一种中药组合物及其在制备抗H5亚型禽流感病毒的产品中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710287272.8 (22)申请日 2017.04.27 (71)申请人 无限极 （中国） 有限公司 地址 529156 广东省江门市新会区会城镇 七堡工贸城北区三号 (72)发明人 马忠华 胡明华 尹西拳 马方励 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 赵青朵 (51)Int.Cl. A61K 36/9068(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 31/16(2006.01) A61P 37/04(200。

2、6.01) (54)发明名称 一种中药组合物及其在制备抗H5亚型禽流 感病毒的产品中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种含有香菇、 茯苓、 生姜、 陈 皮水提物的具有抗H5亚型禽流感病毒作用的配 方及其应用， 所述的配方主要由香菇、 茯苓、 生 姜、 陈皮组成。 本发明中的配方经抗病毒实验证 实， 能够显著提高H5亚型流感病毒感染小鼠的免 疫功能， 改善H5亚型流感病毒感染小鼠的肺炎性 病变程度， 并可显著改善H5亚型病毒感染小鼠血 清中特异性抗体水平， 显著降低H5亚型病毒感染 小鼠肺部病毒含量以及改善肺部细胞因子IL-2 水平， 体外细胞试验证明中药组合物具有显著的 抗病毒能力和较好的治。

3、疗效果。 表明了该配方具 有良好的抗H5亚型流感病毒作用。 权利要求书1页 说明书17页 CN 106913852 A 2017.07.04 CN 106913852 A 1.一种组合物， 其特征在于， 由以下质量份的原料组成； 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 由以下质量份的原料组成： 3.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 由以下质量份的原料组成： 4.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 由以下质量份的原料组成： 5.根据权利要求14任一项所述的组合物， 其特征在于， 所述香菇为香菇水提物， 所述 茯苓为茯苓水提物， 所述生姜为生姜水提物， 所述陈皮为陈皮水提。

4、物。 6.权利要求14任一项所述的组合物在制备抗H5亚型禽流感病毒的药物中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述抗H5亚型禽流感病毒包括： 抑制H5亚 型病毒侵入宿主细胞和/或降低H5亚型病毒感染后体内病毒滴度。 8.权利要求14任一项所述的组合物在制备提高免疫功能的药物中的应用； 所述免疫 功能为对H5亚型禽流感病毒的免疫功能。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述提高免疫功能包括： 缓解免疫后动物 体重降低、 提高免疫后动物的抗体水平、 提高免疫后动物的细胞因子水平。 10.一种疫苗免疫增强剂， 其特征在于， 包括权利要求14任一项所述的组合物及药学 上。

5、可接受的辅料。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106913852 A 2 一种中药组合物及其在制备抗H5亚型禽流感病毒的产品中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及药物领域， 特别涉及一种中药组合物及其在制备抗H5亚型禽流感病毒 的产品中的应用。 背景技术 0002 禽流感(Avian Influenza， AI)是由正黏病毒科中的A型流感病毒引起的禽类疾 病， AI一旦发生， 不仅会严重阻碍养禽业的稳定发展， 而且还会引发危害人类健康和影响社 会经济发展的问题。 0003 禽流感病毒(AIV)分为甲、 乙、 丙3个型。 其中甲型流感病毒多发于禽类， 一些甲型 也可感染猪、 马、。

6、 海豹和鲸等各种哺乳动物及人类； 乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和 猪的感染。 其中， 甲型禽流感病毒， 是有囊膜、 多形态的单股负链RNA病毒。 基因组分为8个节 段， 由大到小依次为PB2、 PBl、 PA、 HA、 NP、 NA、 M、 NS。 基因组序列每个RNA片段5 末端有13个高 度保守的核苷酸， 3 末端有12个保守核苷酸。 根据病毒表面血凝素(Hemagglutinin， HA)和 神经氨酸酶(Neuraminidase， NA)结构及其基因特性的不同分成许多亚型。 0004 病毒进入细胞后， HA蛋白识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的受体， 经受体街道 的胞吞作用进入胞质，。

