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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410572739.X (22)申请日 2014.10.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104434791 A (43)申请公布日 2015.03.25 (73)专利权人 宁夏医科大学 地址 750004 宁夏回族自治区银川市兴庆 区胜利街11601号 (72)发明人 王文苹 贺少龙 洪彤彤 刘艳华 隋宏 (74)专利代理机构 宁夏专利服务中心 64100 代理人 张尚星 (51)Int.Cl. A61K 9/10(2006.01) A61K 47/3。
2、6(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (56)对比文件 CN 101195839 A,2008.06.11,权利要求1- 4. CN 102453106 A,2012.05.16,权利要求1- 2. 孔俊豪等.白芨多糖的酶法精制工艺条件研 究. 食品科学 .2009,第30卷(第14期),第52-56 页. 审查员 李友 (54)发明名称 一种改性白芨多糖衍生物纳米载体的制备 及应用技术 (57)摘要 本发明涉及疏水改性低分子量白芨多糖衍 生物的制法及其作为纳米药物载体在生物医药 领域的应用。 白芨粗多糖经纯化、 酶解、 精制得到 低分子量白芨多糖， 再经催化剂辅助反应接。
3、枝疏 水基团， 反应液经透析、 冷冻干燥后制得疏水改 性低分子量白芨多糖衍生物。 所得产物在水溶液 中可自组装形成外壳亲水、 内核疏水的球形纳米 级胶束， 通过调节白芨多糖分子量、 疏水基团种 类及取代度等因素可控制胶束粒径在60800nm 范围内。 该纳米胶束可作为疏水性药物的靶向递 送载体， 具有良好的肝靶向性能。 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 CN 104434791 B 2018.04.06 CN 104434791 B 1.一种具有肝脏靶向作用的疏水改性低分子量白芨多糖的纳米胶束制备方法， 其特征 在于， 将改性白芨多糖于蒸馏水中， 经磁力搅拌、 冰浴超声、 滤膜滤过， 收集。
4、续滤液得圆球形 胶束， 平均粒径范围为60800nm； 所述疏水改性低分子量白芨多糖制备方法具体包括如下步骤： a.称取酶解后的低分子 量白芨多糖0.040.25g分散在2050mL溶剂中溶解， 备用； b.称取一定量疏水材料、 催化 剂A、 催化剂B0.22:1:13， mmol/mmol分散在46mL与步骤a相同的溶剂中， 冰浴活化1.5 3h， 将活化后的反应液逐滴加入到步骤a制得的低分子量白芨多糖溶液中， 持续搅拌， 先 高温反应24h， 再室温反应2436h； c.将步骤b的反应液置于透析袋截留分子量为3000 8000D中并在蒸馏水中透析， 每8h换一次水， 透析23天， 将透析液。
5、过滤， 取续滤液冷冻干 燥， 收集产物即得疏水改性低分子量白芨多糖； 所述低分子量白芨多糖是白芨粗多糖经纯化、 降解、 精制后制得， 其黏均分子量为 1000D8000D； 所述疏水改性低分子量白芨多糖制备中， 步骤b中所述疏水材料中疏水基团选自脱氧 胆酸、 胆酸、 胆烷酸、 C12C19脂肪酸中的任意一种， 所述疏水基团的取代度为560。 2.根据权利要求1所述具有肝脏靶向作用的疏水改性低分子量白芨多糖的纳米胶束制 备方法， 其特征在于： 精密称取疏水改性白芨多糖于蒸馏水中， 经磁力搅拌、 冰浴超声、 滤膜 滤过， 收集续滤液， 滤液自组装成纳米胶束。 3.根据权利要求2所述具有肝脏靶向作用。
