本发明涉及用于稻瘟病抗性基因的核酸标记物，以及使用这些核酸标记物分离到的稻瘟病抗性基因。 稻瘟病抗性基因不仅对于开发优良栽培稻种十分有用，而且还可以作为研究材料以及作为创制能被导入各种植物体的新抗性基因的遗传源。
本领域内技术人员熟知存在着给植物提供抗病源体抗性的基因，并且在常规繁育中已经将引入这些基因作为重要的指标。因此，至今通过导入这些抗性基因已制造了许多新类型的栽培种。鉴于这种生物方法通过利用植株的遗传功能而阻碍瘟疫流传将降低化学杀虫剂的消耗，并且促进了人类健康以及保存了完好的环境，还能降低农业成本，因此这些抗性基因的重要性将在世界范围内日益提高。
在抗病源体的植物抗性基因中，首先在日本发现了稻瘟病抗性基因，其后已知存在许多这样基因。尤其是，来自于印度稻的抗性基因对在日本发现的许多种稻瘟病真菌显示有抗性，并且是十分有用的遗传资源。在其他基因中，来源于印度稻的Pi-ta，Pi-ta2基因适合于分析基因的RFLP图谱。但是仍然仅有十分有限的情况是将基因导入后实际上提供了优良栽培种。
原因可能是常规的育种方法需要通过许多代回交将抗性基因导入一个栽培种，并且伴随该过程，每年将病源体接种到许多单株上进行抗性试验。由于严格控制外源病源体输入，在日本国内对外来病源体进行抗性检测几乎是不可能的。
另一方面，在植物生物技术方面的最新进展已能识别和分离各种基因，并且然后将它们导入到各种植株中。因此，对于植物抗性基因，如果使用遗传工程技术将它们克隆后导入到任何有用的栽培种中并不困难，这样将大大地降低在繁育抗性栽培种时需要的时间及劳动力。还可以阐明抗性基因怎样在植株中活动地机理，并且可使修饰该基因然后提供新类型的抗性基因成为可能。现在许多研究组正在努力尝试以分离到抗性基因，但至今仅有几个组获得了成功。这归因于下列事实：只知道有限的关于抗性基因产物的生化特征的信息。
作为一种鉴别和分离基因的方法，一种已知的定位克隆技术正引起人们的注意。该技术使用基因图谱中靠近靶基因的核酸标记物，并且从基因组文库中分离出靶基因。实际上，使用该技术已经分离到了某些引起人类遗传病的基因。
虽然，在植物中已报道的这种位置克隆仅有几种成功的情况，但根据下列原因据认为稻是该技术最合适的植物：（1）在主要的作物中稻的基因组尺寸最小;（2）水稻中与一个单位遗传距离（CM）相对应的物理距离（以kb计）非常小;（3）通过使用几个邻近的某基因系（NIL）很容易限制基因位点范围，其中已通过将印度稻衍生的基因渐渗到日本稻本底而产生邻近的某基因系（NIL）;以及（4）容易将基因导入到用于互补测试的细胞中。
这种位点克隆过程成功的一个重要关键点是一能否得到一个相邻接的有效的标记物。根据稻基因组大小和遗传图谱进行计算结果，估计对应于稻遗传图谱的1厘摩（CM）的物理距离（基于核酸来计算）大约为100-200kb。另一方面，插入的人工染色体（YAC）的平均大小大于200kb。因此，如果有一种距离小于100kb，即0.5-1.0CM的抗性基因的DNA标记物，该基因位点克隆的成功的可能性被认为是非常高的。
使用这样的稻瘟病抗性基因的邻近核酸标记物还可以大大地降低在常规育种中例如通过回交而检测抗性所需的时间和劳动力。
本发明一个目的是提供稻瘟病抗性基因的新的邻近核酸标记物，以及使用这些标记物分离并克隆的稻瘟病抗性基因。
本发明提供了稻瘟病抗性基因的核酸标记物，这些标记物与从稻基因组DNA中分离的RFLP探针进行杂交，并且定位于离稻瘟病抗性基因Pi-ta或Pi-ta22.0 ceuti Morgan（CM）的距离内。
本发明还提供了定位于在上面介绍的核酸标记物的二级核酸标记物，以及与利用这些核酸标记物分离到的抗性基因相关的基因组。