7、 病毒颗粒被吞入饮泡； 然后， 蛋白的离子通道开放， 使饮泡内的pH值 逐步下降， 当pH降至5.06.0时， HA结构发生改变， 饮泡内的胰蛋白酶将HA蛋白前体切割成 HA1和HA2。 HA能否裂解为HAl和HA2关系到该病毒粒子致病力的强弱。 而HA对蛋白酶裂解的 敏感性又直接影响到病毒的毒力。 HA基因中多碱基切割位点的存在是决定AIV高致病性的 一个分子特征。 已有很多深入的研究证明了HA裂解位点的结构与病毒病原性的相关性。 0005 研究表明H5亚型AIV的致病性强弱还受到HA上其他氨基酸的调节， 有一些在裂解 位点处含有多个碱性氨基酸的H5亚型流感病毒对小鼠和鸡不表现出高致病性。 。

8、另有研究表 明， H5N1流感病毒不同于其他的人类、 禽和猪的流感病毒， 它能抵抗宿主机体IFN和INF- 的抗病毒效应， 这主要由于H5N1病毒的非结构(NSl)基因的92位上的谷氨酸(Glu)能削弱宿 主机体的免疫应答， 而其他流感病毒92位上为天冬氨酸(Asp)。 0006 现代药理及临床研究表明， 多糖类化合物是一种良好的免疫调节剂， 不仅对巨噬 细胞、 T细胞、 B细胞等免疫细胞具有激活作用， 还能促进细胞因子的生成、 活化补体， 具有抗 病毒、 抗肿瘤及抗衰老等独特功效。 0007 中草药多糖是中药材中的主要功效成分， 如本配方使用的香菇和茯苓提取物中的 香菇多糖和茯苓多糖， 已有。

9、研究证明这两种多糖具有一定的免疫调节作用， 在抗病毒方面 有良好的效果。 生姜为芳香性辛辣健胃药， 有温暖、 兴奋、 发汗、 止呕、 解毒等作用， 也常被用 于治疗风寒感冒， 已有研究表明， 生姜具有较强的抗炎、 抗病毒作用。 陈皮， 苦， 能泻能燥， 辛 能散， 温能和， 可用于湿阻中焦、 脘腹痞胀、 便溏泄泻， 以及痰多咳嗽等症。 另外， 陈皮还能燥 湿而健脾开胃， 适用于脾胃虚弱和消化不良等症， 常与人参、 白术、 茯苓等配合应用。 0008 H5亚型的禽流感病毒属高致病性禽流感病毒， 相对于其他亚型的禽流感病毒， H5 说 明 书 1/17 页 3 CN 106913852 A 3 亚。

10、型流感常以突然死亡和高死亡率为主要特征， 可导致感染鸡群或其他禽类全军覆没， 造 成巨大的经济损失及社会恐慌。 目前， 对H5亚型禽流感病毒的防治主要集中在疫苗和抗病 毒药物两种方法上， 疫苗是一种有效抑制流感病毒的手段， 但是从疫苗注射到抗体的产生 需要较长的时间， 更重要的是， 流感病毒的抗原变异是疫苗的有效性显著降低。 对治疗药物 的研究表明， 对H1、 H2或H3亚型有效的金刚烷胺类药物或金刚乙胺类药物却在面对H5N1病 毒时产生了抗药性， 目前达菲是最佳治疗H5亚型流感的药物。 但是， 目前对于甲型流感病毒 感染治疗的药物远远不足， 进一步开发具有抗流感病毒功能的药物十分必要。 发明。

11、内容 0009 有鉴于此， 本发明提供一种中药组合物及其在制备抗H5亚型禽流感病毒的产品中 的应用。 本发明主要基于香菇、 茯苓、 生姜、 陈皮这几种药物可以作为一种广谱的免疫促进 剂的效应， 利用小鼠作为模型， 筛选可增强流感病毒疫苗免疫效果的中药组合物， 从而增强 流感疫苗免疫效果， 帮助人类抵抗流感威胁。 0010 为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案： 0011 本发明提供了一种组合物， 由以下质量份的原料组成； 0012 0013 在本发明的一些具体实施方案中， 所述组合物由以下质量份的原料组成； 香菇5 份， 茯苓5份， 生姜30份， 陈皮30份。 0014 在本发明的一。

