具有不同电荷载气微泡与微球的分步法与一步法修饰与制备.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510461581.3 (22)申请日 2015.07.31 A61K 49/00(2006.01) A61K 47/32(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 9/50(2006.01) (71)申请人 温州生物材料与工程研究所 地址 325000 浙江省温州市高新区文昌路 156 号科技城企业发展总部大楼 (72)发明人 刘哲 石长灿 李宜鸿 宋远会 徐齐恩 (54) 发明名称 具有不同电荷载气微泡与微球的分步法与一 步法修饰与制备 (57) 摘要 本发明公开了利用分步法和一步法修饰聚 - 氰基丙烯。

2、酸乙酯载气微泡， 使其表面具备正 电荷的方法， 公开了利用一步法或分步法制备带 有不同电荷且表面负载亚甲基蓝微球的方法， 制 备工艺简便， 通过本制备方法制得的带正电荷载 气微泡粒径均匀， 表面电荷为正电荷 11-50mV， 具 有基因负载功能， 载气微泡的表面带有电荷且负 载亚甲基蓝微球， 粒径分较小， 表面带有正电荷或 负电荷， 适于作微纳米造影剂， 同时还适于作为药 物或基因载体用于靶向药物与基因传递。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 106620720 A 2017.05.10 CN 106。

3、620720 A 1/1 页 2 1.具有不同电荷载气微泡， 其特征在于， 由聚 - 氰基丙烯酸乙酯、 壳聚糖、 聚乙二醇、 聚乙二醇辛基苯基醚、 亚甲基蓝、 葡聚糖 -70 构成。 2.用于制备权利要求 1 所述的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 其特征在于， 用下 述分步法制成 ： 步骤一、 量取 100200mL 超纯水， 加入 0.5g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.250.5mL， 溶液 pH 调至 23， 加入 1.02.0mL- 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 11.5h， 得到载气微泡悬浮 液 ； 所述聚乙二醇水溶液是由数均分子量为 20005000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成 ；。

4、 步骤二、 离心步骤一所得的悬浮液， 得到电荷为 -50-30mV、 粒径为 1.82.8um 带负 荷载气微泡 ； 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至35mL， 加入0.5g/mL的壳聚糖溶液35mL， 充分 混匀 12h， 超纯水洗涤 34 次， 并离心得到电荷为 3050mV、 粒径为 2.23.2um 带正电 荷载气微泡。 3.用于制备权利要求 1 所述的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 其特征在于， 用下 述一步法制成 ： 量取 100-200mL 超纯水， 加入 0.5g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.250.5mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 35mL， 溶液 pH 调。

5、至 23， 加入 1.02.0mL- 氰基丙烯酸 乙酯， 高速搅拌 11.5h， 得到载气微泡悬浮液， 超纯水洗涤 34 次， 并离心得到电荷为 1130mV， 粒径为 1.62.6um 带正电荷载气微泡 ； 所述聚乙二醇水溶液是由数均分子量为 20005000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成， 所得的载气微泡带有正电荷。 4.用于制备权利要求 1 所述的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 其特征在于， 用下 述一步法制成 ： 取 100mL0.5% 葡聚糖 -70 溶液， 调节 pH 至 23， 加入 0.02mmol 亚甲基蓝， 加入1mL浓度为0.1g/mL聚乙二醇， 加入1mL-氰基丙烯酸。

6、乙酯， 搅拌417h， 洗涤所得悬 浊液 23 次并离心， 得到电荷为 -70-50mV， 粒径为 500800nm 的微球， 微球带有负电荷 且表面负载亚甲基蓝， 所述亚甲基蓝的分子量为 7000， 所述聚乙二醇分子量为 2000。 5.用于制备权利要求 1 所述的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 其特征在于， 用下 述分步法制成 ： 步骤一、 量取0.5%的葡聚糖-70溶液100mL， 调节pH至23， 加入0.02mmol亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 45h， 得到粒径为 440-480nm， 电位为 -37-45mV ； 步骤二、 加入1mL0.20.8g/mL的。

