本发明涉及微生物菌种及其发酵制取聚-β-羟基丁酸酯的过程。 聚-β-羟基丁酸酯（PHB）是微生物合成的一种聚合物，作为细胞内碳源和能源的贮藏物，广泛存在于各类微生物细胞内。PHB具热可塑性，并可被生物降解利用，是一种优良的生物可降解塑料。自七十年代以来，英、美、日等国均广泛开展了用微生物发酵法生产PHB的研究，如美国专利（4336334），使用PseudomonasAM1，以甲醇为碳源，在无机培养基中好氧发酵，菌体浓度达13g/L，PHB含量35%;文献CA111095624中记载了一种使用Protomonas extorguensk发酵生产PHB的方法，在以甲醇、NH3或铵盐为C.N源的无机培养基中好氧发酵至菌体浓度达50g/L以上，限制N源供给72小时，PHB积累至细胞干重的35%，停止发酵;美国专利（4433053），使用Alcaliyenes entrophus以糖为碳源，发酵70小时，菌体浓度达45g/L，限氮后停止发酵，PHB含量70%。以上这些方法均属批式发酵，发酵罐灭菌、接种一次只能生产相当于发酵罐体积的70%的发酵液。设备利用率低，生产周期长，成本较高，不利于规模化生产。PHB的发酵生产，包括细胞增殖期和PHB积累期，这两个时期不能在同一罐内同时进行，因此，使用一个发酵罐只能采用批式发酵，而一般的一级连续发酵只能解决细胞的连续增殖，不能解决PHB的连续积累。
本发明的目的是提供一种连续生产PHB的发酵工艺，以发挥生产菌的生产潜力，提高设备利用率，降低生产成本，使之有利于规模化生产。
本发明的技术解决方案是：采用二级连续发酵，一级罐为菌体的连续增殖，贰级罐为限氮培养，进行PHB的连续积累。
本发明的实施方法：
将甲基营养菌（以甲烷或甲醇为唯一碳源，能源生长的微生物）接种于以甲醇、铵盐为C.N源的无机培养基中，在一级罐中好氧培养20-30hr，至菌体浓度达15g/L以上，用氮水将发酵过程的pH维持在6.2-7.5，N含量0.02-0.30g/L，维持温度25-40℃，流加甲醇维持其浓度0.1-6g/L，流加磷酸盐维持P含量0.1-1g/L，维持溶解氧1-5ppm，并补加Ca、Cu、Fe、Zn、Mn、Mo等微量元素。这是发酵的起始阶段，然后开始二级连续发酵：把发酵液（菌浓达15g/L以上）按一定流速从一级罐泵入二级罐，并按同样的速度流加无机盐培养基至一级罐以保持其液位，稀释率（每小时流加的无机盐培养基体积除以一级罐内发酵液体积），控制在0.01-0.20h-1。流入二级罐地发酵液按一级罐中的发酵条件进行限氮培养，用4%的NaOH溶液代替氨水以维持pH6.2-7.5，适当补加铵盐以维持N含量在0.02g/L以下，但不变为零。限氮培养亦为连续方式，经限氮培养富含PHB的发酵液从二级罐中连续流出进入菌体的分离装置，一级罐中流出的发酵液维持二级罐的液位，调节该液位控制二级罐的稀释率0.05-0.40h-1。大于一级罐。
本发明的优点：
改变以往PHB生产的批式工艺为连续工艺，菌体生产罐一次灭菌、接种，即可生产相当于批式两倍以上的发酵液，提高了生产效率和设备利用率，且PHB含量稳定。
实施例：
把嗜甲基营养菌8502-3（查氏生丝微菌属成都亚种Hyphomicrobium Zavarzinil Suhsp chengduense supsp nov）接种于250ml三角瓶中（内盛100ml无机培养基含甲醇3g/L，（NH4）2SO40.5g/L，内盛无机培养基500ml）同样振摇培养24小时。无机培养基组成如下：
成分 含量（克/升）
（NH4）2SO40.5
CaCl2·2H2O 0.2
MgSO4·7H2O 1.0
CuSO4·5H2O 0.0040
FeSO4·7H2O 0.0080
MnSO4H2O 0.00030
ZnSO4·7H2O 0.00034
Na2MoO4·2H2O 0.00023
NaCl 0.5
EDTANa20.01
KH2PO40.52
Na2HPO4·12H2O 0.48
pH 6.8
蒸馏水配制
二级连续发酵用10升自控发酵罐作一级罐，工作体积6升;用5升发酵罐作二级罐，工作体积1.5升，一级罐发酵参数如下：
温度：33-35℃ pH7.0-7.2
溶氧：30-50% 甲醇：2-4g/L
（NH4）SO40.4-0.6g/L 磷酸盐：1-2g/L
发酵过程中还需补加Ca、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn、Mo等微量元素，扩大于2L三角瓶的种液接种于10升罐按以上参数发酵48小时，菌浓达25g/L，然后开始连续发酵，发酵液从10升罐泵入5升罐，同时给10升罐流加无机盐培养基，流量控制在250-300ml/小时，平均稀释率为0.046，二级罐为限氮积累PHB过程，发酵参数同一级罐，但（NH4）2SO4含量小于0.1g/L，但不得为零。当二级罐的液位达1.5升时，开始按250-300ml/小时的流量收取发酵液，发酵液在二级罐中的限氮时间为：4-5小时，平均稀释率为0.17。连续发酵40小时，共获发酵液17升，菌浓为23.2克/升，PHB含量59.3%。