12、些具体实施方案中， 所述组合物由以下质量份的原料组成； 香菇10 份， 茯苓10份， 生姜20份， 陈皮20份。 0015 在本发明的一些具体实施方案中， 所述组合物由以下质量份的原料组成； 香菇20 份， 茯苓20份， 生姜30份， 陈皮30份。 0016 在本发明的一些具体实施方案中， 所述香菇为香菇原药， 所述茯苓为茯苓原药， 所 述生姜为生姜原药， 所述陈皮为陈皮原药。 0017 在本发明的一些具体实施方案中， 所述中药组合物的制备方法为： 分别取香菇5 20份， 茯苓520份， 生姜2030份， 陈皮2030份， 加入20倍水煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤 渣加入20倍水煎煮1h。

13、， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥 或者70烘干， 粉碎即得中药组合物。 0018 在本发明的一些具体实施方案中， 单味药物的制备方法为： 分别取香菇、 茯苓、 生 姜或陈皮， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 再次煎煮1h， 过滤， 合并2 次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得。 0019 本发明的组合物将香菇、 茯苓、 生姜或陈皮进行复配， 所得组合物具有抗H5亚型禽 流感病毒的作用， 且能够增强动物体对H5亚型禽流感病毒的免疫功能。 本发明提供的组合 物各组分。

14、相互配合， 在恰当的配比下， 共同起到了协同增效作用。 0020 本发明还提供了本发明提供的组合物在制备抗H5亚型禽流感病毒的药物中的应 说 明 书 2/17 页 4 CN 106913852 A 4 用。 0021 所述抗H5亚型禽流感病毒包括： 抑制H5亚型病毒侵入宿主细胞和/或降低H5亚型 病毒感染后体内病毒滴度。 所述降低H5亚型病毒感染后体内病毒滴度， 是指经免疫和病毒 感染后动物血清内病毒滴度。 0022 体外实验表明， 以含有本发明组合物的培养液培养经H5亚型禽流感病毒侵染MDCK 细胞， 添加本发明提供的组合物能够抑制细胞病变， IC50值为46.252.8， 治疗指数TI可达。

15、 29.62， 证明本发明提供组合物对H5亚型禽流感病毒具有抑制作用。 动物实验表明， 给予本 发明组合物30天， 并于第15、 23天， 分别肌肉注射流感病毒疫苗(本发明以H5亚型流感病毒 的典型病毒H5N1和H5N6为试材进行实验)。 第32天滴鼻感染相应流感病毒后， 常规饲养小鼠 至第46天， 结果表明， 本发明提供组合物能够降低小鼠肺匀浆中的病毒滴度。 且不论体外实 验还是动物体实验， 都证明本发明提供的组合物在抑制H5亚型禽流感病毒方面的效果要由 于单一组分， 也优于其他配比条件下的组合， 该效果具有显著性差异(p0.05)。 0023 本发明提供的组合物在制备提高免疫功能的药物中的。

16、应用； 所述免疫功能为对H5 亚型禽流感病毒的免疫功能。 0024 提高免疫功能包括： 缓解免疫后动物体重降低、 提高免疫后动物的抗体水平、 提高 免疫后动物的细胞因子水平。 0025 在本发明的实施例中， 所述H5亚型禽流感病毒为H5N1或H5N6。 0026 优选的， 本发明所述细胞因子为IL-2。 所述免疫为疫苗免疫， 所述疫苗为流感病毒 疫苗； 作为优选， 疫苗为H5亚型流感病毒疫苗。 优选的， 疫苗为H5N1或H5N6流感病毒疫苗。 0027 实验表明， 给予本发明组合物30天， 并于第15、 23天， 分别肌肉注射流感病毒疫苗 (本发明以H5亚型流感病毒的典型病毒H5N1和H5N6。

