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1、10申请公布号CN104059927A43申请公布日20140924CN104059927A21申请号201410196203222申请日20140509C12N15/45200601C12N15/56200601C12N15/866200601C12N9/24200601C12N7/01200601C07K14/125200601A61K39/17200601A61P31/1420060171申请人中国农业科学院生物技术研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号72发明人张志芳李轶女王智权易咏竹李浩洋李田田胡小元74专利代理机构北京康思博达知识产权代理事务所普通合伙11426代理人。
2、余光军54发明名称鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品57摘要本发明公开了一种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品。本发明根据病毒流行趋势预测将鸡新城疫病毒F基因以及HN基因进行优化。本发明进一步将鸡新城疫病毒糖蛋白抗原基因、优化后的抗原基因或串联的优化抗原基因组合在家蚕生物反应器中进行表达，所表达的抗原或制备的重组病毒能为动物提供有效的免疫保护。本发明还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因呈递载体的制备方法，包括将鸡新城疫病毒抗原优化基因或串联的优化抗原基因组合克隆进哺乳动物启动子控制的杆状病毒运载载体中，重组得到含哺乳动物启动子控制的基因呈递载体；通过注射或口服等方式将其进入到动物体内后。
3、，能在动物体内高效呈递抗原基因，有效抵御新城疫病毒的攻击。51INTCL权利要求书2页说明书23页序列表18页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书23页序列表18页附图2页10申请公布号CN104059927ACN104059927A1/2页21经预测后优化的鸡新城疫病毒糖蛋白基因FO，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNO5所示。2预测后优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因HNO，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNO7所示。3含有权利要求1所述优化的鸡新城疫病毒糖蛋白基因FO的表达载体或含有权利要求2所述优化的鸡新城疫血凝素神经氨酸酶基因HNO的表达载。
4、体；优选的，所述的表达载体是杆状病毒表达载体。4一种鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或根据病毒流行趋势预测后优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或根据病毒流行趋势预测后优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载载。
5、体中，构建得到转移表达载体；2将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；3将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞，诱导表达相应的鸡新城疫病毒抗原；收获并纯化所表达的抗原。5一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到。
6、转移表达载体；或者将优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO串联在一起的序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；2将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞获得重组杆状病毒；3将重组杆状病毒感染昆虫宿主，扩增重组杆状病毒，即得。6按照权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述鸡新城疫病毒基因F的核苷酸序列为SEQIDNO1所示，优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO的核苷酸序列为SEQIDNO5所示；所述鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN的核苷酸序列为SEQIDNO3所示，所述优化后的鸡新城疫病毒血凝。
7、素神经氨酸酶基因HNO为SEQIDNO7所示；所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO串联在一起的序列为SEQIDNO9所示。7按照权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述的杆状病毒运载载体选自ACRP23LACZ、ACRP6SC、ACUWLLACZ、BACPAK6、BACTOPAC、BACMID、BLUCBACIIPETL、P2BAC、P2BLUE、P89B310、PAC360、PAC373、PACAB3、PACAB4、PACAS3、PACC129、PACC4、DZI、PACGP67、PACIEL、PACJPL、PACMLF2、PACMLF。
