《一种竹节皂苷提取物及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种竹节皂苷提取物及其应用.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410658352.6 (22)申请日 2014.11.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104352507 A (43)申请公布日 2015.02.18 (73)专利权人 三峡大学 地址 443002 湖北省宜昌市大学路8号 (72)发明人 袁丁 张长城 刘朝奇 王婷 周志勇 顿耀艳 赵海霞 (74)专利代理机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 代理人 蒋悦 (51)Int.Cl. A61K 31/704(2006.01) A61P 1/00(200。
2、6.01) (56)对比文件 CN 102824355A ,2012.12.19, CN 102824355A ,2012.12.19, 李春艳等.竹节参化学成分与药理活性研究 进展. 中医药导报 .2012, 审查员 楼杜鹃 (54)发明名称 一种竹节皂苷提取物及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种竹节参提取物， 包括作为 活性成分的以下IVa化合物或其药学可接受的 盐， 还提供一种从竹节参根茎提取单体化合物， 包含权利要求1所述的竹节参提取物， 以及药学 可接受的辅料及载体。 将该竹节参提取物在制备 治疗肠粘膜损伤的药物上的应用。 其中， 肠粘膜 损伤为非甾体抗炎药所引起的肠粘膜损伤。 。
3、结果 表明， 竹节参皂苷IVa给药组小肠粘膜损伤及通 透性改变明显变小， 竹节参皂苷IVa对非甾体抗 炎药引起的肠粘膜损伤具有治疗作用。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 104352507 B 2017.02.01 CN 104352507 B 1.一种竹节皂苷提取物在制备治疗肠粘膜损伤的药物上的应用， 肠粘膜损伤为非甾体 抗炎药所引起的肠粘膜损伤， 该竹节皂苷提取物为作为活性成分的以下IVa化合物或其药 学可接受的盐： 竹节参皂苷IVa。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104352507 B 2 一种竹节皂苷提取物及其应用 技术领域 0001 本发明提供一种竹节皂苷提。
4、取物及其应用， 具体为竹节参皂苷IVa。 背景技术 0002 非甾体抗炎药(NSAIDs)是一类临床上广泛使用的抗炎药物， 如心脑血管疾病预防 及风湿性疾病、 疼痛、 运动损伤的治疗。 近年来临床上推出的缓释剂和肠溶剂如双氯芬酸钠 肠溶片， 减少胃部损伤的毒副作用， 但却把损伤转移到了远端的小肠1-3； 而随着胶囊内镜 的发展， NSAID导致的肠道损伤的诊出率明显上升， 被长期忽略的NSAID肠道损伤也越来越 受到人们的关注3,4， 然而对这一威胁人类健康的并发症， 目前在其防治上并没有统一合理 的方法。 因此， 积极寻求防治NSAID所导致的并发症已十分迫切。 发明内容 0003 本发明提。
5、供一种竹节皂苷提取物， 包括作为活性成分的以下IVa化合物或其药学 可接受的盐： 0004 0005 一种从竹节皂苷提取物中提取的单体化合物， 包含所述的竹节皂苷提取物， 以及 药学可接受的辅料及载体。 0006 将该竹节参皂苷IVa应用于非甾体抗炎药引起的肠粘膜损伤的药物上的应用。 0007 经与对照组相比， 模型组小肠粘膜通透性显著升高， 小肠粘膜损伤评分增高， 光镜 可见小肠粘膜绒毛发生变性、 坏死、 脱落， 大量炎细胞浸润。 而竹节参皂苷IVa给药组小肠粘 膜损伤及通透性改变明显变小， 竹节参皂苷IVa对非甾体抗炎药引起的肠粘膜损伤具有治 疗作用。 附图说明 0008 图1为伊文思蓝染。