17、为试材进行实验)。 第32天滴鼻感染相应 流感病毒后， 常规饲养小鼠至第46天， 结果表明， 本发明提供组合物对免疫后感染病毒小鼠 的体重有明显的恢复效果。 并且， 感染病毒后， 小鼠体内的特异性抗体水平和细胞因子的水 平也得到显著性提高。 其效果显著优于各单味药物， 也优于其他配比条件下的组合， 该效果 具有显著性差异(p0.05)。 0028 本发明提供组合物提高免疫功能的剂量为2g生药/kg。 连续服药30天， 期间第15天 和第23天分别注射流感病毒疫苗， 在此给药条件下， 本申请的组合物的效果与维他命C(剂 量为0.5g/kg体重)的对照组的效果相当。 0029 本发明还提供了所述组。

18、合物在制备疫苗免疫增强剂的药物中的应用。 0030 本发明还提供了一种疫苗免疫增强剂， 包括所述组合物及药学上可接受的辅料。 0031 本发明提供了含有香菇、 茯苓、 生姜、 陈皮提取物的中药组合物， 本配方利用扶正 祛邪的方式来提高机体抗病毒能力， 增强免疫功能。 配方中的香菇、 茯苓具有扶正之功， 生 姜、 陈皮具有驱邪之功， 扶正和祛邪功效相辅相成， 增强免疫功能和抗病毒作用。 实验表明， 本发明提供的组合物具有抗H5亚型禽流感病毒作用， 具体可以体现在： 其能够显著提高H5 亚型禽流感病毒感染小鼠的存活率和生存质量， 改善H5亚型禽流感病毒感染小鼠的肺炎性 病变程度， 并可显著改善H5。

19、亚型禽流感病毒感染小鼠血清中特异性抗体水平， 显著降低H5 亚型禽流感病毒感染小鼠肺部病毒含量以及改善肺部细胞因子IL-2水平。 而体外细胞试验 证明中药组合物具有显著的抗病毒能力和较好的治疗效果。 实验表明， 本发明提供的组合 物各组分相互配合， 在恰当的配比下， 共同起到了协同增效作用。 且不论体外实验还是动物 说 明 书 3/17 页 5 CN 106913852 A 5 体实验， 都证明本发明提供的组合物在抑制H5亚型禽流感病毒方面的效果要由于单一组 分， 也优于其他配比条件下的组合， 该效果具有显著性差异(p0.05)。 具体实施方式 0032 本发明公开了一种中药组合物及其在制备抗。

20、H5亚型禽流感病毒的产品中的应用， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似 的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明 的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精 神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技 术。 0033 本发明提供的中药组合物中所用原料药或辅料均可由市场购得。 0034 下面结合实施例， 进一步阐述本发明： 0035 实施例1： 中药组合物的制备方法 0036 按照重量份分别为香菇20份， 茯苓20份， 生姜3。

21、0份， 陈皮30份称取香菇、 茯苓、 生姜 和陈皮， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤 液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组合物。 0037 实施例2： 中药组合物的制备方法 0038 按照重量份分别为香菇10份， 茯苓10份， 生姜20份， 陈皮20份称取香菇、 茯苓、 生姜 和陈皮， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤 液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组合物。

22、。 0039 实施例3： 中药组合物的制备方法 0040 按照重量份分别为香菇5份， 茯苓5份， 生姜30份， 陈皮30份称取香菇、 茯苓、 生姜和 陈皮， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组合物。 0041 对比例1： 中药组合物的制备方法 0042 按照重量份分别为30份、 30份、 20份、 20份称取香菇、 茯苓、 生姜和陈皮， 加入20倍 水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓。

23、缩滤液至每 100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组合物。 0043 对比例2： 中药组合物的制备方法 0044 按照重量份分别为20份、 30份、 10份、 10份称取香菇、 茯苓、 生姜和陈皮， 加入20倍 水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每 100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组合物。 0045 对比例3： 中药组合物的制备方法 0046 按照重量份分别为30份、 30份、 5份、 5份称取香菇、 茯苓、 生姜和陈皮， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 。

24、收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL 含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组合物。 0047 对比例4： 中药组合物的制备方法 0048 按照重量份分别为30份、 20份、 5份、 20份称取香菇、 茯苓、 生姜和陈皮， 加入20倍 50乙醇水溶液， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍50乙醇水溶液， 煎煮1h， 过滤， 合 说 明 书 4/17 页 6 CN 106913852 A 6 并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组 合物。 0049 对比。

