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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711352360.8 (22)申请日 2017.12.15 (71)申请人 浙江海洋大学 地址 316000 浙江省舟山市定海区临城街 道长峙岛海大南路1号 (72)发明人 曾霖 (74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 代理人 吴秉中 (51)Int.Cl. A61K 36/704(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/12(2006.01) C12N 1/20(200。
2、6.01) A61K 35/744(2015.01) A61K 31/716(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂 (57)摘要 本发明公开了一种大黄鱼非特异性免疫刺 激剂， 成分及其重量份为： 35份肠膜明串珠菌菌 粉、 1020份-1,3-葡聚糖、 13份炙黄芪提取 物、 13份潞党参提取物、 13份制首乌提取物、 1 3份肉苁蓉提取物和35份积雪草提取物。 有益效 果为： 本发明方法制备的免疫刺激剂生理活性 低， 安全、 转染效果好， 通过活化抗原呈递细胞， 并增强巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬活性和 杀菌活性， 同时延缓细。
3、胞免疫功能的衰退来提高 大黄鱼的非特异性免疫， 从而大大降低大黄鱼对 细菌和病毒等传染性病原体抵抗力， 提高大黄鱼 的存活率。 权利要求书2页 说明书6页 CN 107898833 A 2018.04.13 CN 107898833 A 1.一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于成分及其重量份为： 35份肠膜明串珠 菌菌粉、 1020份 -1,3-葡聚糖、 13份炙黄芪提取物、 13份潞党参提取物、 13份制首乌提 取物、 13份肉苁蓉提取物和35份积雪草提取物。 2.根据权利要求1所述的一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的免疫刺 激剂的制备方法， 包括以下步骤： 1） 斜。
4、面活化培养： 将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养， 在培养基中加入12倍的无菌水， 搅拌 均匀得到种子液； 2） 一级摇瓶培养： 将种子液按310%的接种量转接到一级种摇瓶中， 恒温摇床培养； 3） 二级摇瓶培养： 将一级摇瓶培养得到的菌液按310%的接种量转接到二级种摇瓶中， 进行恒温振荡培养； 4） 发酵罐培养： 将二级种摇瓶培养后的菌液按310%的接种量接种到消毒灭菌过的发 酵罐中， 发酵罐培养， 得到发酵液； 5） 菌粉制备： 将发酵罐培养得到充足的菌种， 将菌种超声破碎处理， 冷冻干燥。
5、得到肠膜 明串珠菌菌粉； 6） 免疫刺激剂制备： 在35份肠膜明串珠菌菌粉中加入1020份 -1,3-葡聚糖， 在2025 温度下搅拌12h， 再加入13份炙黄芪提取物、 13份潞党参提取物、 13份制首乌提取物、 13份肉苁蓉提取物和35份积雪草提取物， 混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。 3. 根据权利要求2所述的一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的斜面 培养基成分及其重量份为： 6070份蔗糖、 2030份麦芽糖、 56份酵母膏、 56份大豆蛋白胨、 0.0050.008份生物素、 0.010.02份FeSO47H2O、 0.20.3份MgSO47H2O、 0.010.0。
6、2份 MnSO4H2O、 3.24.8份K2HPO43H2O、 0.50.9份KH2PO4、 0.040.06份CaCl26H2O、 0.20.5 份NaCl、 0.10.2份吐温-20、 1020份琼脂和10001200份水。 4. 根据权利要求2所述的一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的一级 种摇瓶培养基成分及其重量份为： 90100份蔗糖、 3040份麦芽糖、 56份酵母膏、 56份大豆 蛋白胨、 58份柠檬酸二铵、 58份乙酸钠、 0.010.02份FeSO47H2O、 0.20.3份MgSO4 7H2O、 0.010.02份MnSO4H2O、 3.24.8份K2HPO。
7、43H2O、 0.50.9份KH2PO4、 0.040.06份 CaCl26H2O、 0.20.5份NaCl、 0.10.2份吐温-20和10001200份水。 5. 根据权利要求2所述的一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的二级 种摇瓶培养基成分及其重量份为： 100120份蔗糖、 5060份麦芽糖、 56份酵母膏、 56份大 豆蛋白胨、 58份柠檬酸二铵、 58份乙酸钠、 0.010.02份FeSO47H2O、 0.20.3份MgSO4 7H2O、 0.010.02份MnSO4H2O、 3.24.8份K2HPO43H2O、 0.50.9份KH2PO4、 0.040.06份 C。
