一种抗PMSUB25/SUB所致肺损伤的药物制剂.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710312148.2 (22)申请日 2017.05.05 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风华路 818号宁波大学医学院王长来楼A207 室 (72)发明人 王安世 张晓宏 徐燕 张壮威 (74)专利代理机构 宁波市天晟知识产权代理有 限公司 33219 代理人 张文忠 (51)Int.Cl. A61K 31/26(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (54)发明名称 一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂 (57)摘。

2、要 本发明公开了一种抗PM2.5所致肺损伤的药 物制剂， 所述的药物制剂的成分为莱菔硫烷。 莱 菔硫烷是一种异硫氰酸盐,主要来自于十字花科 蔬菜如西蓝花、 花菜等， 是公认的强抗氧化剂。 Nrf2是SFN的作用靶点， 通过激活Nrf2-ARE通路 上调抗氧化酶NQO-1、 HO-1、 GST表达和抗氧化物 GSH的生成， SFN发挥积极的抗氧化作用。 通过莱 菔硫烷作用于Nrf2-ARE通路， 形成强抗氧化应 激， 从而抑制PM2.5所致肺上皮氧化损伤。 权利要求书1页 说明书6页 附图6页 CN 106963751 A 2017.07.21 CN 106963751 A 1.一种抗PM2.5。

3、所致肺损伤的药物制剂， 其特征是： 所述的药物制剂的成分为莱菔硫烷。 2.根据权利要求1所述的一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂， 其特征是： 所述的药物制 剂还包括所述莱菔硫烷在药学上能接受的载体和/或辅料。 3.根据权利要求2所述的一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂， 其特征是： 所述的药物制 剂为药学上能接受的剂型。 4.根据权利要求3所述的一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂， 其特征是： 所述的剂型为 胶囊、 粉剂、 注射剂、 片剂或者口服液。 5.一种用于抗PM2.5所致肺损伤的药盒， 其特征是： 在适合医药使用的容器内装有莱菔 硫烷。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN。

4、 106963751 A 2 一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 尤其指的是一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂。 背景技术 0002 PM2.5是指空气动力学直径2.5 m的颗粒物， 又称细颗粒物。 流行病学研究证实， 大气PM2.5与呼吸系统疾病的发病率和死亡率密切相关； PM2.5浓度每升高10 g/m3,呼吸系统 疾病死亡率上升1.78%。 研究表明PM2.5不仅可引起肺功能下降、 哮喘， 甚至还影响心血管系 统、 神经系统和免疫系统。 国际癌症研究机构将PM2.5列为人类的致癌物。 随着我国城市化进 程的加快以及机动车保有量的增长， 城。

5、市大气污染日趋严重， 城市空气PM2.5浓度逐渐升高； 开发可有效拮抗PM2.5健康危害的药物势在必行。 0003 研究显示PM2.5诱导的氧化应激是其毒作用的重要机制。 PM2.5可破坏A549人肺癌细 胞的氧化还原失平衡， 造成细胞氧化性损伤， PM2.5还可诱导人血管内皮细胞生成氧自由基、 诱导细胞凋亡。 因此， 抗氧化应激成为探索PM2.5健康危害防治措施的重要研发方向。 0004 已知氧化应激是活性氧(reactive oxygen species, ROS)过量产生与抗氧化物 功能失平衡的结果。 核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor。

6、 2, Nrf- 2)-抗氧化反应元件(antioxidant responsive element, ARE)是细胞内重要的抗氧化反 应通路。 通常情况下， 细胞浆中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH- associated protein1， Keap1) 与Nrf-2结合， 在特定的刺激下二者解聚、 Nrf2转位进入细 胞核与ARE结合、 增强下游抗氧化基因如血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1， HO-1)、 NAD (P)H醌氧化还原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase l， NQO-1)、 谷胱甘肽S-转移酶 (。

7、Glutathione S-Transferase, GST)的转录， 清除自由基、 使细胞免受氧化损伤。 所以， 以 Nrf-2 ARE通路为靶点， 挖掘可有效控制PM2.5所致肺损伤的药物成为该领域新药研发的关 键方向。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状， 提供一种抗PM2.5所致肺损伤 的药物制剂， 其能作用于Nrf2-ARE通路、 具有强抗氧化应激效能、 发挥抑制PM2.5所致肺上皮 氧化损伤。 0006 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂， 所述的药物制剂的成分为莱菔硫烷。 0007 优化的技术措施还包括：。

