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1、10申请公布号CN104195100A43申请公布日20141210CN104195100A21申请号201410438103622申请日20140829C12N5/07120100171申请人山东省农业科学院畜牧兽医研究所地址250100山东省济南市历城区桑园路8号72发明人游伟谭秀文赵红波刘晓牧刘桂芬成海建刘倚帆万发春宋恩亮74专利代理机构济南诚智商标专利事务所有限公司37105代理人韩百翠54发明名称一种乳腺上皮细胞的体外培养方法57摘要本发明公开了一种乳腺上皮细胞的体外培养方法。它是将乳腺组织先用组织匀浆机处理成乳糜状的组织块，然后将组织块依次接种在标定的培养瓶底壁处进行培养，23天后。
2、每个组织块周围有成纤维细胞游离出来并贴壁生长，45天后上皮细胞开始游离出来贴壁生长，成纤维细胞被驱向上皮细胞外周并围绕其生长；这时加入胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止消化后继续培养，57天后有约8090细胞贴壁，得到较高纯度的乳腺上皮细胞。与现有的培养方法相比，该方法在培养初期对成纤维细胞进行消化处理，这时仅有少量的上皮细胞游离生长消化处理时可完全去掉，之后游离生长的上皮细胞不受消化处理损伤，细胞活性和纯度都非常高。51INTCL权利要求书2页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书4页附图2页10申请公布号CN104195100ACN10。
3、4195100A1/2页21一种乳腺上皮细胞的体外培养方法，其特征是，将乳腺组织先用组织匀浆机处理成乳糜状的组织块，然后将组织块依次接种在标定的培养瓶底壁处进行培养；23天后每个组织块周围有成纤维细胞游离出来并贴壁生长，45天后上皮细胞开始游离出来贴壁生长，成纤维细胞被驱向上皮细胞外周并围绕其生长；这时加入025胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止消化后继续培养，57天后有8090细胞贴壁，得到较高纯度的乳腺上皮细胞。2如权利要求1所述的乳腺上皮细胞的体外培养方法，其特征是，所述细胞培养采用的细胞培养液为按照每450500ML的DMEM/F12培养液中加入5060ML的胎牛血清、23ML的。
4、青链霉素混合液、012015G牛磺酸和0305ML表皮生长因子的比例配制细胞培养液，调节PH值为6972；然后经022微米滤膜过滤后，放置4保存。3如权利要求1所述的乳腺上皮细胞的体外培养方法，其特征是，所述加入025胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止消化后继续培养的具体步骤如下采用T25培养瓶时，加入0810毫升的025胰蛋白酶轻轻混匀覆盖培养瓶底壁后弃掉，再重新加入0405毫升025胰蛋白酶，然后放在37培养箱中，在相差显微镜下每隔12分钟观察一次，待组织块外周所有贴壁的成纤维细胞都彻底消化下来后加入56毫升细胞培养液终止消化并弃掉，再加入56毫升PBS液轻轻漂洗残留的成纤维细胞34。
