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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711272031.2 (22)申请日 2017.12.05 (71)申请人 北京林业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路35号 (72)发明人 雷建都 刘彦雪 曹永丽 郑督 罗敏 孔天娇 杨子萱 肖萌 (51)Int.Cl. A61K 47/61(2017.01) A61K 47/60(2017.01) A61K 47/54(2017.01) A61K 31/56(2006.01) A61K 31/4745(2006.01) A61K 9/19(2006.01)。
2、 A61K 47/36(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递 送方法 (57)摘要 本发明公开了一种叶酸修饰的果胶纳米粒 子的双靶向递送方法。 所述的果胶纳米粒子是由 果胶与八臂聚乙二醇共轭结合， 果胶与叶酸通过 酰胺键连接， 八臂聚乙二醇与抗癌药物熊果酸通 过酯键结合， 得到叶酸-(果胶-多臂聚乙二醇)- 熊果酸前药， 与抗癌药物羟基喜树碱以一定比例 混合， 通过自组装的方法制备核壳结构的双靶向 纳米粒子。 该方法制备的双靶向果胶纳米粒子生 物相容性好， 果胶可被结肠处的果胶酶降解， 八 臂聚乙二醇易为无毒载体， 药。
3、物在体内运输过程 无突释现象， 体外释放实验显示出很好的pH值响 应性。 本文制备的纳米药物载药率高， 包埋率可 控， 产率高， 作为一种新型的药物载体， 果胶具有 很好的临床应用前景。 权利要求书2页 说明书6页 附图7页 CN 107970453 A 2018.05.01 CN 107970453 A 1.一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法， 其特征在于： 所述的果胶纳米粒 子是由果胶与八臂聚乙二醇共轭结合， 果胶与叶酸通过酰胺键连接， 八臂聚乙二醇与抗癌 药物熊果酸通过酯键结合， 得到叶酸-(果胶-多臂聚乙二醇)-熊果酸前药， 与抗癌药物羟基 喜树碱以一定比例混合， 通过自组装的。
4、方法制备核壳结构的双靶向纳米粒子。 具体步骤如 下： (1)将适量叶酸溶于二甲基亚砜中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)激活叶酸的末端羧基， 反应30分钟后加入乙二胺和吡啶， 搅拌均匀， 避光反应24小时， 得到氨基化叶酸(FA-NH2)， 将反应液转移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外 液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到黄色粉末； (2)取适量果胶溶于去离子水， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活果胶的羧基， 再加 入FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 避光反应24h， 将反应。
5、液转移到透析膜内， 磷酸缓冲溶 液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷 冻干燥， 得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末； (3)取适量八臂聚乙二醇溶于吡啶中， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活聚乙二醇的 羧基， 再加入抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP， 连续通氮气， 35下反应48小时， 取出混 合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相对于混合液体积)， 搅拌均匀， 有白色沉淀析出， 4000转离心收 集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离心， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品， 将其转移到透析 膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4。
6、)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集 透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉末； (4)取八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， EDC溶解在二甲基亚砜中， 反应30分钟， 加入叶酸- 果胶和DMAP， 连续通氮气， 35避光反应48小时， 取出混合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相对于混 合液体积)搅拌均匀， 有黄色沉淀析出， 4000转离心收集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离心， 得到 叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品， 将其转移到透析膜内， 磷 酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液，。
7、 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内 溶液， 冷冻干燥， 得到纯化的叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末； (5)二甲基亚砜溶解叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， 移液枪析出， 逐滴滴入 磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳 米粒子溶液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶 酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末； (6)取适量叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于二甲 基亚砜， 搅拌均匀， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH。
8、7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶酸-果 胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱(FA-Pectin-8armPEG-UA/HCPT)纳米粒子溶液， 透 析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八臂聚 乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。 2.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法， 其特征在 于： 所述的抗癌药物熊果酸可由其它抗癌药物代替， 如紫杉醇、 齐墩果酸、 雷公藤甲素等。 3.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法， 其特征在 于： 所述的羟基喜树碱可由其它疏水性强的药物代替， 也可。