7、壳聚糖溶液， 继续搅拌417h， 洗涤所得悬浊液23 次并离心， 得到电荷为 2030mV， 粒径为 400600nm 的微球， 微球带有正电荷且负载亚甲 基蓝， 所述亚甲基蓝的分子量为 7000， 所述聚壳聚糖为低粘度壳聚糖。 权 利 要 求 书 CN 106620720 A 2 1/7 页 3 具有不同电荷载气微泡与微球的分步法与一步法修饰与制 备 技术领域 0001 本发明涉及一种具有不同电荷的载气微泡及其载气微泡的多种制备方法， 具体涉 及表面带有正电荷载气微泡分步法及一步法表面修饰方法， 以及一步法制备表面负载荧光 物质且带正电荷或负电荷微球的制备方法。 背景技术 0002 微泡造影。

8、剂主要是由外壳和包裹在内部的气核组成， 微泡的外壳可以由蛋白质、 脂类、 多聚糖类或高分子类聚合物构成。 医用微泡造影剂广泛用于心肌声学造影、 急性局灶 性炎症、 血栓、 肿瘤的诊断。通过增强组织的背向散射信号和血液的多普勒信号， 超声微泡 能够实现无创显影。 载气微泡造影剂还能携带基因或药物达到靶向组织， 定点释放药物， 有 益于疾病的治疗。此外， 通过表面负载自发荧光物质， 构建而成的荧光载药微球， 作为药物 载体和荧光示踪载体， 在医疗领域得到了广泛的应用。 0003 目前造影剂的应用较为广泛， 其粒径大小、 表面所带电荷是限制其应用范围的一 个关键因素。 毛细血管的直径为69um， 若。

9、造影剂的直径较大， 则无法进入毛细血管进行显 影。此外， 超声微泡的表面所带正负电荷及电荷量， 也决定了造影剂的应用范围。近年来， 不同功能的载药或载基因纳米粒及微球医疗方面得到广泛的研究。 功能纳米粒的粒径一般 小于 100nm， 功能微球的粒径大小一般为几百纳米。因其粒径较小， 能被细胞吞噬进入靶细 胞， 并实现药物缓释、 基因传递或靶向治疗的目的。 0004 载气微泡或功能微球的制备材料多种多样， 例如， 根据不同的治疗目的， 人们利用 聚乳酸乙醇酸、 聚己内酯、 聚乙烯亚胺、 聚赖氨酸等多种材料生物材料， 制备不同功能的纳 米粒、 微球或微泡。- 氰基丙烯酸酯类组织胶具有较好的生物相容。

10、性， 广泛用于在临床手 术粘合剂。壳聚糖是自然界中存在的唯一碱性多糖。由于具有良好的生物相容性、 可降解 性以及独特的物理化学性质， 壳聚糖在药物负载、 基因传递载体、 抗菌材料等生物医学领域 都有广泛的应用。 0005 本发明采用 - 氰基丙烯酸乙酯作为基材， 制备了载气微泡和微球。采用分步法 和一步法两种方法， 利用壳聚糖对载气微泡进行了表面修饰， 使其表面带有正电荷， 从而 是其具有基因负载功能。采用一步法， 制备了表面带有不同电荷， 且表面负载亚甲基蓝的 - 氰基丙烯酸乙酯微球， 此微球不仅具有微纳米成像的潜力， 而且还可以用于基因和药物 的靶向传送。 发明内容 0006 本发明的第一。

11、个目的是提供一种具有不同点荷的载气微泡。 0007 本发明的第二个目的是提供一种分步法修饰载气微泡且使其带有正电荷的方法。 0008 本发明的第三个目的是提供一种一步法制备表面带有正电荷载气微泡的方法。 0009 本发明的第四个目的是提供一种一步法制备带负电荷且表面负载亚甲基蓝微球 说 明 书 CN 106620720 A 3 2/7 页 4 的方法。 0010 本发明的第五个目的是提供一种分步法制备带正电荷且表面负载亚甲基蓝微球 的方法。为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为 ： 具有不同电荷载气微泡， 由聚 - 氰基丙烯酸乙酯、 壳聚糖、 聚乙二醇、 聚乙二醇辛基 苯基醚、 或 3。