5、次；所述025胰蛋白酶中含有005的EDTA。4如权利要求1所述的一种乳腺上皮细胞的体外培养方法，其特征是，1细胞培养液配制细胞培养液按照每450500ML的DMEM/F12培养液中加入5060ML的胎牛血清、23ML的青链霉素混合液、012015G牛磺酸和0305ML表皮生长因子的比例配制细胞培养液，调节PH值为6972；然后经022微米滤膜过滤后，放置4保存；2培养瓶处理将T25培养瓶的底壁朝上平放，然后在底壁上划出横向和纵向间距均为04CM的网格线，每个交汇点处即是组织块的接种点；3乳腺组织的取样与匀浆处理首先将乳腺组织用含1青链霉素的PBS液反复冲洗清除组织中携带的乳汁；然后将乳腺组织。
6、剪成0507CM3的块状，之后把组织块放在干燥的平皿内沾23下，放入组织匀浆机的无菌试管内，180200转/分钟匀浆处理23分钟，这时组织块成大小均一、体积为081MM3的乳糜粒状的组织块；4乳腺上皮细胞培养将乳糜粒状的组织块依次接种到培养瓶底壁的接种点处；然后翻转培养瓶加入45毫升细胞培养液，平放入含5CO2、37培养箱中，051小时后将培养瓶轻轻翻转，让培养液缓慢进入培养瓶底壁后立即放回培养箱继续培养；23天后每个组织块有成纤维细胞游离出来并贴壁生长，45天后上皮细胞开始游离出来贴壁生长并逐渐形成形状大致规则的圆形细胞区域，成纤维细胞被驱向这片细胞区域外周并围绕其生长，这时加入0810毫升。
7、的025胰蛋白酶轻轻混匀覆盖培养瓶底壁后弃掉，再重新加入0405毫升025胰蛋白酶，然后放在37培养箱中，在相差显微镜下每隔12分钟观察一次，待组织块外周所有贴壁的成纤维细胞都彻底消化下来后加入56毫升细胞培养液终止消化并弃掉，再加入权利要求书CN104195100A2/2页356毫升PBS液轻轻漂洗残留的成纤维细胞34次；57天后有8090细胞贴壁，得到较高纯度的乳腺上皮细胞；所述025胰蛋白酶中含有005的EDTA。权利要求书CN104195100A1/4页4一种乳腺上皮细胞的体外培养方法技术领域0001本发明涉及一种生物培养技术，具体是一种乳腺上皮细胞的体外培养方法。背景技术0002乳腺。
8、是哺乳动物所特有的器官，具有合成和分泌乳汁的功能，是蛋白质合成十分活跃的场所。研究表明，乳蛋白编码的基因其表达具有明显的组织特异性和阶段特异性，即乳蛋白的合成仅在乳腺上皮细胞中进行，并且发生在哺乳母体即将分娩之前和分娩之后的相当长一段时间的泌乳期中，所以乳腺上皮细胞被公认为是制作乳腺生物反应器的靶细胞。即利用体外培养的乳腺上皮细胞，通过构建特异性表达载体生产医疗上价值极大的药用蛋白或其他蛋白质。另外，乳腺上皮细胞也是研究乳蛋白基因表达、调控及细胞形态学的有利工具，它从细胞水平上对泌乳机制进行深入研究，为进一步研究各种因素对乳腺发育及泌乳过程的影响奠定了基础。0003人们对乳腺细胞的培养始于上世。
9、纪五、六十年代，最初利用胶原酶消化乳腺组织，将乳腺细胞从中分离出来直接培养，发现开始培养时上皮细胞所占比例很大，然而随着传代的不断进行，上皮细胞逐渐被生长较快的成纤维细胞所取代。为了解决培养的乳腺上皮细胞中混有成纤维细胞的问题，MCGRATH等将含乳腺上皮细胞的胶原酶消化液进行密度梯度离心，去除消化液中的成纤维细胞、脂肪颗粒、细胞碎片、DNA纤维等成分MCGRATHMFANOVELSYSTEMFORMAMMARYEPITHELIALCELLCULTUREJDAIRYSCI1987,70196780，但使用这种方法来分离乳腺上皮细胞会产生不可逆地机械性损伤。WANG等试图通过细胞克隆得到纯净的乳。