8、aCl26H2O、 0.20.5份NaCl、 0.10.2份吐温-20和10001200份水。 6. 根据权利要求2所述的一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的发酵 培养基成分及其重量份为： 100120份蔗糖、 5060份麦芽糖、 56份酵母浸出物、 56份大豆 蛋白胨、 0.0010.003份 （S） -4-苄基-2-唑烷酮、 0.010.02份FeSO47H2O、 0.20.3份 MgSO47H2O、 0.010.02份MnSO4H2O、 3.24.8份K2HPO43H2O、 0.50.9份KH2PO4、 0.04 0.06份CaCl26H2O、 0.040.06份NaCl。
9、、 0.10.2份吐温-20和10001200份水。 7.根据权利要求2所述的一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的发酵期 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 107898833 A 2 间补充培养基， 1212.5h后第一次补加发酵培养基， 并添加1822%甘油， 2020.5h后第二次 补加发酵培养基， 2426h后第三次补加发酵培养基， 发酵至4650h。 8. 根据权利要求2所述的一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的超声 破碎条件为： 超声破碎功率为430460W， 破碎时间为1723min， 时间间隔为10： 8s/s 。 9.根据权利要求2所述的。
10、一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 其特征在于： 所述的斜面活 化培养， pH为6.06.5， 温度为2025， 活化培养时间为1224h； 一级摇瓶培养， pH为6.0 6.5， 温度为2025， 摇床转速为100150r/min， 摇瓶培养时间为1236h； 二级摇瓶培养， pH 为6.06.5， 温度为2025， 摇床转速为100200r/min， 摇瓶培养时间为1236h； 发酵罐培 养， pH为6.06.5， 温度为2530， 摇床转速为150250r/min。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 107898833 A 3 一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂 技术领域 0001 本发明。
11、涉及水产养殖领域， 具体是一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂。 背景技术 0002 免疫刺激剂(immunologic stimulant)是指能够调节动物免疫系统并激活免疫 机能， 增强机体对细菌和病毒等传染性病原体抵抗力的一类物质。 近年来， 国内、 外均开展 了将免疫刺激剂用于水产养殖动物传染性疾病预防的研究， 其主要目的是为了将免疫刺激 剂用于预防使用化学药物难于奏效的水产养殖动物的病毒和细菌性疾病。 0003 鱼类的免疫机制可以分为特异性和非特异性免疫， 所谓非特异性免疫就是机体对 非特定的病原体的防御机制， 其中分布在鱼类体表粘液， 血液和肾脏等器官中的溶菌酶 (lysozyme)， 就。
12、是一种在补体(complement)的协同作用下， 可以将细菌溶解的酶补体是存 在于鱼类粘液和血液中的一组蛋白质， 其活化途径有两条:一是能被抗原抗体复合物激活 的经典激活途径， 二是能被与抗体无关的细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和肽聚 糖等激活的替代途径。 无论哪种途径活化的补体都能将菌体溶解。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种安全、 转染效果好， 可明显提高大黄鱼的非特异性免 疫的大黄鱼非特异性免疫刺激剂。 制备上述免疫刺激剂的方法， 肠膜明串珠菌菌种生长繁 殖速度快， 菌粉收获量大。 0005 本发明针对背景技术中提到的问题， 采取的技术方案为：。
13、 NTM048 菌株购于位于日 本千叶县木更津市 (2-5-8Kazusakamatari， Kisarazu-shi， Chiba， Japan)的独立行政法 人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心， 其保藏号为NITE BP-1519， 分类命名为肠 膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。 0006 一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂， 成分及其重量份为： 35份肠膜明串珠菌菌粉、 1020份 -1,3-葡聚糖、 13份炙黄芪提取物、 13份潞党参提取物、 13份制首乌提取物、 13 份肉苁蓉提取物和35份积雪草提取物。 0007 一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备。
