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1、(10)授权公告号 CN 101444629 B (45)授权公告日 2011.05.25 CN 101444629 B *CN101444629B* (21)申请号 200810177470.X (22)申请日 2008.11.25 200710171742.0 2007.11.30 CN A61K 48/00(2006.01) A61P 5/00(2006.01) A61P 7/00(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/00(2006.01) A61P 43/00(2006.01) (73)专利权人 芮屈生物技术 。
2、( 上海 ) 有限公司 地址 201108 上海市闵行区光华路 728 号 4 幢 426 室 (72)发明人 裘建英 张云福 (74)专利代理机构 上海翼胜专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 31218 代理人 翟羽 何兴元 (54) 发明名称 一种非注射用的基因治疗药物及其药盒 (57) 摘要 本发明公开一种非注射用基因治疗药物， 该 药物是以重组腺相关病毒 (rAAV) 为载体制备的 水剂、 油剂或水油混合剂 ； 该药物重组体的目的 基因包括各种对疾病有治疗作用的基因。本发明 还公开了包含上述药物的药盒， 药盒还包括说明 书， 说明书记载该药物通过口服、 呼吸道、 尿道、 肛 肠注入或皮肤。
3、涂抹使用。目前， rAAV 载体基因治 疗药物的给药途径都采取注射方法， 本发明与现 有技术相比， 给药更加简单方便， 并可多次重复， 病人更容易接受， 在给病人带来很大方便的同时， 亦具有相当大的实用价值。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. 审查员 张小勇 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 101444629 B1/1 页 2 1.一种非注射用的基因治疗药物， 其特征在于， 所述的药物是Maxi-k基因-腺相关病 毒重组体制备的水剂， 所述水剂通过尿道口滴入的方法给药。 2. 如权利要求 1 所述的基因治疗药物， 。
4、其特征在于， 所述的腺相关病毒包括所有血清 型的腺相关病毒。 权 利 要 求 书 CN 101444629 B1/4 页 3 一种非注射用的基因治疗药物及其药盒 技术领域 0001 本发明属于基因治疗领域， 具体地说， 是涉及一种非注射用的基因治疗药物给药 途径及其药盒， 更具体地说， 是涉及一种以重组腺相关病毒为载体制备的水剂、 油剂或水油 混合剂给药途径及其药盒。 背景技术 0002 基因疗法是指将正常基因植入靶细胞代替病人细胞中的遗传缺陷基因， 或关闭、 抑制异常表达的基因， 以达到预防和医疗疾病目的的一种临床医疗技术。在治疗遗传性疾 病、 恶性肿瘤、 癌症、 艾滋病病毒 (HIV)、 。
5、关节炎、 糖尿病、 腺苷脱氢酶 (ADA) 缺陷症、 神经系 统紊乱、 心脏病等疾病方面， 基因疗法发挥着越来越重要的作用。 0003 基因治疗的最早提出是针对单基因缺陷的遗传病， 其原理是用一个正常的基因 来置换缺陷的基因或补救缺陷基因。1990 年美国国家卫生院 (NIH) 研究的 Blas RM 和 Anderson WF 用 ADA( 腺苷酸脱氨酶 ) 基因治愈了一位因 ADA 基因缺陷导致严重免疫缺失 (SCID)的4岁女孩， 使世界各国掀起研究基因的热潮。 至今， 基因治疗的研究内容也从单基 因的遗传病扩大到多基因的肿瘤、 艾滋病、 心血管病、 神经系统疾病、 自身免疫性疾病、 内。