12、,7- 双 （二甲氨基） 吩噻嗪 -5- 翁氯化物、 葡聚糖 -70 构成。 0011 第一种制备方法 ： 用于制备权利要求 1 的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 用 下述分步法制成 ： 步骤一、 量取 100200mL 超纯水， 加入 0.5g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.250.5mL， 溶液 pH 调至 23， 加入 1.02.0mL- 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 11.5h， 得到载气微泡悬浮 液 ； 聚乙二醇水溶液是由数均分子量为 20005000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成 ； 步骤二、 离心步骤一所得的悬浮液， 得到电荷为 -50-30mV、 粒径为 1.82.8um 带负 。

13、荷载气微泡 ； 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至35mL， 加入0.5g/mL的壳聚糖溶液35mL， 充分 混匀 12h， 超纯水洗涤 34 次， 并离心得到电荷为 3050mV、 粒径为 2.23.2um 带正电 荷载气微泡。 0012 第二种制备方法 ： 用于制备权利要求 1 的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 用 下述一步法制成 ： 量取 100-200mL 超纯水， 加入 0.5g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.250.5mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 35mL， 溶液 pH 调至 23， 加入 1.02.0mL- 氰基丙烯 酸乙酯， 高速搅拌 11.5h， 得到载气微泡。

14、悬浮液， 超纯水洗涤 34 次， 并离心得到电荷 为 1130mV， 粒径为 1.62.6um 带正电荷载气微泡 ； 聚乙二醇水溶液是由数均分子量为 20005000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成， 所得的载气微泡带有正电荷。 0013 第三种制备方法 ： 用于制备权利要求 1 的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 用 下述一步法制成 ： 取100mL0.5%葡聚糖-70溶液， 调节pH至23， 加入0.02mmol亚甲基蓝， 加入1mL浓度为0.1g/mL聚乙二醇， 加入1mL-氰基丙烯酸乙酯， 搅拌417h， 洗涤所得悬 浊液 23 次并离心， 得到电荷为 -70-50mV， 粒径为 500。

15、800nm 的微球， 微球带有负电荷 且表面负载亚甲基蓝， 亚甲基蓝的分子量为 7000， 聚乙二醇分子量为 2000。 0014 第四种制备方法 ： 用于制备权利要求 1 的具有不同电荷载气微泡的制备方法， 用 下述分步法制成 ： 步骤一、 量取0.5%的葡聚糖-70溶液100mL， 调节pH至23， 加入0.02mmol亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 45h， 得到粒径为 440-480nm， 电位为 -37-45mV ； 步骤二、 加入1mL0.20.8g/mL的壳聚糖溶液， 继续搅拌417h， 洗涤所得悬浊液23 次并离心， 得到电荷为 2030mV， 粒径为 40。

16、0600nm 的微球， 微球带有正电荷且负载亚甲 基蓝， 亚甲基蓝的分子量为 7000， 聚壳聚糖为低粘度壳聚糖。 0015 本发明与现有技术相比具有以下有益效果 ： 本发明提供了一种具有不同电荷载气 微泡与微球的分步法与一步法修饰与制备方法， 与现有方法相比， 本发明提供的方法具有 工艺简便、 所带电荷可控、 粒径均匀、 结构稳定以及便于保存的特点， 具有实现产业化生产 的潜力。 附图说明 说 明 书 CN 106620720 A 4 3/7 页 5 0016 下面结合附图对本发明做进一步详细的说明。 0017 图 1 为带负电荷微泡的 zeta 电位。 0018 图 2 为载气微泡的光学显。