14、方法， 包括以下步骤： 1） 斜面活化培养： 将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养， pH为6.06.5， 温度为2025， 活化培 养时间为1224h， 在培养基中加入12倍的无菌水， 搅拌均匀得到种子液。 斜面培养基成分 及其重量份为： 6070份蔗糖、 2030份麦芽糖、 56份酵母膏、 56份大豆蛋白胨、 0.005 0.008份生物素、 0.010.02份FeSO47H2O、 0.20.3份MgSO47H2O、 0.010.02份MnSO4 H2O、 3.24.8份K2HPO43H2O、。
15、 0.50.9份KH2PO4、 0.040.06份CaCl26H2O、 0.20.5份NaCl、 0.10.2份吐温-20、 1020份琼脂和10001200份水； 2） 一级摇瓶培养： 将种子液按310%的接种量转接到一级种摇瓶中， 恒温摇床培养， pH 为6.06.5， 温度为2025， 摇床转速为100150r/min， 培养时间为1236h； 说 明 书 1/6 页 4 CN 107898833 A 4 3） 二级摇瓶培养： 将一级摇瓶培养得到的菌液按310%的接种量转接到二级种摇瓶中， 进行恒温振荡培养， pH为6.06.5， 温度为2025， 摇床转速为100200r/min， 培。
16、养时间为 1236h； 4） 发酵罐培养： 将二级种摇瓶培养后的菌液按310%的接种量接种到消毒灭菌过的发 酵罐中， 发酵罐培养， pH为6.06.5， 温度为2530， 摇床转速为150250r/min。 发酵培养基 成分及其重量份为： 100120份蔗糖、 5060份麦芽糖、 56份酵母浸出物、 56份大豆蛋白胨、 0.0010.003份 （S） -4-苄基-2-唑烷酮、 0.010.02份FeSO47H2O、 0.20.3份MgSO47H2O、 0.010.02份MnSO4H2O、 3.24.8份K2HPO43H2O、 0.50.9份KH2PO4、 0.040.06份CaCl2 6H2O。
17、、 0.040.06份NaCl、 0.10.2份吐温-20和10001200份水。 发酵过程中补充培养基， 得 到发酵液。 发酵期间补充培养基， 1212.5h后第一次补加发酵培养基， 并添加1822%甘油， 2020.5h后第二次补加发酵培养基， 2426h后第三次补加发酵培养基， 发酵至4650h。 菌种 的活力旺盛， 生长繁殖速度快， 接种到发酵罐中后菌种快速生长， 并迅速进入对数期， 发酵 1620h进入稳定期。 在发酵期间，（S） -4-苄基-2-唑烷酮和培养基中其他成分有耦合作用， 促使菌种分裂增殖形成新细胞， 生成的细胞壁中壳聚糖结构中氮元素含量提高， 壳聚糖活 性官能团被修饰，。
18、 降低了壳聚糖的生理活性， 大幅降低其危险性； 5） 菌粉制备： 通过离心或过滤或磁分离发酵液得到湿肠膜明串珠菌， 用无菌水或PBS洗 涤后， 超声破碎处理， 冷冻干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。 超声破碎条件为： 超声破碎功率为 430460W， 破碎时间为1723min， 时间间隔为10： 8s/s； 6） 免疫刺激剂制备： 在35份肠膜明串珠菌菌粉中加入1020份 -1,3-葡聚糖， 在2025 温度下搅拌12h， 再加入13份炙黄芪提取物、 13份潞党参提取物、 13份制首乌提取物、 13份肉苁蓉提取物和35份积雪草提取物， 混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。 上述免 疫刺激剂可活化抗原呈递。
19、细胞， 并能提高溶菌酶和补体的活性， 增加机体中补体的C3成分; 不仅可以增强巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬活性， 而且还可以提高这些细胞的杀菌活 性;激活自然杀伤细胞(NK)， 增强其杀伤异物细胞的活性外， 还能促进巨噬细胞白细胞介素 一2(interleukin-2,IL-2)。 肠膜明串珠菌菌粉、 -1,3-葡聚糖与中草药提取物 （炙黄芪提 取物、 潞党参提取物、 制首乌提取物、 肉苁蓉提取物和积雪草提取物） 有耦合作用， 能抑制 LPS引起的 p65亚基核转运。 通过抑制 NF- B转录活性,从而抑制下游炎症因子 IL-6、 TNF- 的释放而发挥抗炎效应。 与此同时, 还促进 IL-1。
20、0的产生 , 维持促炎因子和抗炎因子之 间的平衡 。 并且还能通过活化衰老细胞NF- B的核转位， 增强NF- B与IL-2启动子的结合， 提高IL-2表达， 延缓衰老细胞免疫功能衰退。 综上所述， 上述免疫刺激剂通过活化抗原呈递 细胞， 并增强巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬活性和杀菌活性， 同时延缓衰老细胞免疫功 能的衰退来提高大黄鱼的非特异性免疫， 从而大大降低大黄鱼对细菌和病毒等传染性病原 体抵抗力， 提高大黄鱼的存活率。 0008 作为优选， 一级种摇瓶培养基成分及其重量份为： 90100份蔗糖、 3040份麦芽糖、 56份酵母膏、 56份大豆蛋白胨、 58份柠檬酸二铵、 58份乙酸钠、。