10、腺上皮细胞WANGS,HASLAMSZSERUMFREEPRIMARYCULTUREOFNORMALMOUSEMAMMARYEPITHELIALANDSTROMALCELLSINVITROCELLDEVBIOLANIM1994,30A85966，但正常乳腺上皮细胞的克隆率极低，要获得上皮细胞的单细胞克隆非常困难，即使有克隆出现，这些克隆极易老化，失去增殖能力。ZAVIZION等利用放射性射线照射的方法去除成纤维细胞，即用小片铅板挡住需保留的上皮细胞区域，让射线照射上皮细胞外的区域。这样未受到射线照射的细胞便存活下来，照射过的细胞便失去增殖能力，逐渐衰退、死亡ZAVIZIONB,VANDUFFE。
11、LENM,SCHAEFFERW,POLITISIESTABLISHMENTANDCHARACTERIZATIONOFABOVINEMAMMARYEPITHELIALCELLLINEWITHUNIQUEPROPERTIESINVITROCELLDEVBIOLANIM1996,3213848，但这种方法操作起来非常困难，因为乳腺上皮细胞生长的区域不规则、大小不一，而铅板的尺寸、形状都是固定的，所以很难控制铅板能完全遮挡住上皮细胞，当然成纤维细胞也不可能完全被遮挡住，这样造成实际的纯化效果并不理想。也有报道提出由于乳汁中含有上皮细胞，可低速离心然后收集细胞沉淀进行培养BUEHRINGGCCULTUR。
12、EOFMAMMARYEPITHELIALCELLSFROMBOVINEMILKJDAIRYSCI1990,7395663，但乳汁中的上皮细胞通常是从乳腺内膜上自然脱落下来，细胞状态或活力很差，所以培养后细胞增殖能力很低，很难维持生长。近年来研究人员在利用胶原酶将乳腺组织消化成单个细胞进行培养的基础上，根据成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶敏感性不同及贴壁时间差异在消化传代时逐步将成纤维细胞去除，说明书CN104195100A2/4页5但这种方法由于最初是利用胶原酶分离乳腺组织，所以获得的细胞是成纤维细胞和上皮细胞的混合群体，培养后也是两种细胞相互混杂生长。这就造成消化传代时很难完全将成纤维细胞去除。
13、，而且多次消化传代造成乳腺上皮细胞活力下降和生物学功能降低。发明内容0004为了克服上述乳腺上皮细胞体外培养方法存在的缺点，本发明提供了一种乳腺上皮细胞的体外培养方法。该培养方法根据乳腺组织块中成纤维细胞和上皮细胞的生长特性，采取不经胶原酶消化，而是直接将组织块接种培养，将先游离出来生长的成纤维细胞利用胰蛋白酶消化彻底去掉，再培养后游离出来生长的细胞即为上皮细胞。与上述几种培养方法相比，该方法在培养初期对成纤维细胞进行消化处理，这时仅有少量的上皮细胞游离生长消化处理时可完全去掉，之后游离生长的上皮细胞不受消化处理损伤，所以细胞活性和纯度都非常高。0005本发明的技术方案是一种乳腺上皮细胞的体外。
14、培养方法，其特征是，将乳腺组织先用组织匀浆机处理成乳糜状的组织块，然后将组织块依次接种在标定的培养瓶底壁处进行培养；23天后每个组织块周围有成纤维细胞游离出来并贴壁生长，45天后上皮细胞开始游离出来贴壁生长，成纤维细胞被驱向上皮细胞外周并围绕其生长；这时加入025胰蛋白酶将贴壁的成纤维细胞消化下来控制加入胰蛋白酶的量，使其消化时仅将贴壁的成纤维细胞层去掉，而不会对组织块进行消化处理，终止消化后继续培养，57天后有8090细胞贴壁，得到较高纯度的乳腺上皮细胞。0006具体包括以下步骤00071培养液配制0008细胞培养液按照每450500毫升的DMEM/F12培养液加入5060毫升的胎牛血清FB。
