技术领域
本发明属于一种食品加工技术领域，涉及一种胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚制品及其制备方法，具体涉及一种在普通市售生鲜桑葚及桑葚干中含有的胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚制品及其制备方法。
背景技术
桑葚为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥果穗，俗名桑枣，桑果，呈椭圆形深紫色或黑色。另，桑葚和桑椹为同一物，特此说明，本文采用桑葚表述。在我国许多古典医药著作中都有记载，如唐代《新修本草》有“单食，主消渴”；明朝《本草纲目》有“捣汁饮，解酒中毒；酿酒服，利水气，消肿”等。桑葚中含有多种活性成分，比如花青素、多酚、黄酮、多糖、蛋白类等。在中国和韩国，桑葚被作为传统民间药用于治疗发热、贫血、咽喉痛以及高血压。很多文献报道了桑葚具有多种生物活性，比如保肝、抗氧化、抗菌、降血脂、抗炎和抗细胞凋亡活性。不少文献也报道了桑葚在免疫调节方面的作用，比如可促进小鼠的免疫功能、造血功能及防止环磷酰胺所致的白细胞减少。1993 年，中国国家卫生部把桑葚列为“既是食品又是药品”的农产品之一。桑葚可直接食用或制成桑葚酒、桑葚汁、果酱以及罐头。这些都表明桑葚具有较好的药食两用价值。
据本草文献记载，桑葚性寒味甘，脾胃虚寒者不宜多服。并且近年来，有文献报道，儿童过量服用桑葚引起出血性肠炎等症状，也有文献提到桑葚中含有胰蛋白酶抑制剂，胃肠功能发育尚未健全的儿童及胃肠功能较弱的成年人不宜多食。《中药学》教材p465记载桑葚“脾胃虚寒，大便溏泄者忌服。另小儿多食，可引起出血性肠炎，宜慎”。但迄今未见实验研究桑葚中的胰蛋白酶抑制剂的论文及文献。
生理状态下，胰液由胰泡和导管细胞分泌，经胰腺导管排入十二指肠。胰蛋白酶是胰液的组成之一，属于丝氨酸蛋白水解酶，它与动物的胃肠道消化相关。胰蛋白酶抑制剂是一种抗营养因子，尤其当过度摄入桑葚时，食糜中胰蛋白酶与抑制因子结合，导致游离胰蛋白酶减少，肠促胰酶素分泌增加，刺激胰腺分泌更多的胰蛋白酶补充肠道，过分刺激胰腺分泌，势必造成胰腺分泌失调性肥大、增生甚至损伤，出现消化吸收功能紊乱。胰腺的过分分泌导致胰腺管内压力升高，可能引起小导管和胰泡破裂，胰蛋白酶原进入胰腺间质，被组织激活成为活性胰蛋白酶，该活性胰蛋白酶直接消化胰腺组织，导致胰腺肿大及急性胰腺炎。此外，胰腺组织超过生理强度分泌大量胰液时，也会造成胰腺应激氧化损伤。因此对桑葚中的胰蛋白酶抑制剂进行失活处理很有必要。
桑葚虽含有多种活性成分，具有多种药理作用，有种种美誉，且我国的桑葚资源也很丰富，但市面上很少见到生鲜桑葚的身影，原因之一是生鲜桑葚皮薄多汁易损易腐败，原因之二是生鲜桑葚中含有胰蛋白酶抑制剂，食用后易引起腹泻等消化系不适。同时，即使是桑葚干品，市面上也不多见，这其中原因很多，桑葚干品中的胰蛋白酶抑制剂并未失活，很多人食用桑葚干品后容易出现腹泻等消化系不适是重要原因。这说明桑葚并没有形成它应有的市场，桑葚的副作用阻碍了它为人类社会的服务。由于桑葚中含有的胰蛋白酶抑制剂对于人类消化系统的损伤作用，大大限制了药食两用资源桑葚的实际应用。桑葚即使作为中药饮片使用，我国药典给出的成人每日使用量也只是9-15g左右，大约相当于3-5颗桑葚的量。
现在，可以检索到很多关于桑葚加工利用的专利文献。主要有以下两类：（1）桑葚膏或含有桑葚的复方膏剂，由于桑葚中的胰蛋白酶抑制剂对热稳定（详见后述），仅仅加热熬膏，并不能完全使桑葚中的胰蛋白酶抑制剂失活；（2）将桑葚加工成为桑葚酒、醋、酸奶、饮料等，在这些加工处理过程中，桑葚中的胰蛋白酶抑制剂可能被失活分解，也可能在产品的澄清工序中被沉淀除去，也可能继续留在产品中，但不论是什么结果，第二类产品的加工过程都比较冗长复杂，而且不是对桑葚资源的直接利用和全部利用。