6、分 泌以及老年性疾病上。近来， 基因载体的技术， 外源基因的表达调控等研究的突破性进展， 使基因治疗在人体内应用的安全性和靶向性大大提高。从 2005 年 7 月以来， 已有 1076 项 基因试验在全世界 20 多个国家开展， 治疗病例 6000 多例。 0004 基因治疗是一把双刃剑， 基因治疗中最重要的一个环节是选择适当的基因载体 (Vector)。基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。目前在基因治疗研究或临 床试验上， 85是使用病毒载体， 2000 年时， 美国宾州大学有病人在基因治疗中死亡， 2003 年法国又发生先天免疫不全症， 基因治疗临床试验发生类白血病的副作用。这两。
7、种失败的 案例， 被归于病毒载体的安全性低， 据了解， 均是由于逆转录病毒作为基因载体所引起的。 因此， 逆转录病毒载体逐渐被淘汰。 而今用腺病毒和腺相关病毒， 腺病毒的缺点是表达外源 基因时间短， 免疫性强， 可引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应， 毒性大， 免疫反应重， 一次使用后产生抗原抗体反应， 重复使用无效。 0005 目前， 被看好的基因治疗载体是腺相关病毒 AAV， 它具有病毒基因组小， 如 2 型腺 相关病毒是 4681 核苷酸组成的单链 DNA， 可感染分裂静止期细胞， 当辅助病毒不存在时， AAV 能整合到宿主细胞基因组的特定区域， 无致病性， 免疫原性弱， 可以感染宿主。
8、组织细胞 ： 肝、 肺、 肾、 脑、 胃肠道黏膜、 视网膜、 皮肤、 肌肉等组织， 在猴子的实验中， 六年持续表达目的 蛋白， 它无毒高效， 是目前理想的基因治疗载体。构建重组 AAV(rAAV) 涉及到用一个目的基 因替换病毒基因组的大部分， 然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。 0006 我国的预防科学院病毒研究所与本元正阳基因技术公司和国内多个单位合作， 用 重组腺相关病毒 (rAAV) 载体开展肿瘤和遗传病的基因治疗项目。复旦大学遗传所和本元 正阳基因技术公司合作重组 AAV( 携带凝血因子 ) 的血液病治疗项目已进入临床 2 期。第 一军医大学南方医院肿瘤中心采用腺相。
9、关病毒为载体， 将人乳头状病毒的 E-6 和 E-7 及 说 明 书 CN 101444629 B2/4 页 4 GM-CSF病毒转染DC用于宫颈癌的治疗。 可以预见在近几年， 国外和国内将会有很多的基因 治疗方案采用 AAV 做载体。由于基因治疗针对的脏器和疾病的不同， 特别是深部器官内的 靶向性的问题至今无突破， 使基因治疗效果受到影响。一味采用肌肉注射或静脉注射可能 影响治疗效果， 如胃肠道或直肠疾病 ( 消化器官癌症或其他疾病 )， 可能使用胃肠道给药药 效会更好 ； 如皮肤疾病或其他疾病， 可能经皮转录目的基因， 比常规肌肉注射和静脉注射会 发挥更好的治疗作用 ； 如生发类的基因治疗。
10、药物如果可以直接涂抹在头皮表面， 局部用药 浓度更高 ； 治疗 ED 基因药物采用尿道或皮肤给药比阴颈注射方便多， 上述用药有非常重要 的临床意义。将注射类药物改为口服剂或涂抹剂， 将会使基因治疗药物更易进入临床以及 降低诸多生产成本和测试成本。 0007 因此， 本发明旨在提供一种非注射用的基因治疗药物。本发明还提供包括上述药 物的药盒。 发明内容 0008 为实现本发明的目的， 本发明的技术方案如下 ： 0009 本发明提供一种非注射用的基因治疗药物， 所述的药物是目的基因 - 腺相关病 毒重组体制备的水剂、 油剂或水油混合剂。 0010 根据本发明所述的基因治疗药物， 其中较好地是， 所。