8、7、PACMLF8、PACMPL、PACMP2、PACRP23、权利要求书CN104059927A2/2页3PACRP25、PACRW4、PACSMAG,PACUWL、PACUW21、PACUW2A、PACUW2B、PACUW3、PACUW31、PACUW41、PACUW42、PACUW43、PACUW51、PACVC2、PACVC3、PACYML、PACJCC5、PBACL、PBAC2、PBLUEBACIII、PBLUEBACHIS、PEV55、MXIV,PIEINEO、PJVETL、PJVNHEL、PJVP10、PJVRSMAG、PMBAC、PP10、PPAKL、PPBAC、PSHONEX。
9、11、PSYNXIVVI、PSYNVIWP、PSYNXIVVI、PVL1391、PVL1392、PVL1393、PVL941、PVL945、PVL985、PVTBAC、PBM030或PUAC5；优选为PVL1393；所述的杆状病毒选自BMNPV、ACMNPV、APNPV、HANPV、HZNPV、LDMNPV、MBMNPV、OPMNPV、SLMNPV、SEMNPV或SPLTNPV；优选为BMNPV；所述的昆虫宿主包括家蚕BOMBYXMORI、野蚕BOMBYXMANDARINA、蓖麻蚕PHILOSAMIACYNTHIARICIM、樟蚕DICTYOPLOCAJAPANICA、樗蚕PHILOSAMIA。
10、CYNTHIAPRYERI、柞蚕ANTHERAEAPERNYI、日本柞蚕ANTHERAEAYAMAMAI、野天蚕ANTHERAEAPOLYPHYMUS、苜蓿尺蠖ATOGRAPHACALIFORICA、茶尺蠖ECTROPISOBLIQUA、甘兰夜蛾MAMESTRABRASSICAE、斜纹夜蛾SPODOPTERALITTORALIS、秋粘虫SPODOPTERAFRUGIPERDA、粉纹夜蛾TRICHOPLUSIANI、行军虫THAUMETOPOEAWILKINSONI、棉铃虫HELIOTHISARMIGERA、美国棉铃虫HELIOTHISZEA、烟青虫HELIOTHISASSULTA、烟草夜蛾HE。
11、LIOTHISVIRESCENS、东方粘虫PSEUDALETIASEPARATA或舞毒蛾LYMANTRIADISPAR及相应的昆虫细胞；优选为家蚕；所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染15龄的昆虫幼虫或蛹体；优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种15龄的家蚕幼虫或蛹，在感染36天后收集含各种抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆或在昆虫体内繁殖的重组病毒；最优蛹体为12天的早期嫩蛹。8按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞启动子包括但不限于CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1亚基启动子、ROUS肉瘤长末端重复序列、。
12、人LEUKOSIALIN基因启动子、鼠3磷酸甘油激酶L基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子、鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CAG启动子。9由权利要求48任何一项制备方法制备得到的重组鸡新城疫病毒抗原或鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒基因呈递载体。10权利要求9的重组鸡新城疫病毒抗原或鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒基因呈递载体在制备预防、治疗或诊断鸡新城疫疫苗或试剂中的用途。权利要求书CN104059927A1/23页4鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的制备方法及其产品技术领域0001本发明涉及一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，尤其涉及利用重组杆状病毒在昆虫体。
13、内制备鸡新城疫病毒抗原的方法以及由该制备方法得到重组抗原，本发明还涉及一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备方法及其产品，本发明进一步涉及它们在预防、治疗或诊断鸡新城疫疫苗或试剂中的用途，属于鸡新城疫病毒抗原的制备和应用领域。背景技术0002新城疫于1926年首先发现于印度尼西亚，同年发现于英国的新城，由于新城疫危害严重，国际兽疫局OIE把新城疫定为烈性传染病，给养殖业带来巨大经济损失。世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病。因此，寻找一种理想的免疫保护性抗原用于该病的快速诊断与免疫防治十分迫切。0003随着杆状病毒作为载体，在体外和体内转导动物细胞并获得目的蛋白的高效表达，杆。
14、状病毒日益显示了其作为非复制型载体在基因治疗中的应用前景，开辟了杆状病毒应用研究的新领域HIISERAAMJPHARMACOGENOMIES,315363,2003。从杆状病毒表达系统建立以来，已有1000多种外源基因在这一系统中得到了表达。1985年，MAEDA用家蚕BOMBYXMORINPV作表达载体，在家蚕体内高水平地表达出人干扰素以来，以中国和日本为代表的有蚕国家，不断发展家蚕杆状病毒表达系统，已成为比较成熟的一种蛋白表达技术吕鸿声昆虫病毒分子生物学免疫研究,1998。与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比，家蚕杆状病毒表达系统在一定方面具有许多优势，因此充分利用家蚕资源来生产外源蛋白。