25、例5： 中药组合物的制备方法 0050 按照重量份分别为20份、 20份、 10份、 5份称取香菇、 茯苓、 生姜和陈皮， 加入20倍 70乙醇水溶液， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍70乙醇水溶液， 煎煮1h， 过滤， 合 并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即得中药组 合物。 0051 对比例6： 香菇提取物的制备方法 0052 称取适量的香菇， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即 。

26、得香菇提取物。 0053 对比例7： 茯苓提取物的制备方法 0054 称取适量的茯苓， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即 得茯苓提取物。 0055 对比例8： 生姜提取物的制备方法 0056 称取适量的生姜， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即 得生姜提取物。 0057 对比例9： 陈皮提取物的制备方法 00。

27、58 称取适量的陈皮， 加入20倍水， 煎煮2h， 过滤， 收集滤液， 滤渣加入20倍水， 煎煮1h， 过滤， 合并2次滤液； 浓缩滤液至每100mL含有100g生药量， 冷冻干燥或者70烘干， 粉碎即 得陈皮提取物。 0059 实施例4： 中药组合物对H5N1病毒感染小鼠的干预研究 0060 1材料和方法 0061 1.1材料 0062 1.1.1实验动物 0063 SPF小鼠， 雌性， 小鼠用标准全价饲料进行饲胃， 购买小鼠当天要根据小鼠体重对 所有小鼠进行分笼及编号， 每只鼠笼5只小鼠。 本次实验所需小鼠均从华中农业大学实验动 物中心订购且均由本校实验动物中心进行饲养及管理。 0064 。

28、1.1.2供试品 0065 本次研究配方药物对流感疫苗免疫效力影响实验所用的药物由公司提供， 需在4 摄氏度避光保存。 0066 1.1.3主要试剂及仪器 0067 流感病毒毒株： A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)； 华南农业大学禽病 0068 研究室 0069 流感病毒疫苗： 禽流感H5N1亚型Re-6株灭活疫苗， 兽药生字(2012)080012191， 哈 尔滨维科生物技术开发公司 0070 0.5牛蛋白血清(BSA)： 购自Biosharp公司； 说 明 书 5/17 页 7 CN 106913852 A 7 0071 小鼠IgG-HRP： 购自South。

29、ern Biotech公司； 0072 小鼠细胞因子IL-2ELISA试剂盒， 美国R&D Systems公司； 0073 禽流感病毒ELISA检测试剂盒， 武汉科前动物生物制品有限责任公司； 0074 小鼠IgG抗体ELISA检测试剂盒， 武汉科前动物生物制品有限责任公司； 0075 电子天平BSA124S， 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司； 0076 台式高速离心机TG16-， 长沙平凡仪器仪表有限公司； 0077 酶标仪318C， 美国Perkin Elmer公司； 0078 1.1.4实验器材 0079 灌胃针， 1ml注射器， 1.5mlEP管,移液枪， 离心机， 小剪刀镊子等。 。

30、0080 1.2方法 0081 1.2.1动物分组及处理 0082 采用Excel软件的随机数字功能， 对SPF级小鼠进行随机分组， 分为空白对照组、 疫 苗对照组、 维他命C对照组、 实施例1组、 实施例2组、 实施例3组、 对比例1组、 对比例2组、 对比 例3组、 对比例4组、 对比例5组、 对比例6组、 对比例7组、 对比例8组、 对比例9组， 每组15只。 分 别按照下列方法操作： 0083 疫苗对照组： 生理盐水灌胃30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感病毒疫苗。 0084 空白对照组： 生理盐水灌胃30天。 0085 维他命C(VC)对照组： VC灌胃(0.5g生药/kg。

31、)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病毒疫苗。 (参照文献 Red ginseng and vitamin C increase immune cell activity and decrease lung inflammation induced by influenza A virus/H5N1infection 、 大剂量维生素C辅助治疗流行性感冒的临床观察 ， 维生素C用于抗病毒的成人每日服用量 为3g左右， 按照等效剂量折算为小鼠给药剂量为0.5g/kg体重) 0086 实施例1组： 实施例1组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病。