11、述的药物重组体的目的基因 包括各种对癌症、 心脑血管、 老年性疾病、 内分泌疾病、 自身免疫性疫病、 血液性疾病或遗传 性疾病有治疗作用的基因。 0011 根据本发明所述的基因治疗药物， 其中较好地是， 所述的腺相关病毒包括所有血 清型的腺相关病毒。 0012 本发明还提供一种药盒， 所述的药盒包括如上所述的基因治疗药物和说明书。 0013 根据本发明所述的药盒， 其中较好地是， 所述的基因治疗药物重组体的目的基因 包括各种对癌症、 心脑血管、 老年性疾病、 内分泌疾病、 自身免疫性疫病、 血液性疾病或遗传 性疾病有治疗作用的基因。 0014 根据本发明所述的药盒， 其中较好地是， 所述的药物。
12、为水剂、 油剂或水油混合剂。 口服首选水剂， 药物通过胃肠道、 直肠黏膜转染导入体内， 水剂更利于疾病的治疗， 也可使 用油剂或水油混合剂 ； 皮肤涂抹首选油剂， 在表皮、 头发、 阴茎龟头、 尿道口内粘膜、 阴道内 膜等皮肤涂抹， 也可使用水剂或水油混合剂。 0015 根据本发明所述的药盒， 其中较好地是， 所述的基因治疗药物还包含调整胃肠道、 直肠pH值的溶剂(选自细胞培养液、 细胞保护液、 酸性水溶液或碱性水溶液)。 药物口服后 通过胃肠道、 直肠粘膜转染导入， 为配合腺相关病毒在最佳pH值8中得到最高转染率， 要随 时改变胃肠道、 直肠的 pH 值， 本发明使用的溶剂是培养条件的 pH。
13、 值， 不影响腺相关病毒导 入体内的生物活性功能。 0016 根据本发明所述的药盒， 其中较好地是， 所述的说明书记载的内容如下 ： 0017 (1) 基因治疗药物采用口服或皮肤涂抹的方法给药。 0018 (2) 调整胃肠道、 直肠 pH 值的细胞培养液、 细胞保护液、 酸性水溶液或碱性水溶液 单独在用药前使用。 0019 (3) 调整胃肠道、 直肠 pH 值的细胞培养液、 细胞保护液、 酸性水溶液或碱性水溶液 说 明 书 CN 101444629 B3/4 页 5 混合在含有目的基因的腺相关病毒载体中使用。 0020 本发明与现有技术相比， 具有如下有益效果 ： 0021 (1) 本发明药物。
14、选用腺相关病毒为载体， 安全无毒副作用 ； 0022 (2) 本发明药物成本与注射剂相比较低， 根据不同病情选择适用的剂型， 可达到更 好的治疗效果 ； 0023 (3) 本发明的药物给药方便、 可多次重复， 病人易于接受， 给病人带来方便的同时 亦有相当大的实用价值。 具体实施方式 0024 下面参照实施例， 更具体地说明本发明内容。 应当理解， 下面的实施例用于说明本 发明的内容， 而非限定本发明的内容， 任何形式上的变动和 / 或变通， 将落入本发明的保护 范围。 0025 实施例 1 0026 本发明基因治疗药物水剂的生产工艺如下 ： 0027 一、 细胞种子扩大 0028 取 50L。
15、 发酵罐所要的 HEK293 细胞库的种子细胞， 接种 HEK293 至专用发酵罐中， 发 酵罐培养基在接种前预热至 37， 用二氧化碳来平衡培养液的 pH， 发酵罐在发酵培养中能 自动检测各项参数指标 ( 如 ： 氧分压、 二氧化碳分压、 pH 值、 温度、 葡萄糖浓度、 氨浓度、 呼吸 比等 )， 细胞在发酵罐中培养至所需的培养密度约需 3-4 天的时间， 每天检测细胞生长的密 度， 中间的培养液更换和补充以程控仪表显示参数为依据， 培养液为无血清培养液。培养 工艺中本发明改由转瓶到发酵罐大容量悬浮培养和无血清培养， 用悬浮培养方法代替贴壁 培养， 使大规模培养更易操作， 也降低了培养液自。