15、，对生物医药产业具有重要意义。但是，至今尚无利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内成功表达鸡新城疫病毒抗原的报道。发明内容0004本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内表达鸡新城疫病毒抗原的方法。0005本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的0006本发明提供了一种鸡新城疫病毒抗原的制备方法，包括以下步骤00071将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO克隆到杆状病毒运载载体。
16、中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO串联在一起的序列克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；00082将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞以发生同源重组说明书CN104059927A2/23页5或转座，获得重组杆状病毒；00093将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞，诱导表达相应的鸡新城疫病毒抗原；收获并纯化所表达的抗原。0010本发明还提供了一种鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体的制备。
17、方法，该方法包括以下步骤00111将鸡新城疫病毒的糖蛋白基因F或优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者将鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；或者优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO串联在一起的序列与哺乳动物细胞启动子一起克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；00122将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞以发生同源重组或转座，获得。
18、重组杆状病毒，将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞扩增重组杆状病毒，即得。0013所述鸡新城疫病毒基因F的核苷酸序列为SEQIDNO1所示，其氨基酸序列为SEQIDNO2所示；优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO的核苷酸序列为SEQIDNO5所示，其氨基酸序列为SEQIDNO6所示；所述鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN的核苷酸序列为SEQIDNO3所示，其氨基酸序列为SEQIDNO4所示；所述优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO的核苷酸序列为SEQIDNO7所示，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO8所示；所述优化后的鸡新城疫病毒的糖蛋白基因FO与优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸。
19、酶基因HNO串联在一起的序列FIRESHNO为SEQIDNO9所示。0014所述的杆状病毒运载载体选自ACRP23LACZ、ACRP6SC、ACUWLLACZ、BACPAK6、BACTOPAC、BACMID、BLUCBACIIPETL、P2BAC、P2BLUE、P89B310、PAC360、PAC373、PACAB3、PACAB4、PACAS3、PACC129、PACC4、DZI、PACGP67、PACIEL、PACJPL、PACMLF2、PACMLF7、PACMLF8、PACMPL、PACMP2、PACRP23、PACRP25、PACRW4、PACSMAG,PACUWL、PACUW21、PA。
20、CUW2A、PACUW2B、PACUW3、PACUW31、PACUW41、PACUW42、PACUW43、PACUW51、PACVC2、PACVC3、PACYML、PACJCC5、PBACL、PBAC2、PBLUEBACIII、PBLUEBACHIS、PEV55、MXIV,PIEINEO、PJVETL、PJVNHEL、PJVP10、PJVRSMAG、PMBAC、PP10、PPAKL、PPBAC、PSHONEX11、PSYNXIVVI、PSYNVIWP、PSYNXIVVI、PVL1391、PVL1392、PVL1393、PVL941、PVL945、PVL985、PVTBAC、PBM030、PUA。
21、C5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，优选为PVL1393杆状病毒运载载体。0015所述的哺乳动物细胞启动子包括但不限于CAG启动子、PEC启动子、CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1亚基启动子、ROUS肉瘤长末端重复序列、人LEUKOSIALIN基因启动子、鼠3磷酸甘油激酶L基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、鸡肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子、鼠乳房瘤病毒启动子；优选为CAG启动子。0016所述的杆状病毒选自BMNPV、ACMNPV、APNPV、HANPV、HZNPV、LDMNPV、MBMNPV、OPMNPV、SLMNPV、SEMNPV或SPLTNPV；。