21、 0.010.02份FeSO4 7H2O、 0.20.3份MgSO47H2O、 0.010.02份MnSO4H2O、 3.24.8份K2HPO43H2O、 0.50.9份 KH2PO4、 0.040.06份CaCl26H2O、 0.20.5份NaCl、 0.10.2份吐温-20和10001200份水。 0009 作为优选， 二级种摇瓶培养基成分及其重量份为： 100120份蔗糖、 5060份麦芽 糖、 56份酵母膏、 56份大豆蛋白胨、 58份柠檬酸二铵、 58份乙酸钠、 0.010.02份FeSO4 说 明 书 2/6 页 5 CN 107898833 A 5 7H2O、 0.20.3份Mg。
22、SO47H2O、 0.010.02份MnSO4H2O、 3.24.8份K2HPO43H2O、 0.50.9份 KH2PO4、 0.040.06份CaCl26H2O、 0.20.5份NaCl、 0.10.2份吐温-20和10001200份水。 上 述一级种摇瓶培养基和二级种摇瓶培养基中营养物质充足， 能满足肠膜明串珠菌生长繁殖 的需求， 培养得到的菌种细胞呈对或短链状排列， 细胞壁厚度高于MS培养基培养的肠膜明 串珠菌细胞壁。 0010 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本发明方法制备的免疫刺激剂生理活性低， 安全、 转染效果好， 通过活化抗原呈递细胞， 并增强巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬活。
23、性和 杀菌活性， 同时延缓细胞免疫功能的衰退来提高大黄鱼的非特异性免疫， 从而大大降低大 黄鱼对细菌和病毒等传染性病原体抵抗力， 提高大黄鱼的存活率。 具体实施方式 0011 下面通过实施例对本发明方案作进一步说明： 实施例1： 一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法， 包括以下步骤： 1） 斜面活化培养： 将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养， pH为 6.5， 温度为22， 活化培养时间 为12h， 在培养基中加入1.5倍的无菌水， 搅拌均匀得到种子液。 斜面培养基成分及其重量份 为： 65份。
24、蔗糖、 25份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 0.007份生物素、 0.02份 FeSO47H2O、 0.26份MgSO47H2O、 0.01份MnSO4H2O、 4.2份K2HPO43H2O、 0.8份KH2PO4、 0.05 份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20、 15份琼脂和1000份水； 2） 一级摇瓶培养： 将种子液按310%的接种量转接到一级种摇瓶中， 恒温摇床培养， pH 为6.5， 温度为22， 摇床转速为100r/min， 培养时间为24h。 一级种摇瓶培养基成分及其重 量份为： 100份蔗糖、 35份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5。
25、.5份大豆蛋白胨、 6份柠檬酸二铵、 7份乙酸 钠、 0.01份FeSO47H2O、 0.27份MgSO47H2O、 0.01份MnSO4H2O、 4.3份K2HPO43H2O、 0.7份 KH2PO4、 0.05份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水； 3） 二级摇瓶培养： 将一级摇瓶培养得到的菌液按310%的接种量转接到二级种摇瓶中， 进行恒温振荡培养， pH为6.5， 温度为22， 摇床转速为150r/min， 培养时间为24h。 二级种摇 瓶培养基成分及其重量份为： 100份蔗糖、 55份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 6份 柠檬。
26、酸二铵、 6份乙酸钠、 0.01份FeSO47H2O、 0.2份MgSO47H2O、 0.01份MnSO4H2O、 4.3份 K2HPO43H2O、 0.7份KH2PO4、 0.05份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水； 4） 发酵罐培养： 将二级种摇瓶培养后的菌液按5%的接种量接种到消毒灭菌过的发酵罐 中， 发酵罐培养， pH为6.5， 温度为28， 摇床转速为200r/min。 发酵培养基成分及其重量份 为： 110份蔗糖、 55份麦芽糖、 5.7份酵母浸出物、 5.6份大豆蛋白胨、 0.002份 （S） -4-苄基-2- 唑烷酮、 0.01份FeS。
27、O47H2O、 0.27份MgSO47H2O、 0.01份MnSO4H2O、 4.1份K2HPO43H2O、 0.8份KH2PO4、 0.05份CaCl26H2O、 0.05份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水。 发酵过程中补充 培养基， 得到发酵液。 发酵期间补充培养基， 12h后第一次补加发酵培养基， 并添加20%甘油， 20h后第二次补加发酵培养基， 24h后第三次补加发酵培养基， 发酵至48h； 5） 菌粉制备： 通过离心发酵液得到湿肠膜明串珠菌， 用PBS洗涤后， 超声破碎处理， 冷冻 干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。 超声破碎条件为： 超声破碎功率为450W， 破碎时间为20m。