经检索，未见桑葚中胰蛋白酶抑制剂的试验研究文献，更未见失活桑葚中胰蛋白酶抑制剂的专利技术文献。桑葚中的胰蛋白酶抑制剂具有较强的热稳定性（详见后述），仅靠加热煎煮不足以失活桑葚中的胰蛋白酶抑制剂，有必要进一步研究有效失活桑葚中胰蛋白酶抑制剂的技术措施。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，提供一种普通市售桑葚中含有的胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚制品及其制备方法，实现桑葚资源的全部利用。
本发明在研究清楚桑葚中存在蛋白类胰蛋白酶抑制剂的基础上，提供以下技术，失活桑葚中的胰蛋白酶抑制剂，所使用的添加剂符合食品要求，所采用的加工措施也是常规食品加工措施。采用成熟的桑葚为原料，制成品符合食品规范要求。
本发明提供一种胰蛋白酶抑制剂失活处理的桑葚制品，所述桑葚制品经过胰蛋白酶抑制剂被失活处理；所述桑葚制品为桑葚片或桑葚提取物。
本发明还提供一种胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚制品的制备方法；其中所述桑葚制品为桑葚片或桑葚提取物。
其中所述胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚片的制备方法，具体操作如下：
将桑葚切成约为1-2 mm的薄片，将一定量的碱性蛋白酶液均匀喷于薄片上，调pH值，一定温度下水浴加热温育一段时间，反应结束后，在70℃下灭活碱性蛋白酶10 min。烘干，得到碱性蛋白酶处理后的桑葚片，备用。
失活胰蛋白酶抑制剂的最佳条件为：pH值为8.5，相对于每g桑葚片，碱性蛋白酶添加量为1000-3000 U，温育温度为40-60 ℃，温育时间为40-80 min，在此条件下胰蛋白酶抑制剂的失活率约为85%，经处理后，桑葚片的外观色彩、风味及重量均无明显变化。
由于酶对底物的专一性，经处理后桑葚片的活性成分无明显变化，详见后述实施例。
其中所述胰蛋白酶抑制剂失活处理的桑葚提取物的制备方法，具体操作如下：
将桑葚干粉碎，称取适当重量的桑葚粉，分别经95%乙醇提取2次、蒸馏水提取1次，抽滤，合并3次滤液，将滤液浓缩干燥得到桑葚提取物（ME），得率为80%。也可直接采用新鲜桑葚为原料，捣碎后按照上述方法制备桑葚提取物（ME）。取一定量的桑葚提取物粉末，将一定量的碱性蛋白酶液调pH值，均匀喷于该粉末上，使充分湿润，一定温度下水浴加热温育一段时间，反应结束后，在70℃下灭活碱性蛋白酶10 min。烘干，得到碱性蛋白酶处理后的桑葚提取物（T-ME），备用。
失活桑葚提取物中胰蛋白酶抑制剂的最佳条件为：pH值为8.5，相对于每g桑葚提取物，碱性蛋白酶添加量为1000-3000 U，温育温度为40-60 ℃，温育时间为40-80 min，在此条件下胰蛋白酶抑制剂的失活率约为85%，经处理后的桑葚提取物与处理之前的桑葚提取物相比，外观色彩、风味及重量均无明显变化。
由于酶对底物的专一性，经处理后桑葚提取物与处理之前的桑葚提取物相比，活性成分无明显变化，详见后述实施例。
本发明还提供一种胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚制品的应用，具体为增进免疫功能；对于白细胞减少症患者，具有一定的升白、促进造血功能以及免疫增强作用。
本发明的有益效果阐述如下：
(1)处理过程十分简单有效，采用对底物具有高度专一性的蛋白酶分解桑葚中的胰蛋白酶抑制剂，将该胰蛋白酶抑制剂降解为人可以吸收利用的氨基酸或肽类，同时不改变桑葚的外观色彩和内在的活性成分，实现了桑葚资源的全部利用；
(2)采用本专利技术制备的桑葚产品，人们可以像食用普通水果片那样食用，也可以用于组方熬膏，不必担心引起肠炎或造成对胰腺的损伤等；