根据本发明，提供了适用于分离稻瘟病抗性基因Pi-ta2或Pi-ta的有效的标记物。通过这些核酸标记物的应用，便可以方便地从各种栽培稻种内分离到稻瘟病抗性基因以及相关的基因组，从而有利于开发和繁育出优良栽培种。还可以方便地完成水稻抗性检测。开创了制备新的抗性基因的途径。
图1.表示将水稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-ta2导入日本栽培稻种的谱系图。底下划线表示带有抗性基因的栽培种。
图2.图解观察水稻第十二种染色体的带有Pi-ta2或Pi-ta的邻近等基因系。黑色或灰色部分表示来源于印度供体的区域。
图3是将稻第十二染色体上的稻瘟病抗性基因Pi-ta2和Pi-ta扩大后的解剖图。a：将PiNo.4（带有Pi-ta2）和Norin22（无Pi-ta2）之间杂交后进行F2分析结果。b：Kasalatb（印度稻）和Koshihikari（日本稻）杂交后F2分析结果;这亲本都不带有抗性基因。c：来源于图2的结果的可能存在的Pi-ta2区域。较小的括号表示Pi-ta和Pi-ta2精确的等位的情况。较大的括号表示Pi-ta和Pi-ta2不精确的非等位基因的情况。
下文进一步详细描述本发明的核酸标记物
通过比较几个带有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-ta2的不同栽培稻种的基因组DNAS以及不带有瘟病抗性基因的栽培稻种的基因组DNAs，并且在稻瘟病抗性基因附近（2.0CM或200-400kb内）识别出在带有稻瘟病抗性基因的栽培种中存在的特异性DNA谱带。
基因组DNAs的比较可以在具有稻瘟病抗性基因的印度稻栽培种（供体亲本）和不具有这种基因的日本栽培稻种（回交亲本）之间进行并且通过将供体亲本和回交亲本的回复杂交而开发了两稻栽培种之间的邻近等基因系。
此外，通过与任何RFLP探针杂交可以检测到本发明的核酸标记物。因此在本发明中，通过用限制性酶切割待测试的稻栽培稻种的基因组DNA（例如上面介绍的供体亲本，回交亲本和邻近等基因系），然后在凝胶电泳后与一种RFLP探针杂交而鉴别DNA标记物。
通过RFLP分析而将由此制备到的本发明的核酸标记物分级分离如在所试验的稻栽培种单株的基因组DNA中是印度稻来源或日本稻来源，并且被定位于稻瘟病抗性基因Pi-ta或Pi-ta2的2CM的附近范围内，并且可作为稻瘟病抗性基因或相关基因的有效的标记物。
本发明将用实施例和试验的方法在以下作进一步的详细说明。
实施例
鉴别稻瘟病抗性基因Pi-ta2的核酸标记物。
（1）材料的制备
（a）DNA提取：
分别采用已知方法制备下列提取物：
（1）含有水稻DNA文库的大肠杆菌DNA估粒;
（2）含有稻瘟病抗性基因Pi-ta1的栽培稻（供体亲本）的DNA;
（3）不含有稻瘟病抗性基因Pi-ta2的日本栽培（回交亲本）的DNA;
（4）通过将回交亲本与供体亲本重复杂交而制备的稻栽培种DNA（邻近等基因系）。
（b）RFLP探针
使用由Saito等（Jpn.J.Bneed.，41，665670，1991）限定的稻第十二染色体的RFLP探针。
（2）DNA片段与RFLP探针杂交
对于在上述（a）中列出的DNA提取物（1）至（4）中每一种，使用限性酶（见表1）将2-3μg的基因组DNA分裂成片段，并加到用1×TAE缓冲液和0.7-1%琼脂糖配制的凝胶的3-5×1-mm狭槽中并以5V/cm的电压梯度电泳4小时。然后采用已知技术将DNA从电泳后的凝胶上转移到尼龙膜上。另一方面，采用已知技术（例如随机引物方法）用32P或过氧化物酶将上述（b）中列出的RFLP探针进行标记，并且采用Southern杂交方法，基于它们的互补性而特异性地与固定在膜上的DNA杂交。随后，通过置于X射线胶片上而检测杂交DNA谱带。