28、in， 时 说 明 书 3/6 页 6 CN 107898833 A 6 间间隔为10： 8s/s； 6） 免疫刺激剂制备： 在4份肠膜明串珠菌菌粉中加入16份 -1,3-葡聚糖， 在22温度下 搅拌1.5h， 再加入2份炙黄芪提取物、 2份潞党参提取物、 2份制首乌提取物、 2份肉苁蓉提取 物和4份积雪草提取物， 混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。 0012 实施例2： 一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法， 包括以下步骤： 1） 斜面活化培养： 将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养， pH为。
29、 6.0， 温度为25， 活化培养时间 为12h， 在培养基中加入1.5倍的无菌水， 搅拌均匀得到种子液。 斜面培养基成分及其重量份 为： 65份蔗糖、 25份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 0.007份生物素、 0.02份 FeSO47H2O、 0.25份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.2份K2HPO43H2O、 0.8份KH2PO4、 0.05 份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20、 15份琼脂和1000份水； 2） 一级摇瓶培养： 将种子液按310%的接种量转接到一级种摇瓶中， 恒温摇床培养， pH 为6.0， 温度为2。
30、5， 摇床转速为100r/min， 培养时间为24h。 一级种摇瓶培养基成分及其重 量份为： 100份蔗糖、 35份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 5.5份柠檬酸二铵、 7份乙 酸钠、 0.02份FeSO47H2O、 0.27份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.6份K2HPO43H2O、 0.7 份KH2PO4、 0.05份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水； 3） 二级摇瓶培养： 将一级摇瓶培养得到的菌液按310%的接种量转接到二级种摇瓶中， 进行恒温振荡培养， pH为6.0， 温度为25， 摇床转速为150r/。
31、min， 培养时间为24h。 二级种摇 瓶培养基成分及其重量份为： 100份蔗糖、 55份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 5.5 份柠檬酸二铵、 5.5份乙酸钠、 0.02份FeSO47H2O、 0.2份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.6份K2HPO43H2O、 0.7份KH2PO4、 0.05份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份 水； 4） 发酵罐培养： 将二级种摇瓶培养后的菌液按5%的接种量接种到消毒灭菌过的发酵罐 中， 发酵罐培养， pH为6.0， 温度为28， 摇床转速为200r/min。 发酵培养基成分及。
32、其重量份 为： 110份蔗糖、 55份麦芽糖、 5.7份酵母浸出物、 5.5.5份大豆蛋白胨、 0.002份 （S） -4-苄基- 2-唑烷酮、 0.02份FeSO47H2O、 0.27份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.1份K2HPO4 3H2O、 0.8份KH2PO4、 0.05份CaCl26H2O、 0.05份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水。 发酵过程中 补充培养基， 得到发酵液。 发酵期间补充培养基， 12h后第一次补加发酵培养基， 并添加20% 甘油， 20h后第二次补加发酵培养基， 24h后第三次补加发酵培养基， 发酵至48h； 5） 菌粉制备：。
33、 通过过滤发酵液得到湿肠膜明串珠菌， 用无菌水洗涤后， 超声破碎处理， 冷冻干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。 超声破碎条件为： 超声破碎功率为450W， 破碎时间为 23min， 时间间隔为10： 8s/s； 6） 免疫刺激剂制备： 在5份肠膜明串珠菌菌粉中加入20份 -1,3-葡聚糖， 在20温度下 搅拌2h， 再加入1份炙黄芪提取物、 3份潞党参提取物、 2份制首乌提取物、 2份肉苁蓉提取物 和5份积雪草提取物， 混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。 0013 实施例3： 一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法， 包括以下步骤： 1） 斜面活化培养： 将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串。