22、优选为家蚕杆状病毒亲本株BMNPV。说明书CN104059927A3/23页60017本发明中所构建的重组杆状病毒包括1重组家蚕核型多角体病毒RBMNPVNDVF、RBMNPVNDVFO或RBMNPVNDVFIRESHNO；2重组家蚕核型多角体病毒RBMNPVCAGNDVFO或RBMNPVCAGNDVFIRESHNO。所述的昆虫宿主选自家蚕BOMBYXMORI、野蚕BOMBYXMANDARINA、蓖麻蚕PHILOSAMIACYNTHIARICIM、樟蚕DICTYOPLOCAJAPANICA、樗蚕PHILOSAMIACYNTHIAPRYERI、柞蚕ANTHERAEAPERNYI、日本柞蚕ANTH。
23、ERAEAYAMAMAI、野天蚕ANTHERAEAPOLYPHYMUS、苜蓿尺蠖ATOGRAPHACALIFORICA、茶尺蠖ECTROPISOBLIQUA、甘兰夜蛾MAMESTRABRASSICAE、斜纹夜蛾SPODOPTERALITTORALIS、秋粘虫SPODOPTERAFRUGIPERDA、粉纹夜蛾TRICHOPLUSIANI、行军虫THAUMETOPOEAWILKINSONI、棉铃虫HELIOTHISARMIGERA、美国棉铃虫HELIOTHISZEA、烟青虫HELIOTHISASSULTA、烟草夜蛾HELIOTHISVIRESCENS、东方粘虫PSEUDALETIASEPARATA。
24、、舞毒蛾LYMANTRIADISPAR等；优选为家蚕BOMBYXMORI。0018本发明中所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染15龄的昆虫幼虫或蛹体；更优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种15龄的家蚕幼虫或蛹，在感染36天后收集含各种鸡新城疫病毒糖蛋白抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹体最优为12天的早期嫩蛹。0019鸡新城疫病毒抗原基因F、优化的基因FO、鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HN或优化后的鸡新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因HNO以及串联的FIRESHNO基因在多角体启动子、CAG启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，在家蚕中高效表达鸡。
25、新城疫病毒抗原，所表达的抗原或所构建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性，能够为包括鸡在内的动物提供良好的免疫保护，可用于制备预防鸡新城疫的疫苗或药物组合物。0020本发明所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体通过注射或口服等方式将其进入到动物体内后，能在动物体内高效呈递抗原基因，有效抵御新城疫病毒的攻击。0021ELISA检测表明，本发明中所构建的重组杆状病毒RBMNPVNDVF中NDVF基因在家蚕中表达量高，平均每头家蚕或蚕蛹中的表达量至少1MG，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。WESTERNBLOTTING结果表明，在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的。
26、上清液中可检测到59KD大小的特异性条带。动物免疫实验证明，NDVF基因实验组全部产生针对NDV的抗体，50支苗/组实验组的检测效价可达1600倍以上；而对照组没有检测到抗体；攻毒后，50支苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。0022本发明所构建的重组杆状病毒RBMNPVNDVFO中NDVFO基因在家蚕中表达量高，比NDVF基因在家蚕中表达量高出23倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。WESTERNBLOTTING结果表明，在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上清液中可检测到59KD大小的特异性条带。动物免疫实验证明，实验。
27、组全部产生针对NDV的抗体，100支苗/组实验组检测效价可达3200倍以上；而对照组没有检测到抗体；攻毒后，100支苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。0023ELISA法检测RBMNPVNDVFIRESHNO中NDVFIRESHNO抗原蛋白表达量，结果表明，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。WESTERN说明书CN104059927A4/23页7BLOTTING结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到F、HN蛋白大小约为59KD、64KD的特异性条带。动物免疫实验证明，实验组全部产生针对NDV的抗体，。
28、200支疫苗/组实验组检测效价可达3200倍以上；而对照组没有检测到抗体；攻毒后，200支疫苗/组免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。0024用本发明所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载体RBMNPVCAGNDVFO或重组杆状病毒RBMNPVCAGNDVFO注射或口服实验鸡，实验组全部产生针对NDV的抗体，抗体滴度达到1600左右，而对照组检测到的抗体滴度在20左右；攻毒后，免疫组没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。用所构建的鸡新城疫病毒抗原基因家蚕杆状病毒呈递载RBMNPVCAGNDVFIRESHNO或重组杆状病毒R。