16、身带来的动物源性污染， 提高产品的安全 性。 0029 二、 质粒转染 ( 符合 GMP 标准的三质粒共转染技术 ) 0030 重组 Maxi-K 基因的腺相关病毒 (rAAV) 载体包括 ITRs 携带目的基因功能区 ； AAV 的 Rep 启动子和转录子系统 Cap ； 腺相关病毒的辅助系统质粒是腺病毒的表面蛋白的基因， 整个转染过程是包装质粒与 HEK293 共转染。当 HEK293 细胞培养到适当的密度， 约占培养 密度的 80左右， 历时 5 天时间， 将适量的 rAAV 质粒加入发酵罐中， 进行转染培养。质粒 行将转染时， 发酵罐暂时停止转动， 加入质粒后作轻微搅拌后， 再停止一小。
17、时， 再轻微搅拌 几次， 再停止一小时， 在约 5-6 小时内， 每小时作相同动作， 使 rAAV 与 HEK293 细胞能很好地 受到转染， 直至大部分细胞受到转染。值得一提的是 HEK293 在发酵罐中培养的基本条件， 尽量提供与体内生活条件相接近的培养环境， 培养环境应具备以下几个因素 ： 所有与细胞 接触的设备、 器材、 溶液等， 其中包括种子库细胞培养和放大培养及生产培养过程， 都必须 保持绝对无菌， 避免细胞外微生物的污染， 必须有充足的营养供应， 绝对不能含有有害的物 质， 甚至极微量有害离子 ； 保证有适量的氧气供应 ； 及时清除细胞代谢产生的有害物质 ； 有 良好的适宜细胞生。
18、存的外界环境， 包括渗透压、 离子浓度、 氨基酸浓度、 氧分压、 二氧化碳分 压、 葡萄糖浓度、 pH 值等， 保持合适的细胞密度。 0031 三、 营养更新 ( 介质更新 ) 0032 细胞在培养过程中由于细胞自我的代谢需要， 将吸取营养物质， 排出代谢产物， 在 说 明 书 CN 101444629 B4/4 页 6 大容量的培养过程中， 要及时补充各种营养物质和氧气等， 也要及时清除代谢产物如二氧 化碳、 氨等， 特别在质粒转染前， 要先更新和补充培养液， 使质粒转染过程中， 细胞能大多受 到转染， 增加转染率， 进一步提高产量。 0033 四、 细胞收集 0034 当 HEK293 与。
19、 rAAV 质粒转染时， 达到收集的时候时， 将细胞全部收集。可收集程度 的指标， 依照抽样经显微镜下观察已有大量细胞产生报告基因 Lacz 比例， 或肉眼观察， 见 大量细胞呈簇状， 此时也可以收集细胞。将收集的细胞和培养液进行过滤或离心， 富集细 胞。 0035 五、 细胞破壁和纯化 0036 富集的细胞经匀浆机 ( 或超声波 ) 破壁， 然后离心除去细胞碎片， 作过柱的预处 理， 在快速纯化仪中快速过柱纯化， 最后将病毒液转移至透析袋， 在 4下透析， 后经安全性 和生物活性检测， 即得到所需的 GMP 条件下重组腺相关病毒载体的产品。 0037 六、 包装和储存 0038 收集到重组基因治疗药物产品后， 在 4包装， 加入保护液 5山梨醇或 5甘露 醇， 包装为所需的水剂， 在 4或 -20低温保存。 0039 实施例 2 0040 除步骤六加入甘油包装为油剂外。 0041 其他操作同实施例 1。 0042 实施例 3 0043 自愿受试者三人， 男性， 年龄分别为47、 55、 65岁， 有ED症状， 使用本发明制备的水 剂， 从阴茎尿道口滴入 1 毫升水剂， 每天一次， 连续使用二周。五个月后阴茎勃起功能明显 改变， 性交时间延长。受试者非常满意。 说 明 书 。