34、珠菌(Leuconostoc 说 明 书 4/6 页 7 CN 107898833 A 7 mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养， pH为 6.2， 温度为24， 活化培养时间 为24h， 在培养基中加入1.5倍的无菌水， 搅拌均匀得到种子液。 斜面培养基成分及其重量份 为： 65份蔗糖、 24份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 0.007份生物素、 0.02份 FeSO47H2O、 0.25份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.7份K2HPO43H2O、 0.8份KH2PO4、 0.045份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0。
35、.1份吐温-20、 16份琼脂和1000份水； 2） 一级摇瓶培养： 将种子液按6%的接种量转接到一级种摇瓶中， 恒温摇床培养， pH为 6.2， 温度为24， 摇床转速为100r/min， 培养时间为24h。 一级种摇瓶培养基成分及其重量 份为： 100份蔗糖、 35份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 5.5份柠檬酸二铵、 7份乙酸 钠、 0.02份FeSO47H2O、 0.27份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.7份K2HPO43H2O、 0.7份 KH2PO4、 0.045份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水；。
36、 3） 二级摇瓶培养： 将一级摇瓶培养得到的菌液按6%的接种量转接到二级种摇瓶中， 进 行恒温振荡培养， pH为6.2， 温度为24， 摇床转速为150r/min， 培养时间为24h。 二级种摇瓶 培养基成分及其重量份为： 100份蔗糖、 55份麦芽糖、 5.5份酵母膏、 5.5份大豆蛋白胨、 5.5份 柠檬酸二铵、 5.5份乙酸钠、 0.02份FeSO47H2O、 0.2份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.7 份K2HPO43H2O、 0.7份KH2PO4、 0.045份CaCl26H2O、 0.4份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水； 4） 发酵罐培养： 将。
37、二级种摇瓶培养后的菌液按5%的接种量接种到消毒灭菌过的发酵罐 中， 发酵罐培养， pH为6.2， 温度为28， 摇床转速为200r/min。 发酵培养基成分及其重量份 为： 110份蔗糖、 55份麦芽糖、 5.7份酵母浸出物、 5.5.5份大豆蛋白胨、 0.002份 （S） -4-苄基- 2-唑烷酮、 0.02份FeSO47H2O、 0.27份MgSO47H2O、 0.02份MnSO4H2O、 4.1份K2HPO4 3H2O、 0.8份KH2PO4、 0.045份CaCl26H2O、 0.045份NaCl、 0.1份吐温-20和1000份水。 发酵过程 中补充培养基， 得到发酵液。 发酵期间补。
38、充培养基， 24h后第一次补加发酵培养基， 并添加 20%甘油， 20h后第二次补加发酵培养基， 24h后第三次补加发酵培养基， 发酵至48h； 5） 菌粉制备： 通过磁分离发酵液得到湿肠膜明串珠菌， 用无菌水洗涤后， 超声破碎处 理， 冷冻干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。 超声破碎条件为： 超声破碎功率为450W， 破碎时间为 23min， 时间间隔为10： 8s/s； 6） 免疫刺激剂制备： 在5份肠膜明串珠菌菌粉中加入20份 -1,3-葡聚糖， 在20温度下 搅拌2h， 再加入1份炙黄芪提取物、 3份潞党参提取物、 2份制首乌提取物、 3份肉苁蓉提取物 和5份积雪草提取物， 混合均匀后冷冻干燥。
39、得到免疫刺激剂。 0014 实施例4： 试验在69月份进行， 将养殖大黄鱼网箱分成8组， 5组网箱为试验组， 3组为对照组， 使 用含免疫刺激剂的饲料 （每公斤饲料添加免疫刺激剂50mg） 投喂， 连续投喂8周， 统计自然发 病死亡率， 计算相对免疫保护率 （Relative Percent Survival, RPS） ， RPS= （1-免疫组死亡 率/对照组死亡率） 100%。 结果显示， 实验组大黄鱼的病害发生率显著下降， 平均成活率提 高37.39%， 相对免疫保护率RPS达84.40%， 表明饲喂免疫刺激剂能增强大黄鱼在养殖中对病 菌感染的抵抗力 （表1） ； 表1 大黄鱼养殖抗病试验结果 说 明 书 5/6 页 8 CN 107898833 A 8 本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知， 在此不进行赘述。 0015 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明， 应理解的是以上所述仅 为本发明的具体实施例， 并不用于限制本发明， 凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、 补充或类似方式替代等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 9 CN 107898833 A 9 。