9、以是具有光学性能的金纳米粒 子， 或磁靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 107970453 A 2 4.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法， 其特征在 于： 所述的八臂聚乙二醇可以由单链聚乙二醇、 四臂聚乙二醇代替， 根据不通的药物可选用 不同的聚乙二醇末端基。 5.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法， 其特征在 于： 所述的双靶向果胶纳米粒子粒径范围100纳米左右。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 107970453 A 3 一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法 技术领域 0001。
10、 本发明涉及一种天然果胶作为药物载体制备新型抗癌药剂的方法， 具体一种叶酸 修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法， 属于高分子材料应用、 先进纳米技术和生物制药 领域。 背景技术 0002 果胶广泛存在于植物的果实、 根、 茎、 叶中， 是细胞壁的组成成分， 构成相邻细胞中 间层粘结物， 使植物组织细胞紧紧黏结在一起。 果胶是线形的多糖聚合物， 主要由半乳糖醛 酸组成， 含有数百至约1000个脱水半乳糖醛酸残基， 其相应的平均相对分子质量为50000 150000， 主要应用于食品加工行业， 如胶凝剂、 乳化剂和增稠剂等。 果胶良好的生物活性和 生物相容性， 成为药物载体的新宠儿， 近几年研究人。
11、员发现果胶的半乳糖凝集素-3(Gal-3) 配体具有识别干预肿瘤生长作用， 且在胃肠道不能被消化， 而结肠分泌的果胶酶可以降解 果胶， 实现了结肠靶向， 同时研究发现果胶可靶向肝癌， 诱导细胞凋亡， 抑制细胞转移的作 用， 而现有关于果胶作为药物载体的报道很少， 特别是基于靶向果胶载药的报道尚未有报 道， 因此， 建立一种全新的果胶载药系统变得尤为重要， 并为今后的研究提供一种新的途 径。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法， 解决疏水 药物的溶解性问题， 该方法的载体材料生物相容性好、 无毒、 可生物降解， 将果胶设计成双 靶向、 双载药的果胶纳。
12、米粒子实现联合抗癌的功效。 0004 本发明的上述目的通过以下技术方案实现： 果胶纳米粒子是由果胶与八臂聚乙二 醇共轭结合， 果胶与叶酸通过酰胺键连接， 八臂聚乙二醇与抗癌药物熊果酸通过酯键结合， 得到叶酸-(果胶-多臂聚乙二醇)-熊果酸前药， 与抗癌药物羟基喜树碱以一定比例混合， 通 过自组装的方法制备核壳结构的双靶向纳米粒子。 具体步骤如下： 0005 (1)将适量叶酸溶于二甲基亚砜中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基， 反应30分钟后加入乙二胺和吡啶， 搅拌均匀， 避光反应24 小时， 得到氨基化叶酸(FA-NH2)， 将反应液转移到透。
13、析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为 透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到黄色 粉末； 0006 (2)取适量果胶溶于去离子水， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活果胶的羧基， 再加入FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 避光反应24h， 将反应液转移到透析膜内， 磷酸缓 冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶 液， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末； 0007 (3)取适量八臂聚乙二醇溶于吡啶中， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活聚乙二。
14、 醇的羧基， 再加入抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP， 连续通氮气， 35下反应48小时， 取 说 明 书 1/6 页 4 CN 107970453 A 4 出混合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相对于混合液体积)， 搅拌均匀， 有白色沉淀析出， 4000转离 心收集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离心， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品， 将其转移到 透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉末； 0008 (4)取八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， EDC。
15、溶解在二甲基亚砜中， 反应30分钟， 加入 叶酸-果胶和DMAP， 连续通氮气， 35避光反应48小时， 取出混合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相 对于混合液体积)搅拌均匀， 有黄色沉淀析出， 4000转离心收集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离 心， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品， 将其转移到透析 膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集 透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到纯化的叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末； 0009 (5)二甲基亚砜溶解叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， 。
16、移液枪析出， 逐滴 滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果 酸纳米粒子溶液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到 叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末； 0010 (6)取适量叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于 二甲基亚砜， 搅拌均匀， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶 酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱(FA-Pectin-8armPEG-UA/HCPT)纳米粒子溶 液， 透析， 每隔6小时更换透析外液，。