6、的疏水改性低分子量白芨多糖的纳米胶束的 制备方法， 其特征在于： 精密称取20.0025.00mg所述疏水改性白芨多糖于512mL蒸馏水 中， 磁力搅拌34h， 冰浴超声510min， 分别经0.45 m、 0.22 m的滤膜滤过， 收集续滤液， 滤 液自组装成纳米胶束， 胶束成圆球形， 其平均粒径范围为60800nm。 4.根据权利要求1或2或3任意一项所述具有肝脏靶向作用的疏水改性低分子量白芨多 糖的纳米胶束制备方法， 其特征在于， 所述疏水改性低分子量白芨多糖以降解后的低分子 量白芨多糖为原料， 经透析、 冷冻干燥即得。 5.根据权利要求1所述具有肝脏靶向作用的疏水改性低分子量白芨多糖的。
7、纳米胶束制 备方法， 其特征在于： 所述疏水改性低分子量白芨多糖制备中， 步骤a所述酶解后的低分子 量白芨多糖是白芨多糖通过酶法降解所得， 其中酶采用纤维素酶、 果胶酶、 -葡聚糖酶、 - 葡萄糖苷酶中的能够作用于 -1,4糖苷键的一种或以上多种酶的组合物。 6.根据权利要求1所述具有肝脏靶向作用的疏水改性低分子量白芨多糖的纳米胶束制 备方法， 其特征在于： 所述疏水改性低分子量白芨多糖制备中， 步骤a中的溶剂选自二甲基 亚砜、 N,N-二甲基甲酰胺、 甲酰胺、 乙醇与水的混合溶剂、 水与N， N-二甲基甲酰胺的混合溶 剂中的一种或多种。 7.根据权利要求1所述具有肝脏靶向作用的疏水改性低分子。
8、量白芨多糖的纳米胶束制 备方法， 其特征在于： 所述疏水改性低分子量白芨多糖制备中， 步骤b中催化剂A选自N,N-二 环已基碳二亚胺、 1-乙基- （3-二甲基氨基丙基） 碳酰二亚胺中的任意一种； 催化剂B选自4- 二甲氨基吡啶、 N-羟基丁二酰亚胺中的任意一种。 8.一种根据权利要求1所述的具有肝脏靶向作用的疏水改性低分子量白芨多糖纳米胶 束作为药物载体的应用。 9.根据权利要求1所述的疏水改性低分子量白芨多糖纳米胶束作为药物载体的应用， 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 104434791 B 2 其特征在于， 具体是在包载难溶性药物并将药物靶向运送至肝脏中的应用。 权 利 要 求。
9、 书 2/2 页 3 CN 104434791 B 3 一种改性白芨多糖衍生物纳米载体的制备及应用技术 技术领域 0001 本发明属于功能性医药材料与纳米技术领域， 具体涉及一种疏水改性低分子量白 芨多糖衍生物及其纳米载体的制备方法。 技术背景 0002 白芨多糖提取自传统中药白芨， 是其收敛止血、 消肿生肌的主要活性成分。 研究表 明， 白芨多糖具有止血、 促进创伤愈合、 抑菌、 消炎、 抗肿瘤、 抗氧化、 抗溃疡、 促进骨髓造血 等生物活性， 临床应用广泛。 此外， 还可以用作食品、 化妆品的功能添加剂。 进年来国内外学 者致力于把白芨多糖开发成为功能型医药材料， 将白芨多糖单独或与其他材。
10、料协同应用的 报道居多， 如作为末梢血管栓塞剂介入治疗恶性肿瘤， 作为增稠剂用于改善滴眼液生物利 用度等。 目前， 极少数报道涉及白芨多糖的化学改性研究， 仅有学者制备了胆甾醇琥珀酰基 白芨多糖， 但其合成产物分子量较大， 并未做材料安全性及作为生物医药材料方面的相关 研究。 因此， 其改性产物难以在新型医药材料方面得到应用与推广。 发明内容 0003 为了充分发挥和利用白芨多糖的原有优势， 同时改善和提高其性能、 弥补和克服 其缺陷， 本发明以低分子量白芨多糖为原料， 提供一种疏水改性低分子量白芨多糖衍生物 纳米胶束作为药物载体的制备方法及应用。 0004 本发明的目的是通过以下技术方案予以。
11、实现： 0005 一种疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束， 将改性白芨多糖衍生物于蒸 馏水中， 经磁力搅拌、 冰浴超声、 滤膜滤过， 收集续滤液得圆球形胶束， 平均粒径范围为60 800nm； 0006 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法： 精密称取疏水改性 白芨多糖衍生物于蒸馏水中， 经磁力搅拌、 冰浴超声、 滤膜滤过， 收集续滤液， 滤液自组装成 纳米胶束； 0007 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法： 精密称取20.00 25.00mg所述疏水改性白芨多糖衍生物于512mL蒸馏水中， 磁力搅拌34h， 冰浴超声5 10min， 分别经0.45 。