8、 上述的药物制剂还包括所述莱菔硫烷在药学上能接受的载体和/或辅料。 0008 上述的药物制剂为药学上能接受的剂型。 0009 上述的剂型为胶囊、 粉剂、 注射剂、 片剂或者口服液。 0010 一种用于抗PM2.5所致肺损伤的药盒， 在适合医药使用的容器内装有莱菔硫烷。 0011 本发明一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂， 其成分为莱菔硫烷， 莱菔硫烷是一种 说 明 书 1/6 页 3 CN 106963751 A 3 异硫氰酸盐,主要来自于十字花科蔬菜如西兰花、 花菜等， 是公认的强抗氧化剂。 Nrf-2是 SFN的作用靶点， 通过激活Nrf2-ARE通路上调抗氧化酶NQO-1、 HO-1、。

9、 GST表达和抗氧化物谷 胱甘肽 （Glutathione， GSH） 的生成， SFN发挥积极的抗氧化作用。 通过莱菔硫烷作用于Nrf- 2 ARE通路， 显著降低氧化应激， 从而抑制PM2.5所致的肺上皮氧化损伤。 附图说明 0012 图1是莱菔硫烷的化学结构式图； 图2是SFN对MLE-12细胞存活率的影响图(*P 0.05)； 图3是PM2.5诱导MLE-12细胞活性氧生成图； 图4是PM2.5诱导MLE-12细胞活性氧生成的定量分析图； 图5是SFN降低MLE-12细胞ROS的生成图(* P 0.05)； 图6是SFN抑制MLE-12细胞GSH的消耗图(*P 0.05)； 图7是SF。

10、N对MLE-12细胞凋亡的影响图(*P 0.05)； 图8是SFN增强MLE-12细胞Akt和p-Akt蛋白表达图； 图9是SFN增强MLE-12细胞ERK和p-ERK蛋白表达图； 图10是SFN增强MLE-12细胞Nrf-2、 NQO-1和HO-1蛋白表达图； 图11是SFN抑制MLE-12细胞凋亡相关蛋白表达图。 具体实施方式 0013 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 0014 一种抗PM2.5所致肺损伤的药物制剂， 所述的药物制剂的成分为莱菔硫烷。 0015 实施例中， 药物制剂还包括所述莱菔硫烷在药学上能接受的载体和/或辅料。 0016 实施例中， 药物制剂为药学上能接受。

11、的剂型。 0017 上述的剂型为胶囊、 粉剂、 注射剂、 片剂或者口服液。 0018 一种用于抗PM2.5所致肺损伤的药盒， 在适合医药使用的容器内装有莱菔硫烷。 0019 莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一种异硫氰酸盐， 主要来自于十字花科蔬菜如 西蓝花、 花菜等， 是公认的强抗氧化剂。 Nrf2是SFN的作用靶点， 通过激活Nrf-2 ARE通路上 调抗氧化酶NQO-1、 HO-1、 GST表达和抗氧化物GSH的生成， SFN发挥积极的抗氧化作用。 0020 下面通过实验说明莱菔硫烷能够拮抗PM2.5所致肺损伤。 0021 一、 材料与方法 1 实验细胞株： MLE-12肺。

12、泡型上皮细胞株购于美国菌种保藏中心(American type culture collection， ATCC)。 0022 2 莱菔硫烷 莱菔硫烷的化学结构式如图1所示。 0023 3 细胞存活率检测： MTT法检测细胞活力。 生长对数期的MLE-12细胞以1105个/ ml的密度接种于96孔细胞培养板(200 l/孔)中， 24 h后细胞完全贴壁后， 按实验设计更换 不同浓度的PM2.5工作液(0、 12.5、 25、 50、 100、 200 g/ml)， 每个浓度设6个平行。 不同浓度的 PM2.5悬液染毒MLE-12细胞24h后， 每孔更换为100 l含MTT的完全培养基(90 l。