17、 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八 臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。 0011 作为优选， 抗癌药物熊果酸可由其它抗癌药物代替， 如紫杉醇、 齐墩果酸、 雷公藤 甲素等。 优选地， 羟基喜树碱可由其它疏水性强的药物代替， 也可以是具有光学性能的金纳 米粒子， 或磁靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。 0012 优选地， 羟基喜树碱可由其它疏水性强的药物代替， 也可以是具有光学性能的金 纳米粒子， 或磁靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。 0013 优选地， 双靶向果胶纳米粒子粒径范围100纳米左右。 0014 本发明具有以下优点： 0015 (1)本发明选用果胶作。
18、为药物载体大大提高了药物的生物相容性， 无突释现象， 避 免普通载体施药后存在的突释、 生物相容性差、 不能降解、 在体内的堆积导致的毒副作用 等。 0016 (2)本发明利用八臂聚乙二醇的两亲性特性， 提高果胶与八臂聚乙二醇耦合作为 共载体自组装形成的纳米粒子的稳定性和产率， 提高纳米粒子的水溶性和分散性。 0017 (3)本发明的双靶向果胶纳米粒子是针对高发性结肠癌而研制的专一药物， 有望 临床应用。 0018 (4)本发明运载两种疏水抗癌药物， 根据两种药物杀死癌细胞的作用机理的不通 实现两种药物协同治疗癌症。 0019 说明书附图 0020 图1A合成氨基化叶酸的技术路线图， B合成八。
19、臂聚乙二醇-熊果酸的技术路线图， C 合成叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸的技术路线图； 0021 图2自组装叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子的方案设计 说 明 书 2/6 页 5 CN 107970453 A 5 图； 0022 图3叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物的氢谱核磁图； 0023 图4叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子粒径分布图； 0024 图5叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子稳定性实验； 0025 图6叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子的溶血实验图； 0026 图7纳米粒子中熊果酸和羟基喜树碱的体外。
20、释放图； 0027 图8叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子的细胞毒性图； 0028 图9叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子的共聚焦成像图， A-羟基喜树碱， B-叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子， C-叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基 喜树碱纳米粒子； 0029 图10纳米粒子中熊果酸和羟基喜树碱在血液中的含量与时间的关系图； 0030 图11叶酸的浓度对结肠癌细胞活性的影响； 0031 图12施用纯药与纳米药物的小鼠肿瘤体积变化图； 0032 图13施药后小鼠的相对肿瘤体积图， 小鼠存活率图， 小鼠体重变化图， 药物的超敏 反应， 血液中WBC细胞数。 。
21、具体实施方式 0033 实施例一 0034 (1)将1.0g叶酸溶于二甲基亚砜中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基， 反应30分钟后加入乙二胺和吡啶， 搅拌均匀， 避光反应24 小时， 得到氨基化叶酸(FA-NH2)， 将反应液转移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为 透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到黄色 粉末； 0035 (2)取1.0g果胶溶于去离子水， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活果胶的羧基， 再加入0.1g FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 避光。
22、反应24h， 将反应液转移到透析膜内， 磷 酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内 溶液， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末； 0036 (3)取2.0g八臂聚乙二醇溶于吡啶中， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活聚乙二 醇的羧基， 再加入0.1g抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP， 连续通氮气， 35下反应48小 时， 取出混合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相对于混合液体积)， 搅拌均匀， 有白色沉淀析出， 4000 转离心收集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离心， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品， 将其转。
23、 移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉 末； 0037 (4)取1.0g八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， EDC溶解在二甲基亚砜中， 反应30分钟， 加入0.5g叶酸-果胶和DMAP， 连续通氮气， 35避光反应48小时， 取出混合液， 加入三倍乙醚 (v/v， 相对于混合液体积)搅拌均匀， 有黄色沉淀析出， 4000转离心收集沉淀， 并用乙醚多次 洗涤离心， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品。
24、， 将其转移 到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 说 明 书 3/6 页 6 CN 107970453 A 6 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到纯化的叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末； 0038 (5)二甲基亚砜溶解10mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， 移液枪析出， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇- 熊果酸纳米粒子溶液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末。