12、m、 0.22 m的滤膜滤过， 收集续滤液， 滤液自组装成纳米胶束， 胶束成圆 球形， 其平均粒径范围为60800nm； 0008 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法， 疏水改性低分子量 白芨多糖衍生物以降解后的低分子量白芨多糖为原料， 经透析、 冷冻干燥即得； 0009 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法， 疏水改性低分子量 白芨多糖衍生物制备包括如下步骤： 0010 a.称取酶解后的低分子量白芨多糖0.040.25g分散在2050mL溶剂中溶解， 备 用； 0011 b.称取一定量疏水材料、 催化剂A、 催化剂B(0.22:1:13， mmol/mmol。
13、)分散在4 说 明 书 1/5 页 4 CN 104434791 B 4 6mL与步骤a相同的溶剂中， 冰浴活化1.53h， 将活化后的反应液逐滴加入到步骤a制得 的低分子量白芨多糖溶液 中， 持续搅拌， 先高温反应24h， 再室温反应2436h； 0012 c.将步骤b的反应液置于透析袋(截留分子量为30008000D)中并在蒸馏水中透 析， 每8h换一次水， 透析23天。 将透析液过滤， 取续滤液冷冻干燥， 收集产物即得疏水改性 低分子量白芨多糖衍生物； 0013 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物纳米胶束的制备方法， 低分子量白芨多糖 是白芨粗多糖经纯化、 降解、 精制后制得， 其黏均分。
14、子量为1000D8000D； 0014 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法， 所述疏水改性低分 子量白芨多糖衍生物制备中， 步骤a所述酶解后的低分子量白芨多糖是白芨多糖通过酶法 降解所得， 其中酶采用纤维素酶、 果胶酶、 -葡聚糖酶、 -葡萄糖苷酶中的能够作用于 -1,4 糖苷键的一种或以上多种酶的组合物； 0015 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法， 所述疏水改性低分 子量白芨多糖衍生物制备中， 步骤a中的溶剂可用二甲基亚砜、 N,N-二甲基甲酰胺、 甲酰胺、 乙醇与水的混合溶剂、 水与N， N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中的一种或多种； 0016 上述疏水。
15、改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法， 所述疏水改性低分 子量白芨多糖衍生物制备中， 步骤b中所述疏水材料中疏水基团可以是脱氧胆酸、 胆酸、 胆 烷酸、 C2C19脂肪酸中的任意一种， 所述疏水基团的取代度为560； 0017 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物的纳米胶束制备方法， 所 述疏水改性低 分子量白芨多糖衍生物制备中， 步骤b中催化剂A可以用N,N-二环已基碳二亚胺、 1-乙基- (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺中的任意一种； 催化剂B可选用4-二甲氨基吡啶、 N-羟基丁 二酰亚胺中的任意一种； 0018 上述疏水改性低分子量白芨多糖衍生物纳米胶束作为药物载体的应用； 001。