17、微结构。 0019 图 3 为表面带正电荷的载气微泡的粒径分布。 0020 图 4 为具有负电荷且表面负载亚甲基蓝的微球 zeta 电位。 0021 图 5 为具有负电荷且表面负载亚甲基蓝的微球粒径分布。 0022 图 6 为具有正电荷且负载亚甲基蓝的微球 zeta 电位。 0023 图 7 为具有正电荷且负载亚甲基蓝的微球粒径分布。 0024 图 8 为不同浓度载气微泡对基因 PET28A 的吸附功能。 具体实施方式 0025 下面结合图 1-8 和具体实施例对本发明作进一步的说明， 本发明的实施例是为了 使本领域的技术人员能够更好地理解本发明， 但并不对本发明进行任何限制。 0026 实施。

18、例 1 一种具正电荷载气微泡， 是用下述分步法制成 ： 步骤一、 量取 100mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.25mL， 溶液 pH 调至 2。 加入 1.0 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1 h， 得到载气微泡悬浮液 ； 所述聚乙二醇水溶 液， 是由数均分子量为 2000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。 0027 步骤二、 离心步骤一所得悬浮液， 得到电荷为 -50mV、 粒径为 2.8 um 带负荷载气微 泡 （图 1） 。 0028 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至 35 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 3mL， 充分混匀 1 h。超。

19、纯水洗涤 3 次， 并离心得到电荷为 30 mV、 粒径为 3.2 um 带正电荷载气微 泡。 0029 一种具正电荷载气微泡， 是用下述一步法制成 ： 量取 100mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.25mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖 溶液 3mL， 溶液 pH 调至 2。加入 1.0mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1h， 得到载气微泡悬 浮液 ； 超纯水洗涤 3 次， 并离心得到电荷为 11mV、 粒径为 1.6 um 带正电荷载气微泡。所述 聚乙二醇水溶液， 是由数均分子量为 2000 的聚乙二醇， 溶于超纯水配置而成。 0030 一种具负电荷且表。

20、面负载亚甲基蓝微球， 是用下述一步法制成 ： 取 100mL 0.5% 葡聚糖 -70 溶液， 调节 pH 至 2。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 滴加 1mL 浓 度为 0.1g/mL 聚乙二醇， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 4h。继续搅拌 4h， 洗涤所得悬 浊液 2 次并离心， 得到电荷为 -70 mV、 粒径为 500 nm 表面带有负电荷的微球。所述亚甲基 蓝的分子量为 7000， 所述聚乙二醇分子量为 2000。 0031 一种具正电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述分步法制成 ： 量取 0.5% 的葡聚糖 -70 溶液 100 mL， 调节 pH 至 2。加入。

21、 0.02 mmol 亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 4h。得到粒径为 440 nm、 电位为 -37 mV。 0032 之后， 加入 1mL 0.2g/mL 的壳聚糖溶液， 继续搅拌 4h。洗涤所得悬浊液 2 次并离 心， 得到电荷为 20mV， 粒径为 400nm 带正电荷微球。所述亚甲基蓝的分子量为 7000， 所述聚 壳聚糖为低粘度壳聚糖。 说 明 书 CN 106620720 A 5 4/7 页 6 0033 实施例 2 一种具正电荷载气微泡， 是用下述分步法制成 ： 步骤一、 量取 200 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.5mL， 。

22、溶液 pH 调至 3。 加入 2.0 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1.5 h， 得到载气微泡悬浮液 ； 所述聚乙二醇水 溶液是由数均分子量为 5000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。 0034 步骤二、 离心步骤一所得悬浮液， 得到电荷为 -30mV（图 1） ， 粒径为 1.8um 带负荷 载气微泡 （图 2） 。 0035 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至 35 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 5mL， 充分混匀 2 h。超纯水洗涤 4 次， 并离心得到电荷为 50 mV、 粒径为 2.2um 带正电荷载气微 泡 （图 3） 。 0036 一种具正电荷载气微泡， 。