(3)在解除了桑葚的负面作用后，桑葚的各项生理活性作用更加显著。实验结果显示未经处理的普通市售桑葚可轻微促进成年小鼠的免疫功能，而胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚明显促进成年小鼠的免疫功能；对于白细胞减少症小鼠模型，未经处理的普通市售桑葚具有一定的升白、促进造血功能以及免疫增强作用，而胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚的相应调节作用更显著。
附图说明
图1为桑葚对胰蛋白酶的抑制动力学曲线；其中，曲线a：未加入抑制剂；曲线b：加入
抑制剂的浓度为2.5 mg/mL；曲线c：加入抑制剂的浓度为5.0 mg/mL。
图2为桑葚中胰蛋白酶抑制剂的热稳定性结果。
图3为大豆中胰蛋白酶抑制剂的热稳定性结果。
图4为ME和T-ME对小鼠体重的影响，图中a*表示与正常组比较有显著性差异（P<0.05）。
图5为2周末小鼠胰腺病理切片在光学显微镜的图片（400×）；图中，箭头a表示高剂量组小鼠胰腺组织结构紊乱，有大量炎症细胞浸润；箭头b表示充血肿胀。
图6为ME和T-ME对小鼠胰腺的氧化损伤程度；其中，图A14、A28：2周末和4周末
小鼠的胰腺指数；图B14、B28：2周末和4周末小鼠胰腺中丙二醛（MDA）的含量；图C14、C28：2周末和4周末小鼠胰腺中总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活力；*表示与正常组比较有显著性差异（P<0.05）。
图7为ME和T-ME对小鼠细胞免疫指标的影响；图中，图A：4周末小鼠血清溶血素抗体积数水平；图B：4周末小鼠的巨噬细胞吞噬比率。
图8为ME和T-ME对环磷酰胺所致白细胞减少症小鼠免疫功能的影响；图中，A为血清溶血素抗体水平结果；B为腹腔巨噬细胞的吞噬能力结果；C为对刀豆蛋白A( ConA)诱导的脾淋巴细胞的增值能力的影响；D为对脂多糖(LPS)诱导的脾淋巴细胞的增值能力的影响；图中，与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001。
具体实施方式
本发明通过以下实施例来说明本发明的技术效果。本发明中所涉及的猪胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶、碱性蛋白酶液、环磷酰胺溶液等相关试剂或材料均是常规市售。
幼年小鼠、无特定病原体动物(SPF级)小鼠来源于江苏大学实验动物中心。
胰腺指数、胰腺中丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、血清溶血素抗体水平、腹腔巨噬细胞吞噬比率、白细胞、红细胞、骨髓有核细胞、脂多糖(LPS)诱导的脾淋巴细胞的增殖等检测均是通过市售相关试剂盒完成。
动物实验的病理切片由江苏大学附属江滨医院检验科完成。
实施例1：桑葚中存在蛋白类的胰蛋白酶抑制剂的作用机制
本发明所述的桑葚中的胰蛋白酶抑制剂由市售桑葚中提取，提取方法参照大豆中胰蛋白酶抑制剂的常规提取制备方法。
本发明专利申请人采用经典的Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺(BAPNA)测定法，阐明桑葚中存在蛋白类的胰蛋白酶抑制剂及其作用机制，本发明以猪胰蛋白酶（常规市售）为底物，测得桑葚中胰蛋白酶抑制剂对猪胰蛋白酶的抑制作用强度为34.2TUI/mg。图1显示了该抑制剂的作用类型，该图是根据赖氏方程（Lineweaver-Burk）采用双倒数作图法，以1/ V对1/[S]作图得出，纵坐标1/ V表示反应速度V的倒数，横坐标1/[S] 表示底物浓度[S]的倒数，不同抑制剂浓度条件下的三条曲线的交点位于第三象限，表明桑葚对胰蛋白酶的抑制作用表现为非竞争性抑制和反竞争性抑制混合型，桑葚中胰蛋白酶抑制剂（TI）不仅可与酶-底物复合物结合，也可与胰蛋白酶活性中心以外的必需基团结合，使底物与胰蛋白酶特异性结合受到抑制，从而降低胰蛋白酶的活性，甚至使其活性丧失。