（3）核酸标记物的鉴别：
对于上述（1）-a的（2），（3），（4）列出的DNA提取物的DNA片段，比较与RFLP探针的杂交的DNA谱带，并且存在具有稻瘟病抗性基因Pi-ta2的DNA2）和4）而不存在于不具有Pi-ta2基因的DNA3）中的谱带被标记。从由F2分析得到的这些DNA谱带中选择出定位于离Pi-ta2基因2.0cm的距离内的DNA谱带，并且鉴别出这些DNA谱带为Pi-ta2基因的核酸标记物。
表1显示与Pi-ta2附近的核酸标记物杂交的RFLP探针，探针的大小以及用于切割基因组DNA的限制性酶。
还证明了如果这些标记物来源于具有Pi-ta2基因的栽培稻种则这些标记物也可用作为上述水稻基因组文库（1）的Pi-ta2的满意的标记物。
接下来完成一些试验以调查将要显示的这些核酸标记物的特征。
试验1
对于实施例中获得的核酸标记物，测试其在邻近等基因系（NILS）中的行为，该邻近等基因系已通过与印度栽培稻重复回交而导入了稻瘟病抗性基因。
已知来源于印度稻的Pi-ta2和Pi-ta基因占据相同位点并且通过如图1所示的重复回交而分别将它们导入到5和4个系中。在这些供体亲本，回交亲本和邻近等基因系中调查靠近Pi-ta2的RFLPS，并且弄清每个栽培种中来源于印度稻的染色体区。
从显示于图1中的每个栽培种中提取DNAs并利用表1显示的RFLP探针进行Southern印迹分析，以调查每个邻近基因系中来源于印度稻的染色体区（图2）。结果，估计Pi-ta2在染色体图谱上的位置是在图2划分的范围内。
试验2
进行F2分析以在RFLP图谱中确定稻瘟病抗性基因Pi-ta2的位置。
将一种具有稻瘟病抗性基因Pi-ta2的栽培种PiNo.4与一种不含有Pi-ta2的栽培种Norin22进行杂交，并且获得了许多F2单株。利用这些F2，测定稻瘟病抗性基因Pi-ta2和核酸标记物之间的重组比例，以及测定它们之间的遗传距离。
栽培的400粒F2单株，在约5片叶期时，将1×105/ml的稻瘟病HoRu-1菌株菌丝体悬液喷雾接种到叶上。将经过接种后的叶置于25℃，100%相对湿度24小时，然后移到温室中。接种7天后，根据叶上出现的坏死损伤而确诊单株是抗性或易感染。
从确定为易感染性的84个单株的每株提取DNA，并以相同于实施例描述的方法用RFLP探针进行Souhem杂交，以检测各个核苷酸标记物带是印度型或日本型。结果，用XNpb289探测的核酸标记物未发现重组，估计该标记物和抗性基因之间的遗传距离低于0.0CM。该距离相当于基因组DNA中约小于60-120kb的距离。考虑到在酵母人工染色体（YAC）中200-300kb基因组片段容易获得因而该遗传距离非常短，对于该距离有足够能力进行位点克隆。由于与其他探针杂交的其他核酸标记物定位于该图谱上2CM的距离内，暗示这些核酸标记物可作为Pi-ta2基因的满意的有效标记物（图3）。
在F2分析中仅使用易感染性单株以避免由于不充分的喷雾接种而出现明显未显示出损伤但被诊断为抗性的易感染单株。相反，一个抗性单株显示许多坏死损伤的可能性是非常低的。因此导致表现型诊断的较高的精确性。由于抗性基因是显性，在pi-ta2基因位点易感染单株是日本型隐性纯合。并预期附近的标记物的谱带型是日本型。因此，能容易检测到两个日本型同源染色体之间仅有的一个杂交。由于可以在两倍数量的单株染色体中检测到重组，测定重组比例的效率也高出二倍。这两个优点对于测定是非常低重组比例的两个基因之间的距离是十分重要的。
根据上面描述的测试1和2的结果，证实在实施例中获得的核酸标记物是用于Pi-ta和pi-ta2基因的满意的标记物，定位于来自稻瘟病抗性基因pi-ta和pi-ta2的遗传图谱上0-2CM的距离内。