23、是用下述一步法制成 ： 量取 200 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.5mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖 溶液 5mL， 溶液 pH 调至 3。加入 2.0 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1.5 h， 得到载气微 泡悬浮液 ； 超纯水洗涤 4 次， 并离心得到电荷为 30 mV、 粒径为 2.6 um 带正电荷载气微泡。 所述聚乙二醇水溶液是由数均分子量为 5000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。 0037 一种具负电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述一步法制成 ： 取 100mL 0.5% 葡聚糖 -70 溶液， 调节 pH 至 3。加入 0.0。

24、2 mmol 亚甲基蓝， 滴加 1mL 浓 度为 0.1g/mL 聚乙二醇， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 5h ； 继续搅拌 17 h。洗涤所得 悬浊液 3 次并离心， 得到电荷为 -50 mV（图 4） ， 粒径为 800 nm（图 5） 表面带有负电荷的微 球。所述亚甲基蓝的分子量为 7000。所述聚乙二醇分子量为 2000。 0038 一种具正电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述分步法制成 ： 量取 0.5% 的葡聚糖 -70 溶液 100 mL， 调节 pH 至 3。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 5h。得到粒径为 480 n。

25、m， 电位为 -45 mV。 0039 之后， 加入1mL 0.8g/mL的壳聚糖溶液， 继续搅拌17 h。 洗涤所得悬浊液3次并离 心， 得到电荷为 30 mV（图 6） ， 粒径为 600 nm（图 7） 带正电荷微球。所述亚甲基蓝的分子 量为 7000， 所述聚壳聚糖为低粘度壳聚糖。 0040 实施例 3 一种具正电荷载气微泡， 是用下述分步法制成 ： 步骤一、 量取 150 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.4mL， 溶液 pH 调至 2。 加入 1.5mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1.2 h， 得到载气微泡悬浮液 ； 所述聚乙二醇水 溶液是由数均分。

26、子量为 4000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。 0041 步骤二、 离心步骤一所得悬浮液， 得到电荷为 -40mV， 粒径为 2.2um 带负荷载气微 泡。 0042 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至 35 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 4 mL， 充分混匀 1.5 h。超纯水洗涤 3 次， 并离心得到电荷为 40 mV， 粒径为 2.8um 带正电荷载气 微泡。该载气微泡具有基因负载功能， 如图 8 所示， 为不同浓度载气微泡对基因 PET28A 的 吸附功能。 0043 一种具正电荷载气微泡， 是用下述一步法制成 ： 量取 150 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL。

27、 的聚乙二醇水溶液 0.4 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚 说 明 书 CN 106620720 A 6 5/7 页 7 糖溶液 4 mL， 溶液 pH 调至 3。加入 1.5 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1.2 h， 得到载气 微泡悬浮液 ； 超纯水洗涤 4 次， 并离心得到电荷为 25 mV、 粒径为 2.0um 带正电荷载气微泡。 所述聚乙二醇水溶液， 是由数均分子量为 4000 的聚乙二醇， 溶于超纯水配置而成。 0044 一种具负电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述一步法制成 ： 取 100mL 0.5% 葡聚糖 -70 溶液， 调节 pH 至 3。加入 0.02 。

28、mmol 亚甲基蓝， 滴加 1mL 浓 度为 0.1g/mL 聚乙二醇， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 4.5h ； 继续搅拌 13 h。洗涤所 得悬浊液 2 次并离心， 得到电荷为 -60 mV、 粒径为 600 nm 表面带有负电荷的微球。所述亚 甲基蓝的分子量为 7000。所述聚乙二醇分子量为 2000。 0045 一种具正电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述分步法制成 ： 量取 0.5% 的葡聚糖 -70 溶液 100 mL， 调节 pH 至 3。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 5h。得到粒径为 400 nm、 电位为 -40 。