13、完全培养基及 10 l 5mg/ml MTT溶液)， 继续培养34 h。 弃培养基， 加入DMSO (150 l/孔)， 水平摇床上摇 说 明 书 2/6 页 4 CN 106963751 A 4 10 min， 使用酶标仪读取546 nm吸光度。 为保证实验结果的稳定性， 本实验重复三次。 0024 4 细胞内ROS检测： 取生长状态良好的MLE-12细胞， 消化并计数后用完全培养基稀 释为1105个/ml， 将稀释后的细胞悬液接种于96孔细胞培养板(200 l/孔)。 待细胞完全贴 壁 (24h后)按实验设计， 弃原培养基、 更换为含不同浓度PM2.5的培养基 (0、 12.5、 25、 。

14、50、 100、 200 g/ml)， 每个浓度6个平行。 24h后弃含PM2.5的培养基， 更换为含10 M DCFA-DA的无 血清无酚红培养基。 孵育20min后， 用无血清无酚红培养液洗三次， 488nm激发波长和525nm 发射波长检测荧光强弱并记录， 荧光显微镜下拍照。 为保证实验结果的稳定性， 本实验重复 三次。 (染毒结束前30min阳性对照组用Rosup刺激20min， 其余步骤同前。 ) 5 细胞还原型GSH含量检测 (1)依照试剂盒说明书配置氧化型GSH （GSSG） 储备液、 5,5二硫二硝基苯甲酸 （DTNB） 储备液、 蛋白去除剂M溶液、 还原型辅酶 （NADPH）。

15、 储备液、 稀释的GSH清除辅助液、 GSH清除 试剂工作液、 40倍稀释谷胱甘肽还原酶、 总GSH检测工作液和0.16 mg/ml NADPH。 0025 (2)将GSSG储备液稀释为15、 10、 5、 2、 1、 0.5 M， 用以做标准曲线的6个点。 0026 (3)将收集的细胞样品与3倍体积的蛋白去除试剂M混合均匀后， 利用液氮和37 水浴进行两次快速冻融。 冰浴放置5min后， 4、 10000 g离心10min， 取上清用于测定总谷胱 甘肽。 0027 (4)取部分上一步骤的样品， 按每100 l加5 l稀释的GSH清除辅助液和1 l GSH清 除试剂的比例加入GSH清除辅助液和。

16、GSH清除试剂， 混匀后25反应60 min， 用于GSSG的测 定。 0028 (5)在96孔板中依次加入样品或标准品， 并加入150 l总谷胱甘肽检测工作液， 混 匀， 室温孵育5min。 加入50 l 0.16mg/ml NADPH、 混匀， 25min后立即在酶标仪上读取412nm 处吸光度并记录。 0029 (6)根据测定得到的总谷胱甘肽的含量和GSSG的含量计算出GSH的含量， 公式为： GSH的浓度=总谷胱甘肽的浓度-2GSSG的浓度。 0030 6 流式细胞术检测细胞凋亡 取生长状态良好的MLE-12细胞经消化计数后， 调整细胞悬液浓度为2105个/ml， 接种 于2块六孔板中。

17、， 每孔2 ml， 轻轻晃动六孔板使细胞均匀铺开。 恒温恒湿细胞培养箱培养24 h后， 更换为含10 M SFN的培养基孵育30min。 然后， 更换为含不同浓度PM2.5的培养基(0、 12.5、 25、 50、 100 g/ml)继续孵育24h。 弃去培养基， PBS润洗， 消化并收集细胞。 加入500 l 1 Binding Buffer、 10 l PI、 5 l Annexin V， 混匀、 并转移至流式管中， 用流式细胞仪检测 细胞凋亡。 0031 7. 蛋白免疫印迹(Western-Blot)实验 (1)细胞蛋白质提取： 取生长状态良好的MLE-12细胞经消化计数后， 以1106。

18、个/皿的 密度依次均匀接种于9个10cm平皿中(依次编号为19)， 置于细胞培养箱中培养。 平皿1为 空白对照、 不做任何处理。 当细胞生长密度达到70%， 平皿2、 3、 4、 5均用10 M SFN预处理 30min， 然后平皿2、 3、 4、 5依次用含不同浓度PM2.5的培养基(12.5、 25、 50、 100 g/ml)孵育 24h； 而平皿6、 7、 8、 9只用含不同浓度PM2.5的培养基(12.5、 25、 50、 100 g/ml)处理24h、 不接 受SFN预处理。 弃去培养基， PBS润洗后吸尽皿内液体， 每皿加入200 l裂解液， 将平皿置于冰 浴上、 轻轻刮取细胞，。

