本发明涉及使用流式细胞光度术进行致激性淋巴细胞转化试验（通常称作细胞转化试验）的方法。由于该方法的简便性及具有多种用途，它适用于临床，不象其它常规方法那样，因其复杂性和精密性而主要用于实验室研究中。 已知淋巴细胞的活化或致激作用是指当该抗原与致敏淋巴细胞反应时通常发生在体内的某一过程的体外关联作用。淋巴细胞转化是由Nowell于1960年首次使用的术语，Hirschorn后来用其来描述小型休止淋巴细胞经暴露于促细胞分裂剂植物凝血素（PHA）下转变为淋巴母细胞时所发生的形态变化。胚细胞样转变是指大型嗜焦宁细胞的形成过程，后者与受特异性促细胞分裂剂和抗原刺激的淋巴细胞培养物中的胚细胞相似。淋巴细胞活化作用是一种通常用来评估实验对象的细胞免疫性的体外技术，这些实验对象是免疫缺陷性的，患有传染性和自身免疫性疾病或肿瘤。在与促细胞分裂剂一起温育之后，发生了许多复杂的生化反应。促细胞分裂剂是能刺激大量淋巴细胞的物质，它不需要预先的致敏作用，但这种作用对抗原刺激作用却是必要的。生化反应包括与膜相关联的早期的现象，例如磷脂合成的增加、二价阳离子通透性的增加、腺嘌呤环化酶的活化作用和胞内cAMP的同时增加。紧随着这些现象之后，蛋白质、RNA及DNA合成发生了。正是这个最后地现象（即DNA合成）先于细胞分裂，它是对淋巴细胞活化作用的多数临床重要性试验的基础。便利性和习惯性使得临床免疫学家使用DNA合成而没有使用前面提及的变化例如cAMP或磷脂代谢的增加等等作为淋巴细胞活化作用的标志物。
淋巴细胞转化作用最早是通过对培养物中存在的淋巴母细胞百分比的形态试验来评估的。不过，这种方法因其极端变异性和结果的主观性而被废弃了。对DNA合成更准确的估价目前是通过培养物的脉冲标记来进行的，其中使用了氚标记胸苷（3H-TdR），这是在合成中掺入DNA的一种放射性核苷酸前体。氚标记胸苷的摄入量是由液相闪烁（γ计数器）而确定的。这种方法目前已普遍被大多数临床免疫学实验室所接受。闪烁计数提供了（同位素脉冲）每分钟计数（cpm）数据或通过每分钟蜕变数（dpm）进行修正，这可以用作淋巴细胞反应的一种测度。为了表示这种数据，受过刺激的培养物的每分钟计数被对照培养物的每分钟计数来除，所得出的结果就给出了刺激指数。
显然，存在着许多能影响这类敏感性试验体系结果的变量。它们包括培养物中的细胞数量及其浓度、培养容器的几何学、非淋巴样细胞或微生物对培养物的污染、促细胞分裂剂的剂量、温育时间及用于分离淋巴细胞和收获细胞的方法。就实践和临床水平而言，假定在细胞免疫方面临床上的明显缺陷通常不是绝对的，培养物的维持时间和促细胞分裂剂的浓度都是极为重要的，因此淋巴细胞活化作用的数量比就具有非常重要的意义。在将正常对照试验对象的反应与一组淋巴细胞功能有变化的患者的反应进行对比时，这种情况尤其明显。通过使用具有96个孔的平板上的微量培养物和半自动化收获系统，有可能确定由促细胞分裂剂和抗原所刺激的培养物的剂量-反应和时间-反应动力学。淋巴细胞的功能变化可能决定着时间-反应及剂量-反应曲线的左、右移动。这些曲线迁移决定着淋巴细胞反应的最适剂量和最适时间。没有这种细致的分析，有时就不可能检测出淋巴细胞反应中的部分或少量不足。用于单一时间段研究或使用单一刺激剂量的培养物常常是极不明确的。由于在数据显示上缺乏标准化，也会出现混乱。刺激指数是一个比值，因而由没有促细胞分裂剂的对照培养物（表示为分母的每分钟计数）的改变能导致相当大的变化。因此最好以刺激性培养物的每分钟计数和刺激作用指数来表示结果。