15、S、23毫升的青链霉素混合液、012015G牛磺酸和0305毫升表皮生长因子10G/ML的比例配制细胞培养液，调节PH值为6972；然后经022微米滤膜过滤后，放置4保存；00092培养瓶处理0010将T25培养瓶的底壁朝上平放，然后在底壁上划出横向和纵向间距均为04CM的网格线，每个交汇点处即是组织块的接种点；00113乳腺组织的取样与匀浆处理0012首先将乳腺组织用含1青链霉素的PBS液反复冲洗，以彻底清除为组织中携带的乳汁；然后将乳腺组织剪成0507CM3的块状，之后把组织块放在干燥的平皿内沾23下，让组织块稍微干燥后，放入组织匀浆机的无菌试管内，180200转/分钟匀浆处理23分钟，这。
16、时组织块成大小均一、体积为081MM3的乳糜粒状的组织块；00134乳腺上皮细胞培养0014将乳糜粒状的组织块依次接种到培养瓶底壁的接种点处；然后翻转培养瓶加入45毫升细胞培养液，平放入含5CO2、37培养箱中，051小时后将培养瓶轻轻翻转，让培养液缓慢进入培养瓶底壁后立即放回培养箱继续培养；23天后每个组织块有成纤维细胞游离出来并贴壁生长，45天后上皮细胞开始游离出来贴壁生长并逐渐形成形状大致规则的圆形细胞区域，成纤维细胞被驱向这片细胞区域外周并围绕其生长，这时加入0810说明书CN104195100A3/4页6毫升的025胰蛋白酶含005EDTA轻轻混匀覆盖培养瓶底壁后弃掉，再重新加入04。
17、05毫升025胰蛋白酶含005EDTA，然后放在37培养箱中，在相差显微镜下每隔12分钟观察一次，待组织块外周所有贴壁的成纤维细胞都彻底消化下来后加入56毫升细胞培养液终止消化并弃掉，再加入56毫升PBS液轻轻漂洗残留的成纤维细胞34次；之后加入细胞培养液放回培养箱继续培养；57天后有8090细胞贴壁，此即为乳腺上皮细胞。0015备注在培养至45天时采用胰蛋白酶消化，理论上可以除去所有的成纤维细胞；如果有个别的组织块的细胞游离速度较慢，胰蛋白酶消化结束后，组织块周围游离出来的还是成纤维细胞，用细胞刮将组织块连同其周围的成纤维细胞直接刮掉。最后加入培养液放回培养箱继续培养。0016本发明的有益效。
18、果是1本发明先将乳腺组织匀浆成乳糜粒，这种处理不仅比传统的徒手剪碎省时、省力，而且使单个组织粒大小更均匀一致，接种到培养瓶底壁后从每个乳糜粒游离出来的细胞生长速度基本一致，这样既有利于判定并控制合适的胰蛋白酶处理时间，又既能保证外周的成纤维细胞完全被消化下来。2本发明一改传统培养中先用胶原酶将乳腺组织消化成单个细胞的做法，而是使用组织匀浆机将乳腺组织处理成细小的乳糜粒直接接种，发现培养后成纤维细胞和上皮细胞生长区域存在明显的界限，即以乳糜粒为中心，上皮细胞基本按圆形区域生长，围绕外周的是成纤维细胞及极少量的其他杂细胞如脂肪细胞、基质细胞等，所以在上皮细胞刚游离出来生长时加入胰蛋白酶，将外周的成。
19、纤维细胞消化下来漂洗去掉，继续培养后游离出来生长的是上皮细胞，这些新生长的上皮细胞不受消化处理的损伤，所以活性非常高。3本发明严格控制加入胰蛋白酶的量，所以消化时仅将贴壁的成纤维细胞层有时也有少许的上皮细胞去掉，而不会对组织块进行消化处理，这样不仅可以避免在后续培养中混入杂细胞，而且可以保持组织块的位置不动，进而保证在外周的成纤维细胞去掉后重新生长的全部为上皮细胞。4本发明在培养液中添加促上皮细胞生长的能量物质牛磺酸和表皮生长因子，有利于维持乳腺上皮细胞活性，保持较高的增殖速度。附图说明0017图1为组织块在培养瓶底壁的接种位置示意图；其中，1、组织块，2、划线，3、培养瓶底壁；4、瓶口；00。