29、mV。 0046 之后， 加入1mL 0.4g/mL的壳聚糖溶液， 继续搅拌12 h。 洗涤所得悬浊液3次并离 心， 得到电荷为 25 mV、 粒径为 500 nm 带正电荷微球。所述亚甲基蓝的分子量为 7000， 所述 聚壳聚糖为低粘度壳聚糖。 0047 实施例 4 一种具正电荷载气微泡， 是用下述分步法制成 ： 步骤一、 量取 150 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.5mL， 溶液 pH 调至 3。 加入 1.5 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1 h， 得到载气微泡悬浮液 ； 所述聚乙二醇水溶 液是由数均分子量为 4600 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。

30、。 0048 步骤二、 离心步骤一所得悬浮液， 得到电荷为 -35 mV， 粒径为 2.5um 带负荷载气微 泡。 0049 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至 35 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 3.5mL， 充分混匀 2 h。超纯水洗涤 4 次， 并离心得到电荷为 45 mV、 粒径为 2.8um 带正电荷 载气微泡。 0050 一种具正电荷载气微泡， 是用下述一步法制成 ： 量取 150 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.4 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚 糖溶液 3.5mL， 溶液 pH 调至 2。加入 1.5 mL - 氰基丙烯酸乙酯。

31、， 高速搅拌 1h， 得到载气 微泡悬浮液 ； 超纯水洗涤 4 次， 并离心得到电荷为 25 mV， 粒径为 2.4um 带正电荷载气微泡。 所述聚乙二醇水溶液是由数均分子量为 4600 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。 0051 一种具负电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述一步法制成 ： 取 100mL 0.5% 葡聚糖 -70 溶液， 调节 pH 至 3。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 滴加 1mL 浓 度为 0.1g/mL 聚乙二醇， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 4h ； 继续搅拌 17 h。洗涤所得 悬浊液 3 次并离心， 得到电荷为 -60 mV、 粒径为 650 。

32、nm 表面带有负电荷的微球。所述亚甲 基蓝的分子量为 7000。所述聚乙二醇分子量为 2000。 0052 一种具正电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述分步法制成 ： 量取 0.5% 的葡聚糖 -70 溶液 100 mL， 调节 pH 至 3。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 5h。得到粒径为 450 nm、 电位为 -39 mV。 0053 之后， 加入1mL 0.6g/mL的壳聚糖溶液， 继续搅拌15 h。 洗涤所得悬浊液3次并离 心， 得到电荷为 28 mV、 粒径为 550 nm 带正电荷微球。所述亚甲基蓝的分子量为 7000， 所述 说 。

33、明 书 CN 106620720 A 7 6/7 页 8 聚壳聚糖为低粘度壳聚糖。 0054 实施例 5 一种具正电荷载气微泡， 是用下述分步法制成 ： 步骤一、 量取 200 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.5mL， 溶液 pH 调至 2。 加入 1.0 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1.5 h， 得到载气微泡悬浮液 ； 所述聚乙二醇水 溶液是由数均分子量为 2000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。 0055 步骤二、 离心步骤一所得悬浮液， 得到电荷为 -40mV， 粒径为 2.0um 带负荷载气微 泡。 0056 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至。

34、 35 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 4 mL， 充分混匀 1.5 h。超纯水洗涤 4 次， 并离心得到电荷为 45 mV、 粒径为 3.0um 带正电荷载气 微泡。 0057 一种具正电荷载气微泡， 是用下述一步法制成 ： 量取 200 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.5mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖 溶液 4 mL， 溶液 pH 调至 3。加入 2.0 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1.2 h， 得到载气 微泡悬浮液 ； 超纯水洗涤 3 次， 并离心得到电荷为 20 mV、 粒径为 1.8um 带正电荷载气微泡。 所述聚乙二醇水溶。

35、液是由数均分子量为 2000 的聚乙二醇溶于超纯水配置而成。 0058 一种具负电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述一步法制成 ： 取 100mL 0.5% 葡聚糖 -70 溶液， 调节 pH 至 2。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 滴加 1mL 浓 度为 0.1g/mL 聚乙二醇， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 5h ； 继续搅拌 11 h。洗涤所得 悬浊液 2 次并离心， 得到电荷为 -60 mV、 粒径为 550 nm 表面带有负电荷的微球。所述亚甲 基蓝的分子量为 7000。所述聚乙二醇分子量为 2000。 0059 一种具正电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述分步。

