71** 5-FU组 50 34.20±0.75** Control组 - 58.27±1.45
注：各组与Control组比较，**表示P＜0.01。
表3显示，Control组细胞的愈合速度较快，中药组合物高剂量组相对较慢。各给药组与Control组比较，抑制了BxPC-3细胞的运动。P＜0.01，均有显著性差异。
4.2中药组合物对胰腺癌细胞株BxPC-3细胞增殖的影响
表4中药组合物对胰腺癌细胞株BxPC-3细胞增殖的影响
组别 给药剂量(μg/ml) 增殖抑制率(％) 中药组合物高剂量组 48 70.81±1.21** 中药组合物低剂量组 24 44.98±2.08** 5-FU组 50 58.50±3.34 Control组
注：各组与5-FU组比较，**表示P＜0.01。
表4的实验结果表明，中药组合物高剂量组的细胞增殖抑制率为(70.81±1.21)％；中药组合物低剂量组的细胞增殖抑制率为(44.62±3.06)％；5-FU组的细胞增殖抑制率为(58.50±3.34)％。与5-FU组比较，中药组合物高剂量组和中药组合物低剂量组的抑制率都具有显著差异(P＜0.01)。
4.3中药组合物对胰腺癌细胞株BxPC-3细胞凋亡的影响
表5中药组合物对胰腺癌细胞株BxPC-3细胞凋亡的影响
组别 给药剂量(μg/ml) 细胞凋亡率(％) 中药组合物高剂量组 48 10.72±0.29** 中药组合物低剂量组 24 5.38±0.21** 5-FU组 50 6.23±0.26** Control组 - 2.32±0.12
注：各组与Control组比较，**表示P＜0.01。
应用流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)，检测胰腺癌细胞BxPC-3细胞凋亡。其检测结果如表5所示：左上象限(机械损伤或坏死细胞)；左下象限(活细胞)；右上象限(晚期凋亡细胞)；右下象限(早期凋亡细胞)。各组凋亡率分别为其对应的右上象限与右下象限细胞之和。AnnexinV-FITC、碘化丙啶(PI)双染的结果所示：中药组合物高剂量组的细胞凋亡率为(10.72±0.29)％；中药组合物低剂量组的细胞凋亡率为(5.38±0.21)％；5-FU组的细胞凋亡率为(6.23±0.26)％；Control组的细胞凋亡率为(2.32±0.12)％。各给药组与Control组比较，细胞凋亡率均有显著提高(P＜0.01)。
4.4中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞RafmRNA表达的影响
表6中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞RafmRNA表达的调控
注：各组与Control组比较，**表示P＜0.01。
表6结果表明，与Control组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组、5-FU组RafmRNA表达均明显降低，具有显著差异(P＜0.01)。
4.5中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞MEK1 mRNA表达的影响
表7中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞MEK1 mRNA表达的调控
注：各组与Control组比较，**表示P＜0.01。
表7所示，与Control组比较，中药组合物高剂量组、中药组合物低剂量组和5-FU组MEK1 mRNA表达降低，其差异显著(P＜0.01)。
4.6中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中Raf蛋白表达的影响
如图1、图2所示
表8中药组合物对BxPC-3细胞中Raf蛋白表达的影响
组别 剂量(μg/ml) Raf/GAPDH(OD值) 中药组合物高剂量组 80 0.9283±0.1967** 中药组合物低剂量组 40 1.3106±0.2219* 5-FU 50 1.2737±0.1082* C 等体积生理盐水 1.8304±0.2171
注：与C组比较P＜0.05表示为*，P＜0.01表示为**。
结果如表8及图1、图2所示，与C组相比，各给药组Raf蛋白表达均有降低；凝胶成像分析系统分析OD值后，中药组合物高剂量组Raf蛋白的表达有显著性差异(P＜0.01)，中药组合物低剂量组、5-FU组Raf蛋白的表达有统计学意义(P＜0.05)。
4.7中药组合物对胰腺癌BxPC-3细胞中MEK1蛋白表达的影响
如图3、图4所示
表9中药组合物对BxPC-3细胞中MEK1蛋白表达的影响
组别 剂量(μg/mL) MEK1/GAPDH(OD值) 中药组合物高剂量组 80 0.6902±0.1152** 中药组合物低剂量组 40 0.6508±0.1229** 5-FU 50 0.7988±0.0192* C 等体积生理盐水 1.2789±0.1766
注：与C组比较P＜0.05表示为*，P＜0.01表示为**。
结果如表9及图3、图4所示，与C组相比，各给药组MEK1蛋白表达均有降低；凝胶成像分析系统分析OD值后，中药组合物高剂量组和低剂量组MEK1蛋白的表达，有显著性差异(P＜0.01)；5-FU组MEK1蛋白的表达有统计学差异(P＜0.05)。