近年来，已经建立了用来估价淋巴细胞增殖的越来越小型化的培养物。在特殊的自动细胞收集程序（收获器）出现之后，从试管中的1ml培养物已发展到平板上的200μl培养物。今天，在悬浮的20μl悬滴中培育淋巴细胞并用促细胞分裂剂、抗原和异源白细胞予以刺激已成为可能。使用一种容器，其中放射性标记培养物被简单地置于滤纸板上，随后冲洗和加工以进行闪烁计数（吸印），通过氚标记胸苷的掺入可测量增殖作用。这种方法具有双重优点，即只使用不足10倍的细胞（10-40，000）并简化了收获技术（British Technology Group of London System）。悬浮的20μl悬滴技术是进行多因素实验所必需的一种实用性解决方案，多因素实验在鉴定淋巴细胞增殖作用中出现的每一种变化的性质上是必不可少的。使用Terasaki平板中的人类及动物淋巴细胞可以很容易地获得20μl悬滴培养物。与大型培养物相比，该方法在培养期间需要对维持恒温箱内部的适当的pH值和理想的湿度极为重视。通常为，细胞的收获是极为简单的。为了能收获到带有60个20μl培养物的平板，进行吸印，冲洗和加工只需不到2分钟。因此这种方法可以使大量的培养物进行多因素实验。这种进行多因素实验（浓度、时间、细胞数、自体或异体血清、树突细胞的增加、异源淋巴细胞的数目等等）的能力使得特殊的数学技术的使用成为数据分析所必需的。
这些常规方法本身并不是令人完全满意的。它们的实际应用碰到了一系列的问题。实际上，尽管培养物的小型化、收获方法的复杂性、精细软件的可用性可使人们对淋巴细胞的致激反应获得更好的理解，但由于其复杂性和精确性，常规方法绝对不适用于临床应用，而只能仅限于实验室研究。
现已意外地发现，依据本发明采用通过流式细胞光度术进行致激性淋巴细胞转化试验的方法，使上述问题的克服成为可能，而同时还具有进一步的优点，下面将更清楚地说明这些优点。
依据本发明进行致激性淋巴细胞转化试验的方法，包括取无菌肝素化样品;将全血或分离的淋巴细胞注入培养基中;在无菌恒温箱中进行温育;准备两种培养物，其中一种必须含有刺激剂，其浓度为能引起细胞增殖的浓度，
其特征在于，培养温度为25-45℃，时间为24-192小时，它包括以下操作的结合：
-温育结束时进行离心;
-红细胞在溶胞液中重新悬浮;
-DNA染色;
-用等渗水溶液冲洗白细胞悬浮液;
-对生成的白细胞悬浮液进行离心;
-在DNA特异性荧光色素的存在下，细胞在白细胞溶胞液中重新悬浮，该溶胞液还有选择地含有使溶胞作用最佳化的试剂;
-使用流式细胞光度术对样品进行分析。
培养温度为25-45℃，时间为24-192小时，在塞封条件下进行。或者，也可在含有允许气体交换的试剂的培养基中，将培养物置于具有控制性湿度和二氧化碳水平的无菌恒温箱中，在不塞封条件下进行。
在DNA特异性荧光色素的存在下，细胞在白细胞溶胞液中进行重新悬浮，该溶胞液还有选择地含有使溶胞作用最佳化的试剂。
或者，细胞可在固定液中重新悬浮，随后进行冲洗，再在含有DNA荧光色素的溶液中重新悬浮。另一种方法是，细胞可与单克隆或多克隆抗体（直接或间接地与荧光色素相结合，其对于接受检测的细胞群具有特异性）一起温育，随后用DNA特异性荧光色素进行固定和染色。