20、18图2为乳腺上皮细胞采用实施例1的方法培养6天后的100照片；0019图3为乳腺上皮细胞进行角蛋白18单克隆抗体免疫荧光染色。A指示区白色为细胞核，B指示区为角蛋白18阳性。具体实施方式0020实施例100211、培养液配制0022将50毫升FBS、25毫升青链霉素混合液青霉素链霉素混合液100X，青霉素含量为10000U/ML，链霉素的含量为10MG/ML、015克牛磺酸和04ML的表皮生长因子10G/ML溶解在450毫升DMEM/F12培养液中，经022微米滤膜过滤后分装到灭菌的50说明书CN104195100A4/4页7毫升离心管中，每管40毫升，放置4保存。细胞培养前半小时将两管共8。
21、0毫升培养液放在37水浴锅中预热。00232、培养瓶处理0024将无菌包装的T25培养瓶在超净台内取出，培养瓶底壁朝上平放，用比例尺从底壁靠瓶底处开始每隔04厘米用记号笔划一横线直到接近瓶口处，然后从培养瓶底壁一侧开始按每隔04厘米用记号笔划一纵线直到底壁另一侧，这样每个交汇点处即是组织块的接种点如图1所示。00253、乳腺组织的取样与匀浆处理0026乳腺组织必须选自处于泌乳中后期、不携带传染性疾病及乳腺疾病的健康个体。取样前按常规消毒处理乳房，然后切取乳房后侧乳沟处乳腺组织块放在含1青链霉素的磷酸盐缓冲液PBS中带回实验室。在无菌超净台内首先将乳腺组织放在平皿中用含1青链霉素的PBS液反复冲。
22、洗，直到将组织中携带的乳汁彻底清除为止；然后将乳腺组织修剪成06CM3的块状，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3下，让组织块稍微干燥后，放入组织匀浆机的无菌试管内，190转/分钟匀浆处理3分钟，这时组织块成大小均一、体积为08MM3的乳糜粒。00274、乳腺上皮细胞培养0028用吸管将乳糜粒从无菌试管内转移到平皿中，轻轻摊成薄薄的一层，用尖端微细的眼科镊夹取乳糜粒，依次接种到培养瓶底壁划线的交汇处；然后翻转培养瓶加入5毫升细胞培养液，平放入含5CO2、37培养箱中，05小时后将培养瓶轻轻翻转，让培养液缓慢进入培养瓶底壁后立即放回培养箱继续培养，2天后每个乳糜粒有成纤维细胞游离出来并贴壁生长，4天。
23、后上皮细胞开始游离出来贴壁生长并逐渐形成形状大致规则的圆形细胞区域，成纤维细胞被驱向这片细胞区域外周并围绕其生长。这时加入08毫升025胰蛋白酶含005EDTA轻轻混匀覆盖培养瓶底壁后弃掉，再重新加入05毫升025胰蛋白酶含005EDTA，然后放在37培养箱中，在相差显微镜下每隔1分钟观察一次，待组织块外周所有成纤维细胞都彻底消化下来后加入5毫升细胞培养液终止消化并弃掉，再加入6毫升PBS液轻轻漂洗残留的成纤维细胞4次，之后加入细胞培养液放回培养箱继续培养。后续如果有少许组织块周围游离出来的还是成纤维细胞，用细胞刮将组织块连同其周围的成纤维细胞直接刮掉。最后加入培养液放回培养箱继续培养，6天后有约8090细胞贴壁如图2所示。采用上皮细胞特征表达蛋白即角蛋白18单克隆抗体对培养的细胞进行免疫荧光检测，结果发现角蛋白18在乳腺上皮细胞中均呈阳性如图3所示。说明书CN104195100A1/2页8图1图2说明书附图CN104195100A2/2页9图3说明书附图CN104195100A。