32、毒疫苗。 0087 实施例2组： 实施例2组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病毒疫苗。 0088 实施例3组： 实施例3组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病毒疫苗。 0089 对比例1组： 对比例1组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病毒疫苗。 0090 对比例2组： 对比例2组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病毒疫苗。 0091 对比例3组： 对比例3组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病。

33、毒疫苗。 0092 对比例4组： 对比例4组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病毒疫苗。 0093 对比例5组： 对比例5组合物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23天， 分别肌肉注射流感 病毒疫苗。 0094 对比例6组(香菇提取物组)： 对比例6香菇提取物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23 说 明 书 6/17 页 8 CN 106913852 A 8 天， 分别肌肉注射流感病毒疫苗。 0095 对比例7组(茯苓提取物组)： 对比例7茯苓提取物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23 天， 分别肌肉注射流感病毒疫苗。 009。

34、6 对比例8组(生姜提取物组)： 对比例8生姜提取物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23 天， 分别肌肉注射流感病毒疫苗。 0097 对比例9组(陈皮提取物组)： 对比例9陈皮提取物灌胃(2g生药/kg)30天， 第15、 23 天， 分别肌肉注射流感病毒疫苗。 0098 第31天， 每组取5只小鼠， 取血、 肺脏。 0099 第32天(第0天)， 除空白组外， 其他组小鼠分别用50 l H5N1流感病毒滴鼻感染。 0100 第35天(感染后第3天)， 每组取3只小鼠， 取血、 肺脏。 0101 第38天(感染后的第6天)， 每组取3只小鼠， 取血、 肺脏。 0102 第33天到第4。

35、6天(感染后的2周内)， 记录体重； 观察小鼠精神状态和临床发病情 况。 0103 第46天(感染后的第14天)， 称重后处死小鼠， 取血、 肺脏。 0104 1.2.2样品采集及处理 0105 血清采集 0106 小鼠经摘眼球取血， 让血液自由滴入1.5ml离心管中， 4静置2小时后3500rpm， 10min， 离心取血清， 分装在EP管中， -20冻存备用。 0107 小鼠经尾静脉采血时根据每次要采血的小鼠数量准备好1.5ml EP管， 在每个管中 加入40ulEDTA抗凝剂待用。 0108 2结果 0109 2.1精神状态及临床发病情况 0110 对比例组、 VC组及疫苗对照组小鼠在病。

36、毒感染后第2天， 出现精神不振， 反应迟钝， 皱毛， 弓背， 食欲下降及呼吸急促， 爱扎堆， 蜷缩、 竖毛、 颤抖， 第4-8天上述临床症状明显， 出 现死亡， 部分小鼠出现腹泻。 疫苗对照组小鼠在第3天上述症状有所减轻。 空白对照组小鼠 未出现临床症状。 复方组发病状况较轻， 且在第3天上述症状明显减少且逐渐消失， 未出现 死亡。 0111 2.2中药组合物对病毒感染小鼠体重的影响 0112 表1 H5N1病毒感染后小鼠体重占初始体重百分比(n15) 说 明 书 7/17 页 9 CN 106913852 A 9 0113 0114 注： 与疫苗组比较， *P0.05； 与实施例3比较， #。

37、P0.05； 0115 如表1所示， 空白对照组小鼠体重有增长但未出现明显波动； 疫苗对照组和维他命 C对照组小鼠在感染病毒后第一天体重明显下降， 第二天之后体重有了明显恢复而且波动 不大， 维持在原来体重的9798左右； 各个实施例组小鼠在感染病毒后第一天体重明 显下降， 第二天之后体重开始明显回升且逐渐恢复到初始体重， 其中实施例3组小鼠体重恢 复较为显著， 体重恢复到最大时达到初始体重的105左右， 证明实施例3的中药组合物对 感染病毒的小鼠体重有明显的恢复效果， 且实施例3组效果明显(P0.05)优于部分对比例 组。 0116 2.3中药组合物对H5N1病毒感染小鼠血清中特异性抗体的影。