培养基可以是加有10%的热失活胎牛血清和1%的谷氨酰胺的RPMI1640，所述培养基的用量为每个培养物3ml。该培养基可以是新配制的或冷冻干燥的。
可选择刺激物，例如植物凝血素（PHA），伴刀豆球蛋白A（ConA）和高陆丝裂素（PWM）。
红细胞溶胞液可由双蒸馏水配制而成，其中含8.28g/l的NH4Cl、1g/l的KHCO3、0.037g/l的单钠或四钠乙二胺四乙酸（EDTA）。
白细胞溶胞液和DNA染色液由双蒸馏水配制，内含0.1%的柠檬钠、0.1%的“诺乃洗涤剂NP-40”和50μg/ml的碘化3，8-二氨基-5-丙基-6-苯基菲啶鎓（propidium iodide）。后者也可以用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓、二咪苯基吲哚（DAPI）和具有相似特性的物质代替。
固定液可由50%（V/V）的乙醇（甲醇）和50%（V/V）的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）制成，而DNA染色液可由等渗磷酸盐缓冲液中的50μg/ml的碘化3，8-二氨基-5-丙基-6-苯基菲啶鎓和1mg/l的核糖核酸酶A制成。
应该注意到，本发明的方法可应用于取自人体的体液;该体液不返回到同一机体中。而且，本发明的方法旨在得到仅能提供中间结果的信息，中间结果本身并不能对是否有必要进行治疗得出结论。
与使用氚标记胸苷的传统方法相比较，依据本发明的方法表现出以下另一些优点：
-试剂的成本要低得多;
-最终信息的质量较高（本方法可得出与生物现象直接关联的结果）;
-由于不使用放射线物质，环境和工作场所的安全有所改善;
-培养物污染的危险性较小（在培养期间培养容器不必开启）;
-本方法具有极其简便性和重复性;
-结果基本上不受细胞数量影响;
-全血培养物;
-只需极少量的血。
至此，已对本发明进行了一般性的描述。现借助于下述实施例（其涉及到本发明的一个具体实施方案），对本发明做进一步的说明，其目的是使人们更好地理解本发明的目的、特征、优点及应用方法。
实施例
依据本发明，使用细胞分裂剂和流式细胞光度术对致激性淋巴细胞转化作用进行临床试验的一种商业化药盒，组成如下：
（1）带有橡胶盖的无菌容器，含有RPMI1640培养基，其中加有10%的热失活胎牛血清和1%的谷氨酰胺。该培养基可以是新配制的或冷冻干燥的。培养基的体积（如果是冷冻干燥的则要重新配制）为每个培养物3ml。橡胶盖可用针穿孔。为每项试验提供两种培养容器，其中之一含有植物凝血素，其浓度为能引起淋巴细胞增殖的浓度。也有可能在另一个商业化包装中有选择地添加两种培养物，其含有最适浓度的伴刀豆球蛋白A和商陆丝裂素，用于对淋巴细胞功能的更全面的评估;
（2）含有粉剂或浓缩液的容器，用于得到每个培养物5ml的红细胞溶胞液。所使用的溶液由双蒸馏水制成，含有8.28g/l的NH4Cl、1g/l的KHCO3、0.037g/l的单钠或四钠乙二胺四乙酸。
（3）含有粉剂或浓缩液的容器（或两种容器，一种含有粉剂，另一种含有浓缩液，混在一起），用于得到含有DNA特异性荧光色素的低渗白细胞溶胞液。溶液的用量为每个培养物2ml，由双蒸馏水制成，内含0.1%的柠檬酸钠、0.1%的“诺乃洗涤剂NP-40”、50μg/ml的碘化3，8-二氨基-5-丙基-6-苯基菲啶鎓（按照血细胞计数器的光源，其它荧光色素的应用也是可能的并有所准备）。