6、色检测竹节参皂苷IVa对NASIDs模型小肠黏膜损伤的保护作用。 0009 图2 HE染色观察竹节参皂苷IVa对小肠黏膜组织的保护活性， 其中， a正常组； b模 型组； c竹节参皂苷IVa5mg组； d竹节参皂苷IVa20mg组(HE 1010)。 0010 图3.竹节参皂苷IVa对GRP78表达的影响。 A正常组， B模型组， C低剂量组， D高剂量 组。 说 明 书 1/4 页 3 CN 104352507 B 3 0011 图4.竹节参皂苷IVa对TNFa表达的影响。 A正常组， B模型组， C低剂量组， D高剂量 组。 具体实施方式 0012 实施例1 0013 实验动物 0014 。
7、湖北省动物实验中心提供： 健康雄性BABL/c小鼠60只， 体重18-24g左右， 自然光照 周期、 于恒温、 恒湿条件下标准配方的普通饲料喂养， 自由进食进水。 0015 仪器和试剂 0016 倒置荧光显微镜： 日本Nikon ECLIPSE TE2000-S； 全波长酶标仪： Thermo Electron公司； 凝胶成像系统(Gel Logic-200)： 美国Kodak公司； 高性能梯度PCR仪： 德国 Whatman Biometra公司； 多功能荧光酶标仪： 瑞士Tecan集团公司； ECL化学发光系统： 上海 欧翔科学仪器有限公司。 0017 双氯芬酸： 石药集团欧意药业有限公司。
8、， 临用前用1羧甲基纤维素配制0.5mg/ ml； 竹节参皂苷IVa： 成都迪康科技制药公司， 临用前用生理盐水溶解0.5mg/ml、 2mg/ml； FD4： 美国Sigma公司产品， 临用前用PBS溶解配制成20mg/ml溶液； 伊文氏蓝： 临用前用生理 盐水溶解配制成7.5mg/ml溶液。 0018 对42只BABL/c小鼠行随机组， 标记为： 模型组、 正常组、 竹节参皂苷IVa5mg/kg、 20mg/kg组， 连续灌胃六天。 于第四天给予双氯芬酸5mg/kg(10mg/ml)灌胃。 于第七天对小鼠 进行手术取材， 行肉眼观察及相关的实验研究。 0019 小鼠小肠组织的伊文思蓝染色：。
9、 0020 小鼠术前禁食(12h)不禁水。 劲椎脱臼处死， 处死前30min尾静脉注射伊文思蓝， 剖 腹， 分离小肠， PBS液冲洗内容物。 沿肠系膜对侧切开小肠， 粘膜面朝上平铺固定于玻璃板 上， 滤纸吸干多余水分， 数码相机拍摄。 0021 FITC-D检测小肠粘膜通透性： 给小鼠10水合氯醛行腹腔注射(0.2ml/只)， 以四 肢瘫软， 呼吸心跳正常为标准， 剖腹， 距回盲部2cm处选4-5cm小肠， 保持肠系膜血管血液供 应正常， 两端结扎， 肠腔注入0.2ml异硫氰酸荧光素标记葡聚糖(FITC-D)， 并予以保温， 20min后活体取肝脏， 称重、 匀浆器冰上研磨， 按1g/5ml加。
10、入1PBS液， 2000rpm/min、 30min 离心。 取上清液于多功能荧光酶标仪(激发波长480nm和发射波长530nm)测量吸光度值， 按 标准曲线计算FITC-D含量， 用统计学方法对实验数据进行分析。 0022 每只小鼠取约2-3cm小肠组织， 10中性甲醛溶液固定， 常规石蜡包埋， 4um切片， HE染色， 倒置荧光显微镜观察组织学改变， 组织学评分采用Chiu肠粘膜损伤评分标准参见 表1。 0023 表1.Chiu评分标准 说 明 书 2/4 页 4 CN 104352507 B 4 0024 0025 统计学分析 0026 用spass18.0软件对实验数据行非参数检验和方。
11、差分析， 结果用平均值与标准差 关系表示， (p0.05)。 0027 伊文思蓝染色检测竹节参皂苷IVa对NASIDs小肠黏膜损伤的保护作用。 0028 伊文思蓝能够从从血管中漏出到组织损伤处致伤损处局部蓝染， 图1显示： 阴性对 照组小鼠小肠黏膜形态正常、 粘膜表面干净； 模型组小肠组织可见多个散在分布、 大小不等 的溃疡,多沿肠系膜缘侧分布， 溃疡之间有多处水肿， 但未见肠道穿孔。 竹节参皂苷IVa给药 组， 由低浓度至高浓度， 肠道粘膜逐渐趋于正常、 溃疡数明显减少甚至无明显肉可视变化。 0029 竹节参皂苷IVa对NASIDs模型小肠黏膜通透性的影响： 实验以FITC-D作为检测探 针。