38、响 0117 表2 H5N1病毒感染前后小鼠血清中特异性抗体的变化(n3) 说 明 书 8/17 页 10 CN 106913852 A 10 0118 0119 注： 与疫苗组比较， *P0.05； 与实施例3比较， #P0.05； 0120 如表2， 在病毒感染前， 空白对照组作为阴性对照， 血清中不存在特异性抗体， 各疫 苗免疫组(单纯的疫苗组和各实施例组)血清中的特异性抗体水平没有明显差异。 病毒感染 第3天开始， 各组的特异性抗体显著增加， 各个实施例组小鼠的特异性抗体显著高于单纯的 疫苗组， 而空白对照组的抗体始终处于较低水平。 在感染后第6、 14天， 与疫苗组相比， 各个 实施。

39、例组小鼠的特异性抗体水平显著高于疫苗组或各对比例组(P0.05)。 其中实施例3组 的小鼠特异性抗体水平最高， 且效果显著优于实施例1或实施例2(p0.05)。 0121 2.4中药组合物对病毒感染小鼠肺匀浆中H5N1病毒含量的影响 0122 表3病毒感染后小鼠肺部H5N1病毒含量的变化(n3) 说 明 书 9/17 页 11 CN 106913852 A 11 0123 0124 注： 与疫苗组比较， *P0.05； 与实施例3比较， #P0.05； 0125 从表3中可以看到， 病毒感染后第3天开始， 疫苗对照组以及维他命C对照组小鼠肺 部H5N1病毒含量稍微有所升高； 感染后第6、 14。

40、天， 各实施例组肺部H5N1病毒含量均处于相 对正常的水平， 其中， 实施例3组小鼠病毒滴度最低， 且效果显著优于各对比例以及实施例1 或实施例2(p0.05)。 0126 2.5中药组合物对小鼠肺匀浆中细胞因子IL-2的影响 0127 表4 H5N1病毒感染前后小鼠肺IL-2的变化(n3) 0128 说 明 书 10/17 页 12 CN 106913852 A 12 0129 0130 注： 与疫苗组比较， *P0.05； 与实施例3比较， #P0.05； 0131 小鼠感染H5N1病毒后， 肺匀浆细胞因子的水平发生了明显变化， IL-2随着病毒感 染时间的延长逐渐升高。 由表4可知， 在。

41、改善肺匀浆IL-2的水平方面， 各个实施例的对小鼠 肺匀浆中细胞因子IL-2水平均有改善作用， 尤其是各实施例组的小鼠肺匀浆中细胞因子 IL-2水平最高显著优于各对比例组(P0.05)， 并且实施例3的效果显著(P0.05)优于实 施例1或实施例2(p0.05)。 0132 实施例5中药组合物对H5N1病毒体外抑制作用的研究 0133 1.材料和方法 0134 1.1材料 0135 1.1.1实验药物 0136 阳性对照药:羧酸奥司他韦， 购自上海罗氏制药有限公司； 供试药物： 由公司提供， 需在4摄氏度避光保存； 细胞株： 狗肾细胞(MDCK)， 引自中国科学院典型培养物保藏委员会 细胞库；。

42、 流感病毒毒株： 0137 A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)； 华南农业大学禽病研究室。 0138 1.1.2主要试剂 0139 胎牛血清， 美国GIBCO公司； PBS， 美国GIBCO公司； TPCK， 广州捷倍斯生物科技有限 公司； MTT， 购自Genebase。 0140 1.2方法 0141 1.2.1药物毒性试验(MTT法) 0142 按每孔约2.5104MDCK细胞接种到96孔板， 24h后待细胞长成单层后， 弃去培养 液， 加入不同稀释度的相应药物100 L/孔， 空白对照和正常细胞对照孔加入100 L/孔MEM， 37、 5CO2继续培养364。

43、8h， 每孔加MTT溶液(5mg/mL)20 L， 置37、 5CO2温箱中继续 孵育4h。 吸弃培养上清液， 每孔加100 L DMSO， 低速振荡10min， 使结晶物充分融解。 选择 490nm波长， 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。 按照下列公式计算抑制率， 并用 说 明 书 11/17 页 13 CN 106913852 A 13 ReedMuench法计算50毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC50)。 抑制率(正常组平均OD 值空白组平均OD值)(给药组平均OD值空白组平均OD值)/(正常组平均OD值空白 组平均OD值)100。 0143 1.2.2体外抗流感病毒活性试验(细胞病。