25、； 0039 (6)取12mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于 二甲基亚砜， 搅拌均匀， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶 酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱(FA-Pectin-8armPEG-UA/HCPT)纳米粒子溶 液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八 臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。 0040 实施例二 0041 (1)将1.0g叶酸溶于二甲基亚砜中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐(EDC)激活叶酸的末端。
26、羧基， 反应30分钟后加入乙二胺和吡啶， 搅拌均匀， 避光反应24 小时， 得到氨基化叶酸(FA-NH2)， 将反应液转移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为 透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到黄色 粉末； 0042 (2)取1.0g果胶溶于去离子水， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活果胶的羧基， 再加入0.2g FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 避光反应24h， 将反应液转移到透析膜内， 磷 酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内 溶液， 冷冻干燥， 得到。
27、叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末； 0043 (3)取2.0g八臂聚乙二醇溶于吡啶中， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活聚乙二 醇的羧基， 再加入1.0g抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP， 连续通氮气， 35下反应48小 时， 取出混合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相对于混合液体积)， 搅拌均匀， 有白色沉淀析出， 4000 转离心收集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离心， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品， 将其转 移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合。
28、物(8armPEG-UA)白色粉 末； 0044 (4)取1.0g八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， EDC溶解在二甲基亚砜中， 反应30分钟， 加入0.5g叶酸-果胶和DMAP， 连续通氮气， 35避光反应48小时， 取出混合液， 加入三倍乙醚 (v/v， 相对于混合液体积)搅拌均匀， 有黄色沉淀析出， 4000转离心收集沉淀， 并用乙醚多次 洗涤离心， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品， 将其转移 到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到纯化的叶酸-果。
29、胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末； 0045 (5)二甲基亚砜溶解10mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， 移液枪析出， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇- 熊果酸纳米粒子溶液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末； 0046 (6)取12mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于 二甲基亚砜， 搅拌均匀， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶 说 明 书 4/6 页 7 C。
30、N 107970453 A 7 酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱(FA-Pectin-8armPEG-UA/HCPT)纳米粒子溶 液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八 臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。 0047 实施例三 0048 (1)将1.0g叶酸溶于二甲基亚砜中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基， 反应30分钟后加入乙二胺和吡啶， 搅拌均匀， 避光反应24 小时， 得到氨基化叶酸(FA-NH2)， 将反应液转移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)。
31、作为 透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到黄色 粉末； 0049 (2)取1.0g果胶溶于去离子水， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活果胶的羧基， 再加入0.1g FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 避光反应24h， 将反应液转移到透析膜内， 磷 酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内 溶液， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末； 0050 (3)取1.0g八臂聚乙二醇溶于吡啶中， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活聚乙二 醇的羧基， 再加。
32、入0.5g抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP， 连续通氮气， 35下反应48小 时， 取出混合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相对于混合液体积)， 搅拌均匀， 有白色沉淀析出， 4000 转离心收集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离心， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品， 将其转 移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉 末； 0051 (4)取1.0g八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， EDC溶解在二甲基亚砜中， 反应30分钟， 加入0.1g叶酸-果胶。