19、 将含有细胞的裂解液转移至1.5ml EP管中， 涡旋混匀后冰浴震荡1h， 说 明 书 3/6 页 5 CN 106963751 A 5 随后20000g， 4离心20min， 取上清-80保存备用。 0032 (2)蛋白质定量： BCA检测试剂A和B按50： 1的比例混匀后， 在置于冰上的96孔板中 按表1所示依次加入相应体积的蛋白标准品， 预冷的PBS、 补足至20 l。 取1 l各蛋白样品， 用 19 l预冷的PBS补足至20 l。 每孔加入200 l BCA检测工作液， 混匀， 37摇床孵育25min。 使 用酶标仪检测570nm处吸光度， 利用蛋白标准品的OD值绘制蛋白标准曲线， 然。

20、后算出每个蛋 白样品的蛋白含量。 0033 表1 BCA法标准曲线的准备 编号12345678 蛋白标准品(ml)01248121620 PBS(ml)2019181612840 (3)Western Blot基本步骤 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 （SDS-PAGE） 凝胶制备： 通常依据目标蛋白分子量确定 分离胶浓度： 如分子量为1260KDa的目标蛋白、 选用12%的分离胶； 分子量为2080KDa的 目标蛋白、 选用10%的分离胶； 分子量为3090KDa的目标蛋白、 则选用8%的分离胶。 本实验 选用12%的分离胶。 分离胶与堆积胶的配方如表2所示。 0034 表2 分离胶与堆积胶的制备。

21、 分离胶堆积胶 高纯水4.0 ml2.7 ml 30%丙烯酰胺3.3 ml0.67 ml PH=8.8 Tris -HCL2.5 ml PH=6.8 Tris -HCL0.5 ml 10% AP0.1 ml0.04 ml 10% SDS0.1 ml0.04 ml TEMED0.004 ml0.004 ml 总体积10.0 ml4.0 ml 蛋白上样:根据蛋白定量的结果、 计算蛋白样品的上样体积， 按 ： 的比例与5SDS 上样缓冲液混匀， 沸水浴5min， 冷却后即可上样。 0035 SDS-PAGE凝胶电泳： 将凝胶置于电泳槽中， 分别用50v和110v恒压跑堆积胶和分 离胶。 0036 转。

22、膜： 电泳结束后， 根据蛋白分子量Marker对凝胶进行适当裁减， 取大小适当的 已激活的聚偏氟乙烯(PVDF)膜置于胶上， 覆盖滤纸和海绵垫， 组成 “转膜三明治” 、 嵌入转膜 盒中， 4恒压(100v)转膜105min。 0037 丽春红染色： 转膜完成的PVDF膜浸泡在丽春红染液中片刻， 观察条带、 分析转膜 效率。 0038 封闭： 洗净PVDF膜以去除丽春红染液， 封闭液室温封闭3-4h。 0039 孵抗体： TBST洗膜两次、 每次5min， 特异性一抗4孵育过夜。 TBST洗膜三次， 每 次7min， 二抗室温孵育1.5h， TBST洗膜三次、 每次10min。 说 明 书 4。

23、/6 页 6 CN 106963751 A 6 0040 曝光及凝胶成像分析： ECL发光液均匀滴于膜上， 曝光、 拍照， Image J软件读取 灰度值。 0041 二、 结果 1 SFN预处理显著增强PM2.5暴露的MLE-12的活力 如图2所示， 在相同浓度PM2.5情况暴露下， SFN预处理的MLE-12肺上皮细胞存活率明显 高于无SFN处理的细胞， 差异有统计学意义(P 0.05)。 可见SFN预处理具有保护MLE-12肺上 皮细胞、 降低PM2.5损害的作用。 0042 2. SFN预处理降低PM2.5暴露的MLE-12细胞氧化应激 颗粒物尤其是细颗粒物 （PM2.5） 、 超细颗。