29、BMNPVCAGNDVFIRESHNO注射或口服育成鸡，实验组全部产生针对NDV的抗体，抗体滴度达到3200左右，而对照组检测到的抗体滴度在20以下；攻毒后，免疫组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。0025本发明采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中生产鸡新城疫糖蛋白病毒抗原，其生产成本显著低于传统的制备鸡新城疫糖蛋白病毒抗原的方法。由于家蚕已经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。总之，本发明方法具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。0026本发明所涉及到的术语定义0027除非另外定义，否。
30、则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。0028术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。0029术语“启动子”意指存在于目的基因编码序列的上游的序列，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为MRNA。0030术语“转染”意指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。0031术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。0032术语“贴壁”意指当细胞悬液被接种到培养器皿后，首先要发生粘附，结合到生长基质表面，形成贴。
31、壁。0033术语“疫苗”意指将病原微生物如细菌、立克次氏体、病毒等及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。0034术语“佐剂”意指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。0035术语“抗体”意指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。0036术语“抗原”意指能够刺激机体产生特异性免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应特异性反应的物质。附图说明0037图1为NDVF基因的演化趋势。
32、的序列比对图；说明书CN104059927A5/23页80038图2为NDVHN基因的演化趋势的序列比对图；0039图3为重组NDVF蛋白的WESTERN杂交分析；M预染的蛋白质分子质量标准；1重组RBMNPVNDVFO感染的幼虫血淋巴；2阴性对照；0040图4为重组NDVF蛋白的WESTERN杂交分析；M预染的蛋白质分子质量标准；12重组RBMNPVNDVFIRESHNO感染的幼虫血淋巴；3阴性对照；0041图5为重组NDVHN蛋白的WESTERN杂交分析；M预染的蛋白质分子质量标准；1重组RBMNPVNDVFIRESHNO感染的幼虫血淋巴；2阴性对照。具体实施方式0042下面结合具体实施例。
33、来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。00431、实验材料004411菌株、病毒株与载体0045BMNPV为中国发明专利公开号CN102286534A中的BMBACMID；家蚕细胞BMN、原核表达载体PET28A为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；运载载体PVL1393、大肠杆菌TOP10，DH10B购自PROMEGA公司；PMD18T载体购自TAK。
34、ARA公司；PEASYT3载体购自北京全式金生物技术有限公司；LASOTA疫苗株购自山东绿都生物科技有限公司。004612培养基0047大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕细胞培养基为TC100培养基；DMEM培养基购自SIGMA公司和INVITROGEN公司。0048实施例1鸡新城疫病毒F基因的原始序列在家蚕生物反应器中的表达及表达产物的检测00491重组质粒PTNDVF的构建及鉴定005011引物设计与目的基因的合成0051TRIZOL法提取LASOTA疫苗株基因组RNA。设计引物，通过RTPCR方法扩增出鸡新城疫病毒F基因原始序列SEQIDNO1，所设计反转录特异引物为NDVFRT5TCAC。
35、ATTTTTGTAGTGGCTC3。F基因的原始序列的扩增引物为NDVF上游5CGGATCCATGGGCTCCAAACCTTCT3BAMHI；NDVF下游5CTCTAGATCACATTTTTGTAGTGGC3XBA1。PCR扩增结束后，取50L反应产物用10的TAE琼脂糖凝胶电泳，获得预期大小的条带。采用玻璃奶纯化回收DNA片段。005212DNA片段与克隆载体连接0053克隆载体PMD18T连接体系05LPMD18TVECTOR，25L目的片段，3LLIGATIONSOLUTIONI，16连接8H以上。005413连接产物的热转化0055取70冻存的ECOLI感受态细胞，用双手搓至大部分融化。
36、后迅速置冰上；感受态细胞完全融化后加入连接产物5L，轻轻混匀，冰浴30MIN；42热激90S，迅速置冰上说明书CN104059927A6/23页912MIN；加入1ML已温浴至37的LB培养基，37温育培养1H；5000R/MIN离心3MIN，去部分上清后留150200L涂布于含适当抗生素的LB平板上；37倒置培养过夜。005614重组质粒的鉴定0057141细胞破碎法快速鉴定0058分别挑取多个单菌落转化子接种于4ML含80G/MLAMP的LB培养基中，37振荡培养过夜；取300500L菌液于EPPENDORF管中，12000G离心10S，弃上清，加入30L缓冲液6蔗糖，01溴酚蓝，再加入2。