33、和DMAP， 连续通氮气， 35避光反应48小时， 取出混合液， 加入三倍乙醚 (v/v， 相对于混合液体积)搅拌均匀， 有黄色沉淀析出， 4000转离心收集沉淀， 并用乙醚多次 洗涤离心， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品， 将其转移 到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到纯化的叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末； 0052 (5)二甲基亚砜溶解10mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， 移液枪析出， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS，。
34、 pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇- 熊果酸纳米粒子溶液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末； 0053 (6)取12mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于 二甲基亚砜， 搅拌均匀， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶 酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱(FA-Pectin-8armPEG-UA/HCPT)纳米粒子溶 液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到。
35、叶酸-果胶-八 臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。 0054 实施例四 0055 (1)将1.0g叶酸溶于二甲基亚砜中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基， 反应30分钟后加入乙二胺和吡啶， 搅拌均匀， 避光反应24 小时， 得到氨基化叶酸(FA-NH2)， 将反应液转移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为 说 明 书 5/6 页 8 CN 107970453 A 8 透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到黄色 粉末； 0056 (2)取1.0g果胶溶于去离子水， 搅拌均匀。
36、， 加入EDC反应30分钟， 激活果胶的羧基， 再加入0.1g FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)， 避光反应24h， 将反应液转移到透析膜内， 磷 酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外液， 收集透析膜内 溶液， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末； 0057 (3)取2.0g八臂聚乙二醇溶于吡啶中， 搅拌均匀， 加入EDC反应30分钟， 激活聚乙二 醇的羧基， 再加入1.0g抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP， 连续通氮气， 35下反应48小 时， 取出混合液， 加入三倍乙醚(v/v， 相对于混合液体积)， 搅拌均匀， 。
37、有白色沉淀析出， 4000 转离心收集沉淀， 并用乙醚多次洗涤离心， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品， 将其转 移到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉 末； 0058 (4)取1.0g八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， EDC溶解在二甲基亚砜中， 反应30分钟， 加入0.2g叶酸-果胶和DMAP， 连续通氮气， 35避光反应48小时， 取出混合液， 加入三倍乙醚 (v/v， 相对于混合液体积)搅拌均匀， 有黄色沉淀析出， 4000转离心收集沉淀。
38、， 并用乙醚多次 洗涤离心， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品， 将其转移 到透析膜内， 磷酸缓冲溶液(pH7.4)作为透析外液， 透析过夜， 每4小时更换一次透析外 液， 收集透析膜内溶液， 冷冻干燥， 得到纯化的叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末； 0059 (5)二甲基亚砜溶解10mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物， 移液枪析出， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇- 熊果酸纳米粒子溶液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 。
39、得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末； 0060 (6)取12mg叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物和疏水药物羟基喜树碱溶于 二甲基亚砜， 搅拌均匀， 逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS， pH7.4)， 搅拌一段时间， 得到叶 酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱(FA-Pectin-8armPEG-UA/HCPT)纳米粒子溶 液， 透析， 每隔6小时更换透析外液， 过夜， 收集透析膜内液体， 冷冻干燥， 得到叶酸-果胶-八 臂聚乙二醇-熊果酸/羟基喜树碱纳米粒子黄色粉末。 说 明 书 6/6 页 9 CN 107970453 A 9 图1 说 明 书 附 图 1/7 页 10 CN 107970453 A 10 图2 图3 说 明 书 附 图 2/7 页 11 CN 107970453 A 11 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 3/7 页 12 CN 107970453 A 12 图7 图8 说 明 书 附 图 4/7 页 13 CN 107970453 A 13 图9 图10 说 明 书 附 图 5/7 页 14 CN 107970453 A 14 图11 图12 说 明 书 附 图 6/7 页 15 CN 107970453 A 15 图13 说 明 书 附 图 7/7 页 16 CN 107970453 A 16 。