实施例2：桑葚中的胰蛋白酶抑制剂的稳定性研究
申请人对比研究了大豆中含有的胰蛋白酶抑制剂和桑葚中的胰蛋白酶抑制剂的热稳定性。众所周知，大豆中含有胰蛋白酶抑制剂，主要类型是Bowman-Birk和Kunitz型，它是大豆中主要的抗营养因子。如图2所示，在100℃加热10min、20min、30min和60min时，桑葚中的胰蛋白酶抑制剂活性分别仅下降了12.1%、13.5%、16.5%和17.9%。而如图3所示，在100℃加热处理10min、20min、30min和60min时，大豆中的胰蛋白酶抑制剂活性分别下降了12.1%、19%、27%和39.6%。可见，桑葚中的胰蛋白酶抑制剂具有较强的热稳定性，仅靠加热煎煮不足以失活桑葚中的胰蛋白酶抑制剂，有必要进一步研究有效失活桑葚中的胰蛋白酶抑制剂的其它技术措施。
实施例3：胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚提取物制备及活性成分含量比较
称取10g烘干后的桑葚全果，粉碎，分别经95%乙醇提取2次、蒸馏水提取1次，料液比（g:mL）1:10，抽滤，合并3次滤液，将滤液减压浓缩，真空冷冻干燥得到桑葚提取物（mulberry extract, ME），得率为80%。取5g桑葚提取物粉末，将1000 U碱性蛋白酶液调pH值8.5，均匀喷于该粉末上，至充分湿润，50 ℃温育50 min，反应结束后，在70℃下灭活碱性蛋白酶10 min。烘干，得到碱性蛋白酶处理后的桑葚提取物（treated mulberry extract, T-ME），备用。经此处理后胰蛋白酶抑制剂的失活率约为85%。
分析表明，T-ME中的活性成分与ME相比较，未见明显变化，见表1。
表1. ME和 T-ME的活性成分
实施例4：胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚提取物对幼年小鼠生长、消化系统及免疫能力的影响
为了评价比较桑葚中胰蛋白酶抑制剂失活处理的生物学效应，本实施例进行了正常幼年小鼠饲喂试验。取60只幼年小鼠，雄性，10 ~ 12g，随机分为5组（n=12）。①正常组；②ME低剂量组；③ME高剂量组；④经碱性蛋白酶处理后的ME（T-ME）低剂量组；⑤经碱性蛋白酶处理后的ME（T-ME）高剂量组。第①组小鼠每天灌胃给予与给药组等量的生理盐水；第②、④组每天分别灌胃给予ME和T-ME 1.8 mg·g-1·d-1 ；第③、⑤组每天分别灌胃给予ME和T-ME 5.4 mg·g-1·d-1。小鼠每两天称一次体重，并随之调整给药剂量。实验周期分别为2周、4周，实验结束前12 h，小鼠禁食，自由饮水。本实验中小鼠给药剂量是依据《中国药典》中人体每日桑葚最大摄取量9 ~ 15 g，并根据人体与动物等效剂量换算得出的，换算结果为小鼠每日最大摄取量为1.17-1.95 mg·g-1。
胰蛋白酶抑制剂被失活处理前后的桑葚对正常幼年小鼠体重的影响试验结果见图4，给药2周末，与空白组比较，ME高剂量组小鼠体重显著降低（P<0.05），T-ME高剂量组小鼠体重显著增高（P<0.05），表明T-ME可促进幼年小鼠的生长，而ME对幼年小鼠的生长有抑制作用；给药4周末，桑葚各组与空白组比较均无显著变化（P>0.05），表明可能由于成年小鼠的耐受力增强，ME对成年小鼠的生长影响不显著。试验结果总体趋势表明，T-ME可促进小鼠生长，而ME 对小鼠的生长有抑制作用。
对小鼠生长指标研究完毕后，将小鼠处死，取小鼠全血及小鼠脏器进行下一步试验研究。
首先对小鼠消化系统进行评价：