37、0L酚/氯仿11，充分振荡将菌体弹起；12000G离心5MIN，取上清上样电泳，观察结果。0059142重组质粒的酶切鉴定0060碱法少量快速抽提质粒DNA，用于酶切鉴定。37酶切12H，加MARKER作为参考标准，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将鉴定的阳性克隆命名为PTNDVF。143重组质粒的测序鉴定及分析0061将鉴定的阳性克隆PTNDVF的菌种进行测序分析；测定的序列结果为SEQIDNO1所示，氨基酸序列为SEQIDNO2所示。00622鸡新城疫病毒衣壳蛋白F基因原始序列在家蚕生物反应器中的表达006321重组杆状病毒转移载体PVL1393NDVF的构建0064211目的片段及载体的获。
38、得0065测序鉴定过的重组质粒PTNDVF双酶切，使其线性化。37反应2H，取5L电泳检测是否酶切完全，向反应体系中加入1/10体积的3MNAAC，2倍体积的无水乙醇，20放置30MIN；4，12000RPM离心10MIN，用预冷的70乙醇洗沉淀一次；4，12000RPM离心5MIN，真空干燥沉淀，加入35LDDH2O溶解，加入4LBUFFERE，XBAI1L，37反应3H，65灭活15MIN，保存于20备用。0066212目的片段与载体连接0067连接体系0068006916反应812H，转化大肠杆菌感受态细胞。0070213重组质粒的抽提及鉴定0071提取重组质粒，进行酶切鉴定；37酶切2。
39、H，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，加MARKER作为参考标准。将鉴定正确的阳性克隆命名为PVL1393NDVF。0072214重组质粒的测序鉴定以及分析0073将阳性克隆PVL1393NDVF的菌种重新加入含有AMP的LB培养液，220R/MIN摇培过夜后后，吸取1ML新鲜菌液至无菌的EPPENDORF管中，加入少量甘油，以封口膜封好后进行测序；测序结果证实，F基因核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其氨基酸序列如SEQ说明书CN104059927A7/23页10IDNO2所示。测序结果用DNASTAR、DNAMAN软件对序列进行分析。3重组家蚕杆状病毒RBMNPVNDVF的构建和鉴定00743。
40、1家蚕核型多角体病毒BMBACMIDDNA的繁殖及病毒DNA的制备0075按SIGMA公司产品说明配制1TC100培养基，用2MNAOH将PH调至622，过滤除菌后的培养基补加10胎牛血清，27下培养家蚕细胞BMN。用家蚕核型多角体病毒BMBACMIDDNA感染对数生长期的家蚕细胞BMN约50ML，感染复数为1，34天后收集病毒感染液，离心10000RPM10MIN，除去沉淀，上清25000RPM离心1H，除上清，用1ML病毒DNA抽提液1000ML中含TRIS121G，EDTA336G，KCL141G，PH75悬浮病毒粒子沉淀，转移至15ML离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50G/ML，50。
41、保温2小时，再加入35的SARKORSEL至终浓度为1，继续于50保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚氯仿11、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3MNACL，再加入2倍体积的无水乙醇，20放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000RPM离心10MIN，沉淀用75乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100LTEBUFFER中，4保存备用。007632重组家蚕杆状病毒RBMNPVNDVF的构建和获得0077接种大约1106家蚕细胞BMN于15CM2培养瓶中，家蚕细胞贴壁后，除去含胎牛血清FBS培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加15ML无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1G家。
42、蚕杆状病毒BMBACMIDDNA，2G重组转移质粒PVL1393NDVFDNA和5L脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60L，轻轻混匀，静置15MIN后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27培养4H后补加15ML无血清培养基和300LFBS。27恒温培养45天，收集上清液用于重组病毒RBMNPVNDVF的筛选。接种适量细胞约7080于35MM小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ML共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27感染1H后，吸去感染液，将2低融点琼脂糖凝胶于60水浴中融化，冷至40与40预热的2TC100培养基含20FBS混合均匀，每平皿加4ML胶，待凝固后用P。