16、9 上述的疏水改性低分子量白芨多糖衍生物纳米胶束作为药物载体的应用， 具体是 在包载难溶性药物并将药物靶向运送至肝脏中的应用。 0020 本发明的有益效果： 以低分子量白芨多糖为原料， 合成一种疏水改性多糖纳米材 料， 扩大白芨多糖及改性白芨多糖的应用领域。 由发明所制的疏水改性低分子量白芨多糖 通过自作装成纳米胶束， 形成核-壳结构， 包裹疏水性药物， 增强疏水药物在体液中的溶解 性， 延长作用时间， 防止药物被生物体内酶降解， 进而提高生物利用度。 用于包载难溶性药 物并将药物靶向运送至肝脏。 可用于保肝、 护肝药物的肝靶向递释。 既可以实现药物的控制 释放和靶向治疗等作用， 又降低药物对。
17、正常组织的毒副作用， 是一种较好的药物载体材料。 附图说明 0021 图1为本发明合成月桂酸接枝白芨多糖衍生物自组装成纳米胶束的透射电镜图 0022 图2为本发明合成胆酸接枝白芨多糖衍生物自组装成纳米胶束的透射电镜图 0023 图3为本发明合成硬脂酸接枝白芨多糖衍生物自组装成纳米胶束的透射电镜图 0024 图4为本发明超声分散法制备载甘草次酸胶束透射电镜图 0025 图5为本发明超声分散法制备载水飞蓟素胶束透射电镜图 0026 图6为本发明游离药物与载药胶束小鼠尾静脉注射4小时后离体组织荧光图 0027 图7为本发明改性白芨多糖载香豆素-6胶束与HepG2细胞孵育1h后荧光图 说 明 书 2/。
18、5 页 5 CN 104434791 B 5 0028 图中(40， a： 空白组， b： 游离香豆素组， c： 载香豆素胶束组) 具体实施方式 0029 以下结合附图通过实例对本发明的技术方案做进一步的说明： 0030 实例1： 0031 白芨多糖的降解以及改性： 0032 (1)白芨多糖的纤维素酶降解 0033 精密称取2.00g白芨多糖， 分散溶解在100ml蒸馏水中， 用磷酸二氢钾调节pH为 5.0， 加入0.45(w/v)的纤维素酶， 50保温振荡46h， 煮沸510min灭活酶； 用3,5-二硝 基水杨酸法测得降解产物还原糖含量为14.270.59， 黏均分子量为4850.48Da。
19、。 0034 (2)白芨多糖接枝脱氧胆酸的合成 0035 精密称取0.04g上述纤维素酶法降解后的白芨多糖， 溶解于20mL二甲基亚砜中， 备 用； 称取0.39g脱氧胆酸、 0.19g N,N-二环已基碳二亚胺、 0.12g 4-二甲氨基吡啶溶解于5mL 的二甲基亚砜中， 冰浴 活化2h， 将活化后的反应液逐滴滴加到白芨多糖溶液中， 高温反应 2h， 室温反应24h。 终止反应， 将反应液置于透析袋中(MWCO3000)， 于1L蒸馏水中透析， 每8h 换一次水， 透析3天。 冷冻干燥得改性白芨多糖。 将脱氧胆酸接枝白芨多糖反应物复溶用激 光粒度仪测得粒径： 400.371.23nm。 00。
20、36 实例2： 0037 (1)白芨多糖的纤维素酶降解 0038 精密称取2.00g白芨多糖， 分散溶解在100ml蒸馏水中， 用磷酸二氢钾调节pH为 4.0， 加入0.25(w/v)的纤维素酶， 40保温振荡46h， 煮沸510min灭活酶； 用3,5-二硝 基水杨酸法测得降解产物还原糖含量为10.600.38， 黏均分子量为4235.21Da。 0039 (2)白芨多糖接枝月桂酸的合成 0040 精密称取0.08g纤维素酶法降解后的白芨多糖， 溶解于40mLN,N二甲基甲酰胺水 (5： 1， v/v)混合溶剂中， 备用； 称取0.16g月桂酸、 0.19g N,N-二环已基碳二亚胺、 0.。
21、31g 4- 二甲氨基吡啶溶解于5mL的N,N二甲基甲酰胺水(5： 1， v/v)混合溶剂中， 冰浴活化2h， 将活化 后的反应液逐滴滴加到白芨多糖溶液中， 高温反应2h， 室温反应24h。 停止反应， 将反应液置 于透析袋中(MWCO7500)， 于2.5L蒸馏水中透析， 每8h换一次水， 透析3天。 冷冻干燥得改性白 芨多糖衍生物。 将月桂酸接枝白芨多糖反应物复溶用激光粒度仪测得粒径： 400.37 1.23nm。 0041 实例3： 0042 (1)白芨多糖的纤维素酶降解 0043 精密称取2.00g白芨多糖， 分散溶解在100ml蒸馏水中， 用磷酸二氢钾调节pH为 4.5， 加入0.3。