如图5显示失活处理前后的桑葚提取物对小鼠胰腺结构的影响，给药2周末，除ME高剂量组，其余各组与空白组小鼠胰腺组织结构形态在光镜下无明显差异，结构完整，纹理清晰，腺泡细胞排列整齐，几乎无细胞破坏和炎症细胞浸润。而ME高剂量组小鼠胰腺组织结构紊乱，有大量炎症细胞浸润[如图5(C)中箭头a所指示]，充血肿胀[如图5(C)中箭头b所示]。给药4周末，与空白组比较，各组小鼠胰腺组织结构形态未见明显差异。表明桑葚中TI可引起幼年小鼠胰腺组织病理性损伤，由于成年小鼠耐受力增强，桑葚对成年小鼠胰腺组织结构未见明显损伤。
本实验表明ME高剂量可造成幼年小鼠胰腺组织炎性细胞浸润及充血肿胀，而T-ME高剂量对幼年小鼠胰腺组织没有明显影响，这与儿童大量服用桑葚引起出血性肠炎的临床报道相一致（毛继录, 周青云, 孙耀民. 桑葚引起出血性肠炎2例报告 [J]. 中国医刊, 1984, 05.）。
失活处理前后的桑葚提取物对正常幼年小鼠胰腺指数影响的试验结果见图6。
给药2周末，与空白组比较，ME高剂量组小鼠胰腺指数显著增高（P<0.05），表明ME高剂量组可导致幼年小鼠胰腺肿胀，见图6(A14)；给药4周末，桑葚各组与空白组比较均未见显著差异（P>0.05），见图6(A28)。
给药2周末，与空白组比较，ME高剂量组小鼠胰腺中丙二醛（MDA）含量显著增高（P<0.05），其余各组无显著变化（P>0.05）；给药4周末，各组与空白组比较均无显著变化（P>0.05），结果如图6(B14)、图6(B28)所示。
给药2周末，与空白组比较，ME高剂量组总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力显著降低（P<0.05），其余各组无显著变化（P>0.05）；给药4周末，各组与空白组比较均无显著变化（P>0.05），结果如图6(C14)、图6(C28)所示。
上述结果表明桑葚中TI可引起幼年小鼠胰腺氧化损伤，由于成年小鼠耐受力增强，桑葚对成年小鼠未见显著影响。上述试验结果提示了桑葚中TI造成小鼠胰腺氧化应激损伤的可能机制。胰蛋白酶抑制剂是一种抗营养因子，尤其当过度摄入桑葚时，食糜中胰蛋白酶与抑制因子结合，导致肠液中游离胰蛋白酶减少，诱导肠促胰酶素分泌增加，从而刺激胰腺分泌更多的胰蛋白酶补充肠道；在刺激胰腺合成、分泌大量消化酶的过程中，为了合成DNA、mRNA、消化酶、肽类激素，需要大量ATP合成嘌呤、嘧啶及活化氨基酸。大量ATP的生成过程导致大量游离基的产生，而过量自由基能通过氧化细胞膜、DNA、脂质等膜成分对细胞造成损伤，进而使胰腺等消化器官发生病变。由此推测桑葚中TI对胰腺造成的损伤可能与其诱发机体产生的氧化应激有关。MDA的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度，而SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力。本实验通过测定小鼠胰腺组织中的MDA含量和T-SOD活力，显示ME可造成幼年小鼠胰腺氧化损伤，而T-ME组幼年小鼠胰腺未见氧化损伤，这表明桑葚中TI对幼年小鼠胰腺组织结构造成的损伤机理可能与TI诱发机体产生
的氧化应激有关。
其次对小鼠的免疫指标进行评价：
图7显示失活处理前后的桑葚对小鼠免疫指标的影响。
给药4周末，与空白组比较，ME高剂量组与T-ME高剂量组小鼠血清溶血素抗体水平均有显著增强趋势（P<0.05和P<0.001），见图7(A)。
给药4周末，与空白组比较，ME高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬比率与T-ME高剂量组均有一定的增高趋势，T-ME高剂量组有显著变化（P<0.05），如图7(B)所示。本实验结果显示ME可轻微促进成年小鼠的免疫功能，而T-ME明显促进了成年小鼠的免疫功能，这表明桑葚中TI减弱了桑葚的免疫增强作用。