43、ARALM封口，27倒置培养35天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过23轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒RBMNPVNDVF。007833重组病毒RBMNPVNDVF在家蚕细胞中的扩增0079将重组家蚕杆状病毒RBMNPVNDVF感染正常生长的BMN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒RBMNPVNDVF。008034重组病毒RBMNPVNDVF的PCR鉴定0081利用PCR方法分析外源基因的整合。0082游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150L，加入150L05MOL/L的NAOH后混匀，再加入20L8MOL/L的醋酸铵，混匀后用等体。
44、积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20L的TE溶解DNA。0083以新城疫F基因原始序列为模板设计特异性引物进行扩增，扩增片段长度为624BP，能够扩增出目的片段的说明转移载体与杆状病毒已重组成功。寡核苷酸引物为0084上游引物5ATGGGCTCCAGACCTTCTACC3；0085下游引物5TACACCAACTTGCTGTGCAAT3；0086取上述病毒基因组DNA1L进行PCR扩增，反应条件为94变性5MIN、9440SEC、5840SEC、7245SEC，30个循环，最后72延伸5MIN。说明书CN104059927A108/23页110087取15L反应产物电泳分析。结果，扩增出长。
45、度为624BP片段，证明获得了重组病毒RBMNPVNDVF。008835NDVF在家蚕蛹和蚕体中的表达0089所用的家蚕蛹为高表达品种JY1由中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的中国养蚕学上海科学技术出版社，1991的常规方法进行。饷食后48H选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约10105RBMNPVNDVF，45天后收集发病蚕蛹和取蚕血，20冻存。0090351ELISA检测表达产物0091注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测NDVF抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为。
46、阴性对照，原核表达的NDVF蛋白免疫小鼠后的血清为第一抗体，HRP标记的羊抗鼠抗体为第二抗体。任取所收蚕血中的样品，用包被液做梯度稀释，从50两倍倍比稀释到6400倍，每个梯度处做双孔检测，计算时取平均值，各取100L包被到酶标板上。0092检测结果见表1，表明NDVF基因在家蚕中表达量高，平均每头家蚕或蚕蛹中的表达量至少1MG，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。0093表1ELISA检测家蚕生物反应器表达的NDVF基因00940095352WESTERNBLOTTING检测表达产物0096WESTERNBLOTTING结果表明在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上。
47、清液中可检测到59KD大小的特异性条带。009736动物免疫实验0098按国家标准中华人民共和国兽药典将收集的纯化抗原NDV病毒F抗原经肌肉注射试验组分为50支苗/组3MLNDV蛋白抗原母液与等体积油佐剂混合试制疫苗；150支疫苗/组1MLNDV蛋白抗原母液2MLPBS3ML油佐剂混合试制疫苗；每组均为12羽，05ML/只在鸡上进行动物试验，另设12羽鸡只注射佐剂和喂食抗原的为对照组。在免疫后14天后取血，进行ELISA抗体效价检测。0099实验结果表明，实验组全部产生针对NDV的抗体，实验组的50支苗/组检测效价可达1600倍以上；而对照组没有检测到抗体；在免疫后2128D进行攻毒实验，免疫。
48、组50支苗/组的没有鸡死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的鸡新城疫症状。0100实施例2鸡新城疫经密码子优化后FO基因的序列在家蚕生物反应器中的表达及表达产物的检测01011优化后序列FO的获得0102收集近年来的NDVF基因的序列，尤其是比较现行疫苗株与流行株的差异，预测其演化趋势，调整其原始序列图1。首先根据氨基酸序列的变化趋势，选择其保守位点，通说明书CN104059927A119/23页12过收集不同地区新城疫F基因序列进行同源性比较分析，结果表明，虽然氨基酸序列保守性较高，但是不同位点氨基酸还存在可预测的变化趋势，通常是疫苗株的广泛使用导致现在的流行株的氨基酸位点发生点突变。
49、，长此以往将导致疫苗株的免疫效果下降，甚至丧失保护效果。如在19、20、27、28位氨基酸的变化，强毒株氨基酸位点有V突变成I、A突变成M、V突变成I、P突变成L的趋势，根据此原则进行相应的氨基酸序列的调整。0103同时根据家蚕密码子的偏嗜性、序列的GC含量、限制性内切酶位点等对实施例1获得的鸡新城疫F基因原始序列进行调整和优化，得到适宜在家蚕中表达的基因序列NDVFOSEQIDNO5，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO6所示。原始序列中含有串联的稀有密码子，这减少了翻译序列或者甚至解除翻译装置；优化后序列CAI值由072提高为079，调整了GC含量及不宜峰以延长MRNA的半衰期。0104直接将人工合成优化后的序列NDVFO并克隆到载体PUC57上获得重组质粒PUC57FO；F序列5端加入PSTI，ECORI，BAMHI位点和KOZAK序列；3端加入XBAI，PSTI位点。01052重组杆状病毒转移载体PVL1393NDVFO的构建0106测序鉴定过的重组质粒PUC57FO用BAMHI/XBAI双酶切，使其线性化；真核表达载体质粒PVL1393作同样酶切处理。将酶切回收的NDVFO与PV。