22、5(w/v)的纤维素酶， 45保温振荡46h， 煮沸510min灭活酶； 用3,5-二硝 基水杨酸法测得降解产物还原糖含量为12.800.41， 黏均分子量为3164.39Da。 0044 (2)白芨多糖接枝胆酸的合成 0045 精密称取0.10g酶法降解后的白芨多糖， 溶解于25mL甲醇水(4:1， v/v)混合溶剂 中， 备用； 称取0.32g胆酸、 0.19g N,N-二环已基碳二亚胺、 0.14g 4-二甲氨基吡啶溶解于 5mL的甲醇水(4:1， v/v)混合溶剂中， 冰浴活化2h， 将活化后的反应液逐滴滴加到白芨多糖 说 明 书 3/5 页 6 CN 104434791 B 6 溶液。
23、中， 高温反应3h， 室温反应28h。 停止反应， 将反应液置于透析袋中(MWCO5000)， 于1.5L 蒸馏水中透析， 每8h换一次水， 透析3天。 冷冻干燥得改性白芨多糖。 将胆酸接枝白芨多糖反 应物复溶用激光粒度仪测得粒径： 340.306.09nm。 0046 实例4： 0047 (1)白芨多糖的果胶酶降解 0048 精密称取2.00g白芨多糖， 分散溶解在100ml蒸馏水中， 滴加35滴磷酸调节pH 3.0， 加入0.25(w/v)的果胶酶， 50保温振荡46h， 煮沸510min灭活酶； 用3,5-二硝基 水杨酸法测得降解产物还原糖含量为4.700.11， 黏均分子量为5895.。
24、02Da。 0049 (2)白芨多糖接枝胆烷酸的合成 0050 精密称取0.18g酶法降解后的白芨多糖， 溶解于25mL N,N二甲 基甲酰胺中， 备用； 称取1.71g胆烷酸、 0.15g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、 0.17g N-羟基丁二酰 亚胺溶解于5mL的N,N二甲基甲酰胺中， 冰浴活化2h， 将活化后的反应液逐滴滴加到白芨多 糖溶液中， 高温反应3h， 室温反应28h。 停止反应， 将反应液置于透析袋中(MWCO4500)， 于 1.5L蒸馏水中透析， 每8h换一次水， 透析3天。 冷冻干燥得改性白芨多糖。 将胆烷酸接枝白芨 多糖反应物复溶用激光粒度仪测得粒径： 。
25、600.573.09nm。 0051 实例5： 0052 (1)白芨多糖衍生物的 -葡聚糖酶降解 0053 精密称取2.00g白芨多糖衍生物， 分散溶解在100ml蒸馏水中， 用磷酸二氢钾调节 pH 4.8， 加入0.45(w/v)的 -葡聚糖酶， 50保温振荡46h， 煮沸510min灭活酶； 用3, 5-二硝基水杨酸法测得降解产物还原糖含量为7.980.2， 黏均分子量为6573.46Da。 0054 (2)白芨多糖衍生物接枝硬脂酸的合成 0055 精密称取0.25g酶法降解后的白芨多糖衍生物， 溶解于35mL二甲基亚砜中， 备用； 称取0.34g硬脂酸、 0.21g N,N-二环已基碳二。
26、亚胺、 0.17g 4-二甲氨基吡啶溶解于5mL的二 甲基亚砜中， 冰浴活化2h， 将活化后的反应液逐滴滴加到白芨多糖溶液中， 高温反应4h， 室 温反应30h。 停止反应， 将反应液置于透析袋中(MWCO3400)， 于2L蒸馏水中透析， 每8h换一次 水， 透析3天。 冷冻干燥得改性白芨多糖。 将硬质酸接枝白芨多糖反应物复溶用激光粒度仪 测得粒径： 249.838.10nm。 0056 实例6： 0057 疏水改性白芨多糖衍生物自组装纳米胶束的制备： 0058 (1)精密称取20.00mg上述实例2中接枝月桂酸的改性白芨多糖衍生物于68mL蒸 馏水中， 磁力搅拌持续3h， 取溶解液冰浴超声。