12、用于肠粘膜通透性检测。 FITC-D是大分子荧光物质， 当肠粘膜屏障受损时， 它通过损伤部 位进入血管而被吸收， 因此， 通过分光测量该物质的荧光值可反应肠粘膜通透性变化。 按标 准曲线可测得： 模型组肝脏组织中FD4含量显著高于正常组， 而竹节参皂苷IVa预处理组； FITC-D含量随着给药浓度增加， 呈下降趋势； 结果提示竹节参皂苷IVa可以改善NSAIDs所致 小肠粘膜通透性的增加。 (表2)经spass软件进行非参数检验和方差分析得出各组之间差异 存在统计学意义(p0.05)。 0030 表2 竹节参皂苷IVa对NSAIDs损伤小肠粘膜的影响 0031 0032 说 明 书 3/4 页。
13、 5 CN 104352507 B 5 0033 a与模型组比较p0.05 0034 组织病理学观察竹节参皂苷IVa对NSAIDs小肠黏膜组织的保护活性： 正常对照组 小肠黏膜形态结构正常； 模型组黏膜绒毛断裂、 萎缩,甚至出现脱落或相互融合,大量炎细 胞浸润， 粘膜下层结构紊乱， 形成蜂窝织炎， 按Chiu评分标准明显偏高； 预防给药组， 随着给 药浓度增加， 粘膜层炎性细胞浸润有所改善， 黏膜结构清晰度增加,腺体数目明显改变， 膜 下层肿胀,结构紊乱明显改善， 与模型组对比Chiu评分明显下降。 0035 石蜡切片在光镜下观察(图2)： 模型组局部粘膜层全层坏死,绒毛坏死脱落,固有 层受损。
14、,腺体结构消失， 粘膜肌层不完整,损伤甚至达粘膜下层， 残留绒毛水肿， 大量中性粒 细胞等炎性细胞浸润； 正常组粘膜形态结构无明显改变； 给药组， 有低浓度至高浓度， 粘膜 层绒毛结构趋于完整， 绒毛水肿及炎细胞浸润逐渐减轻， 固有层结构逐渐清晰， 无明显损 坏， 粘膜下层未受累。 0036 免疫荧光染色方法： 0037 1.玻片经多聚赖氨酸浸泡特殊处理后干燥备用。 连续切片2 m， 裱于载玻片上， 60 烤片3h， 常规脱蜡， 1PBS洗3次。 0038 2.高压加热抗原修复： 在电高压消毒锅中放入加有枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液的染 缸， 加盖。 在高压消毒锅开启压力阀的情况下将枸橼酸-枸橼酸盐。
15、缓冲液加热煮沸。 将常规 处理好的切片放入缓冲液中， 密封高压消毒锅， 关闭压力阀。 加热至121计时2分钟。 切断 电源， 打开压力阀， 让高压锅内的压力迅速降低。 取出染缸， 在室温放置20分钟备用。 0039 3.1PBS洗3次， 每次10分钟； 0040 4.5BSA室温封闭30分钟； 0041 5.加一抗(用1BSA稀释)放在湿盒里， 4度过夜； 0042 6.1PBS洗3次， 每次10分钟； 0043 7.加二抗(用1BSA稀释)30分钟； 0044 8.1PBS洗3次， 每次10分钟； 0045 9.95甘油封片； 0046 10.荧光显微镜观察拍照。 0047 结果： 0048。
16、 内质网(Endoplasmic reticulum)是细胞中重要的细胞器， 能够调节蛋白质的合 成、 折叠、 聚集； 内质网对各种刺激极为敏感， 当受不良刺激时， 它通过激活未折叠蛋白反应 (unfolded protein response， UPR)来减少细胞内蛋白的异常聚集， 发生内质网应激 (endoplasmic reticulum stress,ERS)， 从而起到细胞保护作用。 在内质网应激条件下， GRP78的表达明显上调， 因此， grp78被认为是内质网稳态的感受器， 是启动ERS和内质网稳 态调节的关键因子之一。 TNF- 是重要的炎症因子， 它表达于多种炎症中。 有研。
17、究表明， TNF- 能够促进GRP78的表达， 从而促进ERS的发展， 同时， 内质网应激又能促进TNF- 的表达。 ERS 在机体的炎症反应中发挥重要作用， 且UPR与炎症反应通路之间通过多种机制相互偶联， 参 与多种炎症性疾病的发生发展。 因此本项目选择ERS中关键因子GRP78和TNF- 反映竹节参 IVa对结肠炎的干预活性。 从下图3、 4可见， 模型组高表达GRP78和TNF- ， 在正常组相对低表 达， 而竹节参IVa给药组能够下调TNF 和GRP78的表达。 说 明 书 4/4 页 6 CN 104352507 B 6 图1 说 明 书 附 图 1/4 页 7 CN 104352507 B 7 图2 说 明 书 附 图 2/4 页 8 CN 104352507 B 8 图3 说 明 书 附 图 3/4 页 9 CN 104352507 B 9 图4 说 明 书 附 图 4/4 页 10 CN 104352507 B 10 。