44、变抑制法) 0144 长满单层的96孔细胞培养板内的MDCK细胞吸附病毒2h， 同时设定阳性药物和细胞 对照， 然后加入含不同浓度药物的培养液， 置34、 5CO2环境下培养48h。 细胞出现病变程 度按以下6级标准记录： ()为细胞生长正常， 无病变出现； ()为细胞病变少于整个单层 细胞的10； (+)为细胞病变约占整个单层细胞的25； (+)为细胞病变约占整个单层细胞 的50； (+)为细胞病变约占整个单层细胞的75； (+)为细胞病变占整个单层细胞的 75以上。 用ReedMuench法计算半数抑制浓度(IC50)， 并以选择指数TI表示药物的治疗指 数(TITC50/IC50)。 0。

45、145 2.结果 0146 表5供试药品对H5N1流感病毒的药效 0147 0148 0149 采用治疗指数TI评价供试药物对病毒抑制的效力， TI值大于1为有效， 指数越大， 安全范围越大。 由表5可知， 各复方组TI值显著大于各对比例组， 其中实施例3效果较为突 出， 为29.62， 各对比例组TI值普遍在56左右。 由此， 可以充分说明此药物抗流感病毒的有 效性和安全性。 0150 实施例6： 中药组合物对H5N6病毒感染小鼠的干预研究 0151 1.材料及方法 0152 同实施例10， 其中， 流感病毒毒株： A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N6)； 购自华南 。

46、农业大学禽病研究室 0153 2.结果 0154 2.1精神状态及临床发病情况 0155 对比例组、 VC组及疫苗对照组小鼠在H5N6病毒感染后第2天， 出现精神不振， 反应 迟钝， 皱毛， 弓背， 食欲下降及呼吸急促， 爱扎堆， 蜷缩、 竖毛、 颤抖， 第4-8天上述临床症状明 显， 出现死亡， 部分小鼠出现腹泻。 疫苗对照组小鼠在第3天上述症状有所减轻。 空白对照组 小鼠未出现临床症状。 复方组发病状况较轻， 且在第3天上述症状明显减少且逐渐消失， 未 出现死亡。 说 明 书 12/17 页 14 CN 106913852 A 14 0156 2.2中药组合物对H5N6病毒感染小鼠体重的影。

47、响 0157 表6 H5N6病毒感染后小鼠体重占初始体重百分比(n15) 0158 0159 0160 注： 与疫苗组比较， *P0.05； 单味药与实施例3比较， #P0.05； 0161 如表6所示， 空白对照组小鼠体重有增长但未出现明显波动； 疫苗对照组和维他命 C对照组小鼠在感染病毒后第一天体重明显下降， 第二天之后体重有了明显恢复而且波动 不大； 各个实施例组小鼠在感染病毒后第一天体重明显下降， 第二天之后体重开始明显回 升且逐渐恢复到初始体重， 其中实施例3组小鼠体重恢复较为显著， 证明实施例3的中药组 合物对感染病毒的小鼠体重有明显的恢复效果， 且实施例3组效果明显(P0.05)。

48、优于部分 对比例组。 0162 2.3中药组合物对H5N6病毒感染小鼠血清中特异性抗体的影响 0163 表7 H5N6病毒感染前后小鼠血清中特异性抗体的变化(n3) 说 明 书 13/17 页 15 CN 106913852 A 15 0164 0165 0166 注： 与疫苗组比较， *P0.05； 与实施例3比较， #P0.05； 0167 如表7， 在病毒感染前， 空白对照组无特异性抗体， 疫苗免疫组及各实施例组血清 中的特异性抗体水平没有明显差异。 病毒感染3天后， 各组的特异性抗体显著增加， 各个实 施例组小鼠的特异性抗体显著高于单纯的疫苗组， 以实施例3组的小鼠特异性抗体水平较 为突出， 而空白对照组的抗体始终处于较低水平。 在感染后第6、 14天， 与疫苗组相比， 各个 实施例组小鼠的特异性抗体水平显著(P0.05)高于疫苗组或各对比例组。 其中实施例3组 的小鼠特异性抗体水平最高， 且效果显著优于实施例1或实施例2(p0.0。