27、5min， 溶液先过0.45 m， 再过0.22 m滤膜， 收集 续滤液得到纳米胶束溶液。 取样品滴加于铜网上， 样品干燥后， 在透射电镜下观察并拍照 (附图1)。 0059 (2)精密称取22.00mg上述实例3中接枝胆酸的改性白芨多糖衍生物于810mL蒸 馏水中， 磁力搅拌持续3.5h， 取溶解液冰浴超声8min， 溶液先过0.45 m， 再过0.22 m滤膜， 收 集续滤液得到纳米胶束溶液。 取样品滴加于铜网上， 样品干燥后， 在透射电镜下观察并拍照 (附图2)。 0060 (3)精密称取25.00mg上述实例5中接枝硬脂酸的改性白芨多糖衍生物于1012mL 蒸馏水中， 磁力搅拌持续4h。
28、， 取溶解液冰浴超声10min， 溶液先过0.45 m， 再过0.22 m滤膜， 说 明 书 4/5 页 7 CN 104434791 B 7 收集续滤液得到纳米胶束溶液。 取样品滴加于铜网上， 样品干燥后， 在透射电镜下观察并拍 照(附图3)。 0061 实例7： 0062 疏水改性低分子量白芨多糖衍生物纳米胶束作为药物载体的应用： 0063 (1)超声分散法制备载甘草次酸胶束 0064 精密称取25.00mg实例1中所合成脱氧胆酸接枝白芨多糖聚合 物， 以2.50mgmL-1 浓度分散于蒸馏水， 将加药量为10(重量)载体量的甘草次酸溶解于0.5ml无水乙醇中， 缓 慢滴加至上述聚合物水溶。
29、液中， 磁力搅拌24h后， 冰浴超声10min(超声功率800W， 工作2s， 间 歇3s)， 溶液于3500rpm离心20min， 收集上清液过0.45 m滤膜， 收集续滤液得到载甘草次酸 纳米胶束溶液。 取样品滴加于铜网上， 样品干燥后， 在透射电镜下观察并拍照(附图4)。 0065 (2)超声分散法制备载水飞蓟素胶束 0066 精密称取25.00mg实例4中所合成胆烷酸接枝白芨多糖聚合物， 以2.50mgmL-1浓 度分散于蒸馏水， 将加药量为10(重量)载体量的水飞蓟素溶解于1mL无水乙醇中， 缓慢滴 加至上述聚合物水溶液中， 磁力搅拌24h后， 冰浴超声15min(超声功率700W，。
30、 工作2s， 间歇 3s)， 溶液于3500rpm离心20min， 收集上清液过0.45 m滤膜， 收集续滤液得到载水飞蓟素纳 米胶束溶液。 取样品滴加于铜网上， 样品干燥后， 在透射电镜下观察并拍照(附图5)。 0067 (3)超声分散法制备载香豆素胶束 0068 精密称取25.00mg疏水改性白芨多糖聚合物， 以2.50mgmL-1浓度分散于蒸馏水， 将加药量为10(重量)载体量的香豆素溶解于0.51mL无水乙醇中， 缓慢滴加至上述聚合 物水溶液中， 磁力搅拌24h后， 冰浴超声15min(超声功率700W， 工作2s， 间歇3s)， 溶液于 3500rpm离心20min， 收集上清液过0。
31、.45 m滤膜， 收集续滤液得到载香豆素纳米胶束溶液。 0069 载香豆素纳米胶束小动物活体成像试验 0070 将昆明种小鼠分为游离药物组和载药胶束组， 分别尾静脉注射(0.10ml/10mg)游 离香豆素等渗溶液与实例7中所制得的香豆素载药纳米胶束， 用水合氯醛麻醉， 4小时后处 死， 解剖取心、 肝、 脾、 肺、 肾， 用滤纸吸取残留血液后按次序摆放在小动物活体成像仪的暗 箱平台上， 采用软件控制对其拍照观察(附图6)。 0071 载香豆素纳米胶束的细胞摄取试验 0072 将HepG2细胞以2105cells/孔的密度接种到载有盖玻片的6孔培养板中， 孵育 24h待细胞生长正常后， 分别加入经无血清培养液、 经无血清培养液稀释的香豆素乙醇溶液 和载香豆素纳米胶束200 L， 孵育1h。 孵育结束后， 经过处理， 取出盖玻片， 经载玻片固定后， 在倒置荧光显微镜下拍照观察(附图7)。 说 明 书 5/5 页 8 CN 104434791 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 104434791 B 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 104434791 B 10 图5 图6 图7 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 104434791 B 11 。