实施例5：胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚提取物对环磷酰胺致白细胞减少症小鼠免疫功能的影响
恶性肿瘤的治疗主要采用放化疗，放化疗会引起白细胞减少、红细胞减少及骨髓抑制等副作用的出现，同时引起病人免疫力低下，极易并发各种感染甚至死亡，因此有必要寻找能有效升高白细胞数量、提高机体免疫功能且副作用小的辅助治疗药物。为此，本专利申请人还研究了胰蛋白酶抑制剂被失活前后的桑葚对环磷酰胺致白细胞减少症小鼠免疫功能的影响。考虑到癌症病人一般需连续进行多次化疗，故本试验采用先后两次连续注射环磷酰胺致白细胞减少症小鼠模型考察TI失活前后的桑葚对模型小鼠白细胞、红细胞、骨髓细胞及免疫功能的影响。
采用SPF级小鼠72只，雌雄各半，20 g左右，随机分为6组（n=12）。各组给药方案为：①正常对照组：第1 ~ 17天小鼠每天灌胃给予生理盐水（0.2 mL/10g/d）；②模型对照组：第1~ 17天小鼠每天灌胃给予生理盐水（0.2 mL/10g/d）；③ME低剂量组：第1 ~ 17天每天灌胃给予ME（1.8 mg/g/d）；④ME高剂量组：第1 ~ 17天每天灌胃给予ME（5.4 mg/g/d）；⑤T-ME低剂量组：第1 ~ 17天每天灌胃给予T-ME（1.8 mg/g/d）；⑥T-ME高剂量组：第1 ~ 17天每天灌胃给予T-ME（5.4 mg/g/d）。造模方案为：对于第②—⑥组，第4 ~ 6天、第11 ~ 13天小鼠每天腹腔注射环磷酰胺溶液（80 mg/kg/d）。主要试验结果见下述。
如表2所示，实验第7天，与正常组比较，模型组与给药组的白细胞数（WBC）明显下降，且具有统计学意义，表明白细胞减少症小鼠模型制备成功。数据显示，与模型组比较，给药组各项指标均无显著性差异（P>0.05），说明桑葚对环磷酰胺引起的白细胞减少无预防作用。
实验第10天，与正常组比较，模型组，ME低剂量组，T-ME低剂量组的WBC和RBC均有显著性差异（P<0.05），同时，与模型组比较，ME高剂量组和T-ME高剂量组的WBC和RBC均显著性增加（P<0.05），此外，T-ME高、低剂量组的WBC与ME高、低剂量组比较均显著性增加（P<0.01）。
实验第14天，与正常组比较，模型组与给药组的WBC和RBC均明显下降（P<0.001），说明白细胞减少症小鼠模型第二次造模成功。
实验第17天，与正常组比较，各组WBC和RBC均显著下降，但同时，与模型组比较，ME高剂量组、T-ME高剂量组的WBC显著增加（P<0.05和P<0.001），以及T-ME高剂量组的RBC也显著增加（P<0.05），此外，T-ME高剂量组的WBC、RBC与ME高剂量组比较均显著性增加（P<0.01和P<0.05）。
上述结果表明，桑葚对环磷酰胺引起的小鼠白细胞减少无预防作用，ME及T-ME均有明显的升白作用，且T-ME效果较ME明显；此外，与第一轮注射环磷酰胺比较，第二轮注射后，ME及T-ME的升白作用减弱。推测是因为两轮注射环磷酰胺后，动物受到很大摧残。
表2 桑葚对两次注射环磷酰胺致白细胞减少症小鼠白细胞数的影响
注：与正常组相比，* P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，# P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001；同等剂量组间比较，aaP<0.01。
如表3所示，实验第10天，与正常组比较，模型组、ME低剂量组和T-ME低剂量组的骨髓有核细胞数（BMC）均明显下降，同时，与模型组比较，ME高剂量组和T-ME高剂量组的BMC明显增高（P<0.01和P<0.001），此外T-ME高剂量组与ME高剂量组比较显著性增加（P<0.01）；实验第17天，与正常组比较，各组的BMC均明显下降，同时，与模型组比较，ME高剂量组和T-ME高剂量组的BMC均显著性增高（P<0.05和P<0.01），此外，与ME高剂量组比较，T-ME高剂量组显著性增加（P<0.05）。