36、法制成 ： 量取 0.5% 的葡聚糖 -70 溶液 100 mL， 调节 pH 至 3。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 5h。得到粒径为 460 nm、 电位为 -42 mV。 0060 之后， 加入1mL 0.8g/mL的壳聚糖溶液， 继续搅拌15 h。 洗涤所得悬浊液3次并离 心， 得到电荷为 30 mV、 粒径为 480 nm 带正电荷微球。所述亚甲基蓝的分子量为 7000， 所述 聚壳聚糖为低粘度壳聚糖。 0061 实施例 6 一种具正电荷载气微泡， 是用下述分步法制成 ： 步骤一、 量取 120 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的。

37、聚乙二醇水溶液 0.3 mL， 溶液 pH 调至 2。加入 1.2 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1h， 得到载气微泡悬浮液 ； 所述聚乙二醇水 溶液， 是由数均分子量为 5000 的聚乙二醇， 溶于超纯水配置而成。 0062 步骤二、 离心步骤一所得悬浮液， 得到电荷为 -40mV， 粒径为 2.6um 带负荷载气微 泡。 0063 步骤三、 将步骤二所得微泡溶液稀释至 35 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚糖溶液 4mL， 充分混匀1h。 超纯水洗涤3次， 并离心得到电荷为35 m、 粒径为3.0 um带正电荷载气微泡。 0064 一种具正电荷载气微泡， 是用下述一步法制成 ：。

38、 量取 120 mL 超纯水， 加入 0.5 g/mL 的聚乙二醇水溶液 0.4 mL， 加入 0.5g/mL 的壳聚 糖溶液 4 mL， 溶液 pH 调至 3。加入 1.2 mL - 氰基丙烯酸乙酯， 高速搅拌 1 h， 得到载气 说 明 书 CN 106620720 A 8 7/7 页 9 微泡悬浮液 ； 超纯水洗涤 3 次， 并离心得到电荷为 30 mV， 粒径为 2.4um 带正电荷载气微泡。 所述聚乙二醇水溶液， 是由数均分子量为 5000 的聚乙二醇， 溶于超纯水配置而成。 0065 一种具负电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述一步法制成 ： 取 100mL 0.5% 葡聚糖 -。

39、70 溶液， 调节 pH 至 2。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 滴加 1mL 浓 度为 0.1g/mL 聚乙二醇， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 4 h ； 继续搅拌 16h。洗涤所得 悬浊液 2 次并离心， 得到电荷为 -65 mV、 粒径为 560 nm 表面带有负电荷的微球。所述亚甲 基蓝的分子量为 7000。所述聚乙二醇分子量为 2000 ； 一种具正电荷且表面负载亚甲基蓝微球， 是用下述分步法制成 ： 量取 0.5% 的葡聚糖 -70 溶液 100 mL， 调节 pH 至 3。加入 0.02 mmol 亚甲基蓝， 加入 1mL- 氰基丙烯酸乙酯， 搅拌 5h。得到粒。

40、径为 470 nm、 电位为 -42 mV。 0066 之后， 加入1mL 0.8g/mL的壳聚糖溶液， 继续搅拌17 h。 洗涤所得悬浊液2次并离 心， 得到电荷为 25mV、 粒径为 450 nm 带正电荷微球。所述亚甲基蓝的分子量为 7000， 所述 聚壳聚糖为低粘度壳聚糖。 0067 本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此， 无 论从那一点来看， 本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明， 权利要求书指出了本发明的范围， 而上述的说明并未指出本发明的范围， 因此， 在与本发明 的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化， 都应认为是包括在权利要求书的范围内。 说 明 书 CN 106620720 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 106620720 A 10 2/4 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 106620720 A 11 3/4 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 106620720 A 12 4/4 页 13 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 106620720 A 13 。