24、粒物(PM0.1)是强氧化剂、 能够产生ROS、 诱发氧 化应激， 后者通过氧化还原敏感的信号通路、 诱发炎症或细胞死亡。 ROS大量生成可打破机 体的氧化-还原动态平衡， 引起脂质过氧化、 生成大量丙二醛 （MDA） ， 后者作为脂质过氧化产 物， 诱导DNA损伤、 导致细胞损伤甚至死亡。 所以， 细胞的ROS和MDA水平可间接反映氧化损伤 程度。 由图3可见， PM2.5处理的细胞内荧光强度增强， 提示PM2.5暴露增加MLE-12细胞活性氧 生成。 应用荧光酶标仪对荧光强度进行进一步的定量分析， 以量化评价PM2.5暴露的MLE-12 细胞活性氧生成情况。 结果显示， PM2.5暴露的M。

25、LE-12细胞ROS生成量明显高于未处理的正常 细胞(P0.05)(图4)； 然而SFN预处理则可显著降低细胞内ROS水平(图5)。 0043 还原型GSH是重要的自由基清除剂， 还原型GSH可清除H2O2、 O2-等自由基、 稳定含巯 基酶、 防止血红蛋白及其他因子受氧化损伤， 是影响机体抗氧化能力的重要因素。 本研究发 现PM2.5暴露可显著降低细胞还原型GSH/总GSH， 应用SFN预处理则可明显升高细胞内还原型 GSH/总GSH(图6)。 0044 由此可见， SFN处理可显著抑制PM2.5暴露的MLE-12氧化应激的形成。 0045 3 SFN预处理降低PM2.5暴露的MLE-12细。

26、胞凋亡 各组细胞凋亡率的定量分析结果显示在相同浓度PM2.5暴露情况下， SFN预处理的MLE- 12细胞凋亡率明显低于无SFN预处理组(P0.05)(图7)。 0046 4. SFN预处理增强PM2.5暴露的MLE-12细胞Akt和ERK的活化 由图8可见， PM2.5暴露的MLE-12细胞Akt和p-Akt表达均明显降低； SFN预处理后再行 PM2.5染毒， MLE-12细胞内Akt和p-Akt水平则明显升高。 PM2.5处理的MLE-12细胞ERK表达及其 磷酸化水平明显降低， 其中ERK呈现剂量依赖性降低趋势。 SFN预处理后再行PM2.5染毒的细 胞ERK表达和磷酸化水平明显高于无。

27、SFN处理的细胞， 其中ERK蛋白质含量增加更为明显(图 9)。 0047 5 SFN预处理促进PM2.5暴露的MLE-12细胞抗氧化基因的表达 PM2.5处理的MLE-12细胞转录因子Nrf-2水平明显降低， 抗氧化基因NQO-1、 HO-1表达显 著下调； SFN预处理后再行PM2.5染毒， MLE-12细胞Nrf-2水平明显升高、 NQO-1和HO-1表达显 著增加(如图10所示)。 0048 6 SFN预处理抑制PM2.5暴露的MLE-12细胞线粒体凋亡相关基因的表达 线粒体凋亡途径是重要的凋亡途径， Bcl-2家族发挥重要调节作用。 如图11所示， PM2.5 显著升高促凋亡蛋白Ba。

28、x表达， 并剂量依耐性地增加促凋亡蛋白Bad的表达、 降低抗凋亡蛋 白Bcl-2水平。 应用SFN进行预处理则可明显降低促凋亡蛋白Bax、 Bad的表达、 升高抗凋亡蛋 说 明 书 5/6 页 7 CN 106963751 A 7 白Bcl-2的表达。 0049 以上结果说明， SFN预处理可降低PM2.5暴露的MLE-12细胞ROS的产生、 升高还原型 GSH水平、 增强抗氧化基因表达、 上调ERK和Akt促存活信号通路、 抑制线粒体凋亡蛋白表达， 拮抗PM2.5造成的MLE-12细胞氧化损伤。 0050 本发明的最佳实施例已阐明， 由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不 会脱离本发明的范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 106963751 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/6 页 9 CN 106963751 A 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/6 页 10 CN 106963751 A 10 图5 图6 说 明 书 附 图 3/6 页 11 CN 106963751 A 11 图7 图8 说 明 书 附 图 4/6 页 12 CN 106963751 A 12 图9 图10 说 明 书 附 图 5/6 页 13 CN 106963751 A 13 图11 说 明 书 附 图 6/6 页 14 CN 106963751 A 14 。