表3 桑葚对两次注射环磷酰胺致白细胞减少症小鼠骨髓有核细胞数的影响
注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001；同等剂量组间比较，aP<0.05，aaP<0.01。
ME和T-ME对小鼠免疫功能的影响见图8。
如图8A所示，实验第10天，与空白组比较，模型组、ME高、低剂量组的血清溶血素抗体水平均显著下降，同时，与模型组比较，ME和T-ME高剂量组均显著增加（P<0.05和P<0.001）；在实验第17天，与空白组比较，各组的血清溶血素抗体水平均显著下降，同时，与模型组比较， T-ME高剂量组显著增加（P<0.05）。
如图8 B所示，与空白组比较，模型组、ME高、低剂量组和T-ME低剂量组的腹腔巨噬细胞的吞噬能力均显著下降，同时，与模型组比较，ME和T-ME高剂量组均显著增强（P<0.05和P<0.001）；在实验第17天，与空白组比较，各组的腹腔巨噬细胞的吞噬能力均显著下降，同时，与模型组比较，T-ME高剂量组显著增强（P<0.05）。
对ConA诱导的脾淋巴细胞的增殖能力的影响如图8C所示，与空白组比较，模型组、ME高、低剂量组和T-ME低剂量组均显著降低，同时，与模型组比较，ME和T-ME高剂量组均显著增强（P<0.01和P<0.001）；在实验第17天，与空白组比较，各组均显著降低，同时，与模型组比较，T-ME高剂量组均显著增强（P<0.05）。
对LPS诱导的脾淋巴细胞的增殖能力的影响如图8D所示，与空白组比较，模型组、ME高、低剂量组和T-ME低剂量组均显著降低，同时，与模型组比较，ME和T-ME高剂量组均显著增强（P<0.05和P<0.01）；在实验第17天，与空白
组比较，各组均显著降低，同时，与模型组比较T-ME高剂量组均显著增强（P<0.05）。
实施例6：胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚片的制备技术
将桑葚切成约为1 mm的薄片，每g桑葚薄片使用碱性蛋白酶的量为2000 U/g，将一定量的碱性蛋白酶液调pH值8.5，均匀喷于薄片上至湿润，55 ℃温育60 min，反应结束后，在70℃下灭活10 min。烘干，得到碱性蛋白酶处理后的桑葚片。在此条件下测得胰蛋白酶抑制剂的失活率为85.3%。
实施例7：胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚片的活性成分含量比较
将制备的胰蛋白酶抑制剂被失活处理的桑葚片烘干粉碎，称取10g的桑葚粉，放置锥形瓶中，超声辅助提取，料液比为1:10（g / mL），温度为40℃，功率为300W，提取时间为30min，分别经95%乙醇提取2次、蒸馏水提取1次，抽滤，合并3次滤液，将滤液在45℃，55r/min条件下旋转蒸发浓缩，再经冷冻干燥得到酶法炮制处理（酶法炮制处理即前述酶法处理）的桑葚片提取物（Extract of treated mulberry flakes , T-MFE）8g，得率为80%。由于每g桑葚片中碱性蛋白酶粉添加量为2mg，因此，其提取物的得率与桑葚干提取物的得率相同。
分析测定经酶法炮制处理的桑葚片及未经蛋白酶处理的桑葚干提取物中的活性成分含量，并统一换算为桑葚干物质中的含量，数据表明，桑葚片经酶法炮制前后各活性物质含量未见明显变化，见表4。
表4 桑葚干经酶法炮制前后的活性成分含量
以酶法炮制处理的桑葚片提取物及未经处理的桑葚干提取物为供试药品，进行动物实验，测定其对正常小鼠消化系统、白细胞减少症小鼠的造血系统及免疫功能的调节作用，试验结果表明，桑葚片经酶法炮制前后各项生物学活性评价试验结果与前述胰蛋白酶被失活处理前后的桑葚提取物的对应试验结果相同，不再一一列举。